Bu protokol, glial ve vasküler doku kontaminasyonu en aza indirilmesi ile axoplasm izolasyon sağlar. Bu yöntem, bir 8-10 haftalık Wistar sıçan başına yaklaşık 70-100 mg toplam axoplasm protein verir. 1. Siyatik Sinir teşrih <ol><li> CO 2 inhalasyon servikal dislokasyon iki sıçan Euthanize. Kalp atışı olmadığı için başından diseksiyonu önce palpe ölüm onaylayın. </li><li> Swab% 70 etanol ile diseksiyon alanı. </li><li> Cilt, ayrı kaslar kesin ve siyatik sinir, zararlı kan damarları olmadan makas ve forseps kullanarak dikkatli bir şekilde izole. Hem siyatik sinirleri teşrih (yaklaşık 1,5 cm), her hayvan ve 500 mcL PBS 0,2 X + inhibitörleri ile bir Eppendorf dört sinirler toplamak, buz üzerinde tutulmalıdır. </li><li> En az 2 mL PBS 0,2 X + proteaz inhibitörleri içeren plastik tabaklar sinir segmentleri aktarın. </li><li> Binoküler kapsamında ince forseps kullanarak sinirler epineurium çıkarın. Bulutlu hale gelene kadar çok fasiküller dikkatle ayırın ve çözüm yüzeyinde yüzen başlar. Bu adım (10 dakika başına daha fazla sinir almayan) hızlı ve doğru bir şekilde yapılabilir kadar uygulanmalıdır. </li></ol> 2. Kuluçka, Çamaşır ve Elüsyon <ol><li> Transfer oda sıcaklığında 2 saat inkübasyon proteaz inhibitörleri içeren PBS 0,2 X 500 mcL ile taze bir Eppendorf tüp fasiküller ayrılmış. </li><li> 1 ml Eppendorf tüp Eppendorf tüp fasiküller transferi ve transfer edildikten sonra 5 dakika sallayarak aynı tampon ile en az 3 kez yıkayın. </li><li> Fasiküller sıvı aşırı kaldırmak için yeni ve boş bir Eppendorf tüp içine koymak ve sonra oda sıcaklığında 20-30 dakika inkübasyon için proteaz inhibitörü içeren PBS 1X 300 mcL ile yeni bir Eppendorf tüpüne fasiküller transfer. </li><li> 10,000 xg&#39;de 10 dakika santrifüjleyin 4 ° C </li><li> Süpernatantı ve ölçü protein konsantrasyonu atın. Bu sizin axoplasm hazırlık. </li></ol> 3. Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/2087/2087fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Bu protokol gösterildiği gibi izole axoplasm örnekleri ile el sıkma yöntemi ile izole edilen Western Blot karşılaştırarak axoplasm. Sırasıyla, kan protein ve glial hücre Bulaşmayı temsil albümin ve GFAP düzeylerinde azalma, dikkat edin. Buna karşılık, aksonal tubulin b3 aksonal proteinlerin yüksek seviyesini gösteren, bu hazırlık zenginleştirilmiştir.

<ol>
	<li>Hanz, S., Perlson, E., Willis, D., Zheng, J. Q., Massarwa, R., Huerta, J. J., Koltzenburg, M., Kohler, M., van-Minnen, J., Twiss, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axoplasmic+importins+enable+retrograde+injury+signaling+in+lesioned+nerve.">Axoplasmic importins enable retrograde injury signaling in lesioned nerve.</a> Neuron. 40, 1095-1104 (2003).</li><li>Michaelevski, I., Medzihradszky, K. F., Lynn, A., Burlingame, A. L., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+proteomics+reveals+mobilization+of+translation+machinery+to+the+lesion+site+in+injured+sciatic+nerve.">Axonal transport proteomics reveals mobilization of translation machinery to the lesion site in injured sciatic nerve.</a> Mol Cell Proteomics. 9 (5), 976-987 (2010).</li><li>Rishal, I., Michaelevski, I., Rozenbaum, M., Shinder, V., Medzihradszky, K. F., Burlingame, A. L., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axoplasm+isolation+from+peripheral+nerve.">Axoplasm isolation from peripheral nerve.</a> Dev Neurobiol. 70, 126-133 (2010).</li><li>Twiss, J. L., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosomes+in+axons--scrounging+from+the+neighbors.">Ribosomes in axons--scrounging from the neighbors.</a> Trends Cell Biol. 19, 236-243 (2009).</li></ol>

Biyokimyasal ve proteomik analiz, mekanik sıkmak 1 axoplasm izolasyonu için daha önce açıklanan yöntemleri ile karşılaştırıldığında bu yordamı serum ve glial hücre kontaminasyonu 3 azalttığını teyit etmiştir . Biz, sonra dynein tabanlı retrograd sinyalizasyon siyatik sinir yaralanması 2 keşfetmek ve erişkin periferik sinir akson-glia etkileşimler de dahil olmak üzere 4 arama, pek çok diğer işlemler yardımcı olmasını bekliyoruz bu axoplasm izol...

<ul><li> Erkek Wistar sıçanlar (8-10 hafta) </li><li> 50 ml başına proteaz inhibitörleri (Roshe) 2 tablet içeren PBS 0,2 X ve PBS 1X çözümler </li><li> 1,5 ml için Eppendorfs </li><li> Plastik tabaklar 35 mm Steril </li><li> Diseksiyon araçları, makas ve ince forseps: </li><li> Binoküler ve masa ışığı </li></ul> Antikorlar Fare anti-GFAP klon GA-5 Sigma (G6171) oldu. Tavşan anti-Albumin Cedarlane (CLAG5140) oldu. Fare anti-tubulin β3 ve tavşan anti-gERK Sigma (sırasıyla T2200 ve M5670) idi.

axoplasm isolation from rat sciatic nerve

Periferik sinir saf aksonal sitoplazma (axoplasm) izolasyonu birçok biyolojik süreçlerin biyokimyasal çalışmalar için çok önemlidir. Bu makalede, biz göstermek ve yetişkin sıçan siyatik sinir aşağıdaki adımları dayalı axoplasm izolasyonu için bir protokol tarif: (1) sinir fasiküller ve bağ dokusu ayrılması diseksiyon, hipotonik ortamda sinir fasiküller kısa kesimleri (2) inkübasyon miyelin olmayan aksonal yapılar bırakın ve lyse; ve (3) kalan akson zenginleştirilmiş malzeme çıkarma. Bu hazırlık Proteomik ve biyokimyasal karakterizasyonu aksonal bileşenleri zenginleştirmek için yüksek derecede onaylamıştır.

Watch this Scientific Journal Video about Axoplasm Isolation from Rat Sciatic Nerve at JoVE.com

Axoplasm Isolation from Rat Sciatic Nerve

Biz yetişkin sıçan siyatik sinir miyelin bırakın ve kalan akson zenginleştirilmiş malzeme çıkarılması takip olmayan aksonal yapıları, lyse hipotonik orta sinir fasiküller ve kuluçka diseksiyonu dayalı axoplasm izolasyonu için bir protokol göstermektedir.

Sıçan Siyatik Sinir Axoplasm İzolasyon

Isolation of pure axonal cytoplasm (axoplasm) from peripheral nerve is crucial for biochemical studies of many biological processes. In this article, we ...

axoplasm-isolation-from-rat-sciatic-nerve

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.5K Görüntüleme.  Weizmann Institute of Science. Biz yetişkin sıçan siyatik sinir miyelin bırakın ve kalan akson zenginleştirilmiş malzeme çıkarılması takip olmayan aksonal yapıları, lyse hipotonik orta sinir fasiküller ve kuluçka diseksiyonu dayalı axoplasm izolasyonu için bir protokol göstermektedir.