Bükreş, Romanya'dan Nicolae Simionescu Hücresel Biyoloji ve Patoloji Enstitüsü'ne hoş geldiniz. Burada, Viral Transdüksiyon Laboratuvarı'nda, Profesör Vogelstein tarafından geliştirilen AdEasy sistemine dayanan optimize edilmiş bir metodoloji kullanarak adenoviral parçacık üretiminin bir kısmını gösteriyoruz. Bu adenovirüsleri üretmek için teknolojinin ana adımları, birincisi, BJ5183 bakterilerinde pAdEasy-1 plazmid ile GFP içeren pAdTrack'in yeniden birleşmesidir.
İki, adenoviral parçacıkların paketlenmesi. Üç, AD293 hücrelerinde adenovirüs amplifikasyonu. Dört, adenoviral parçacıkların hücre lisatından ve kültür ortamından arındırılması.
Beş, viral titrasyon ve adenovirüs fonksiyonel test. Burada, metodolojinin önemli bir adımını sunacağız. Adenoviral parçacıkların hücre lisatından ve kültür ortamından arındırılması.
Adenovirüslerin saflaştırılması, virüs üreten hücrelerin ve ortamın toplanmasıyla başlar. AD293 hücreleri rekombinant plazmid ile trans enfekte edildi ve adenovirüs paketlendi. Daha sonra adenovirüs art arda gelen daha büyük kültürler tarafından güçlendirildi.
Burada 25 T175 plaka elde ettik ve adenovirüslerin hücre lisatı ve kültür ortamından arındırılmasına başladık. İlk olarak, transdüklenmiş hücreler tarafından ifade edilen GFP'nin yeşil floresanını kontrol ettik. Hücreler hala bağlıysa, kültür çanağı dokunarak veya uzun bir kazıyıcı kullanarak onları ayıracağız.
Hücreler ve ortam toplanır. Şişeler, Falcon tüplerinde de toplanan PBS ile yıkanır. Hücreler santrifüjleme ile peletlenir.
Adenovirüslerin daha fazla arındırılması için hücre peletini ve ortamı saklayın. Bu adımda, hasat sürecini hızlandırmak için bir meslektaşının yardımı takdir edilir. Hücre peletı GFP ifadesi nedeniyle yeşildir.
Pelet, hücrelerin bozulmasını kolaylaştıracak hipertonik Tris tamponunda yeniden biriktirilir. Hücre lizisi için sıvı nitrojen kullanıyoruz ve kuru gaz 37 dereceye kadar ısındı. Virüs zarar görene kadar üçten fazla döngü yapmayın.
Hücre bozulmasının verimliliğini artırmak için hücre homojenizesini 23 kalibrelik bir şırınga iğnesi ile dikkatlice geçirin. Hücre lisatını 9.600 x g'da 12 dakika santrifüjleyin. Süpernatant'ı yeni tüplere geçirin ve peletleri atın.
Ultracentrifuge ile daha fazla işlem için süpernatantı buz üzerinde tutun. Şimdi, hücrelerden salınan adenovirüsü izole etmek için kültür ortamını işliyoruz. Bunun için öncelikle gerekli miktarda amonyum sülfat ağırlıklandırıp kültür ortamının toplandığı şişeye ekliyoruz.
Şişe, kristaller tamamen çözünene kadar kuvvetlice çalkalanır. Karışım oda sıcaklığında iki saat ve yarım boyunca inkübe edilir. Daha sonra çökeltmenin süspansiyonu Falcon tüplerine ayrılır.
1,600 x g'da 15 dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, süpernatant atılır ve pelet 10 milimolar Tris tamponunda yeniden atılır. Adenovirüsun saflaştırılmasına ultrasantrifüjleme adımı ile devam edilemezse, çökelti dört derecede birkaç gün tutulabilir, ancak sadece amonyum sülfatın çıkarılması için diyalizden sonra.
Burada diyaliz adımını sunduk. Süspansiyonu daha önce ıslanmış bir kasete sokmak için şırınna kullanıyoruz. Numuneler dört derecede bir gecede 10 milimolar Tris tampona karşı çaprazlanmıştır.
Saflaştırmanın son adımı, sezyum klorür süreksiz gradyanı üzerindeki ultracentrifugation adımı ile temsil edilir. Gradyanı oluşturmak için, ilk olarak, yüksek yoğunluklu sezyum klorür çözeltisinin üç mililitresini pipetleye alıyoruz. Bu tabakanın üzerine, üç mililitre düşük yoğunluklu sezyum klorür dökün.
Hücre lisatından veya kültür ortamından adenoviral parçacık süspansiyonu daha sonra gradyanın üzerine bindirilir. Tüpler mineral yağ ile doldurulur ve SW41 kovalarında tanıtılır. Dengeden sonra, tüpler ultrasantrifüjde tanıtılan rotora simetrik olarak yüklenir.
Santrifüj, 18 saat boyunca 35.000 RPM ve dört derece ara vermeden çalışır. Ultrasantrifüjlemeden sonra, tüpler bantları hasat etmek için arkasında siyah bir kağıt bulunan bir standa yerleştirilir. Temiz üst faz ve hücre kalıntıları, ağartma çözeltisi ile bir atık konteynerinde atılır.
Tam adenovirüs içeren en düşük bant pipet ucu ile hasat edilir ve steril bir Eppendorf tüpünde toplanır. Diyalizden sonra, viral süspansiyona% 4 son konsantrasyona sakkaroz eklenir ve viral aliquot eksi 80 derecede dondurulur. Sonuçlar bölümünde, elde edilen adenovirüs ile transdüklenmiş hücrelerde GFP ekspresyonını gösterdik.
Transdüksiyondan 48 saat sonra GFP, floresan mikroskopi ile gösterildiği gibi transdüklenmiş hücreler tarafından ifade edilir. GFP ekspresyon hücrelerinin yüzdesi akış sitometrisi ile belirlenir. Hücre başına 25 transdüksiyon ünitesi ile transdüklenen insan ve sığır endotel hücrelerinin yaklaşık %50'si GFP pozitiftir.
Hücre başına sadece beş transdüksiyon ünitesi kullanıldığında murine hepatositler için aynı transdüksiyon verimi elde edilmiştir, ancak bu hücre duyarlılığı nedeniyle daha yüksek mortalite ile ilişkilidir. Spesifik reseptörlerin düşük ekspresyasyonu nedeniyle mezenkimal stromal hücrelerin transdüksiyonu ile GFP ekspresyona indirgenmiştir. Sonuç açıklamalar.
Adenoviral parçacıkları elde etmek için gereken süreyi, maliyetleri ve çabayı azaltmak için bu zahmetli teknolojiyi optimize ediyoruz. Hazırlanan adenovirüs çeşitli hücre tiplerini enfekte edebilir ve ilgi geninin ekspresyonunun indüklesini sağlayabilir.
