Biz arenavirus ters genetik teknikleri ve plazmid geliştirilmesi ve iyileştirilmesi için JCT ve LM-S laboratuvarlarında geçmiş ve mevcut üyelerine teşekkür. Ayrıca teknik destek için Snezhana Dimitrova teşekkür ederim. JUNV NP (SA02-BG12) yönelik monoklonal antikor BEI Kaynakları (NIAID biyosavunma ve Ortaya Çıkan Enfeksiyonlar Araştırma Kaynakları Deposu) elde edilmiştir. BYHC Kurumsal Ruth L. Kirschstein Ulusal Araştırma Hizmet Ödülü Grant sayısı GM068411 tarafından desteklenmiştir. EO-R Fulbright-Conicyt (BIO 2008) ve Rochester Aşı Bursu (2012) almıştır. EO-R güncel destek Rochester Üniversitesi&#39;nde Öğretim Üyesi Yetiştirme ve Çeşitlilik için Office Çeşitlilik ve Akademik Mükemmellik için doktora sonrası Bursu tarafından sağlanmaktadır. LM-S laboratuvar araştırma NIH hibe RO1 AI077719, R21NS075611-01, R03AI099681-01A1, Grip Araştırma ve Gözetim Mükemmellik NIAID Merkezleri (HHSN266200700008C) tarafından finanse edilen ve birBiyosavunma Bağışıklık Modelleme (HHSN272201000055C) için Rochester Merkezi Üniversitesi. JCT laboratuvar Araştırma hibe RO1 AI047140, NIH RO1 AI077719 ve RO1 AI079665 tarafından desteklenmiştir.

1. Arenavirus Kurtarma Transfeksiyon Bizim kurtarma sistemi nükleoprotein (NP) ve RNA-bağımlı RNA polimeraz (L), RNA kopyalamasının ve arenavirus genomunun gen ekspresyonu için gerekli olan viral Trans-etkili faktör kodlayan polimeraz II proteini ifade plazmid hem de kullanımı dayalı 7, 19, ve hücresel S RNA polimeraz I (pol I), ve L, antigenome RNA türlerinin 7 ile hücre içi sentez, doğrudan sahip plazmid. Bizim çalışmalarımız sırasında bir promotör ve terminatör sıçangil dizileri (Şekil 2), insan polimeraz kullanan pCAGGs proteini tavuk β-aktin promoteri ve polyadenylanation (PA) sinyal dizileri kullanan ekspresyon plazmidi, ve insan pol I plazmit kullanmak . S ve L RNA segmenti HPOL-I ile transkripsiyonu genomik RNA segmenti üzerine üretimi için izin vermek için bir antigenomik yönde HPOL-I plazmid içine klonlanır. Vahşi-ty kurtarma içinPE rekombinant LCMV (rLCMV) ve içten # 1 (rCandid # 1) pCAGGs NP ve her bir virüs, insan L kendi poli-I S ve L RNA segmenti (Şekil 3) ile birlikte ko-transfekte edilmiştir. Rekombinant trisegmented LCMV (r3LCMV) ve 1. (# 1 r3Candid) Candid nesil benzer bir protokol izledi ama S segment iki farklı pol-I S plazmid, her kodlama farklı bir muhabir gen bölündü: biri, NP açık okuma çerçevesi (ORF) yeşil floresan proteini (GFP) raportör geni (HPOL-I S GFP / GP) ve bir diğerinde ise, viral glikoprotein öncü (GPC) ORF Gaussia lusiferaz (Gluc) raportör geni ile değiştirilir ile değiştirildi (HPOL-I S NP / Gluc). Protokolünün bir şematik gösterimi Şekil 4 &#39;de gösterilmiştir. Aşağıdaki transfeksiyon, enfeksiyon protokolü 6 kuyulu plakalar için kurulmuştur. <ol><li> OptiMEM-Lipofectamine 2000 (LPF2000) karışımı: OptiMEM medya 250 ul hazırlayın ve, bağlıüzerinde virüs kurtarma, 10 - transfeksiyon başına LPF2000 12 mg (1 ug / ml) (Tablo 1). DNA mikrogram başına 2.5 mikrogram LPF2000 bir oranı tavsiye edilir. Oda sıcaklığında 10 dakika - 5 inkübe edin. Bununla birlikte, ayrı bir mikrosantrifüj tüpü (adım 1.2) elde edildi ve plazmidin transfeksiyon karışımı hazırlandı. </li><li> Plazmid DNA transfeksiyon karışımı: Her virüs kurtarma için önerilen miktarda (bkz. Tablo 1) kullanarak mikrosantrifüj tüp plazmid transfeksiyon kokteyl hazırlayın. OptiMEM ile 50 ul son hacim getirin. </li><li> OptiMEM-LPF2000 plazmid-DNA karışımı: plazmid DNA transfeksiyon karışımı (adım 1.2) içine OptiMEM-LPF2000 karışımı (adım 1.1) 250 ul ekle. Oda sıcaklığında 30 dak - 20 bu karışım inkübe edin. Bu arada hazırlamak ve transfeksiyon reaksiyon başına 1 x 10 6 Vero hücreleri saymak. Vero hücreleri süspansiyon içinde transfekte edilir. </li><li> Vero hücreleri hazırlanması: Vero CelLs 100 mm çanağı kültürlenmiştir. Başlamadan önce, 37 ° C ile 1x PBS, DMEM,% 10 FBS,% 1 PS medya ve tripsin-EDTA karışımı getirmek <ol><li> 1x 5 ml PBS ile iki kez, hücreler yıkayın. </li><li> Tripsin-EDTA 1 ml hücre Trypsinize ve hücreler çıkartılma (yaklaşık 5 dakika) kadar bekleyin. Nazik belki tam olarak yemekler hücreleri ayırmak için gerekli kılavuz çekme. </li><li> Dikkatli bir şekilde, bir 15 ml santrifüj tüpüne DMEM% 10 FBS% 1 PS 10 ml hücre süspansiyon haline getirin. </li><li> Bir santrifüj içinde 1000 rpm&#39;de 5 dakika için hücreler santrifüjleyin. </li><li> DMEM% 10 FBS,% 1 PS 10 ml hücrelerin yeniden süspanse edin ve bir hemasitometre kullanılarak hücre sayımı, 1 x 10 6 hücre / ml konsantrasyonu ayarlanır. 1 x 10 transfeksiyon başına 6 Vero hücreleri en iyi sonuçları vermiştir 0,5 - olduğu gözlenmiştir. </li></ol></li><li> LPF2000/DNA ve hücrelerin karışımı: 20 ardından - 30 dakika, oda sıcaklığında inkübasyon (adım 1.3), Vero hücreleri, 1 ml (1 x 10 6) (Basamak 1.4) eklemekOda sıcaklığında 5 dakika boyunca OptiMEM-LPF2000 plazmid-DNA karışımı ve inkübe. </li><li> 6 kuyulu tabak içine Tohum LPF2000/DNA-cell karışımı: 6-kuyulu plakanın kuyularına DNA LPF2000-Vero karışımı (adım 1.5) ekleyin. Yavaşça 6-iyi plaka sallamak ve 37 inkübatör transfeksiyon inkübe gecede izin ° C ve% 5 CO 2. </li><li> Transfeksiyon orta değiştirin: Yaklaşık 16-24 saat sonrası transfeksiyon, transfeksiyon ortamı çıkarın enfeksiyon medya 2 ml ekleyin ve ek 48 saat için transfekte hücreleri inkübe. </li><li> Hücre geçiş: enfeksiyon ortamı içinde 48 saat inkübasyondan sonra, doku kültür yüzey (ASR) kaldırmak ve 100 mm tabak içine transfekte hücrelere geçerler. Transfekte edilmiş hücrelerin virüs parçacıkları üretmek için ilave inkübasyon gerekir, çünkü ASR nadiren bulaşıcı bir virüs içerir. Hücre geçişi için: <ol><li> 1x 2 ml PBS ile iki kez, hücreler yıkayın. </li><li> Hücreler w Trypsinize<html> ith 0.5 tripsin-EDTA ml ve hücreleri ayırmak kadar bekleyin. </li><li> 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde DMEM% 10 FBS% 1 PS 1 ml süspansiyon hücreleri. </li><li> 5000 rpm&#39;de 5 dakika, 4 ° C bir mikrosantrifüj içinde için hücreler santrifüjleyin. </li><li> Dikkatle enfeksiyon ortamı, 1 ml hücreleri tekrar süspansiyon ve 100 mm tabak için hücreleri aktarın. 8 mL, virüs için konsantre hücre kurutma hem de önlenmesi için yeterli bir hacme kadar, bulaşıcı medya ile, plaka toplam hacmi kadar getir. </li></ol></li><li> Yavaşça 37, 100 mm tabak sallamak ve inkübatör Vero hücreleri ile inkübasyon devam ° C ile 5% 72 saat boyunca CO2. </li><li> TCS toplanması: 72 saat inkübasyondan sonra, 15 ml&#39;lik bir santrifüj tüpüne TCS toplamak. Bir santrifüj içinde 2500 rpm&#39;de 5 dakika boyunca santrifüje edilerek hücre artıkları çıkarın. Bulaşıcı arenavirus TCS bulunan, bu nedenle hücre enkaz pelet kaldırmak ve -80 TCS saklamak ° C </li></ol>Rekombinant Arenavirus Kurtarma le &quot;&gt; 2. Onay RLCMV ve rCandid 1. başarılı bir kurtarma tespiti bir odak oluşturan birim (FFU) immünofloresan testi (IFA) ile elde edilir. Vahşi tip virüs kurtarma için biz viral NP için spesifik antikorların kullanımı. R3LCMV ve r3Candid # 1, bu şekilde floresan mikroskobu (GFP) ve / ya da lüminesans (Gluc) ile antikorların gerek kalmadan tespit ve viral titrasyon sağlayan, iki haberci genlerin (GFP ve Gluc) kodlar. <ol><li> Yabani tip rekombinan arenavirus kurtarma tekrarlayın: titrasyon bir gün önce, iki kez PBS ile yıkayın trypsinize Vero hücreleri ve 80 ulaşmak için 96 oyuklu plaka hazırlanması -% 90 izdiham sonraki gün (4 x 10 4 hücre / çukur). Yavaşça hücre üniformalı dağılımı elde etmek için elle tabak sallayın. Kültür hücreleri, gecede, 37 ° C inkübatör% 5 CO 2 ile. Enfeksiyon devam etmeden önce, bir tek tabaka onaylamak için mikroskop altında hücrelerin kontrol edin: <ol><li> Seri olarak seyreltilmiş (10 kat seyreltme) virüs içeren TCS OptiMEM içinde 100 mm çanağı (adım 1.10) &#39;de transfekte edilmiş hücreler geri kazanılır. </li><li> Numaralı seribaşı Vero hücrelerinde bulunan ortamı çıkarın 1x PBS 50 ul ile iki kez yıkayın, ve seri seyreltilmiş virüs (adım 2.1) 50 ul hücreleri enfekte. 37 1.5 saat hücreleri enfekte ° C ve% 5 CO2. </li><li> Enfeksiyondan sonra, virüs inokulum kaldırmak 100 enfeksiyon medya ul / iyi ekleyin ve 16 hücreleri inkübe - 18 saat. Viral yeniden enfeksiyon viral titreleri aşırı tahmininde neden olabilecek, 18 saat inkübasyondan sonra oluşabilir. </li><li> 16 - 18 saat sonrası enfeksiyon, her kuyudan TCS çıkarın ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca, 1 x PBS içinde sulandırılmış% 4 formaldehit ile hücreleri gidermek. </li><li> Daha sonra, sabitleme çözeltisi kaldırmak ve hücre geçirgenliği ile% 0.1 Triton X-100, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca, 1 x PBS içinde seyreltilmiştir. </li><li> Permeabilization çözüm aspire, daha sonra hücreleri 3 kez wi yıkayıninci 1x PBS. </li><li> Oda sıcaklığında 1 saat boyunca PBS 1x (çözelti engelleme) içinde% 2.5 büyükbaş hayvan serum albümini (BSA) ile hücrelerin bloke edin. Seçenek olarak ise, hücreler, 4 ° C&#39;de gece boyunca bloke edilir ve antikor inkübasyon ertesi gün ile devam edilebilir. </li><li> Bununla birlikte, birincil antikor hazırlanması. Çözümü engelleme LCMV-ve içten # 1 spesifik primer antikorlar seyreltilir ve daha sonra 3,500 rpm&#39;de 15 dakika boyunca / bloke etme çözeltisi antikor santrifüj. BEI Kaynaklar (1:500 seyreltme) ikinci monoklonal anti-NP LCMV antikor klon 1.1.3 (1:30 seyreltme) 16 ve monoklonal anti-NP JUNV antikor SA02-BG12 rLCMV algılama ve rCandid # 1 için kullanılabilir sırasıyla. </li><li> 1 saat inkübasyondan sonra, bloke etme çözeltisi aspire ve hücrelere birincil antikor 50 ul ve 37 ° C&#39;de 1 saat boyunca inkübe ° C </li><li> Bu zamanda, çözelti engelleme ikincil antikor azaltır ve daha sonra 3,500 rpm&#39;de 15 dakika boyunca antikor / bloke etme çözeltisi santrifüj. Poliprimer monoklonal antikorların tespiti için klonal tavşan anti-fare IgG ikincil antikor FITC Şekil 5&#39;te görülen görüntüler elde etmek için kullanılmıştır. </li><li> 1 saat inkübasyondan sonra, birincil antikor aspire 1X PBS ile 3 defa yıkanır ve 37 C&#39;de 30 dakika boyunca, ikincil antikor ekleyin ° C </li><li> 30 dakika inkübasyondan sonra, ikinci antikor ve aspire 1x 3 kez PBS ile yıkayın. Hücreler her iki ml (FFU / ml) başına birim oluşturan odak sayarak viral kurtarma ve titrasyon başarısını belirlemek için floresan mikroskobu kullanarak şimdi dikkat edilmesi hazırız. </li></ol></li><li> r3LCMV ve 1. r3Candid viral kurtarma: Bu virüsler iki muhabiri gen ifade yana, kendi GFP ifade veya TCS olarak Gluc ifade algılamak için floresan mikroskobu ile izlenebilir kurtarır. Kurtarma da TCS içinde Gluc ifade ile teyit edilebilir. Trisegmented virüs titre etmek için, 2.1.4 adımları 2.1 izleyin, ancak hücreleri, B gerekmezE çünkü GFP ifade başarılı bir viral kurtarma belirlemek için sabit. Virüs titrasyonu FFU / ml sayılması ile tespit edilir. Gluc ifade, TCS gelen Gluc ifade tarafından başarılı viral kurtarma belirlemek için bir Gluc tahlil kiti (Biolux Gaussia Lusiferaz Testi kiti, New England Biolabs) kullanılarak ölçülebilir. Bu amaçla: <ol><li> Bir 96-gözenekli beyaz plaka (düz tabanlı mikrotitre plakaları, Fisher Scientific) içine pipet TCS 100 ul. </li><li> Luminometre (Lumicount, Packard Biosciences) ayarlayın. </li><li> Her örnek için 100 ul Gluc Deneyi çözeltisi (imalatçı tarafından tavsiye edilen) ve luminometre ile Gluc raportör gen ölçer - 50 ekleyin. Negatif bir kontrol olarak, vahşi tip virüs enfekte olan hücrelerden TCS Gluc ifade ölçüldü. </li></ol></li></ol> 3. Doku kültür yüzer geçişi Viral kurtarma transfeksiyon verimliliği bağlıdır. Vero hücrelerinde gösterilmiştirdiğer hücre hatları 14 daha düşük transfeksiyon verimliliği olması. TCS virüs titreleri düşük ise, virüs amplifiye etmek için 72 saat boyunca 0.01 (LCMV) veya 0.1 (1. İçten) &#39;lik bir enfeksiyon çokluğu (İB), taze Vero hücreleri enfekte edebilir.

<ol>
	<li>Albarino, C. G., Bird, B. H., Chakrabarti, A. K., Dodd, K. A., Flint, M., Bergeron, E., White, D. M., Nichol, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+determinant+of+attenuation+in+mice+of+the+Candid1+vaccine+for+Argentine+hemorrhagic+fever+is+located+in+the+G2+glycoprotein+transmembrane+domain.">The major determinant of attenuation in mice of the Candid1 vaccine for Argentine hemorrhagic fever is located in the G2 glycoprotein transmembrane domain.</a> Journal of Virology. 85, 10404-10408 (2011).</li><li>Barton, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocytic+choriomeningitis+virus:+a+neglected+central+nervous+system+pathogen.">Lymphocytic choriomeningitis virus: a neglected central nervous system pathogen.</a> Clinical Infectious Diseases: an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 22, 197 (1996).</li><li>Buchmeier, M. J., Peter, C. J., de la Torre, J. C., Fields, B. N., Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arenaviridae:+The+viruses+and+their+replication.">Arenaviridae: The viruses and their replication.</a> Fields' Virology. 2, 179201827 (2007).</li><li>Emonet, S. E., Urata, S., de la Torre, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arenavirus+reverse+genetics:+new+approaches+for+the+investigation+of+arenavirus+biology+and+development+of+antiviral+strategies.">Arenavirus reverse genetics: new approaches for the investigation of arenavirus biology and development of antiviral strategies.</a> Virology. 411, 416-425 (2011).</li><li>Emonet, S. F., Garidou, L., McGavern, D. B., de la Torre, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+recombinant+lymphocytic+choriomeningitis+viruses+with+trisegmented+genomes+stably+expressing+two+additional+genes+of+interest.">Generation of recombinant lymphocytic choriomeningitis viruses with trisegmented genomes stably expressing two additional genes of interest.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 3473-3478 (2009).</li><li>Fischer, S. A., Graham, M. B., Kuehnert, M. J., Kotton, C. N., Srinivasan, A., Marty, F. M., Comer, J. A., Guarner, J., Paddock, C. D., DeMeo, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+of+lymphocytic+choriomeningitis+virus+by+organ+transplantation.">Transmission of lymphocytic choriomeningitis virus by organ transplantation.</a> The New England Journal of Medicine. 354, 2235-2249 (2006).</li><li>Flatz, L., Bergthaler, A., de la Torre, J. C., Pinschewer, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+an+arenavirus+entirely+from+RNA+polymerase+I/II-driven+cDNA.">Recovery of an arenavirus entirely from RNA polymerase I/II-driven cDNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 4663-4668 (2006).</li><li>Gunther, S., Lenz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lassa+virus.">Lassa virus.</a> Critical reviews in clinical laboratory sciences. 41, 339-390 (2004).</li><li>Harrison, L. H., Halsey, N. A., McKee, K. T., Peters, C. J., Barrera Oro, J. G., Briggiler, A. M., Feuillade, M. R., Maiztegui, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+case+definitions+for+Argentine+hemorrhagic+fever.">Clinical case definitions for Argentine hemorrhagic fever.</a> Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 28, 1091-1094 (1999).</li><li>Isaacson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+hemorrhagic+fever+hazards+for+travelers+in+Africa.">Viral hemorrhagic fever hazards for travelers in Africa.</a> Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 33, 1707-1712 (2001).</li><li>Kerber, R., Rieger, T., Busch, C., Flatz, L., Pinschewer, D. D., Kummerer, B. M., Gunther, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-species+analysis+of+the+replication+complex+of+Old+World+arenaviruses+reveals+two+nucleoprotein+sites+involved+in+L+protein+function.">Cross-species analysis of the replication complex of Old World arenaviruses reveals two nucleoprotein sites involved in L protein function.</a> Journal of Virology. 85, 12518-12528 (2011).</li><li>Lee, K. J., Novella, I. S., Teng, M. N., Oldstone, M. B., de La Torre, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NP+and+L+proteins+of+lymphocytic+choriomeningitis+virus+(LCMV)+are+sufficient+for+efficient+transcription+and+replication+of+LCMV+genomic+RNA+analogs.">NP and L proteins of lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) are sufficient for efficient transcription and replication of LCMV genomic RNA analogs.</a> Journal of Virology. 74, 3470-3477 (2000).</li><li>Mets, M. B., Barton, L. L., Khan, A. S., Ksiazek, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocytic+choriomeningitis+virus:+an+underdiagnosed+cause+of+congenital+chorioretinitis.">Lymphocytic choriomeningitis virus: an underdiagnosed cause of congenital chorioretinitis.</a> American Journal of Ophthalmology. 130, 209-215 (2000).</li><li>Murakami, S., Horimoto, T., Yamada, S., Kakugawa, S., Goto, H., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+canine+RNA+polymerase+I-driven+reverse+genetics+for+influenza+A+virus:+its+application+for+H5N1+vaccine+production.">Establishment of canine RNA polymerase I-driven reverse genetics for influenza A virus: its application for H5N1 vaccine production.</a> Journal of Virology. 82, 1605-1609 (2008).</li><li>Palacios, G., Druce, J., Du, L., Tran, T., Birch, C., Briese, T., Conlan, S., Quan, P. L., Hui, J., Marshall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+arenavirus+in+a+cluster+of+fatal+transplant-associated+diseases.">A new arenavirus in a cluster of fatal transplant-associated diseases.</a> The New England Journal of Medicine. 358, 991-998 (2008).</li><li>Rodrigo, W. W., de la Torre, J. C., Martinez-Sobrido, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+single-cycle+infectious+lymphocytic+choriomeningitis+virus+to+study+hemorrhagic+fever+arenaviruses.">Use of single-cycle infectious lymphocytic choriomeningitis virus to study hemorrhagic fever arenaviruses.</a> Journal of Virology. 85, 1684-1695 (2011).</li><li>Rojek, J. M., Kunz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+entry+by+human+pathogenic+arenaviruses.">Cell entry by human pathogenic arenaviruses.</a> Cellular Microbiology. 10, 828-835 (2008).</li><li>Rojek, J. M., Sanchez, A. B., Nguyen, N. T., de la Torre, J. C., Kunz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+mechanisms+of+cell+entry+by+human-pathogenic+Old+World+and+New+World+arenaviruses.">Different mechanisms of cell entry by human-pathogenic Old World and New World arenaviruses.</a> Journal of Virology. 82, 7677-7687 (2008).</li><li>Sanchez, A. B., de la Torre, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+the+prototypic+Arenavirus+LCMV+entirely+from+plasmid.">Rescue of the prototypic Arenavirus LCMV entirely from plasmid.</a> Virology. 350, 370-380 (2006).</li></ol>

Plazmid tabanlı ters genetik teknikler kullanılarak rekombinant arenaviruses üretimi arenavirus biyoloji birçok farklı yönleriyle araştırılması için yaygın olarak kullanılan bir yaklaşım haline gelmiştir. Burada arenavirus yaparak mevcut sistem için çok önemli bir gelişmeyi belgelemek diğer bulaşıcı hastalıklara karşı arenaviruses ve aşı vektörler karşı FDA onaylı aşı adayların potansiyel üretimi için izin, Vero hücrelerinde kurtarır. Ilgili deneysel p...

Arenaviruses Arenaviridae ailesine ait bir bisegmented, negatif dallı RNA genomu 3 zarflı virüslerdir. Arenavirus genomu iki ayrı segmentleri viral 3 bir ambisense şekilde dört protein kodlar. Büyük (L) segmenti RNA-bağımlı RNA polimeraz (L) ve virüs tomurcuklanan temel itici güç olarak hizmet veren küçük HALKA (Gerçekten İlginç Yeni Gen) parmak protein (Z) kodlar. Küçük (S) kademeli bir viral nükleoprotein (NP) ve yüzey glikoprotein (GP) (Şekil 1) kodlar. Arenaviridae ailesinin bazı üyeleri insanlarda 3 ölümcül kanamalı ateşi (HF) sorumludur. Ilke endişeleri yatan hastalarda 8, 9 yüksek mortalite neden olduğu bilinmektedir Lassa virüsü (LASV) ve Junín virüsü (JUNV) vardır. Bu virüsler sırasıyla Batı Afrika ve kırsal Arjantin, endemik olmasına rağmen,artan seyahat 10 nedeniyle endemik olmayan bölgelere LASV ve JUNV ithalatı artan endişeler vardır. Normal insanlarda ciddi hastalığı ile ilişkili olmasa da, ayrıca, prototipik arenavirus lenfositik koryomenenjit virüsü (LCMV) immün sistemi baskılanmış hastalarda 6, 15 ölümcül enfeksiyon vakası olduğu gibi bir ihmal patojen olarak kabul edilir ve konjenital doğum kusurları ve spontan düşükler için sorumludur hamile kadınlar 2, 13. Şu anda herhangi bir ABD arenaviruses ve tedavi karşı aşı sadece kısmen etkilidir ve genellikle önemli yan etkileri ile ilişkili nükleosit analoğu ribavirin ile sınırlıdır FDA tarafından onaylanmıştır. Plazmid tabanlı ters genetik 4 ve rekombinant arenaviruses 7, 19 nesil tanıtımı büyük ölçüde arenavirus araştırma alanında gelişmiş var. Şu anda, kemirgen hücreleri (BHK-21 gibi) homo için kullanılırS ve L bölümlerinin başlangıç ​​transkripsiyonunu yönlendiren türe özgü murin RNA polimeraz I (pol I) promotöre bağlı yeniden birleştirici arenaviruses arasında tirme. BHK-21 hücreleri Bununla birlikte virüs kurtarma potansiyel bir aşı adayı olarak tohum arenaviruses rekombinant üretimi için onaylanmış bir yöntem değildir. Burada prototipik Eski Dünya (OW) LCMV ve Yeni Dünya (KB) Vero hücrelerinde JUNV Candid içerisinde 1. gerginlik etkin kurtarma için insan pol-I organizatörü kullanımını belgeledi. Benzer bir metodoloji kullanarak, rekombinant trisegmented LCMV (r3LCMV) ve Candid 1. (r3Candid # 1) iki farklı S RNA segmentlerinde 5 olarak kodlanmış iki ek yabancı genleri içeren arenaviruses oluşturulur. Bu yeni sistem son derece tekrarlanabilir ve basit bir protokol takip ama hemen potansiyel aşı veya aşı vektör tohum olarak rekombinant arenaviruses üretimi uygulanabilir değil.

<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Material and methods</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>
 Cell lines 
Vero E6 (African green monkey kidney epithelial cells) are maintained in a 37 &deg;C incubator with 5 % CO2 in DMEM 10 % FBS 1 % PS. Cells are available from the American Type Culture Collection (ATCC, catalogue number CRL-1586). 
 
Plasmids 
All plasmids, with the exception of hpol-I L, can be grown at 37 &deg;C, for 16-18 hr. We recommend that cultures of the hpol-I L be grown at 30 &deg;C for 24 hr. Plasmids are prepared using a plasmid maxi kit (EZNA Fastfilter Plasmid Maxi Kit, Omega Bio-tek) following the manufacturer's recommendations and stored at -20 &deg;C. The concentration of the purified DNA plasmid is determined by spectrophotometry at 260 nm, with purity being estimated using the 260:280 nm ratio. Preparations with 1.8-2.0 260:280 nm ratios are considered appropriate for virus rescue purposes. Additionally, plasmid concentration and purity should be confirmed with agarose gel electrophoresis. 
 
Viruses 
The described protocol for rescuing rLCMV (Armstrong 53b) and rCandid#1 can be executed under biosafety level (BSL) 2 conditions. Contaminated material, including TCS and cells should be sterilized before disposal. Rescue of other arenavirus may require higher BSL facilities so proper safety/security measures must be followed. 
 
Tissue culture media and solutions 
DMEM 10 %FBS 1 %PS: 445 ml Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), 50 ml of Fetal Bovine Serum (FBS), and 5 ml of 100X Penicillin/Streptomycin (PS). Store at 4 &deg;C. This media will be used for maintenance of Vero cells. 
 
Infectious Media: 2-to-1 mixture of OptiMEM and DMEM 10 %FBS 1 %PS. Store at 4 &deg;C. This media will be used during viral infections. 
 
10X Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 liter. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature. 
1X PBS: Dilute 10X PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature. 
2.5 % BSA: 2.5 g of BSA in 97.5 ml of 1X PBS. Store at 4 &deg;C. This is used as a blocking solution for IFA.
</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>

generation of recombinant arenavirus for vaccine development in fda-approved vero cells

Arenavirus ters genetik geliştirilmesi ve uygulanması arenavirus alanında 4 önemli bir atılım temsil eder. Genomları içinde önceden belirlenmiş mutasyonlar ile rekombinant bulaşıcı arenaviruses oluşturmak için yeteneği ile birlikte hücre tabanlı arenavirus Minigenom sistemlerinin kullanılması arenavirus yaşam döngüsünün farklı adımlar viral belirleyici katkısı araştırılması, hem de virüs-konak kolaylaştırmıştır etkileşimleri ve arenavirus patogenezi 1, 3, 11 mekanizmaları. Buna ek olarak, trisegmented arenaviruses geliştirilmesi ve böylece arenavirus bazlı aşı vektörü uygulamaları 5 olasılığını açılması, ilgi ek yabancı genleri ifade etmek için arenavirus genomunun kullanımına izin verdi. Aynı şekilde, ifade muhabiri genlerin yeteneğine sahip tek döngüsü bulaşıcı arenaviruses geliştirilmesi highl ilgili araştırma güvenliğini artırmak için yeni bir deneysel araç sağlary patojenik insan arenaviruses 16. Plazmid tabanlı ters genetik teknikler kullanılarak rekombinant arenaviruses üretimi bugüne kadar Gıda ve İlaç İdaresi geliştirme (FDA) lisanslı aşı veya aşı vektörleri için bazı engeller teşkil 7,19 kemirgen hücre hatlarının kullanımı, güvendi. Bu engeli aşmak için, FDA onaylı Vero hücrelerinde rekombinant arenaviruses etkin bir şekilde nesil burada açıklamak.

Bir rekombinant yabani tip arenavirus başarılı kurtarma IFA (Şekil 5) kullanılarak viral antijen varlığı ile teyit edilecektir. Trisegmented rekombinant virüsler ile ilgili olarak, başarılı virüs kurtarma floresan mikroskobu (Şekil 6A), GFP ifade gözlemleyerek değerlendirilebilir. Başarılı kurtarma daha Gluc ifade (Şekil 6B) değerlendirerek teyit edilecektir. Yabani tip ve trisegmented arenavirus başarılı bir kurtarma gösteren Örnek sonuçlar, ...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells at JoVE.com

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

Klonlanmış cDNAs, gibi genetik tersine adlandırılan bir yaklaşım, gelen rekombinant arenaviruses kurtarma araştırmacılar arenavirus biyolojisi birçok farklı yönlerine, spesifik viral gen ürünlerinin rolü, hem de onların farklı özel etki ve kalıntılarının katkısını araştırmak için izin verir . Benzer şekilde, insan patojen arenaviruses mücadele etmek için etkili ve güvenli aşıların üretimi için yeni olanaklar sağlar aşı geliştirilmesi için FDA onaylı hücre çizgileri (Vero) bölgesindeki genetik teknikleri ters.

FDA onaylı Vero hücrelerinde Aşı Geliştirme için bir araya getiren Arenavirus üretimi

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

generation-recombinant-arenavirus-for-vaccine-development-fda

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.8K Görüntüleme.  University of Rochester School of Medicine and Dentistry. Klonlanmış cDNAs, gibi genetik tersine adlandırılan bir yaklaşım, gelen rekombinant arenaviruses kurtarma araştırmacılar arenavirus biyolojisi birçok farklı yönlerine, spesifik viral gen ürünlerinin rolü, hem de onların farklı özel etki ve kalıntılarının katkısını araştırmak için izin verir . Benzer şekilde, insan patojen arenaviruses mücadele etmek için etkili ve güvenli aşıların üretimi için yeni olanaklar sağlar aşı geliştirilme...

Video: Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular matrix proteins. The precise spatiotemporal activation of integrins from a low affinity state to a high affinity state at the cell leading edge is important for T lymphocyte migration 1. Likewise, retraction of the cell trailing edge, or uropod, is a necessary step in maintaining persistent integrin-dependent T lymphocyte motility 2. Many therapeutic approaches to autoimmune or inflammatory diseases target integrins as a means to inhibit the excessive recruitment and migration of leukocytes 3. To study the molecular events that regulate human T lymphocyte migration, we have utilized an in vitro system to analyze cell migration on a two-dimensional substrate that mimics the environment that a T lymphocyte encounters during recruitment from the vasculature. T lymphocytes are first isolated from human donors and are then stimulated and cultured for seven to ten days. During the assay, T lymphocytes are allowed to adhere and migrate on a substrate coated with intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), a ligand for integrin LFA-1, and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1). Our data show that T lymphocytes exhibit a migratory velocity of ~15 &mu;m/min. T lymphocyte migration can be inhibited by integrin blockade 1 or by inhibitors of the cellular actomyosin machinery that regulates cell migration 2.

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

T lymphocyte migration occurs during homing to lymphoid organs, exit from the vasculature, and entering into peripheral tissues. Here, we describe a protocol that can be used to analyze T lymphocyte migration in vitro.

Göç İnsan T Lenfosit İzolasyon, Kültür ve Analiz In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

Plazmid DNA Rekombinant Grip Virüsü Üretimi

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H mice using ALDEFLUOR/ALDH as a marker, and tested their immunogenicity using the cell lysate as a source of antigens to pulse dendritic cells (DCs). DCs pulsed with ALDHhigh CSC lysates induced significantly higher protective antitumor immunity than DCs pulsed with the lysates of unsorted whole tumor cell lysates in both models and in a lung metastasis setting and a s.c.&#160;tumor growth setting, respectively. This phenomenon was due to CSC vaccine-induced humoral as well as cellular anti-CSC responses. In particular, splenocytes isolated from the host subjected to CSC-DC vaccine produced significantly higher amount of IFN&#947; and GM-CSF than splenocytes isolated from the host subjected to unsorted tumor cell lysate pulsed-DC vaccine. These results support the efforts to develop an autologous CSC-based therapeutic vaccine for clinical use in an adjuvant setting.

Evaluated in syngeneic immunocompetent hosts, cancer stem cell (CSC) based dendritic cell (DC) vaccine demonstrated significantly higher antitumor immunity than traditional DC vaccines pulsed with heterogeneous bulk tumor cells.

Melanom ve Skuamöz Kanser Kök Hücreleri Kullanılarak Yeni Bir Dendritik Hücre aşısının Üretilmesi

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, it is therefore important to have a quick and reliable way of measuring transcriptional activity in infected cells. Traditionally, transcription has been measured either by incorporation of radioactive nucleosides such as 3H-uridine followed by detection via autoradiography or scintillation counting, or incorporation of halogenated uridine analogs such as 5-bromouridine (BrU) followed by detection via immunostaining. The use of radioactive isotopes, however, requires specialized equipment and is not feasible in a number of laboratory settings, while the detection of BrU can be cumbersome and may suffer from low sensitivity.
The recently developed click chemistry, which involves a copper-catalyzed triazole formation from an azide and an alkyne, now provides a rapid and highly sensitive alternative to these two methods. Click chemistry is a two step process in which nascent RNA is first labeled by incorporation of the uridine analog 5-ethynyluridine (EU), followed by detection of the label with a fluorescent azide. These azides are available as several different fluorophores, allowing for a wide range of options for visualization.
This protocol describes a method to measure transcriptional suppression in cells infected with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12 using click chemistry. Concurrently, expression of viral proteins in these cells is determined by classical intracellular immunostaining. Steps 1 through 4 detail a method to visualize transcriptional suppression via fluorescence microscopy, while steps 5 through 8 detail a method to quantify transcriptional suppression via flow cytometry. This protocol is easily adaptable for use with other viruses.

This method describes the use of click chemistry to measure changes in host cell transcription after infection with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12. Results can be visualized qualitatively via fluorescence microscopy or obtained quantitatively through flow cytometry. This method is adaptable for use with other viruses.

Ana-Hücre RNA sentezi üzerinde Viral Enfeksiyon Etkisi Tedbir tıklayın Kimya Kullanımı

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in mice. Recently, myeloid differentiation factor 88 (MyD88) signaling was shown to be important for initial T cell priming and memory T cell development during WNV NS4B-P38G mutant infection. In this study, two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and an intracellular cytokine staining (ICS) &#8211; were utilized to assess dendritic cells (DCs) and T cell functions. In the T cell priming assay, cell proliferation was analyzed by flow cytometry following co-culture of DCs from both groups of mice with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) - labeled CD4+ T cells of OTII transgenic mice. This approach provided an accurate determination of the percentage of proliferating CD4+ T cells with significantly improved overall sensitivity than the traditional assays with radioactive reagents. A microcentrifuge tube system was used in both cell culture and cytokine staining procedures of the ICS protocol. Compared to the traditional tissue culture plate-based system, this modified procedure was easier to perform at biosafety level (BL) 3 facilities. Moreover, WNV- infected cells were treated with paraformaldehyde in both assays, which enabled further analysis outside BL3 facilities. Overall, these in vitro immunological assays can be used to efficiently assess cell-mediated immune responses during WNV infection.

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

Batı Nil Virüsü Mutant Soy Enfeksiyon MyD88-aracılı Hücresel Bağışıklık Tepki Vitro Analizi

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Utilizing the Antigen Capsid-Incorporation Strategy for the Development of Adenovirus Serotype 5-Vectored Vaccine Approaches

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these traditionally modified Ad5 vectors in clinical trials could be primarily correlated with Ad5 pre-existing immunity (PEI) among the majority of the population. To promote Ad5-vectored vaccine development by solving the concern of Ad5 PEI, the innovative Antigen Capsid-Incorporation strategy has been employed. By merit of this strategy, Ad5-vectored we first constructed the hexon shuttle plasmid HVR1-KWAS-HVR5-His6/pH5S by subcloning the hypervariable region (HVR) 1 of hexon into a previously constructed shuttle plasmid HVR5-His6/pH5S, which had His6 tag incorporated into the HVR5. This HVR1 DNA fragment containing a HIV epitope ELDKWAS was synthesized. HVR1-KWAS-HVR5-His6/pH5S was then linearized and co-transformed with linearized backbone plasmid pAd5/&#8710;H5 (GL) , for homologous recombination. This recombined plasmid pAd5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 was transfected into cells to generate the viral vector Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6. This vector was validated to have qualitative fitness indicated by viral physical titer (VP/ml), infectious titer (IP/ml) and corresponding VP/IP ratio. Both the HIV epitope and His6 tag were surface-exposed on the Ad5 capsid, and retained epitope-specific antigenicity of their own. A neutralization assay indicated the ability of this divalent vector to circumvent neutralization by Ad5-positive sera in vitro. Mice immunization demonstrated the generation of robust humoral immunity specific to the HIV epitope and His6. This proof-of-principle study suggested that the protocol associated with the Antigen Capsid-Incorporation strategy could be feasibly utilized for the generation of Ad5-vectored vaccines by modifying different capsid proteins. This protocol could even be further modified for the generation of rare-serotype adenovirus-vectored vaccines.

Here, we present a protocol to generate a proof-of-principle divalent adenovirus type 5 (Ad5) vector Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 by utilizing the Antigen Capsid-Incorporation strategy. This vector was demonstrated to exhibit qualitative fitness, the capability to escape Ad5-positive sera in vitro, and the antigenicity as well as immunogenicity to the incorporated antigens.

Adenovirüs Serotipinin 5-vektörlü Aşı Yaklaşımlar Geliştirme Antijen Kapsid-Ortaklık Stratejisi kullanmak

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, including the development of immunotherapeutics. However, the techniques to identify and produce such antibodies tend to be arduous and sometimes the heavy and light chain pair of the antibodies are dissociated. Here, we describe a relatively simple, straightforward protocol to produce human recombinant monoclonal antibodies from human peripheral blood mononuclear cells using immortalization with Epstein-Barr Virus (EBV) and Toll-like receptor 9 activation. With an adequate staining, B cells producing antibodies can be isolated for subsequent immortalization and clonal expansion. The antibody transcripts produced by the immortalized B cell clones can be amplified by PCR, sequenced as corresponding heavy and light chain pairs and cloned into immunoglobulin expression vectors. The antibodies obtained with this technique can be powerful tools to study relevant human immune responses, including autoimmunity, and create the basis for new therapeutics.

Synthesis of human monoclonal antibodies is the first step in studies aimed at unraveling the pathophysiological mechanisms of auto-antibody-mediated immune responses. We have developed a protocol to generate recombinant human immunoglobulin G (IgG) monoclonal antibodies from blood sorted B cells, including B-cell isolation, antibody cloning and in vitro synthesis.

Ölümsüzleştirilmiştir Sıralama B hücrelerinden Rekombinant İnsan IgG Monoklonal Antikorlarının Üretimi

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. While virus-cell attachment can be measured through the use of virions labeled with biotin, radioactive isotopes, or fluorescent dyes, these approaches typically require high multiplicities of infection (MOI) to enable detection of bound virus. We describe a quantitative (q)RT-PCR-based assay that measures Junin virus strain Candid 1 attachment via quantitation of virion-packaged viral genomic RNA. This assay has several advantages including its extreme sensitivity and ability to measure attachment over a large dynamic range of MOIs without the need to purify or label input virus. Importantly, this approach can be easily tailored for use with other viruses through the use of virus-specific qRT-PCR reagents. Further, this assay can be modified to permit measurement of particle endocytosis and genome uncoating. In conclusion, we describe a simple, yet robust assay for highly sensitive measurement of arenavirus-cell attachment.

The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. We report a quantitative (q)RT-PCR-based assay for ultrasensitive detection and quantitation of arenavirus attachment events.

Arenavirüs hücre Ek Ölçümü için son derece hassas Deneyi

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral ...

Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, both to decipher viral replication mechanisms and to study antivirals or provide development platform for vaccines. The construction and manipulation of a reverse genetic system for a negative-strand RNA virus such as a respiratory syncytial virus (RSV), however, remains delicate and requires special know-how. The RSV genome is a single-strand, negative-sense RNA of about 15 kb that serves as a template for both viral RNA replication and transcription. Our reverse genetics system uses a cDNA copy of the human RSV long strain genome (HRSV). This cDNA, as well as cDNAs encoding viral proteins of the polymerase complex (L, P, N, and M2-1), are placed in individual expression vectors under T7 polymerase control sequences. The transfection of these elements in BSR-T7/5 cells, which stably express T7 polymerase, allows the cytoplasmic replication and transcription of the recombinant RSV, giving rise to genetically modified virions. A new RSV, which is present at the cell surface and in the culture supernatant of BSRT7/5, is gathered to infect human HEp-2 cells for viral amplification. Two or three rounds of amplification are needed to obtain viral stocks containing 1 x 106 to 1 x 107 plaque-forming units (PFU)/mL. Methods for the optimal harvesting, freezing, and titration of viral stocks are described here in detail. We illustrate the protocol presented here by creating two recombinant viruses respectively expressing free green fluorescent protein (GFP) (RSV-GFP) or viral M2-1 fused to GFP (RSV-M2-1-GFP). We show how to use RSV-GFP to quantify RSV replication and the RSV-M2-1-GFP to visualize viral structures, as well as viral protein dynamics in live cells, by using video microscopy techniques.

We describe a method for generating and amplifying genetically modified respiratory syncytial viruses (RSVs) and an optimized plaque assay for RSVs. We illustrate this protocol by creating two recombinant viruses that respectively allow quantification of RSV replication and live analysis of RSV inclusion bodies and inclusion bodies-associated granules dynamics.

Üretimi, güçlendirme ve titrasyon rekombinant solunum sinsisyal virüs

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, ...

Cell-Free Scaled Production and Adjuvant Addition to a Recombinant Major Outer Membrane Protein from Chlamydia muridarum for Vaccine Development

Subunit vaccines offer advantages over more traditional inactivated or attenuated whole-cell-derived vaccines in safety, stability, and standard manufacturing. To achieve an effective protein-based subunit vaccine, the protein antigen often needs to adopt a native-like conformation. This is particularly important for pathogen-surface antigens that are membrane-bound proteins. Cell-free methods have been successfully used to produce correctly folded functional membrane protein through the co-translation of nanolipoprotein particles (NLPs), commonly known as nanodiscs. 
This strategy can be used to produce subunit vaccines consisting of membrane proteins in a lipid-bound environment. However, cell-free protein production is often limited to small scale (&lt;1 mL). The amount of protein produced in small-scale production runs is usually sufficient for biochemical and biophysical studies. However, the cell-free process needs to be scaled up, optimized, and carefully tested to obtain enough protein for vaccine studies in animal models. Other processes involved in vaccine production, such as purification, adjuvant addition, and lyophilization, need to be optimized in parallel. This paper reports the development of a scaled-up protocol to express, purify, and formulate a membrane-bound protein subunit vaccine. 
Scaled-up cell-free reactions require optimization of plasmid concentrations and ratios when using multiple plasmid expression vectors, lipid selection, and adjuvant addition for high-level production of formulated nanolipoprotein particles. The method is demonstrated here with the expression of a chlamydial major outer membrane protein (MOMP) but may be widely applied to other membrane protein antigens. Antigen effectiveness can be evaluated in vivo through immunization studies to measure antibody production, as demonstrated here.

Cell-Free Scaled Production and Adjuvant Addition to a Recombinant Major Outer Membrane Protein from Chlamydia muridarum for Vaccine Development

This protocol describes using commercial, cell-free protein expression kits to produce membrane proteins supported in nanodisc that can be used as antigens in subunit vaccines.