Aşağıdaki protokol özetleyen bir örnek için Şekil 1&#39;e bakınız. Emniyet Not: monte viral parçacıkların temas halinde olan tüm malzeme Virkon ® çözümü ya da diğer uygun bir dezenfektan ile dezenfekte edilmesi gerekir. 1. Plazmid DNA stoklarının hazırlanması (~ 2 gün) <ol><li> Aşağıdaki plazmid 1 gereklidir: <ul><li> pRV1 - AAV2 Tecrübe ve kap dizileri İçeren </li><li> pH21 - AAV1 Tecrübe ve kap dizileri içeren </li><li> pFdelta6 - Adenovirüs yardımcı plazmid </li><li> AAV2 ambalaj sinyalleri (ters terminali tekrarlar, ITRs) ile çevrili rekombinant ifade kaset içeren plazmid AAV </li></ul></li><li> PFdelta6 kısmi silinmesini önlemek için Stbl2 yetkili hücrelerde yetişen olmalıdır, pRV1 ve pH21 DH5alpha yetkili hücreleri yetiştirilebilir. AAV plazmid kısmi silmeler DH5alpha hücrelerinde meydana gelmesi halinde Stbl2 hücreleri yetiştirilebilir. </li><li>Plazmid DNA yüksek kaliteli ve RNA yabancı maddelerden arındırılmış olmalıdır. Plazmidler bütünlüğü için aşağıdaki digests kullanarak taranabilen: <ul><li> pRV1 - Özet XbaI ile 7.5 kb ve 3.8 kb bantları vermek </li><li> pH21 - sindirmek EcoRI ile 4.5 kb bant, 2.8 kb ve 0.2 kb vermek </li><li> pFdelta6 - HindIII ile sindirimi 5.5 kb bant, 3 kb, 3 kb, 2.3 kb ve 1.5 kb vermek </li></ul></li></ol> 2. (3 gün 2) transfeksiyon İnsan Embriyonik Böbrek 293 (Hek293) hücreleri hazırlanması <ol><li> Tabak iki adet 80% konfluent 150 cm 2 şişeler içine Hek293 hücreleri beş 15 cm çapında Nunc doku kültürü yemekleri. Hücreler 70 -% 80 (yaklaşık 48 saat sonra kaplama) transfeksiyon önce konfluent. % 10 fetal buzağı serumu ve 100 U / ml penisilin / 100 mikrogram / ml streptomisin içeren düşük glikoz ile standart Dulbecco&#39;nun modifiye Eagle orta (DMEM) Kültür hücreleri. </li><li> 3 saat önce transfeksiyon DMEM kaldırın ve Iscove değiştirin&#39;Ler modifiye Dulbecco&#39;nun orta (IMDM) fetal buzağı serumu,% 5 içeren. </li></ol> 3. Viral plazmid Transfeksiyon (transfeksiyon ~ 1 saat, 3 gün inkübasyon) <ol><li> (5 x 15 cm doku kültürü plakaları) virüsü tek bir toplu iş için aşağıdaki hazırlayın: <ul><li> Plazmid 62.5 mikrogram AAV </li><li> 125 mg pFdelta6 </li><li> 31.25 mg pRV1 </li><li> 31.25 mg pH21 </li><li> 1650 ul 2.5 M CaCl 2 </li><li> 12 ml dH 2 O </li></ul></li><li> 50 ml&#39;lik bir tüp içine sınıfı 2 doku kültürü kaput steril filtre transfeksiyon karışımı. </li><li> Çözüm vorteks olsa da, hızlı bir şekilde 13 ml 2 x Hepes tamponlu salin (pH 7.05). 50 ml tüp kapağını değiştirin ve 15 saniye boyunca girdap devam. 1 dakika 45 saniye bekletilir, ince beyaz bir çökelti oluşturması gerekir. </li><li> , Yavaşça, her biri 15 cm doku kültürü çanak transfeksiyon çözüm 5 ml ekleyin. Swirl plakaları karıştırın ve inkübatör dönmek. </li><li> 16 saat sonra transfeksiyon IMDM orta kaldırmak ve DMEM ile değiştirin. </li></ol> 4. (2 saat) hücreleri, Parçalama ve rAAVs hasadı <ol><li> Transfeksiyon 72 saat sonra, hücre kültürü plakaları, ortamı çıkarın ve atın. Tüm atık Virkon ® çözümü ya da diğer uygun bir dezenfektan ile tedavi edilmelidir. </li><li> Hücreler yavaşça sıcak 1x fosfat yıkama tamponlu salin (PBS, pH 7.4). </li><li> Her plaka için 25 ml sıcak PBS ekleyin ve bir hücre kazıyıcı ile hücreler yavaşça çıkarın. 50 ml tüpler süspansiyon toplayın. </li><li> 10 dakika boyunca 800 xg&#39;de Pelet hücreleri. </li><li> NaCl 150 mM, 20 mM Tris, pH 8.0 süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet atın, doku kültürü plaka başına 10 ml kullanın. Iki adet 50 ml tüpler böler. </li><li> DH 2 O% 10 sodyum deoksikolatın taze bir çözüm hazırlayın Bu 1.25 ml,% 0.5 &#39;lik son konsantrasyon için her tüp ekleyin. Ml başına 50 adet nihai konsantrasyonu Benzonase nükleaz ekleyin. Tüp iyice karıştırın. </li><l&gt; 37 ° ° C&#39;de 1 saat süreyle. </li><li> 15 dakika boyunca 3000 xg santrifüj hücresel enkaz çıkarın. Taze 50 ml tüp geçiş, tüm hücre enkaz (Adım 5&#39;e bakınız), heparin sütun engellenmesini önlemek için çıkarıldığından emin olun. Bu aşamada devam etmeden önce, numuneler -20 ° C&#39;de saklanabilir. Biz enfektivite bir azalma olmadan örnekleri -20 ° C&#39;de birkaç hafta boyunca saklanan var. </li></ol> 5. Heparin sütun rAAVs, arıtma (2 - 3 saat) <ol><li> Çözümler akış, 5.2 - 5.4 için gerekli adımları dakikada 1 ml sütun ile peristaltik bir pompa kullanarak Kur HiTrap heparin sütun. Hiç hava kabarcığı heparin sütuna tanıtıldı sağlamak için önemlidir. </li><li> 10 ml 150 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8.0 ile sütun dengelenmesi. </li><li> 50 ml virüs çözümü için sütun uygulayın ve akmasına izin verin. </li><li> 20 ml 100 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8.0 ile sütun yıkayın. </li><li> 5 ml şırınga kullanarak sütun w yıkama devam1 ml 300 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8.0 ile takip ITH 1 ml 200 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8.0,. Flow-through atın. </li><li> Uygulayarak sütun 5 ml şırınga ve hafif basınç Zehir virüs kullanma: <ul><li> 1.5 mL 400 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8.0 </li><li> 3,0 ml 450 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8.0 </li><li> 1.5 mL 500 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8.0 </li><li> 15 ml santrifüj tüpüne bu toplayın. </li></ul></li></ol> 6. Konsantrasyon ve rAAVs steril filtrasyonu (1 saat) <ol><li> 100.000 molekül ağırlığı kesme Amicon ultra-4 santrifüj filtre üniteleri kullanarak vektör Konsantre. 2 dakika için 2000 xg (oda sıcaklığında) 4 ml sütun eluat konsantratör ve santrifüj içine yükleyin. Kalan virüs çözümü ve tekrar santrifüj flowthrough ve yeniden konsantratör atın. Konsantre hacmi yaklaşık 250 ul olmalıdır. Konsantre hacmi göre anlamlı derecede daha fazla ise, akış t iptalaşma ve bir dakikalık adımlarla hacmi yaklaşık 250 ul kadar santrifüj devam etmektedir. </li><li> PBS 250 ul 500 ul son bir hacim için virüs ve konsantratör kaldırmak. </li><li> 13 mm çapı 0,2 mikron şırınga filtresi süzülür vektör. Vektör ° C &#39;ye kadar gerekli -80 aliquoted ve saklanan olmalıdır. </li></ol> 7. Viral stoklarının Titering (3 gün) Bu, bir muhabir gen ya da immunocytochemically saptanabilir bir gen ürünü sürüş Hek293 hücreleri aktif bir organizatörü gerektirir. Hek293 hücreleri diğer hücre hatları veya primer hücre kültürleri ile uyumlu değildir üreten bir vektör. <ol><li> % 50 confluent - 40 böylece Hek293 hücrelerin ekim tarafından 18 poli-L-lisin kaplı cam lamelleri ya da 18 kuyu Nunc oda slaytlar hazırlayın. Kre-bağımlı rAAVs titrasyonu için, stabil bir şekilde ifade Cre recombinase 2 Hek293 hücreleri kullanır. </li><li> Seri d her iyi enfekteAAV vektör (Şekil 2A) ilutions. Başına 3 kuyu seyreltme kullanın. Biz rutin olarak her bir kuyu için doğrudan virüs eklemek. </li><li> 72 saat on dakika oda sıcaklığında (son konsantrasyon% 2 PFA veren) orta,% 4 paraformaldehid bir eşit hacimde (PFA) ekleyerek Hek293 hücreleri düzelttikten sonra. </li><li> DH 2 O ve kapak hücre PBS içinde üç kez yıkayın, durulayın. </li><li> Seyreltme faktörü yüksek olan üç kuyu, transduced hücrelerinin sayısını ancak hala enfekte olan hücreleri içeren bu ortalama ve mikrolitrelik başına enfeksiyöz birim (Şekil 2B) sayı vermek seyreltme faktörü ile çarpın. </li></ol> 8. Beklenen Sonuçlar Hek293 hücreleri gelişmiş yeşil flüoresan protein (eGFP) Şekil 2B gösterilen bir virüs kodlama ile transduced. Biz genellikle mikro litre başına yaklaşık 6 x 10 6 enfeksiyöz partiküller tutarlı titreleri elde. Biz rutin stereotaksik inje için bu vektörleryetişkin kemirgen beyin içine ction. Bu bölgeye özgü gen ekspresyonu 2 için güçlü bir teknik sağlar. Kre-transgenik fareler 2 hedef bölgeye Cre recombinase bağımlı rAAVs enjekte hücre tipi seçici gen ekspresyonu ile bu bölgede özgüllük birleştirmek için. Şekil 2C-E yetişkin parvalbumin-Cre transgenik farelerin 3 farklı beyin bölgeleri içine eGFP kodlama Cre bağımlı rAAVs stereotaksik enjeksiyonları örnekler gösterir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3348/3348fig1.jpg" /> Şekil 1 rAAV üretimi için protokol şematik gösterimi. 1) Hek293 hücre kaplama ve 70 büyüdü - 80% izdiham. 2.) AAV ve yardımcı plazmid hazırlanan ve Hek293 hücre içine transfekte. 3.) Orta transfeksiyon sonra DMEM 16 saat geri ve Hek293 hücreler 56 saat başka bir kültüre. 4.) Hek293 hücre hasat ve parçalanmış olan. c rAAV vektörlerin hücre enkaz ayrılırentrifugation. 5.) Viral partiküller konsantrasyon ve sterilizasyon önce heparin sütunları ile temizlenir. 6) Hek293 hücreleri 24 kuyucuğu büyüdü ve bulaşıcı birimlerinin sayısını belirlemek için AAV vektör seri dilüsyonları ile enfekte. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3348/3348fig2.jpg" /> Şekil 2 Titering ve rAAV1 / 2 in vivo uygulama. Viral titresi ölçmek için Hek293 hücreleri (A) Kurulum. RAAVs seri dilüsyonları ile Hek293 hücreleri transduced. C, enfekte olmamış kontrolü; N, sulandırılmamış viral stokunun 1 ul. (B) Hek293 hücreleri eGFP ifade rAAVs etkilemiştir. (CE) Viral eGFP ifade sınırlıdır Cre ifade Cre-aktif rAAVs stereotaksik enjeksiyondan sonra parvalbumin-Cre transgenik farelerin farklı hedef bölgelerdeki nöronlar. Örnekler görüntüleri (C) retiküler talamus ve globus pallidus GFP immünoreaktivite, (D) dentat girus ve hipokampus (E) CA1 bölge. DG, DEntate girus, RT, retiküler talamik nükleus, GP, globus pallidus. Ölçek barlar: B, 500 mm; C, 100 mm; D, 100 mm; E, 500 mm.

<ol>
	<li>Klugmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-mediated+hippocampal+expression+of+short+and+long+Homer+1+proteins+differentially+affect+cognition+and+seizure+activity+in+adult+rats.">AAV-mediated hippocampal expression of short and long Homer 1 proteins differentially affect cognition and seizure activity in adult rats.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 28, 347-360 (2005).</li><li>Murray, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parvalbumin-positive+CA1+interneurons+are+required+for+spatial+working+but+not+for+reference+memory.">Parvalbumin-positive CA1 interneurons are required for spatial working but not for reference memory.</a> Nature Neuroscience. 14, 297-299 (2011).</li><li>Hippenmeyer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+switch+in+the+response+of+DRG+neurons+to+ETS+transcription+factor+signaling.">A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling.</a> PLoS Biology. 3, e159-e159 (2005).</li><li>Hauck, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+chimeric+recombinant+AAV+vectors.">Generation and characterization of chimeric recombinant AAV vectors.</a> Molecular Therapy. 7, 419-425 (2003).</li><li>Halbert, C. L., Allen, J. M., Miller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+type+6+(AAV6)+vectors+mediate+efficient+transduction+of+airway+epithelial+cells+in+mouse+lungs+compared+to+that+of+AAV2+vectors.">Adeno-associated virus type 6 (AAV6) vectors mediate efficient transduction of airway epithelial cells in mouse lungs compared to that of AAV2 vectors.</a> Journal of Virology. 75, 6615-6615 (2001).</li><li>Blankinship, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transduction+of+skeletal+muscle+using+vectors+based+on+adeno-associated+virus+serotype+6.">Efficient transduction of skeletal muscle using vectors based on adeno-associated virus serotype 6.</a> Molecular Therapy. 10, 671-678 (2004).</li><li>Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+amino+acid+changes+can+influence+titer,+heparin+binding,+and+tissue+tropism+in+different+adeno-associated+virus+serotypes.">Single amino acid changes can influence titer, heparin binding, and tissue tropism in different adeno-associated virus serotypes.</a> Journal of Virology. 80, 11393-11397 (2006).</li><li>Dong, J. Y., Fan, P. D., Frizzell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+the+packaging+capacity+of+recombinant+adeno-associated+virus.">Quantitative analysis of the packaging capacity of recombinant adeno-associated virus.</a> Human gene therapy. 7, 2101-2112 (1996).</li><li>Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+purification+of+serotype+1,+2,+and+5+recombinant+adeno-associated+viral+vectors.">Production and purification of serotype 1, 2, and 5 recombinant adeno-associated viral vectors.</a> Methods. 1, 158-167 (2002).</li><li>Burova, E., Loffe, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatographic+purification+of+recombinant+adenoviral+and+adeno-associated+viral+vectors:+methods+and+implications.">Chromatographic purification of recombinant adenoviral and adeno-associated viral vectors: methods and implications.</a> Gene Therapy. 12, 5-17 (2005).</li><li>Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+adeno-associated+virus+purification+using+novel+methods+improves+infectious+titer+and+yield.">Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield.</a> Gene Therapy. 6, 973-985 (1999).</li><li>Bilbao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+gene+expression+from+in+utero+delivery+of+adenoviral-associated+vector+serotype+1.">Patterns of gene expression from in utero delivery of adenoviral-associated vector serotype 1.</a> Human Gene Therapy. 16, 678-684 (2005).</li><li>Pilpel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=reproducible+transduction+of+select+forebrain+regions+by+targeted+recombinant+virus+injection+into+the+neonatal+mouse+brain.">reproducible transduction of select forebrain regions by targeted recombinant virus injection into the neonatal mouse brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 182, 55-63 (2009).</li><li>Mastakov, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+injection+of+rAAV+with+mannitol+enhances+gene+expression+in+the+rat+brain.">Combined injection of rAAV with mannitol enhances gene expression in the rat brain.</a> Molecular Therapy. 3, 225-232 (2001).</li><li>Fu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-complementary+adeno-associated+virus+serotype+2+vector:+global+distribution+and+broad+dispersion+of+AAV-mediated+transgene+expression+in+mouse+brain.">Self-complementary adeno-associated virus serotype 2 vector: global distribution and broad dispersion of AAV-mediated transgene expression in mouse brain.</a> Molecular Therapy. 8, 911-917 (2003).</li><li>Ghosh, A., Yue, Y., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Transgene+Reconstitution+with+Hybrid+Dual+AAV+Vectors+Carrying+the+Minimized+Bridging+Sequences.">Efficient Transgene Reconstitution with Hybrid Dual AAV Vectors Carrying the Minimized Bridging Sequences.</a> Human Gene Therapy. 22, 77-83 (2011).</li><li>McCarty, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-complementary+AAV+vectors;+advances+and+applications.">Self-complementary AAV vectors; advances and applications.</a> Molecular Therapy. 16, 1648-1656 (2008).</li><li>Georgiadis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-mediated+knockdown+of+peripherin-2+in+vivo+using+miRNA-based+hairpins.">AAV-mediated knockdown of peripherin-2 in vivo using miRNA-based hairpins.</a> Gene Therapy. 17, 486-493 (2010).</li><li>Atasoy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FLEX+switch+targets+Channelrhodopsin-2+to+multiple+cell+types+for+imaging+and+long-range+circuit+mapping.">A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping.</a> The Journal of Neuroscience. 28, 7025-7030 (2008).</li><li>Guggenhuber, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV+Vector-Mediated+Overexpression+of+CB1+Cannabinoid+Receptor+in+Pyramidal+Neurons+of+the+Hippocampus+Protects+against+Seizure-Induced+Excitoxicity.">AAV Vector-Mediated Overexpression of CB1 Cannabinoid Receptor in Pyramidal Neurons of the Hippocampus Protects against Seizure-Induced Excitoxicity.</a> PLoS One. 5, e15707-e15707 (2010).</li><li>Lawlor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+delivery+and+selective+transduction+of+glial+cells+in+the+mammalian+brain+by+AAV+serotypes+isolated+from+nonhuman+primates.">Efficient gene delivery and selective transduction of glial cells in the mammalian brain by AAV serotypes isolated from nonhuman primates.</a> Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17, 1692-1702 (2009).</li><li>Chtarto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetracycline-inducible+transgene+expression+mediated+by+a+single+AAV+vector.">Tetracycline-inducible transgene expression mediated by a single AAV vector.</a> Gene Therapy. 10, 84-94 (2003).</li><li>Han, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+humoral+immune+response+to+the+tetracycline+(Tet)+activator+in+rats+injected+intracranially+with+Tet-off+rAAV+vectors.">Lack of humoral immune response to the tetracycline (Tet) activator in rats injected intracranially with Tet-off rAAV vectors.</a> Gene Therapy. 17, 616-625 (2010).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

rAAV vektörlerin in vivo hayvan çalışmaları için giderek daha değerli hale gelmektedir. Burada, yaygın uygulama bu yararlı vektör virüs üretimin yüksek maliyetli dış kaynak şirketleri kaçınarak kolaylaştırabilir, üretmek rAAVs için basit ve ucuz bir protokol tanımlanmıştır. Protokolü (referans 1) eşit oranları 4 her iki ebeveyn serotipleri kapsid proteinleri içeren kimerik rAAV1 / 2 vektörler üretimi açıklar. RAAV vektörlerin heparin sütunlar bağlanarak arıtma AAV2 kapsid proteinleri ifade dayanmaktadır, ancak, burada belirtilen AAV1 daha diğer serotipleri ile kombine edilebilir. Ayrıca, AAV6 azaltılmış bir yakınlığa sahip olmakla birlikte, heparin bağlamak için bildirilmiştir, ve potansiyel olarak bu prosedürü 5,6 kullanarak heparin sütunları ile temizlenmiş olabilir . Diğer serotipler heparin sütun elüsyon 5,7 için farklı konsantrasyonlarda NaCl gerektirdiğini, ancak unutulmamalıdır. Ambalaj rAAV genomların 5.2 kb 8 paketleme verimliliği keskin bir düşüş ile 4.1 ve 4.9 kb arasında en iyi olduğu gösterilmiştir. Transgen ekspresyonu hücre tipi özel düzenleme genellikle küçük AAV parçacıklar içinde yer öğeleri oyunculuk büyük cis ile elde edilir bu yana ambalaj sınırı, rAAV sisteminin en büyük dezavantajı olarak kabul edilebilir. Biz yerine PBS ekleyerek adım 6.3 &#39;de belirtildiği gibi, bir 500 ul toplu, 250 ul kadar konsantre ayrı viral toplu birleştirerek AAV ambalaj sınırına yakın paket genler çalışmadan kaynaklanan gibi düşük titreye toplu üstesinden gelmek için. Güvenilir hücre türüne özgü transdüksiyon Cre sürücü fareler ve ambalaj sınırına uzanan önlemek için koşullu rAAV kaset (aşağıya bakınız) birleştirerek elde edilebilir. Unutmayın ki, bu protokol yüksek t üretimi kolay takip talimatları vermek için çalışır ikeniter rAAV, heparin afinite kromatografisi ile saflaştırılması için AAV2 kapsid protein moieties varlığını gerektirir. Daha AAV2 diğer serotipleri alternatif prosedürleri kullanarak 9 arındırılmalıdır. Heparin sütun arınma bir avantajı sezyum klorür degrade 10 kullanılarak üretilen bu daha yüksek bulaşıcılık oranını AAV vektörler üretmek olduğuna inanılmaktadır. Ancak, bu yöntem bazı dezavantajları da vardır. Örneğin, heparin bağlayan diğer proteinleri de saflaştırılmış viral stokta mevcut olabilir. Heparin saflaştırılmış vektörlerin tropizm vektör titresi 10, özellikle 20 eksitatör veya inhibitör nöronlar (Şekil 2) ya hedef yaklaşımı etkilemiş olabilir AAV-aracılı transgen ifade Cre indüklenmiş aktivasyon istihdam ve titre-bağımsızdır. Heparin sütun arıtma için alternatif bir kullanımı daha yüksek bir viral titresi ve saf hazırlık üreten bir iodixanol yoğunluk gradiyenti kullanımı,10 sezyum klorür degrade. Bu yöntem ayrıca,% 99 oranında saf 11 daha büyük bir vektör üretmek için heparin sütun arıtma ile kombine edilebilir . Bu nedenle, dikkatli bir göz, kendi özel alt uygulama için en iyi olan viral arıtma yöntemi olarak bireysel gruplar tarafından alınması gerekir. Bu protokol ile ilgili en sık karşılaşılan sorun, düşük viral titresi. Deneyimlerimize göre bu durum genellikle, düşük transfeksiyon verimlilik, virüs veya heparin sütunlarından elüsyon takip edilebilir. Tüm transfeksiyon malzemelerin transfeksiyon önce oda sıcaklığında olmalıdır ve her laboratuar için en uygun koşulları bulmak için testi transfections yapılmalıdır. Transfeksiyon diğer yöntemler gibi lipofectamine, son derece verimli, ancak çok pahalı olabilir. Ayrıca, heparin sütun elüsyon çözümleri konsantrasyonu ve pH, heparin sütun witho virionlar tam olarak yürütülmesi için kritik öneme sahiptirut zarar. Bir diğer önemli nokta, ambalaj hücreleri, doku kültürü yemekleri yüzey iyi davranmanız gerekir. Hücreler işlem sırasında bazı aşamada ayırmak deney ve defrost hücrelerin yeni bir flakon sonlandırmak için tavsiye edilir. Kemirgenler transgen ekspresyonu uzay-zamansal kontrol doğru anatomik hedefleme ve hayvan gelişim aşamasında kolayca elde edilir. Verimli AAV-aracılı gen transferi, in utero 12,13 gösterilmiştir . Yetişkin beyin, stereotaksik enjeksiyondan sonra rAAV parçacıkları ile enfekte alanı sadece viral titresi değişiklikleri değil, aynı zamanda enjeksiyon parametrelerini değiştirerek çok daha geniş alanları çok küçük bir hedef bölgeler, ayarlanabilir. Bu hacim ve hız enjeksiyon ve virüs süspansiyonu 14 poliol mannitol dahil içerir. Mannitol ayrıca, çeşitli sistemik rAAV enjeksiyon 15 sonra dokuların bir enfeksiyon geliştirmek için kullanılabilir &lt;/&gt; Destek. RAAV (yaklaşık 4.7 kb) paketleme kapasitesi muhtemelen bu viral vektörlerin ifade edilebilir genler açısından en sınırlayıcı faktör. Ancak, son çalışmalar, bu kısmen ayrı rAAV vektörlerin büyük bölme genler veya ifade kasetleri üstesinden gelmek ve virionlar aynı hücrede 16 enfekte gen ekspresyonu başlatırken, bir köprü dizisi tanıtan olduğunu göstermiştir . RAAV vektörler tarafından taşınan genlerin ekspresyon düzeyleri de büyük ölçüde kendi kendine ücretsiz rAAV vektörler kullanarak 17 artabilir. RAAV vektörlerin Stereotaksik enjeksiyon, bölgeye özgü bir şekilde gen ekspresyonu inducing için hızlı, ucuz ve güçlü bir yöntem sağlar. 2. nesil RNA girişim stratejileri ile kombinasyon halinde 18 rAAVs da bölgeye özgü gen vurmak için kullanılan olabilir. rAAVs devre ve hücre tipi ulaşmak için Cre-transgenik fareler ya da hücre tipi özel rehberleri ile kombine edilebilirÖrneğin tet sistemi ile montaj rAAVs virüs aracılı gen ekspresyonu 22,23 üzerinden geçici denetimi ekler, yüksek uzaysal çözünürlüğü 2,19-21 ile genetik manipülasyonlar izin özgü gen ekspresyonu Bu örnekler, bu vektörlerin Kombinatoryal muazzam potansiyeli göstermek ve rAAV tabanlı çalışmalar gelecek yıl içinde hızlı bir artış tahmin ediliyor.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Amicon ultra santrifüj filtreleri </td><td> Millipore </td><td> UFC810024 </td><td> 100.000 MWCO </td></tr><tr><td> Benzonase nükleaz </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E1014 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbeco modifiye Eagle ortamında (DMEM) </td><td> Invitrogen </td><td> 10567014 </td><td> % 10 FCS ve 10 ünite / ml penicillin/100 mcg / ml streptomisin ile Ek </td></tr><tr><td> Hek293 hücreleri </td><td> Amerikan tipi kültür toplama </td><td> CRL-1573 </td><td> Geçit az 30 </td></tr><tr><td> Hepes tamponlu salin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 51558 </td><td></td></tr><tr><td> HiTrap Heparin kartuşu </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 54836 </td><td></td></tr><tr><td> Iscove modifiye Dulbecco&#39;nun orta </td><td> Invitrogen </td><td> 12440-053 </td><td> % 5 FCS ile Ek </td></tr><tr><td> Sodyum deoksikolatın </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D5670 </td><td> Her seri için taze solüsyon </td></tr><tr><td> 15 cm Doku kültürü yemekleri </td><td> Fisher Scientific </td><td> 157150 </td><td></td></tr><tr><td> Stbl2 yetkili hücre </td><td> Invitrogen </td><td> 10268-019 </td><td></td></tr><tr><td> Virkon ® çözümü </td><td> Fisher Scientific </td><td> NC9821357 </td><td> Atarak drenaj önce bir gecede dezenfekte bırakın </td></tr></tbody></table> Tablo 1: Özel reaktifler protokol için gerekli

production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors

Son yıllarda rekombinant adeno-ilişkili viral vektörler (AAV) hayvanlarda in vivo çalışmalar için giderek daha değerli hale gelmiştir ve insan klinik çalışmalarda da şu anda test edilmektedir. Wild-tip AAV bir patojen olmayan Parvoviridae aile üyesi ve doğal olarak çoğaltma eksikliği. Geniş transdüksiyon profili, düşük immün yanıtın yanı sıra, bu vektörler ile elde güçlü ve kalıcı transgen ekspresyonu in vitro ve in vivo gen teslimat için popüler ve çok yönlü bir araç yaptı. rAAVs kolay ve ucuza laboratuvarda üretilen ve onların uygun bir güvenlik profili dayalı olabilir, genellikle düşük bir güvenlik sınıflandırması verilmiştir. Burada, biz, hem de AAV1 ve AAV2 kapsid proteinleri içeren kimerik rAAVs üretim ve titering için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu sözde kimerik vektörlerin kullanımı gibi yüksek titreleri hisse senetleri (AAV1) ve saflaştırma olarak her iki ebeveyn serotiplerinin faydalarını bir araya getirenafinite kromatografisi (AAV2). Bu AAV serotipleri AAV serotipleri en iyi incelenen ve bireysel geniş bir infeksiyözitesi deseni var. Burada açıklanan kimerik vektörler AAV1 ve AAV2 bulaşıcı özelliklere sahip olmalı ve bu nöronlar, iskelet kası, pankreas, diğerlerinin yanı sıra böbrek de dahil olmak üzere geniş bir ürün yelpazesi, dokuların enfekte olması beklenebilir. Burada anlatılan yöntemi, heparin sütun arıtma kullanan, bir yöntem, sezyum klorür degrade yoluyla santrifüj gibi diğer arıtma yöntemleri, daha yüksek bir viral titresi ve temiz viral hazırlık vermek inanıyordu. Ayrıca, bu vektörlerin hızlı ve kolay bir şekilde üretilen bulaşıcı parçacıkların sayısını doğru okuma titre nasıl açıklanmaktadır.

Watch this Scientific Journal Video about Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors at JoVE.com

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

Rekombinant adeno-ilişkili virüs (rAAVs) vektörleri için giderek daha değerli hale geliyor<em&gt; In vivo</emHayvanlar üzerinde yapılan çalışmalar. Biz rAAVs laboratuvar ortamında üretilmiş olabilir ve bu vektörlerin nasıl üretilen bulaşıcı parçacıkların sayısını doğru bir okuma vermek titre edilebilir açıklar.

Rekombinant Adeno ilişkili Viral Vektörlerin Üretimi ve Titering

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

production-and-titering-of-recombinant-adeno-associated-viral-vectors

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

61.4K Görüntüleme.  University of Aberdeen. Rekombinant adeno-ilişkili virüs (rAAVs) vektörleri için giderek daha değerli hale geliyor In vivo

Video: Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control of a heterologous expression system to facilitate the analysis of the resulting phenotype. This approach can be used to express a gene that is not normally found in the organism, to express a mutant form of a gene product, or to over-express a dominant-negative form of the gene product. It is particularly useful in the study of the hematopoetic system, where transcriptional regulation is a major control mechanism in the development and differentiation of B cells 1, reviewed in 2-4.
Mouse genetics is a powerful tool for the study of human genes and diseases. A comparative analysis of the mouse and human genome reveals conservation of synteny in over 90% of the genome 5. Also, much of the technology used in mouse models is applicable to the study of human genes, for example, gene disruptions and allelic replacement 6. However, the creation of a transgenic mouse requires a great deal of resources of both a financial and technical nature. Several projects have begun to compile libraries of knock out mouse strains (KOMP, EUCOMM, NorCOMM) or mutagenesis induced strains (RIKEN), which require large-scale efforts and collaboration 7. Therefore, it is desirable to first study the phenotype of a desired gene in a cell culture model of primary cells before progressing to a mouse model. 
Retroviral DNA integrates into the host DNA, preferably within or near transcription units or CpG islands, resulting in stable and heritable expression of the packaged gene of interest while avoiding transcriptional silencing 8 9. The genes are then transcribed under the control of a high efficiency retroviral promoter, resulting in a high efficiency of transcription and protein production. Therefore, retroviral expression can be used with cells that are difficult to transfect, provided the cells are in an active state during mitosis. Because the structural genes of the virus are contained within the packaging cell line, the expression vectors used to clone the gene of interest contain no structural genes of the virus, which both eliminates the possibility of viral revertants and increases the safety of working with viral supernatants as no infectious virions are produced 10. 
Here we present a protocol for recombinant retroviral production and subsequent infection of splenic B cells. After isolation, the cultured splenic cells are stimulated with Th derived lymphokines and anti-CD40, which induces a burst of B cell proliferation and differentiation 11. This protocol is ideal for the study of events occurring late in B cell development and differentiation, as B cells are isolated from the spleen following initial hematopoetic events but prior to antigenic stimulation to induce plasmacytic differentiation.

An efficient system of structure and function analysis of a gene in an ex vivo culture of splenic B-lymphocytes is described. This method takes advantage of recombinant retroviral production in a helper free, ecotrophic packaging cell line. Stable, heritable expression of a gene of interest within primary lymphocytes is achieved leading to generation of surface antibodies on B cells undergoing class switch recombination.

B Hücreleri Rekombinant Retroviral Üretim ve Enfeksiyon

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the generation of extreme population diversity that facilitates virus adaptation and evolution. Increasing evidence shows that the intrinsic error rates, and the resulting mutation frequencies, of RNA viruses can be modulated by subtle amino acid changes to the viral polymerase. Although biochemical assays exist for some viral RNA polymerases that permit quantitative measure of incorporation fidelity, here we describe a simple method of measuring mutation frequencies of RNA viruses that has proven to be as accurate as biochemical approaches in identifying fidelity altering mutations. The approach uses conventional virological and sequencing techniques that can be performed in most biology laboratories. Based on our experience with a number of different viruses, we have identified the key steps that must be optimized to increase the likelihood of isolating fidelity variants and generating data of statistical significance. The isolation and characterization of fidelity altering mutations can provide new insights into polymerase structure and function1-3. Furthermore, these fidelity variants can be useful tools in characterizing mechanisms of virus adaptation and evolution4-7.

The present article describes the steps required to isolate and characterize RNA polymerase fidelity variants of RNA viruses and how to use mutation frequency data to confirm fidelity changes in tissue culture.

Virüs mutasyon Frekans RNA Virüsler ve Karakterizasyonu Fidelity Varyantlar izolasyonu

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. Several downstream applications require large quantities of pure viral DNA, which is provided by this protocol. These applications include viral genome sequencing, where the removal of host DNA is crucial to optimize data output for viral sequences, and the production of new viral recombinant strains, where co-transfection of purified plasmid and linear viral DNA facilitates recombination.1,2,3 
This procedure utilizes a combination of extractions and density-based centrifugation to isolate purified linear herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells.4,5 The initial purification steps aim to isolate purified viral capsids, which contain and protect the viral DNA during the extractions and centrifugation steps that remove cellular proteins and DNA. Lysis of nucleocapsids then releases viral DNA, and two final phenol-chloroform steps remove remaining proteins. The final DNA captured from solution is highly concentrated and pure, with an average OD260/280 of 1.90. Depending on the quantity of infected cells used, yields of viral DNA range from 150-800 &mu;g or more. The purity of this DNA makes it stable during long-term storage at 4C. This DNA is thus ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections. 
Prior to beginning the protocol, it is important to know the average number of cells per dish (e.g. an average of 8 x 106 PK-15 cells in a confluent 15 cm dish), and the titer of the viral stock to be used (e.g. 1 x 108 plaque-forming units per ml). These are necessary to calculate the appropriate multiplicity of infection (MOI) for the protocol.6 For instance, to infect one 15 cm dish of PK-15 cells with the above viral stock, at an MOI of 5, you would use 400 &mu;l of viral stock and dilute it with 3.6 ml of medium (total inoculation volume of 4 ml for one 15 cm plate).
Multiple viral DNA preparations can be prepared at the same time. The number of simultaneous preparations is limited only by the number of tubes held by the ultracentrifuge rotor (one per virus; see step 3.9 below). Here we describe the procedure as though being done for one virus.

We describe the process of isolating high purity herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells. The final DNA captured from solution is of high concentration and purity, making it ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections to produce new viral recombinants.

Nucleocapsids gelen Viral DNA hazırlanması

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems

Rodent parvoviruses (PV) such as rat H-1PV and MVM, are small icosahedral, single stranded, DNA viruses. Their genome includes two promoters P4 and P38 which regulate the expression of non-structural (NS1 and NS2) and capsid proteins (VP1 and VP2) respectively1. They attract high interest as anticancer agents for their oncolytic and oncosuppressive abilities while being non-pathogenic for humans2. NS1 is the major effector of viral cytotoxicity3. In order to further enhance their natural antineoplastic activities, derivatives from these vectors have been generated by replacing the gene encoding for the capsid proteins with a therapeutic transgene (e.g. a cytotoxic polypeptide, cytokine, chemokine, tumour suppressor gene etc.)4. The recombinant parvoviruses (recPVs) vector retains the NS1/2 coding sequences and the PV genome telomeres which are necessary for viral DNA amplification and packaging. Production of recPVs occurs only in the producer cells (generally HEK293T), by co-transfecting the cells with a second vector (pCMV-VP) expressing the gene encoding for the VP proteins (Fig. 1)4. The recPV vectors generated in this way are replication defective. Although recPVs proved to possess enhanced oncotoxic activities with respect to the parental viruses from which they have been generated, their production remains a major challenge and strongly hampers the use of these agents in anti-cancer clinical applications.
We found that introduction of an Ad-5 derived vector containing the E2a, E4(orf6) and the VA RNA genes (e.g. pXX6 plasmid) into HEK293T improved the production of recPVs by more than 10 fold in comparison to other protocols in use. Based on this finding, we have constructed a novel Ad-VP-helper that contains the genomic adenoviral elements necessary to enhance recPVs production as well as the parvovirus VP gene unit5. The use of Ad-VP-helper, allows production of rec-PVs using a protocol that relies entirely on viral infection steps (as opposed to plasmid transfection), making possible the use of cell lines that are difficult to transfect (e.g. NB324K) (Fig. 2). We present a method that greatly improves the amount of recombinant virus produced, reducing both the production time and costs, without affecting the quality of the final product5. In addition, large scale production of recPV (in suspension cells and bioreactors) is now conceivable.

Here we describe a protocol based only on cell infection, which improves the efficiency of recombinant parvovirus production by more than 100 fold in comparison to other protocols in use. This protocol relies on the use of a novel adenovirus 5-based helper containing the parvovirus VP transcription unit (Ad-VP).

Adenovirüs kaynaklı Sistemleri Yardımı ile verimli Rekombinant Parvovirus Üretim

Rodent parvoviruses (PV) such as rat H-1PV and MVM, are small icosahedral, single stranded, DNA viruses. Their genome includes two promoters P4 and P38 ...

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus (AAV) Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

Adeno-associated viral (AAV) vectors represent some of the most potent and promising vehicles for therapeutic human gene transfer due to a unique combination of beneficial properties1. These include the apathogenicity of the underlying wildtype viruses and the highly advanced methodologies for production of high-titer, high-purity and clinical-grade recombinant vectors2. A further particular advantage of the AAV system over other viruses is the availability of a wealth of naturally occurring serotypes which differ in essential properties yet can all be easily engineered as vectors using a common protocol1,2. Moreover, a number of groups including our own have recently devised strategies to use these natural viruses as templates for the creation of synthetic vectors which either combine the assets of multiple input serotypes, or which enhance the properties of a single isolate. The respective technologies to achieve these goals are either DNA family shuffling3, i.e. fragmentation of various AAV capsid genes followed by their re-assembly based on partial homologies (typically &gt;80% for most AAV serotypes), or peptide display4,5, i.e. insertion of usually seven amino acids into an exposed loop of the viral capsid where the peptide ideally mediates re-targeting to a desired cell type. For maximum success, both methods are applied in a high-throughput fashion whereby the protocols are up-scaled to yield libraries of around one million distinct capsid variants. Each clone is then comprised of a unique combination of numerous parental viruses (DNA shuffling approach) or contains a distinctive peptide within the same viral backbone (peptide display approach). The subsequent final step is iterative selection of such a library on target cells in order to enrich for individual capsids fulfilling most or ideally all requirements of the selection process. The latter preferably combines positive pressure, such as growth on a certain cell type of interest, with negative selection, for instance elimination of all capsids reacting with anti-AAV antibodies. This combination increases chances that synthetic capsids surviving the selection match the needs of the given application in a manner that would probably not have been found in any naturally occurring AAV isolate. Here, we focus on the DNA family shuffling method as the theoretically and experimentally more challenging of the two technologies. We describe and demonstrate all essential steps for the generation and selection of shuffled AAV libraries (Fig. 1), and then discuss the pitfalls and critical aspects of the protocols that one needs to be aware of in order to succeed with molecular AAV evolution.

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus AAV Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

We demonstrate the basic technique to molecularly engineer and evolve synthetic Adeno-associated viral (AAV) gene therapy vectors via DNA family shuffling. Moreover, we provide general guidelines and representative examples for selection and analysis of individual chimeric capsids with enhanced properties on target cells in culture or in mice.

DNA Aile karıştırma ile Mühendislik ve Sentetik adeno-ilişkili virüs Evrimi (AAV) Gen Terapisi Vektörler

Adeno-associated viral (AAV) vectors represent some of the most potent and promising vehicles for therapeutic human gene transfer due to a unique ...

Production and Purification of Non Replicative Canine Adenovirus Type 2 Derived Vectors

Adenovirus (Ad) derived vectors have been widely used for short or long-term gene transfer, both for gene therapy and vaccine applications. Because of the frequent pre-existing immunity against the classically used human adenovirus type 5, canine adenovirus type 2 (CAV2) has been proposed as an alternative vector for human gene transfer. The well-characterized biology of CAV2, together with its ease of genetic manipulation, offer major advantages, notably for gene transfer into the central nervous system, or for inducing a wide range of protective immune responses, from humoral to cellular immunity. Nowadays, CAV2 represents one of the most appealing nonhuman adenovirus for use as a vaccine vector. This protocol describes a simple method to construct, produce and titer recombinant CAV2 vectors. After cloning the expression cassette of the gene of interest into a shuttle plasmid, the recombinant genomic plasmid is obtained by homologous recombination in the E. coli BJ5183 bacterial strain. The resulting genomic plasmid is then transfected into canine kidney cells expressing the complementing CAV2-E1 genes (DK-E1). A viral amplification enables the production of a large viral stock, which is purified by ultracentrifugation through cesium chloride gradients and desalted by dialysis. The resulting viral suspension routinely has a titer of over 1010 infectious particles per ml and can be directly administrated in vivo.

These past 15 years, canine adenovirus type 2 (CAV2)-derived vectors have proven their efficiency to transduce cells in vitro&#160;and in vivo and are widely used for vaccination and gene therapy. Here, we describe a procedure to construct, produce and purify CAV2 vectors, giving rise to high-titer viral suspensions.

Non Replikatif Kanin adenovirüs tip 2 türetilmiş vektörler üretimi ve saflaştırılması

Adenovirus (Ad) derived vectors have been widely used for short or long-term gene transfer, both for gene therapy and vaccine applications. Because of the ...

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. Conversely, viruses have evolved intricate strategies to evade and exploit host immune signaling for survival and propagation. Viral immune evasion, entailing host defense and viral evasion, provides one of the most fascinating and dynamic interfaces to discern the host-virus interaction. These studies advance our understanding in innate immune regulation and pave our way to develop novel antiviral therapies.
Murine &#947;HV68 is a natural pathogen of murine rodents. &#947;HV68 infection of mice provides a tractable small animal model to examine the antiviral response to human KSHV and EBV of which perturbation of in vivo virus-host interactions is not applicable. Here we describe a protocol to determine the antiviral cytokine production. This protocol can be adapted to other viruses and signaling pathways.
Recently, we have discovered that &#947;HV68 hijacks MAVS and IKK&#946;, key innate immune signaling components downstream of the cytosolic RIG-I and MDA5, to abrogate NF&#922;B activation and antiviral cytokine production. Specifically, &#947;HV68 infection activates IKK&#946; and that activated IKK&#946; phosphorylates RelA to accelerate RelA degradation. As such, &#947;HV68 efficiently uncouples NF&#922;B activation from its upstream activated IKK&#946;, negating antiviral cytokine gene expression. This study elucidates an intricate strategy whereby the upstream innate immune activation is intercepted by a viral pathogen to nullify the immediate downstream transcriptional activation and evade antiviral cytokine production.

We describe a protocol to measure the antiviral cytokine production in mice infected with a model herpesvirus, murine gamma herpesvirus 68 (&#947;HV68) that is closely-related to human Kaposi&#8217;s sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) and Epstein-Barr virus (EBV). Utilizing genetically modified mouse strains and mouse embryonic fibroblasts (MEFs), we assessed the antiviral cytokine production both in vivo and ex vivo. &#8220;Reconstituting&#8221; the expression of innate immune components in knockout embryonic fibroblasts by lentiviral transduction, we further pinpoint specific innate immune molecules and dissect the key signaling events that differentially regulate the antiviral cytokine production.

Sitokin Üretimi Viral Evasion Doğuştan Bağışıklık Sinyalizasyonu Diseksiyon

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. burnetii DNA in cell cultures and clinical samples. PCR requires specialized equipment and extensive end user training, and therefore, it is not suitable for routine work especially in a resource-constrained area. We have developed a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay to detect the presence of C. burnetii in patient samples. This method is performed at a single temperature around 60 &#176;C in a water bath or heating block. The sensitivity of this LAMP assay is very similar to PCR with a detection limit of about 25 copies per reaction. This report describes the preparation of the reaction using lyophilized reagents and visualization of results using hydroxynaphthol blue (HNB) or a UV lamp with fluorescent intercalating dye in the reaction. The LAMP reagents were lyophilized and stored at room temperature (RT) for one month without loss of detection sensitivity. This LAMP assay is particularly robust because the reaction mixture preparation does not involve complex steps. This method is ideal for use in resource-limited settings where Q fever is endemic.

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

tespiti için Liyofilize Döngü aracılı İzotermal Amplifikasyon Reaktifler Gelişimi<em&gt; Coxiella burnetii</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

Enzim-linked Lektin Testi tarafından Grip Nöraminidaz İnhibisyon antikor titreleri Ölçme

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

Yüzeyler İnsan Norovirus Tespiti sürüntü Örnekleme Yöntemi

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...