Bu çalışma Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri'nden (hibe numarası MOP 38040) R.K.'ye, Musküler Distrofi Derneği'nden (ABD) R.K.'ye, SMA ailelerinden R.K. ve L.M.M'a, SMA Trust'tan T.H.G.'ye ve Kas Distrofisi Kampanyası'ndan T.H.G.'ye hibelerle desteklendi. L.M.M, Kanada Multipl Skleroz Derneği Doktora Sonrası Bursu'nun alıcısıdır ve R.K. Ottawa Üniversitesi'nden Bir Üniversite Sağlık Araştırma Kürsüsü'nün alıcısıdır.

Tüm işlemler kurum tarafından belirlenen hayvan bakım standartlarına göre yapılmalıdır.
1. Karın Kasının Fareden Diseksiyonu
<ol><li>Başlamadan önce% 4 paraformaldehit (PFA) yapın. Dikkat: PFA'yı her zaman duman kaputunda tutun ve uygun koruyucu ekipman giyin.</li>
	<li>Fareyi onaylanmış bir yöntemle ötenazi edin. Not: Videoda gösterilen fare aşırı dozDA CO2 ve servikal çıkık ile ötenaziye uğradı. Bu fare, CD1/C57Bl6 hibrit arka plan üzerinde 4 haftalık vahşi tip bir faredir. Bu fare, Ottawa Üniversitesi'ndeki hayvan tesislerinde başlangıçta satın alınan farelerden yetiştirildi.</li>
	<li>Kalça seviyesinde ciltten ilk kesiyi yapın ve cildi farenin etrafından kesin.</li>
	<li>Ön ayak seviyesine ulaşana kadar yukarı doğru çekerek cildi soyun.</li>
	<li>Karın kasını kalça hizasına kadar kesin ve omur kolonuna ulaşana kadar kesi devam edin.</li>
	<li>Bu noktada, üst ekvuğa ulaşana kadar kas ve kaburgalardan yukarı doğru kesmeye başlayın.</li>
	<li>Diğer taraftaki omur sütununa ulaşana kadar düz bir şekilde kesin.</li>
	<li>Başladığınız noktaya ulaşana kadar aşağı doğru kesin.</li>
	<li>Diyaframı alttan serbest bırakın (TVA kasına zarar vermemeye dikkat edin) ve 0,2 mm diseksiyon pimli SYLGARD kaplı bir diseksiyon kabına fosfat tamponlu salin (PBS) yerleştirin.</li>
	<li>Göğüs kafesini ve çanaktaki ilişkili kasları, yüzeysel tarafı yukarı doğru sabitleyerek kasın tamamen gerildiğine emin olun.</li>
	<li>1x PBS'yi dökün ve% 4 PFA ile değiştirin.</li>
	<li>15 dakika boyunca oda sıcaklığında sallanan bir platformda örtün ve bırakın.</li>
	<li>10 dakika boyunca oda sıcaklığında 1x PBS'de 3x yıkayın.</li>
</ol>* Bu noktada sabit kaslar sonraki diseksiyondan önce bir gece buzdolabında bırakılabilir.
2. TVA Kasının İzolasyonu
<ol><li>TVA kasının izolasyonu ile devam etmek için, bir diseksiyon mikroskobu altında, dış eğik kası son birkaç kaburga seviyesinde keserek başlayın (açıklamalı bir kılavuz için Bkz. Şekil 1).</li>
	<li>İç eğik kasın başlangıcına ulaşana kadar linea albanın yanında (aşağıdaki TVA'yı kesmemeye dikkat ederek) kesin.</li>
	<li>Daha sonra aşağıdaki TVA'nın üst kısmından aşırı rektus abdominis ve dış eğik kasları serbest bırakmak için kesin.</li>
	<li>Kan damarını ve aşırı yağları TVA kasından çıkarın.</li>
	<li>Kası üstteki son kaburgadan serbest bırakın.</li>
	<li>Kasın kenar boşluklarını kesin ve PBS içeren 24 kuyulu bir plakaya çıkarın.</li>
</ol>3. TVA Kasının İmmünofluoresan Etiketlemesi ve Mikroskopisi
Sonraki tüm adımlar için, ince uçlu bir pipet kullanarak sıvıyı çıkarın ve plakayı sallanan bir platformda bırakın. Aksi belirtilmedikçe, sonraki tüm adımlar oda sıcaklığında gerçekleştirilir.
<ol><li>NMJ'leri etiketlemek için 30 dakika boyunca 1:1.000 floresan etiketli bungarotoxin içeren PBS'de kuluçkaya yatırın. Bu karanlık bir odada veya folyo altında yapılabilir.</li>
	<li>PBS'de % 2 Triton X-100 kuyusu başına 300 μl ekleyerek kası dengele ve 30 dakika boyunca sallanan bir platformda bırakın.</li>
	<li>30 dakika boyunca reaktifi (%4 BSA, PBS'de %1 Triton) bloke etmek için kuluçkaya yatır.</li>
	<li>Primer antikorlar içeren reaktifin bloke edilmesinde kuluçkaya yaslanın (nörofilament 1:100; sinaptik vezikül proteini 2, 1:250) bir gecede 4 °C'de.</li>
	<li>1x PBS'de 3x yıkayın.</li>
	<li>PBS'de 2-4 saat boyunca 1:250 ikincil antikor içeren inkübte edin.</li>
	<li>1x PBS'de 3x yıkayın.</li>
	<li>Yeterli floresan montaj ortamı ve kapak kılıfı kullanarak kasları cam slaytlara monte edin.</li>
	<li>Slaytlar en iyi standart epifluoresan mikroskopta çift bantlı geçiş filtresi kullanılarak görüntülenir.</li>
	<li>NMJ'ler en az 40X hedefiyle donatılmış bir konfokal mikroskop üzerinde z serisi projeksiyon kullanılarak en iyi şekilde görüntülenir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+vertebrate+neuromuscular+junction.">Development of the vertebrate neuromuscular junction.</a> Annu. Rev. Neurosci. 22, 389-442 (1999).</li><li>Dupuis, L., Loeffler, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+junction+destruction+during+amyotrophic+lateral+sclerosis:+insights+from+transgenic+models.">Neuromuscular junction destruction during amyotrophic lateral sclerosis: insights from transgenic models.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 9, 341-346 (2009).</li><li>Murray, L. M., Talbot, K., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+neuromuscular+synaptic+vulnerability+in+motor+neurone+disease:+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+spinal+muscular+atrophy.">Review: neuromuscular synaptic vulnerability in motor neurone disease: amyotrophic lateral sclerosis and spinal muscular atrophy.</a> Neuropathol. Appl. Neurobiol. 36, 133-156 (2010).</li><li>Murray, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+vulnerability+of+motor+neurons+and+dissociation+of+pre-+and+post-synaptic+pathology+at+the+neuromuscular+junction+in+mouse+models+of+spinal+muscular+atrophy.">Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre- and post-synaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 17, 949-962 (2008).</li><li>Kariya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+SMN+protein+impairs+maturation+of+the+neuromuscular+junctions+in+mouse+models+of+spinal+muscular+atrophy.">Reduced SMN protein impairs maturation of the neuromuscular junctions in mouse models of spinal muscular atrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 17, 2552-2569 (2008).</li><li>Iguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+TDP-43+causes+age-dependent+progressive+motor+neuron+degeneration.">Loss of TDP-43 causes age-dependent progressive motor neuron degeneration.</a> Brain. 136, 1371-1382 (2013).</li><li>Martinez-Hernandez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+defects+in+type+I+spinal+muscular+atrophy+in+human+development.">Synaptic defects in type I spinal muscular atrophy in human development.</a> J. Pathol. 229, 49-61 (2013).</li><li>Fischer, L. R., Li, Y., Asress, S. A., Jones, D. P., Glass, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+SOD1+leads+to+oxidative+stress+in+peripheral+nerve+and+causes+a+progressive+distal+motor+axonopathy.">Absence of SOD1 leads to oxidative stress in peripheral nerve and causes a progressive distal motor axonopathy.</a> Exp. Neurol. 233, 163-171 (2012).</li><li>Cifuentes-Diaz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofilament+accumulation+at+the+motor+endplate+and+lack+of+axonal+sprouting+in+a+spinal+muscular+atrophy+mouse+model.">Neurofilament accumulation at the motor endplate and lack of axonal sprouting in a spinal muscular atrophy mouse model.</a> Hum. Mol. Genet. 11, 1439-1447 (2002).</li><li>Fischer, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyotrophic+lateral+sclerosis+is+a+distal+axonopathy:+evidence+in+mice+and+man.">Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: evidence in mice and man.</a> Exp. Neurol.. 185, 232-240 (2004).</li><li>Diers, A., Kaczinski, M., Grohmann, K., Hubner, C., Stoltenburg-Didinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ultrastructure+of+peripheral+nerve,+motor+end-plate+and+skeletal+muscle+in+patients+suffering+from+spinal+muscular+atrophy+with+respiratory+distress+type+1+(SMARD1).">The ultrastructure of peripheral nerve, motor end-plate and skeletal muscle in patients suffering from spinal muscular atrophy with respiratory distress type 1 (SMARD1).</a> Acta Neuropathol. 110, 289-297 (2005).</li><li>Ang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+axonal+sprouting+and+neuromuscular+junction+loss+in+an+animal+model+of+Charcot-Marie-Tooth+disease.">Motor axonal sprouting and neuromuscular junction loss in an animal model of Charcot-Marie-Tooth disease.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 69, 281-293 (2010).</li><li>Simon, C. M., Jablonka, S., Ruiz, R., Tabares, L., Sendtner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+neurotrophic+factor-induced+sprouting+preserves+motor+function+in+a+mouse+model+of+mild+spinal+muscular+atrophy.">Ciliary neurotrophic factor-induced sprouting preserves motor function in a mouse model of mild spinal muscular atrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 19, 973-986 (2010).</li><li>Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+mouse+cranial+muscles+to+investigate+neuromuscular+pathology+in+vivo.">Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo.</a> Neuromuscul. Disord. 20, 740-743 (2010).</li><li>Brill, M. S., Marinkovic, P., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+photo-bleaching+to+delineate+single+Schwann+cells+at+the+neuromuscular+junction.">Sequential photo-bleaching to delineate single Schwann cells at the neuromuscular junction.</a> J. Vis. Exp. (4460), (2013).</li><li>Murray, L. M., Thomson, D., Conklin, A., Wishart, T. M., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+translation+elongation+factor+(eEF1A2)+expression+in+vivo+differentiates+between+Wallerian+degeneration+and+dying-back+neuronal+pathology.">Loss of translation elongation factor (eEF1A2) expression in vivo differentiates between Wallerian degeneration and dying-back neuronal pathology.</a> J. Anat. 213, 633-645 (2008).</li><li>Bowerman, M., Murray, L. M., Beauvais, A., Pinheiro, B., Kothary, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+smn+threshold+in+mice+dictates+onset+of+an+intermediate+spinal+muscular+atrophy+phenotype+associated+with+a+distinct+neuromuscular+junction+pathology.">A critical smn threshold in mice dictates onset of an intermediate spinal muscular atrophy phenotype associated with a distinct neuromuscular junction pathology.</a> Neuromuscul. Disord. 22, 263-276 (2012).</li><li>Comley, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ApoE+isoform-specific+regulation+of+regeneration+in+the+peripheral+nervous+system.">ApoE isoform-specific regulation of regeneration in the peripheral nervous system.</a> Hum. Mol. Genet. 20, 2406-2421 (2011).</li><li>Wright, M., Kim, A., Son, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcutaneous+administration+of+muscarinic+antagonists+and+triple-immunostaining+of+the+levator+auris+longus+muscle+in+mice.">Subcutaneous administration of muscarinic antagonists and triple-immunostaining of the levator auris longus muscle in mice.</a> J. Vis. Exp. (55), (2011).</li><li>Ling, K. K., Gibbs, R. M., Feng, Z., Ko, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+neuromuscular+denervation+of+clinically+relevant+muscles+in+a+mouse+model+of+spinal+muscular+atrophy.">Severe neuromuscular denervation of clinically relevant muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 21, 185-195 (2012).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu videoda, TVA kasının fareden diseksiyonu ve kas içindeki NMJ'lerin tüm montajlı immünofluoresan etiketlemesi için bir protokol detaylandırdık. Ayrıca bu kasın SMA'nın bir fare modelinde nöromüsküler kavşak patolojisini analiz etmek için kullanılabileceğini gösteren veriler sunuyoruz.
Bu teknikteki başarı bir dizi faktöre bağımlıdır. En yaygın sorunlardan bazıları aşağıda özetlenmiştir. İlk olarak: zayıf immünohistokimyasal lekeleme. Bunun bir dizi nedeni olabilir, en yaygın olanlardan biri, bu protokolde listelenenlere farklı reaktiflerin kullanılmasıdır. Bu protokolde listelenen antikorların seçimi gibi, iyi boyama sağlamak için yüksek kaliteli bir elektron mikroskopi sınıfı PFA çok önemlidir. Ek olarak, yaşlı hayvanlarda(yani3 ay >), kaliteli boyama almak daha zor olabilir. Bunun nedeni, kası çevreleyen fasyanın kalınlığının artması ve dış eğik ve tranversus abdominis arasındaki yağ birikiminin artmasıdır. İmmünoresansa geçmeden önce yağı çıkarmak önemlidir. Kalınlaşabilen kası kaplayan fasyanın bir kısmını çıkarmak da gerekebilir. Bazen kas lifine bir miktar zarar vermeden ve innervasyon düzeninde bir bozulma olmadan fasya ve yağı kastan çıkarmak zordur. Ancak bu teknik dikkatli bir şekilde yapılırsa farelerden en az 1 yaşına kadar kaliteli boyama elde edilebilir. Genç farelerde(yani3 aydan az) kas liflerinin herhangi bir alay veya ayrılmasını yapmak gerekli olmamalıdır. İkincisi: diseksiyon ve lekeleme sonrasında NMJ bulmakta zorluk. Bunun nedeni genellikle diseksiyonun son kaburganın altına uzanmamasıdır. NMJ'lerin çoğu son kaburganın hemen altında bulunur ve bu nedenle kasın bu kısmının diseksiyona dahil edilmesine dikkat edilmelidir. Üçüncüsü: EO kasının TVA kasına yapışmasını. Bu genellikle bireyler diseksiyonu iç eğik (GÇ) kas seviyesinin altına uzatmaya çalıştıklarında bir şikayettir. İO'nun da bulunduğu TVA kasının alanını analiz etmek daha zordur, çünkü hangi kasın hangisi olduğunu ayırt etmek zor olabilir. Bu nedenle, rutin olarak TVA kasının en üstün kısmını parçalara ayırıyoruz. Bu seviyede, EO ve TVA kasları arasında yapışma yoktur ve bu nedenle bu önemli bir sorun olmamalıdır.
TVA kasının kullanılmasının önemli bir engeli, apandisitrik kaslara kıyasla, cerrahi manipülasyonlar veya maddelerin enjeksiyonu için erişilebilirliktir. Bu tür deneyler, belirli bir kastaki NMJ fizyolojisini araştırmak için çok önemli olabilir. TVA kesinlikle tibialis ön veya gastrocnemiusgibi daha yaygın olarak kullanılan kaslardan daha az kolay erişilebilir olmasına rağmen, önceki çalışmalar TVA'yı interkostal sinirlerin cerrahi yaralanması ile denervate etmenin mümkün olduğunu göstermiştir18. Son zamanlarda bu kası genel anestezi altındaki maddelerin yerel yönetimi için de kullandık (yayınlanmamış veriler). Bu deneyler ılımlı bir teknik zorluğu temsil etse de, bu çalışma bunların mümkün olduğunu ve böylece hem patolojik hem de fizyolojik manipülasyon altında NMJ'lerin analizi için bu kasın yararlılığını genişlettiklerini göstermektedir.
TVA kası, innervasyon desenlerinin tam olarak monte analizi için kullanılabilecek vücut boyunca bulunan bir dizi ince düz kastan biridir. Diğer kaslar arasında, beyin sapının yüz çekirdeğinden kaynaklanan motor nöronlar tarafından içselleştirilmiş bir grup kranial kas, levator auris longus, auricularis superiorve adductor auris longus, diseksiyonları daha öncetanımlanmıştır 14,19. Ayrıca, EO, IO ve rectus abdominisde dahil olmak üzere TVA kasını çevreleyen kas yapısı da etiketlenebilir ve NMJ analizi için kullanılabilir. Bir fare modelinde NMJ patolojisinin kapsamlı analizi için, vücutta bulunan bir dizi kası göz önünde bulundurmak ve analizi tek bir kasla kısıtlamamak önemlidir. Bu, farklı kaslar arasındaki NMJ patolojisi seviyelerinde önemli heterojenliğin olduğu motor nöron hastalıklarının fare modellerinde örneklenmiştir20. Bu tür intermüsküler değişkenlik, motor nöron kırılganlığının mekanizmasını araştırırken son derece değerli bir araçtır ve bu nedenle analizi tek bir kasla kısıtlamak araştırmanın potansiyelini önemli ölçüde azaltabilir.

Nöromüsküler kavşaklar (NMJs), daha düşük bir motor nöron ile iskelet kas lifi arasındaki sinaptik bağlantıdır. Geleneksel olarak bir nöron (presynaptik terminal), kas lifi (post sinaptik terminal) ve terminal Schwann hücre1'denoluşan üçlü bir sinaps olarak kabul edilirler. NMJ'ler, bir dizi motor nöron hastalığında ve fare modellerinde patolojide erken ve önemli hedefler olarak görünmektedir2,3. Tipik semptomlar, motor plakasının presynaptik bir innervasyondan yoksun hale geldiği denervasyon, presynaptik terminalin şişmesi ve NMJ morfolojisinin karmaşıklığında bir azalma4-11içerir. Aksional süreçlerin kalan sinaptik terminallerden veya internodlardan yeniden yağlanmış denervated uç plakalarına kadar uzandığı terminal ve nodal filizlemeyi içeren telafi edici yanıtlar da not edilebilir12,13. Sinaptik aktivite ve NMJ morfolojisi arasındaki sıkı korelasyon nedeniyle, NMJ morfolojisinin analizinden motor nöronların fonksiyonel durumu hakkında çok fazla bilgi edinilebilir. NMJ kaybı sıklıkla nöromüsküler patolojinin ilk yönlerinden birini temsil ettiği için4,10Innervasyon seviyesinde niceleme patolojinin ilerlemesi ve terapötik bir müdahalenin potansiyel etkisi hakkında önemli bilgiler verebilir. Ayrıca, NMJ kaybı patolojik ilerlemede önemli bir adımı temsil ettiği için, bağlantıları stabilize edebilecek ve yenilenmeyi teşvik edebilecek terapötiklerin geliştirilmesi önemli fayda sağlayabilir.
NMJ morfolojisi analiz edilirken kas seçimi büyük önem taşımaktadır. Başlıca hususlardan bazıları kas lifi tipi, vücut pozisyonu ve insan koşullarına karşılaştırmalı analiz içerebilir. Ek olarak, maddelerin enjeksiyonu veya travmatik sinir hasarı gibi manipülasyonların gerekli olduğu durumlarda, deneysel erişilebilirliği de göz önünde bulundurmak önemlidir. Genel olarak, vücut boyunca konumlandırılmış bir dizi kasın bir dizi motor ünite alt tipini yansıtması tercih edilir. Bununla birlikte, genellikle, kas seçimi diseksiyon kolaylığından etkilenir. Sonuç olarak, NMJ analizi genellikle sadece gastrocnemiusgibi büyük apandisit kaslarda gerçekleştirilir. Bu tür kaslarda iyi NMJ lekeleme elde etmek için, genellikle kas liflerinin bölümleme veya mekanik bozulması gerekir. Sonuç olarak, innervasyon paterni bozulabilir ve innervasyon paternlerinin, filizlenen ve denervasyonun kapsamlı ve kaliteli bir analizi genellikle tehlikeye girer. Alternatif bir yaklaşım, kesit gerektirmeyen ve lekelenebilen ve sağlam bir şekilde monte edilebilen ince düz kasların kullanılmasıdır ve bu da kasın tüm innervasyonuna kapsamlı bir genel bakış sağlar. Bir grup kranial kas da dahil olmak üzere böyle bir analiz için kullanılabilecek bir dizi kas vardır, (levator auris longus, auricularis superiorve adductor auris longus'u kapsar)14, torasik kaslar (örneğin. üçgen sterni) 15ve abdominal(örneğin transversus abdominis (TVA)) kasları. Bu tür kasların kullanılmasındaki en büyük engel, onları hasarsız olarak parçalamak için gereken teknik uzmanlıktır.
Bu videoda, innervasyon paterninin ve NMJ morfolojisinin kapsamlı bir analizine izin vermek için TVA kasının fareden immünofluoresan etiketlemesini parçalamak ve gerçekleştirmek için bir protokol sunuyoruz. TVA kası, karın kaslarının en derin tabakasını içeren ağırlıklı olarak yavaş bir seğirme kasıdır ve alt interkostal sinirler tarafından içselleştirilir. Önceki çalışmalar, çocukluk çağı motor nöron hastalığı spinal müsküler atrofinin (SMA) bir dizi fare modelinde ve erken başlangıçlı motor nöron dejenerasyonu4,16'nındiğer fare modellerinde patolojiye karşı sürekli olarak oldukça savunmasız olduğunu göstermiştir. Bu nedenle TVA'nın periferik nöropatilerde NMJ analizi için yararlı bir kas olduğunu öneriyoruz.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="958">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Paraformaldehyde Aqueous Solution (16% )</td>
			<td style="width:259px;">Electron Micropscopy Sciences</td>
			<td style="width:216px;">15700</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td style="width:259px;">Fine Science Tools</td>
			<td>11251-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Angled Sprung Scissors</td>
			<td style="width:259px;">Fine Science Tools</td>
			<td>15006-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Fine Scissors - ToughCut</td>
			<td style="width:259px;">Fine Science Tools</td>
			<td>14058-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td style="width:259px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:216px;">dependant on local supplier</td>
			<td>Use this to make dissection dish for pinning out muscle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Minutien Pins</td>
			<td style="width:259px;">Fine science tools</td>
			<td>26002-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">&#945;-Bungarotoxin, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:216px;">B-13422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Albumin from Bovine Serum</td>
			<td style="width:259px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:216px;">A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:316px;">Neurofilament Primary antibody (2H3), Supernatant</td>
			<td style="width:259px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:316px;">SV2 Primary antibody (SV2), Supernatant</td>
			<td style="width:259px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td style="width:259px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-166-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Fluorescence Mounting Medium</td>
			<td style="width:259px;">Dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Slides (Superfrost Plus; White)</td>
			<td style="width:259px;">Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Coverslips</td>
			<td style="width:259px;">Fisher</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:259px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:216px;">T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">CD1/C57Bl6 mouse</td>
			<td style="width:259px;">Jackson Labs</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection of the transversus abdominis muscle for whole-mount neuromuscular junction analysis

Nöromüsküler kavşak morfolojisinin analizi, belirli bir motor nöronun fizyolojik durumu hakkında önemli bilgiler verebilir. İnce düz kasların analizi, arka uzuvdan gelenler gibi geleneksel olarak kullanılan daha kalın kaslara göre önemli bir avantaj sağlayabilir(örn. gastrocnemius). İnce kaslar, belirli bir kas için tüm innervasyon deseninin kapsamlı bir genel görünümünü sağlar, bu da seçici olarak savunmasız motor nöron havuzlarının tanımlanmasına izin verir. Bu kaslar ayrıca motor birim büyüklüğü, aksonal dallanma ve terminal/nodal filizleme gibi parametrelerin analizine izin verir. Bu tür kasların kullanılmasında yaygın bir engel, onları parçalamak için teknik uzmanlık kazanmaktır. Bu videoda, enine abdominis (TVA) kasının genç farelerden parçalanması ve aksonları ve nöromüsküler kavşakları (NMJ' ler) görselleştirmek için immünoresans gerçekleştirme protokolünü detaylandırıyoruz. Bu tekniğin TVA kasının innervasyon paternine tam bir genel bakış sağladığını ve çocukluk çağı motor nöron hastalığı spinal müsküler atrofinin bir fare modelinde NMJ patolojisini araştırmak için kullanılabileceğini gösteriyoruz.

Yukarıdaki protokol, NMJ analizi için TVA kasının izolasyonu ve lekelenmesine yön veriyor. Bu, kas innervasyon kalıplarının tam olarak monte analizinin yanı sıra NMJ morfolojisinin yüksek çözünürlüklü analizine izin verir (Şekil 2). Bu teknik, SMA4,17(Şekil 3)gibi motor nöron hastalığının fare modellerinde NMJ patolojisini ortaya çıkarmak için başarıyla uygulanabilir. SMA'nın fare modellerinde patolojide önemli kas içi değişkenlik vardır, ancak TVA kası sürekli olarak yüksek oranda etkilenir. Bu, motor uç plakalarının denervasyonu, presynaptik terminalde nörofilamentlerin birikmesi ve terminal filizlenmesi ile kanıtlanmaktadır (Şekil 3). Burada sunulan sonuçlar, yukarıda açıklanan tekniğin fare modellerinde NMJ patolojisinin innervasyonuna ve analizine kapsamlı bir genel bakış sağlamak için güçlü bir yöntem olabileceğini göstermektedir.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51162/51162fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51162/51162fig1.jpg" width="600px"> Şekil 1. Farenin karın kas yapısına genel bakış. (A) Görüntü, yakın zamanda ötenazilenmiş bir fareden çıkarılan ve diseksiyon kabı yüzeysel bir tarafı yukarı (A) ile sabitlenmiş ekli abdominal kaslı torasik kafesi gösterir. (B) A'daki diseksiyon karın kaslarının yaklaşık sınırlarını işaretlemek için açıklama eklenmiştir. Yüzeysel karın kasları diseksiyonun sol tarafında görülebilir ve dış eğik (mavi ile özetlenmiştir) ve rectus abdominis (kırmızı ile özetlenmiştir) içerir. Diseksiyonun sağ tarafında, yüzeysel kaslar, enine abdominis kasının (yeşil ile özetlenmiştir) ve iç eğik kanın (sarı ile özetlenmiştir) görselleştirilmesine izin verilen şekilde çıkarılmıştır. Bu protokolün amacı, burada düz yeşil bir üçgen olarak gösterilen TVA kasının üst kısmının diseksiyonunun yönlendirilmesidir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51162/51162fig1highres.jpg" target="_blank">Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51162/51162fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51162/51162fig2.jpg" width="600px"> Şekil 2. TVA kasında nöromüsküler kavşaklara tam montajlı genel bakış. Nörofilament (NF; yeşil), sinaptik vezikül proteini 2 (SV2; yeşil) ve bungarotoksin (BTX; kırmızı) için immünoflooresan boyama ile görselleştirilen TVA kasından örnek NMJ'leri gösteren görüntüler. Görüntüler, tüm kası (A) veya grupları gösteren konfokal görüntüleri gösteren montajlı floresan mikrograflardır (B) veya bireysel (C) NMJs. Ölçek çubuğu = 800 μm (A), 70 μm (B), 25 μm (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51162/51162fig2highres.jpg" target="_blank">Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.</a>
<img alt="Figure 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51162/51162fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51162/51162fig3.jpg" width="600px"> Şekil 3. TVA kasında nöromüsküler kavşak patolojisi SMA'nın bir fare modelinden. TVA kasından gelen NMJ'leri gösteren konfokal mikrografiler, nörofilament (NF; yeşil), sinaptik vezikül proteini 2 (SV2; yeşil) ve bungarotoxin (BTX; kırmızı) için immünofluoresanboyama ile görselleştirilmiştir. Normal NMJ morfolojisi kontrol farelerinde gözlenebilirken, Smn2B / - farelerden TVA kaslarında tam denervasyon (beyaz ok ucu), kısmi denervasyon (mor ok ucu) terminali filizlenme (mavi ok ucu) ve presinaptik şişlik (sarı ok ucu) kanıtı olduğunu unutmayın. Post-sinaptik uç plakalar da görünüşte daha az olgun bir fenotip yansıtan daha az karmaşıktır. Ölçek çubuğu = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51162/51162fig3highres.jpg" target="_blank">Daha büyük görüntüyü görüntülemek için burayı tıklatın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis at JoVE.com

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Bu videoda, farenin enine abdominis kasının diseksiyonu için bir protokol gösteriyoruz ve nöromüsküler kavşakları görselleştirmek için immünofluoresans ve mikroskopi kullanıyoruz.

Tüm Montajlı Nöromüsküler Kavşak Analizi için Enine Abdominis Kasının Diseksiyonu

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

dissection-transversus-abdominis-muscle-for-whole-mount-neuromuscular

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

11.4K Görüntüleme.  Ottawa Hospital Research Institute. Bu videoda, farenin enine abdominis kasının diseksiyonu için bir protokol gösteriyoruz ve nöromüsküler kavşakları görselleştirmek için immünofluoresans ve mikroskopi kullanıyoruz.

Video: Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

Retina pigment epiteli Tüm Mount Fare Göz Diseksiyon

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Nörobilim

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The Drosophila larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila is well known for the ease of powerful genetic manipulations and the larval nervous system has proven particularly useful in studying not only normal function but also perturbations that accompany some neurological disease (Lloyd and Taylor, 2010). Many key synaptic molecules found in Drosophila are also found in mammals and like most CNS excitatory synapses in mammals, the Drosophila NMJ is glutamatergic and demonstrates activity-dependent remodeling (Kohet al. , 2000). Additionally, Drosophila neurons can be individually identified because their innervation patterns are stereotyped and repetitive making it possible to study identified synaptic terminals, such as those between motor neurons and the body-wall muscle fibers that they innervate (Keshishian and Kim, 2004). The existence of evolutionarily conserved synapse components along with the ease of genetic and physical manipulation make the Drosophila model ideal for investigating the mechanisms underlying synaptic function (Budnik, 1996).
The active zones at synaptic terminals are of particular interest because these are the sites of neurotransmitter release. NC82 is a monoclonal antibody that recognizes the Drosophila protein Bruchpilot (Brp), a CAST1/ERC family member that is an important component of the active zone (Waghet al. , 2006). Brp was shown to directly shape the active zone T-bar and is responsible for effectively clustering Ca2+ channels beneath the T-bar density (Fouquetet al. , 2009). Mutants of Brp have reduced Ca2+ channel density, depressed evoked vesicle release, and altered short-term plasticity (Kittelet al. , 2006). Alterations to active zones have been observed in Drosophila disease models. For example, immunofluorescence using the NC82 antibody showed that the active zone density was decreased in models of amyotrophic lateral sclerosis and Pitt-Hopkins syndrome (Ratnaparkhiet al. , 2008; Zweieret al. , 2009). Thus, evaluation of active zones, or other synaptic proteins, in Drosophila larvae models of disease may provide a valuable initial clue to the presence of a synaptic defect.
Preparing whole-mount dissected Drosophila larvae for immunofluorescence analysis of the NMJ requires some skill, but can be accomplished by most scientists with a little practice. Presented is a method that provides for multiple larvae to be dissected and immunostained in the same dissection dish, limiting environmental differences between each genotype and providing sufficient animals for confidence in reproducibility and statistical analysis.

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila melanogaster is an important model system for studying normal synaptic function as well as perturbations to synaptic function found in certain neurological diseases. We present a protocol for dissection of the Drosophila larval motor system and immunostaining for active zone proteins within the NMJ.

Aktif Bölgeleri Diseksiyon ve Görüntüleme Drosophila Nöromüsküler Junction

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

Tüm Dağı Muscle Analizi ile tekrarlanabilir Fare Siyatik Sinir Ezilme ve Rejenerasyon daha sonraki Değerlendirme

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system and has served as guiding model to study synaptic structure and function. In mouse NMJs motor axon terminals form pretzel-like contact sites with muscle fibers. The motor axon and its terminal are sheathed by SCs. Over the past decades, several transgenic mice have been generated to visualize motor neurons and SCs, for example Thy1-XFP1 and Plp-GFP mice2, respectively.
Along motor axons, myelinating axonal SCs are arranged in non-overlapping internodes, separated by nodes of Ranvier, to enable saltatory action potential propagation. In contrast, terminal SCs at the synapse are specialized glial cells, which monitor and promote neurotransmission, digest debris and guide regenerating axons. NMJs are tightly covered by up to half a dozen non-myelinating terminal SCs - these, however, cannot be individually resolved by light microscopy, as they are in direct membrane contact3.
Several approaches exist to individually visualize terminal SCs. None of these are flawless, though. For instance, dye filling, where single cells are impaled with a dye-filled microelectrode, requires destroying a labelled cell before filling a second one. This is not compatible with subsequent time-lapse recordings3. Multi-spectral "Brainbow" labeling of SCs has been achieved by using combinatorial expression of fluorescent proteins4. However, this technique requires combining several transgenes and is limited by the expression pattern of the promoters used. In the future, expression of "photo-switchable" proteins in SCs might be yet another alternative5. Here we present sequential photo-bleaching, where single cells are bleached, and their image obtained by subtraction. We believe that this approach - due to its ease and versatility - represents a lasting addition to the neuroscientist's technology palette, especially as it can be used in vivo and transferred to others cell types, anatomical sites or species6.
In the following protocol, we detail the application of sequential bleaching and subsequent confocal time-lapse microscopy to terminal SCs in triangularis sterni muscle explants. This thin, superficial and easily dissected nerve-muscle preparation7,8 has proven useful for studies of NMJ development, physiology and pathology9. Finally, we explain how the triangularis sterni muscle is prepared after fixation to perform correlated high-resolution confocal imaging, immunohistochemistry or ultrastructural examinations.

Visualizing individual cells in densely packed tissues, such as terminal Schwann cells (SCs) at neuromuscular junctions (NMJs), is challenging. "Sequential photo-bleaching" allows delineating single terminal SCs, for instance in the triangularis sterni muscle explant, a convenient nerve-muscle preparation, where sequential bleaching can be combined with time-lapse imaging and post-hoc immunostainings.

Sıralı Nöromusküler Kavşağı&#39;nda Tek Schwann Hücreleri belirginleştiren Photo-beyazlatma

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

In Koku Reseptör Nöronlar Tüm Dağı ile immün<em&gt; Drosophila</em&gt; Anten

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

Tüm Dağı Diseksiyon ve Yetişkin Fare Kohlea immünofloresan

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic pathways. Quantitative descriptions are rarely performed, although genetic manipulations produce a range of phenotypic effects and variations are observed even among individuals within control groups.&#160;Emerging evidence shows that morphology, size and location of organelles play a previously underappreciated, yet fundamental role in cell function and survival. Here we provide step-by-step instructions for performing quantitative analyses of phenotypes at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ). We use several reliable immuno-histochemical markers combined with bio-imaging techniques and morphometric analyses to examine the effects of genetic mutations on specific cellular processes. In particular, we focus on the quantitative analysis of phenotypes affecting morphology, size and position of nuclei within the striated muscles of Drosophila larvae. The Drosophila larval NMJ is a valuable experimental model to investigate the molecular mechanisms underlying the structure and the function of the neuromuscular system, both in health and disease. However, the methodologies we describe here can be extended to other systems as well.

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

En fenotip Karakterizasyonu: Niceleme Matters Neden<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva Nöromüsküler Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

Basit Bir adım Yetişkin Tüm montaj Hazırlama Diseksiyon Protokolü<em&gt; Drosophila</em&gt; Brain

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is impaired, such as aging and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Here we describe an experimental protocol that can be used to measure NMJ functionality by combining two types of electrical stimulation: direct muscle membrane stimulation and the stimulation through the nerve. The comparison of the muscle response to these two different stimulations can help to define, at the functional level, potential alterations in the NMJ that lead to functional decline in muscle.
Ex vivo preparations are suited to well-controlled studies. Here we describe an intensive protocol to measure several parameters of muscle and NMJ functionality for the soleus-sciatic nerve preparation and for the diaphragm-phrenic nerve preparation. The protocol lasts approximately 60 min and is conducted uninterruptedly by means of a custom-made software that measures the twitch kinetics properties, the force-frequency relationship for both muscle and nerve stimulations, and two parameters specific to NMJ functionality, i.e. neurotransmission failure and intratetanic fatigue. This methodology was used to detect damages in soleus and diaphragm muscle-nerve preparations by using SOD1G93A transgenic mouse, an experimental model of ALS that ubiquitously overexpresses the mutant antioxidant enzyme superoxide dismutase 1 (SOD1).

A functional assessment of the neuromuscular junction (NMJ) can provide essential information on the communication between muscle and nerve. Here we describe a protocol to comprehensively evaluate both the NMJ and muscle functionality using two different muscle-nerve preparations, i.e. soleus-sciatic and diaphragm-phrenic.

Nöromüsküler kavşak işlevleri ölçme

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal macropatch recordings of synaptic currents from visualized boutons at the Drosophila larval NMJ. This technique requires customized fabrication of recording micropipettes, as well as a compound microscope equipped with a high magnification, long-distance water immersion objective, differential interference contrast (DIC) optics, and a fluorescent attachment. The recording electrode is positioned on the top of a selected synaptic bouton visualized with DIC optics, epi-fluorescence, or both. The advantage of this technique is that it allows monitoring the synaptic activity of a limited number of sites of release. The recording electrode has&#160;a diameter of several microns, and the release sites positioned outside of the electrode rim do&#160;not significantly affect the recorded currents. The recorded synaptic currents have fast kinetics and can be readily resolved. These advantages are especially important for the studies of mutant fly lines with enhanced spontaneous or asynchronous synaptic activity.

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Synaptic currents can be recorded focally from visualized synaptic boutons at the Drosophila third instar larvae neuromuscular junction. This technique enables monitoring the activity of a single synaptic bouton.

Drosophila larva nöromüsküler kavşak sinaptik akımlardan Fokal Macropatch kayıtları

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...