Bu çalışma Basel Üniversitesi, Biomedikal Bölümü, ve İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (31003A-116624) tarafından desteklenmiştir.

1. Organotipik Serebellar Dilim Kültürleri kurma Serebellar kesit kültürlerinde doğum sonrası elde edilen statik inkübasyon yöntem kullanılarak 8 10 P (8) fare yavrular hazırlanır. Laboratuvarımızda, biz B6CF1 fare kullanın. Bazı deneylerde, aynı zamanda transjenik fareler Purkinje hücreleri seçici olarak EGFP ifade eden kullanılmıştır. Dilim kültürlerin hazırlanması 6 farenin yavru bir çöp için fare yavru, yani 3 saat başına yaklaşık 30 dakika sürer. Tüm adımları steril cerrahi aletler ile laminar akış tezgahı steril koşullar altında yürütülmektedir. <ol><li> P8 fare yavruların serebellum stereomikroskopta kullanarak buz hazırlama orta (MEM (Gibco Katalog No 11012) glutamax 1:100, pH 7.3) içinde beyin disseke edilir. </li><li> Serebellum McIlwain doku kıyıcı kullanarak sagital yönde 350 mikron kalınlığında dilimler halinde kesilir. </li><li> Dilimleri Millipore hücre kültürü ekler (approx.6 dilim yerleştirilirinsert, Millipore PICM03050) başına s ve 0.75 ml başına iyi inkübasyon ortamı (MEM 48.35 ml, 25 ml Eagle Medium, 25 ml at serumu, 1 ml glutamax I, bir steril% 10 glikoz, 0,65 ml ile 6 oyuklu plakalar içerisinde inkübe edilir 37.% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir atmosfer içinde solüsyon, pH 7.3) ° C. Bütün doku kültür reaktifler Gibco, Invitrogen edildi. </li><li> Farmakolojik tedaviler genellikle kültür ortamı için istenen konsantrasyonda ilaç ekleyerek in vitro (DIV3) içinde 3 gün sonra başlamıştır. Forbol 12-miristat 13-asetat (PMA) ve (RS) -3,5-Dihydroxyphenylglycine (DHPG) Tocris, UK edildi. Birçok ilaç, bir stok çözelti (örneğin, PMA) hazırlamakla DMSO ya da etanol kullanımını gerektirdiğinden çözücünün toplam miktarı (çukur başına 7.5 ul)% 1 aşmayacak kültür ortamına eklenen dikkat edilmelidir. Ilaç kültür ortamı her 2. veya 3. günün değişikliği ile birlikte yenilenir. </li></ol> 2. Fiksasyon ve ImmunosOrganotipik Serebellar Dilim Kültürleri temi Beyincik önemli bir avantajı antikorlar spesifik ve parlak anapara serebellar nöronların, yani Purkinje hücreleri ve granül hücreleri leke olduğunu kullanılabilir olmasıdır. Purkinje hücre dendritik morfoloji anti-kalbindin D28K ile immünboyama ortaya çıkabilmektedir. <ol><li> Kültürlerin tespit için, kültür ortamı çıkarılır ve 0.1 M fosfat tampon (pH 7.4) içinde soğuk bir% 4 paraformaldehit ve 3 ml iyi zar bağlı serebellar dilimleri ile Millicell sokmasını içeren göre dikkatli bir şekilde ilave edilmiştir. Kültürler, daha sonra gece boyunca sabit sabitleştirici kaldırılır ve kültürler fosfat tamponu ile yıkanır. </li><li> Immünboyama için aşağıdaki antikorlar kullanılır: tavşan anti-kalbindin D-28K (Swant, Bellinzona, İsviçre) 1:1000 az seçici seçici granu görselleştirmeye yönelik 1:500 de Purkinje hücreleri ve monoklonal anti-Neun (Chemicon, Millipore) görselleştirmek içinle hücreleri 12. Tavşan anti-GFP Abcam, UK yapıldı. Floresan ikincil Alexa antikorlar Molecular Probes, Invitrogen vardı. </li><li> Kültürler 0.1 M fosfat tampon solüsyonu (engelleme) içinde% 3 normal keçi serumu +% 0.3 TritonX100 ekleyerek permeabilize ile bloke edilir. Anti-kalbindin D28K ve anti-bloke etme Neun çözelti içinde seyreltilir ve kültürler hafif karıştırma altında bir gece boyunca 4 ° C&#39;de antikorlarla içeren engelleme çözeltisi ile inkübe edilir. Tüm seyreltmeler% (v / v) olarak gösterilmiştir, Triton X100, pipetle kolaylaştırmak için sırayla bir% 10 stok çözelti alınır. </li><li> Kültürler 0.1 M fosfat tamponu ile 3x durulanır ve daha sonra uygun bir ikinci antikor, örneğin, keçi anti-tavşan Alexa 568 ve keçi anti-fare Alexa 488 ile inkübe edilir +% 0.1 TritonX100 az 2 saat süreyle 0.1 M fosfat tamponu içinde 1:500 seyreltilmiş oda sıcaklığı. Kültürler daha sonra 0.1M fosfat tamponu ile 3x durulanır. </li><li> Lekeli dilimler kültür kaldırılıriyi bir fırça ile ve Superfrost artı cam slaytlar üzerine monte edilir ve uygun bir montaj aracı, örneğin Mowiol ile kaplandı. Kültürler artık Epifloresans ekipman ile düzenli bir mikroskop veya bir konfokal mikroskop ile görülebilir. </li></ol> 3. Organotipik Dilim Kültürleri Bireysel Purkinje Hücrelerinin görüntüleniyor <ol><li> Calbindin D28k ile immünboyama sonra, Purkinje hücreleri tam sitoplazması parlak dendrit ve akson içeren lekeli. Purkinje hücre tabakası Purkinje hücreleri içinde oluşan yoğun bir hizalama nedeniyle, en Purkinje hücreleri ve dendritik milleri zor bir tek hücrenin tam bir dingil çalışma yapma örtüşen edilir. Bununla birlikte, hazırlama işlemi sırasında bazı Purkinje hücreleri arasında hücre ölümü nedeniyle pek çok kültür, bazı alanlarda Purkinje hücreleri daha düşük bir yoğunluğa sahip bulunmaktadır. Bu tür alanlarda, diğer c ile örtüşmeyen bir tam dendritik çardak ile Purkinje hücreleri bulmak mümkündürarşın. Bu hücrelerde, dendritik çardak görülebilir ve Golgi boyama karşılaştırılabilecek kalitede analiz. Beyincik Purkinje hücreleri Calbindin D28K eksprese eden tek hücre tipi olduğundan hücreler de Purkinje hücreleri olarak tanımlanır. </li><li> Alternatif bir yöntem B6 türetilen kültürleri kullanmaktır; FVB-Tg (Pcp2-EGFP) 146.244Yuza / J farelerde (burada Pcp2-EGFP fareler denilen Jackson, laboratuarlar edinilebilir) Purkinje hücre belirli L7 organizatörü 11 altında EGFP ifade eden. Böyle dilim kültürlerde yaşayan Purkinje hücreleri EGFP ifadesi ile görülebilmesi. Bu zaman içinde bir tek hücre dendritik morfoloji takip etmek de mümkündür. Alternatif olarak, tespit sonrası, EGFP-Purkinje hücreleri ifade eden bir anti-GFP antikor ile immünhistokimyasal edilebilir. Her iki yöntem de boyama dendrit, hücre gövdeleri ve organotipik kültürlerinin Purkinje hücre aksonları için uygundur. Pcp2-EGFP farelerde L7 promotörü her Purkinje hücre içinde ifade edilir ve v olduğu olmadığındanfareler (Kapfhammer, veriler gösterilmemiştir) arasında Purkinje hücreleri ifade sıklığında ariations Bu farelerden elde edilen kültürlerin daha kolay diğer Purkinje hücre dendritik ağaçlar ile örtüşen dendritik ağaçlar var Purkinje hücreleri görselleştirmek ve ölçmek için yapmak dilimleyin. Dendritik ağaçlar örtüşen komşu Purkinje hücreleri ifade GFP (Şekil 1A, B) değil, ne zaman böyle dendritik ağaçlar ayrı ayrı izlenebilir. </li></ol> 4. Purkinje Hücre Dendritik Ağaç büyüklüğü ve Şube Nokta Ölçümü <ol><li> Dendritik ağaç büyüklüğü. Ağaç diğer hücreler ile çakışan değilse, Purkinje hücreleri floresan etiketleme ile, belirli bir hücre dendritik ağacının kolaylıkla ölçülebilir. Calbindin immun etiketleri tüm Purkinje hücreleri için, dendritik ağaçlar örtüşmeyen ile hücreleri tespit etmek zor olabilir. Bu durumda, Pcp2-EGFP kullanılması yeterli Purkinje hücre kimlik kolaylaştırmak için tavsiye edilirörtüşmeyen dendritik ağaçlar s. Bir örtüşmeyen dendritik ağaç ile bir Purkinje hücre tespit edildikten sonra, bu 20x lens ile görülür ve bir resim, bir dijital kamera ile kaydedilmiştir. Bu görüntü daha sonra bir görüntü analiz programı ile analiz edilebilir. Biz modu (Şekil 2A) ölçümünde sihirli değnek aracını kullanarak tek bir fare tıklaması ile hücre dendritik ağaç anahat sağlar Image Pro artı kullanın. Program daha sonra dendritik ağacın kapsadığı ve MS Excel aktarır alanı hesaplar. Verilerin istatistiksel analizi GraphPad Prism yazılımı (bkz. aşağıda) ile yapılır. </li><li> Şube noktalarının sayısı. Purkinje dendritik hücre ağaç dalı noktası yüksek dallı ve ince morfolojisi sayesinde el ile sayılır gerekir. Purkinje hücreleri 20x görüntü dosyası, Photoshop kullanarak ekran en kapsar ki bu gibi büyütülür. Sonra her dal noktası sayılır ve parlak bir nokta (Şekil 2B) ile işaretlenmiştir. </li></ol> Kültür periyodu boyunca Purkinje dendritik hücre ağaç gelişimini izlemek Purkinje hücreleri özellikle EGFP ifade Pcp2-EGFP fareler elde Organotipik kesit kültürlerinde kültür içinde birkaç gün esnasında, tek tek hücrelerin morfolojisi çalışma sağlar. Bu şekilde, kültür periyodu boyunca dendritik ağacının büyüme ve gelişme çok iyi belgelenmiş edilebilir. Yaşam tespit Purkinje hücreleri 10x objektif ile kültür periyodu boyunca her 2. veya 3. günü fotoğraflandı. Bu düşük güç hedefi flüoresan ışık ile aydınlatma nedeniyle hücrelere fototoksik hasarı önlemek ve en aza indirmek için seçildi. Şekil 3 yaşayan kültürlerin fotoğraflandı Purkinje hücre iki örnek gösterilmektedir. Ilk olarak hücre in vitro (Şekil 3, AC) içinde 7 gün kadar in vitro olarak 2 gün izlenmiştir. Açıktır ki dendritiBu süre içinde bu hücrenin c ağacı birçok yeni şube büyür ve boyutu genişletir. İkinci örnekte, bir in vitro hücre Purkinje (Şekil 3, DF) içinde 4-11 gün izlenmiştir. DIV4 mevcut küçük dendritik ağaç bu dönemde önemli ölçüde genişletir. Her iki örnek de Purkinje hücreleri ve dendritik ağacın en gerçekten kültür içinde gelişti kültür periyodu sonunda mevcut olduğunu göstermektedir. Purkinje hücre dendritik ağacın Kalkınma PKC veya mGluR1 stimülasyon tarafından inhibe edilir Organotipik serebellar dilim kültürleri 11 gün boyunca kültüre edildi. Kültürlerin bazı kültürlerde tespit edilene kadar PMA (50 nM), PKC veya DHPG (10 uM), bir agonist mGluR1 uyarıcı bir forbol ester, ya ile muamele edildi, in vitro olarak, 2. günde başlayarak. Her iki bileşik Purkinje dendritik hücre büyümesi 7, 8, 9, 5 inhibe eden ve sınırlamak için daha önceden gösterilmiştir.Tedavi edilmeyen kontrol olarak kesitler Purkinje hücreleri, anti-GFP (Şekil 4D) ile immün göre, anti-Calbindin immün (Şekil 4A) veya EGFP eksprese Purkinje hücreleri ile kültürlerinde ya da görünür hale getirildi Tipik bir büyük ve çok dallı dendritik ağaç geliştirilmiştir. PMA ile tedavi kültürlerde dendritik ağacın morfolojisi derinden değişmiş oldu. Dendritler kalınlaşmış çıktı ve sadece birkaç kısa yan dalları vardı. Pek çok Purkinje hücreleri, kontrol kültürleri içinde farklı olarak, bir birincil dendrit hücresi vücut kaynaklanan ile, artık tek kutuplu, fakat iki veya daha fazla primer dendritler (Şekil 4B, E) geliştirmiştir. Dendritik ağacın kapsadığı topraklar belirgin (bkz. aşağıda) düşürülmüştür. Benzer bir durum DHPG işlenmiş kültürler mevcut idi. Purkinje hücreleri ve dendritik ağaç boyut olarak önemli ölçüde azaltılmıştır ve dallanma belirgin bir şekilde (Şekil 4C, F) azalmıştır. Bununla birlikte, bazı Qualität da vardıive farklar PMA ile tedavi edilen kültürler ile karşılaştırıldığında. Orada dendritik dalların hiçbir kalınlaşma oldu ve birincil dendrit sinyalizasyon olaylar benzer fakat aynı olmayabilir PMA ve DHPG işlenmiş purkinje hücrelerinde devam düşündürmektedir (Şekil 4C, F) pek çok kısa ikincil dendrit taşıdı. Yukarıda tarif edildiği gibi Purkinje dendritik hücre ağaç boyut ve kantitatif değerlendirme için dal noktası Kantitatif değerlendirme, Purkinje dendritik hücre ağaç ve Purkinje hücre başına dallanma noktaları sayısı boyut ölçülür. En az üç bağımsız deneyin sonuçları bir araya toplanmış ve 20 hücreleri en az bir analiz edilmesi gerekmektedir. Kontrol deneyleri için dendritik ağaçlarıyla kaplı alanın ortalaması belirlenir ve% 100 olarak ayarlayın ve diğer deneyler için değerler buna göre yüzde değerler olarak ifade edilir edilir. Verilerin istatistiksel analizi GraphPad Prism yazılımı ile yapılır. Biz değil Çünkübelirlenen tüm değerleri bir Gauss dağılımı parçası olduğunu varsayıyorum, biz ölçülen değerlerin böyle bir dağıtım düşünmeyin istatistiksel testler kullanabilirsiniz. İstatistiksel anlamlılık için birden fazla koşul ve test karşılaştırarak, biz GraphPad Prism in Dunn son test uygulanan örneğin, gibi rütbe-tabanlı istatistikleri için post hoc testleri için uygun bir prosedür takip Kruskal-Wallis testi, kullanın. Sonuçlar genellikle çubuk grafikler halinde sunulmuştur. Böyle bir İstatistiksel değerlendirme için bir örnek Şekil 5 &#39;de verilmiştir. Dendritik ağaç büyüklüğü analizi (Şekil 5A) ve Purkinje hücre başına şube noktaları (Şekil 5B) sayısını iki kontrol koşulu ve DHPG veya PMA tedavisi arasında belirgin farklılıklar göstermektedir. Her iki parametre de Kruskal-Wallis testine göre p &lt;0.001 istatistiksel açıdan anlamlı farklıydı. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3637/3637fig1.jpg" /> Figu1 yeniden. Purkinje hücre EGFP-etiketli. Pcp2-EGFP farelerde tüm purkinje hücrelerinde ekspres EGFP. Bu nedenle, bazı Purkinje hücre dendritik ağaçlar (pozitif, A gösterildiği EGFP kanalda negatif gösterilen anti-Calbindin boyama onlar ekspres EGFP (A EGFP kanalı) ve dendritik ağaçlar örtüşen komşu Purkinje hücreleri yok olduğunda ayrı ayrı izlenebilir B kırmızı kanal içinde). Ölçek bar = 50 mikron. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/3637/3637fig2.jpg" /> Şekil 2. Purkinje hücreleri ve dendritik parametrelerin ölçümü. (A). Dendritik ağacın boyutu kolayca Görüntü analiz yazılımı Image Pro tek bir fare tıklaması ile Purkinje hücre anahat izleme artı sihirli değnek aracını kullanarak ölçülebilir. Sihirli değnek aracı hücre soma ve dendritik dalları dahil tüm dendritik ağaç tamamen hattı ile çevrili olduğu gibi kullanılır. (B). Dal noktası sayısı olduğu couPurkinje hücre görüntüleri elle nted. Her şube noktası sarı bir nokta ile işaretlenir. Ölçek bar = 50 mikron. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3637/3637fig3.jpg" /> Şekil 3. Purkinje hücre dendritik ağacın gelişimini izleme. Tespit Purkinje hücre dendritik ağacın büyümesini izlemek için art arda fotoğraflandı. (AC): Bir Purkinje hücre dendritik ağaç DIV7 kadar in vitro (DIV) 2 gün büyüyen ve gelişen. Bu kültürün dönemde dendritler sürekli büyüme ve dallanma vardır. (DF): Bir Purkinje hücre dendritik ağaç DIV11 kadar DIV4 büyüyen ve gelişen. Dendritik ağaç bu kültürün dönemde önemli ölçüde genişletir. Ölçek bar = 50 mikron. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/3637/3637fig4.jpg" /> Şekil 4. Purkinje hücre dendritik ağacın Kalkınma PKC veya mGluR1 stimulati tarafından inhibe edilir(A), (D):. gelişmiş bir dendritik ağaç Tedavisiz kontrol hücreleri. (B), (E): PMA tedavi dendrit 9 gün sonra ortaya çıkar ve kalınlaştırılmış dendritik ağaç kuvvetle boyutlu olarak azalır. Hücreler genellikle polarizasyon kaybeder ve bipolar (E) olur. (C), (F): DHPG tedavi 9 gün sonra, dendritik ağaç büyük ölçüde boyut olarak azalır. PMA tedavisinde aksine, pek çok ince ve kısa yan dallar birincil ve ikincil dendrit bulunurlar. Hücreler genellikle polarizasyon kaybeder ve bipolar (F) olur. (- F D) Pcp2-EGFP fareler elde edilen kültürlerde - (C A) ve EGFP-İfade ile Purkinje hücreleri, anti-Calbindin immün ile görüntülenmiştir. Ölçek bar = 50 mikron. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/3637/3637fig5.jpg" /> Şekil 5,. Purkinje hücre dendritik ağaç büyüklüğü ve dallanma. Nicel ölçümler kantitatif değerlendirilmesi gösteriyor ki dendritik ağaç büyüklüğü (üst çubuk grafik) ve numbe hemdallanma noktaları (alt çubuk grafik) r büyük ölçüde PMA veya DHPG tedaviden sonra azalır. Kontrolü dendritik ağaçlar ve tedavi kültürlerden Purkinje hücre dendritik ağaçlar arasındaki farklar p ile önemli &lt;0.001 idi.

<ol>
	<li>Bosman, L. W., Hartmann, J., Barski, J. J., Lepier, A., Noll-Hussong, M., Reichardt, L. F., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+TrkB+for+synapse+elimination+in+developing+cerebellar+Purkinje+cells.">Requirement of TrkB for synapse elimination in developing cerebellar Purkinje cells.</a> Brain Cell Biol. 35, 87-101 (2006).</li><li>Boukhtouche, F., Janmaat, S., Vodjdani, G., Gautheron, V., Mallet, J., Dusart, I., Mariani, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoid-related+orphan+receptor+alpha+controls+the+early+steps+of+Purkinje+cell+dendritic+differentiation.">Retinoid-related orphan receptor alpha controls the early steps of Purkinje cell dendritic differentiation.</a> J. Neurosci. 26, 1531-1538 (2006).</li><li>Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+control+of+dendritic+growth+and+development+of+cerebellar+Purkinje+cells.">Cellular and molecular control of dendritic growth and development of cerebellar Purkinje cells.</a> Prog. Histochem. Cytochem. 39, 131-182 (2004).</li><li>Kapfhammer, L. C., Doering, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+slice+cultures.">Cerebellar slice cultures.</a> Protocols for Neural cell culture. , 285-298 (2010).</li><li>Gugger, O. S., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+size+of+the+dendritic+tree+does+not+protect+Purkinje+cells+from+excitotoxic+death.">Reduced size of the dendritic tree does not protect Purkinje cells from excitotoxic death.</a> J. Neurosci. Res. 88, 774-783 (2010).</li><li>Li, J., Gu, X., Ma, Y., Calicchio, M. L., Kong, D., Teng, Y. D., Yu, L., Crain, A. M., Vartanian, T. K., Pasqualini, R., Arap, W., Libermann, T. A., Snyder, E. Y., Sidman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mediates+Purkinje+cell+dendritic+development+via+lysyl+oxidase+propeptide+and+NF-&#954;B+signaling.">mediates Purkinje cell dendritic development via lysyl oxidase propeptide and NF-&#954;B signaling.</a> Neuron. 68, 45-60 (2010).</li><li>Metzger, F., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C+activity+modulates+dendritic+differentiation+of+rat+Purkinje+cells+in+cerebellar+slice+cultures.">Protein kinase C activity modulates dendritic differentiation of rat Purkinje cells in cerebellar slice cultures.</a> Eur. J. Neurosci. 12, 1993-2005 (2000).</li><li>Schrenk, K., Kapfhammer, J. P., Metzger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+dendritic+development+of+cerebellar+Purkinje+cells+in+slice+cultures+from+protein+kinase+C?-deficient+mice.">Altered dendritic development of cerebellar Purkinje cells in slice cultures from protein kinase C?-deficient mice.</a> Neuroscience. 110, 675-689 (2002).</li><li>Sirzen-Zelenskaya, A., Zeyse, J., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+class+I+metabotropic+glutamate+receptors+limits+dendritic+growth+of+Purkinje+cells+in+organotypic+slice+cultures.">Activation of class I metabotropic glutamate receptors limits dendritic growth of Purkinje cells in organotypic slice cultures.</a> Eur. J. Neurosci. 24, 2978-2986 (2006).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. -. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).</li><li>Tomomura, M., Rice, D. S., Morgan, J. I., Yuzaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Purkinje+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting+from+transgenic+mice+that+express+green+fluorescent+protein.">Purification of Purkinje cells by fluorescence-activated cell sorting from transgenic mice that express green fluorescent protein.</a> Eur. J. Neurosci. 14, 57-63 (2001).</li><li>Weyer, A., Schilling, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+and+cell+type-specific+expression+of+the+neuronal+marker+NeuN+in+the+murine+cerebellum.">Developmental and cell type-specific expression of the neuronal marker NeuN in the murine cerebellum.</a> J. Neurosci. Res. 73, 400-409 (2003).</li></ol>

Hayvan deneyleri 24 Kasım 1986 (86/609/EEC) ve Avrupa Toplulukları Konseyi Direktifi uyarınca yapılmış ve incelenmiş ve İsviçre makamları tarafından izin verildi. Yazarlar ifşa etmek başka bir şey var.

Yöntemler organotipik serebellar dilim kültürlerde Purkinje hücre dendritik gelişimini incelemeye yarayan ve nicelik dendritik ağaç büyüklüğü ve dendritik dallanma noktaları sayısını ölçerek Purkinje hücre dendritik genişleme değerlendirmek izin Burada sunulan. Tabii ki, Purkinje hücre dendritler daha kapsamlı ve sofistike bir kantitatif analiz, toplam dendritik uzunluğunu belirlerken bir Sholl analizlere ya da dendritik ağacın fraktal boyut belirleyerek, örneğin mümkündür. Bu tür bir ana...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> Doku kültürü Uçlar </td><td> Millipore </td><td> PICM 03050 PICM ORG50 </td><td> PICMORG50 ekler düşük bir ağız var ve bir mikroskop canlı kültürleri inceleyen izin </td></tr><tr><td> MEM </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 11012044 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamax 1 </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 35050038 </td><td></td></tr><tr><td> Bazal Medum Kartal </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 41010026 </td><td></td></tr><tr><td> At serumu </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 26050070 </td><td></td></tr><tr><td> Forbol 12-myristate 13-asetat (PMA) </td><td> Tocris </td><td> 1201 </td><td></td></tr><tr><td> (RS) -3,5-Dihidroksi-fenilglisin (DHPG) </td><td> Tocris </td><td> 0342 </td><td></td></tr><tr><td> Tavşan anti-kalbindin D-28K </td><td> Swant </td><td> CB38 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Neun, klon A60 </td><td> Chemicon, Millipore </td><td> MAB377 </td><td></td></tr><tr><td> Tavşan anti-GFP </td><td> Abcam </td><td> Ab290 </td><td></td></tr></tbody></table>

the analysis of purkinje cell dendritic morphology in organotypic slice cultures

Onlar sagital düzlemde kesinlikle odaklı ve küçük kemirgenler 3 Postnatal dönemde çoğunlukla geliştiren etkileyici bir dendritik ağaç var çünkü Purkinje hücreleri, dendritik gelişim eğitimi için cazip bir model sistem vardır. Dahası, çeşitli antikorların anti-Calbindin D28K ile tüm işlemleri dahil olmak üzere, seçici olarak ve yoğun bir etiket Purkinje hücreleri, en yaygın olarak kullanılan hangi kullanılabilir. Canlı hücrelerde dendritlerin görüntülemek için, Purkinje hücreleri 11 seçici EGFP ifade farelerde Jackson laboratuarlar aracılığıyla mevcuttur. Purkinje hücre dendritik ağacın dendritik genişleme çoğu aslında kültür periyodu 4 sırasında yer alıyor, çünkü Organotipik serebellar dilim kültürlerin hücreleri Purkinje hücre dendritik gelişim kolay deneysel manipülasyon sağlar. Biz burada organotypi yetiştirilen Purkinje hücre dendritik morfoloji görüntüleme ve analiz için kısa, güvenilir ve kolay protokolü sunarızc serebellar dilim kültürleri. Birçok amaç için, Purkinje dendritik hücre ağaç hakkında nicel bir değerlendirme arzu edilir. Biz hızla ve kolayca anti-kalbindin lekeli serebellar dilim kültürleri tespit edilebilir iki parametre, dendritik ağaç büyüklüğü ve şube nokta numaraları, burada odak. Bu iki parametre Purkinje hücre dendritik ağacın değişikliklerin güvenilir ve hassas bir ölçü verir. Protein Kinaz C (PKC) aktivatör PMA ve dendritik gelişme farklılıklar görüntülenmiştir ve nicel değerlendirildi olduklarını göstermek metabotropik glutamat reseptör 1 (mGluR1) ile tedavi örnek kullanılması. Geniş bir dendritik ağaç, seçici ve yoğun immun yöntemler, dendritik mekanizmaları ifşa ettiği için Purkinje hücreleri güçlü bir model sistem haline Purkinje hücre spesifik EGFP ifadesi ile dendritik büyüme ve bir fare modeli dönemini kapsayacak organotipik dilim kültürlerin varlığının kombinasyonu gelişme.

Watch this Scientific Journal Video about The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures at JoVE.com

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Biz organotipik serebellar dilim kültürlerde yetişen bireyin Purkinje hücre dendritik ağacın morfolojisi görüntülemek ve kantitatif tayini için izin veren bir protokol mevcut. Bu protokol, Purkinje dendritik hücre gelişme mekanizmaları üzerinde çalışmalar teşvik etmek için tasarlanmıştır.

Organotipik Dilim Kültürleri Purkinje Hücre Dendritik Morfoloji Analizi

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

the-analysis-purkinje-cell-dendritic-morphology-organotypic-slice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

18.4K Görüntüleme.  University of Basel. Biz organotipik serebellar dilim kültürlerde yetişen bireyin Purkinje hücre dendritik ağacın morfolojisi görüntülemek ve kantitatif tayini için izin veren bir protokol mevcut. Bu protokol, Purkinje dendritik hücre gelişme mekanizmaları üzerinde çalışmalar teşvik etmek için tasarlanmıştır.

Video: The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3. Specifically, it affects the ability of neurons to receive inputs from other cells2 and contributes to the propagation of action potentials4,5. The morphology of the neurites also affects how information is processed. The diversity of dendrite morphologies facilitate local and long range signaling and allow individual neurons or groups of neurons to carry out specialized functions within the neuronal network6,7. Alterations in dendrite morphology, including fragmentation of dendrites and changes in branching patterns, have been observed in a number of disease states, including Alzheimer's disease8, schizophrenia9,10, and mental retardation11. The ability to both understand the factors that shape dendrite morphologies and to identify changes in dendrite morphologies is essential in the understanding of nervous system function and dysfunction.
Neurite morphology is often analyzed by Sholl analysis and by counting the number of neurites and the number of branch tips. This analysis is generally applied to dendrites, but it can also be applied to axons. Performing this analysis by hand is both time consuming and inevitably introduces variability due to experimenter bias and inconsistency. The Bonfire program is a semi-automated approach to the analysis of dendrite and axon morphology that builds upon available open-source morphological analysis tools. Our program enables the detection of local changes in dendrite and axon branching behaviors by performing Sholl analysis on subregions of the neuritic arbor. For example, Sholl analysis is performed on both the neuron as a whole as well as on each subset of processes (primary, secondary, terminal, root, etc.) Dendrite and axon patterning is influenced by a number of intracellular and extracellular factors, many acting locally. Thus, the resulting arbor morphology is a result of specific processes acting on specific neurites, making it necessary to perform morphological analysis on a smaller scale in order to observe these local variations12.
The Bonfire program requires the use of two open-source analysis tools, the NeuronJ plugin to ImageJ and NeuronStudio. Neurons are traced in ImageJ, and NeuronStudio is used to define the connectivity between neurites. Bonfire contains a number of custom scripts written in MATLAB (MathWorks) that are used to convert the data into the appropriate format for further analysis, check for user errors, and ultimately perform Sholl analysis. Finally, data are exported into Excel for statistical analysis. A flow chart of the Bonfire program is shown in Figure 1.

We have developed a computer program to analyze neuronal morphology. In combination with two existing open source analysis tools, our program performs Sholl analysis and determines the number of neurites, branch points, and neurite tips. The analyses are performed so that local changes in neurite morphology can be observed.

Çoklu Ölçeklerde Sayısallaştırılmış Nöronal Morfoloji Otomatik Sholl Analizi

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3.  Specifically, it affects the ability of neurons to ...

Nörobilim

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the strength of their connections after brief periods of strong activation. This phenomenon, known as long-term potentiation (LTP) can last for hours or days and has become the best candidate mechanism for learning and memory 2. In addition, the well defined anatomy and connectivity of the hippocampus 3 has made it a classical model system to study synaptic transmission and synaptic plasticity4.
As our understanding of the physiology of hippocampal synapses grew and molecular players became identified, a need to manipulate synaptic proteins became imperative. Organotypic hippocampal cultures offer the possibility for easy gene manipulation and precise pharmacological intervention but maintain synaptic organization that is critical to understanding synapse function in a more naturalistic context than routine culture dissociated neurons methods.
Here we present a method to prepare and culture hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. This method allows easy access to the slices for genetic manipulation using different approaches like viral infection 5,6 or biolistics 7. In addition, slices can be easily recovered for biochemical assays 8, or transferred to microscopes for imaging 9 or electrophysiological experiments 10.

We describe a method to prepare organotypic hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. Brain slices are laid on porous membranes and culture media is allowed to form an interface. This method preserves the gross architecture of the hippocampus for up to 2 weeks in culture.

Organotipik Hipokampal Dilim Kültürler

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. Since then, the technique was developed further and currently there are many different ways to prepare organotypic cultures. The method presented here was adapted from the one described by Stoppini et al. for the preparation of the slices and from Gogolla et al. for the staining procedure 3,4.
A unique feature of this technique is that it allows you to study different parts of the brain such as hippocampus or cerebellum in their original structure, providing a big advantage over dissociated cultures in which all the cellular organization and neuronal networks are disrupted. In the case of the cerebellum it is even more advantageous because it allows the study of Purkinje cells, extremely difficult to obtain as dissociated primary culture. This method can be used to study certain developmental features of the cerebellum in vitro, as well as for electrophysiological and pharmacological experiments in both wild type and mutant mice.
The method described here was designed to study the effect of apoptotic stimuli such as Fas ligand in the developing cerebellum, using TUNEL staining to measure apoptotic cell death. If TUNEL staining is combined with cell type specific markers, such as Calbindin for Purkinje cells, it is possible to evaluate cell death in a cell population specific manner. The Calbindin staining also serves the purpose of evaluating the quality of the cerebellar cultures.

This method describes the generation of organotypic cerebellar cultures and the effect of certain apoptotic stimuli on the viability of different cerebellar cell types.

Organotipik Serebellar Kültürler: Apoptotik Zorluklar ve Tayin

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex. Because of the lack of specific pharmacological agents for these channels, we have taken a genetic approach to manipulating channel expression. We use an organotypic culture preparation (16) in order to maintain cell morphology and the laminar pattern of cortex. We typically isolate acute neocortical slices at postnatal days 8-10 and maintain the slices in culture for 3-7 days. This allows us to study neurons at a similar age to those in our work with acute slices and minimizes the development of exuberant excitatory connections in the slice. We record from visually-identified pyramidal neurons in layers II/III or V using infrared illumination (IR-) and differential interference contrast microscopy (DIC) with whole cell patch clamp in current- or voltage-clamp. We use biolistic (Gene gun) transfection of wild type or mutant potassium channel DNA to manipulate expression of the channels to study their function. The transfected cells are easily identified by epifluorescence microscopy after co-transfection with cDNA for green fluorescent protein (GFP). We compare recordings of transfected cells to adjacent, untransfected neurons in the same layer from the same slice.

This is a protocol to prepare and maintain a neocortical slice preparation in organotypic culture for the purpose of making electrical recordings from pyramidal neurons.

Neokorteks bir Organotipik Dilim Hazırlık Tüm Hücre Kaydı

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These structures are rich in actin and have been shown to be highly dynamic. In response to classical Hebbian plasticity 
as well as neuromodulatory signals, dendritic spines can change shape and number, which is thought to be critical for the refinement of neural 
circuits and the processing and storage of information within the brain. Within dendritic spines, a complex network of proteins link extracellular 
signals with the actin cyctoskeleton allowing for control of dendritic spine morphology and number. Neuropathological studies have demonstrated that 
a number of disease states, ranging from schizophrenia to autism spectrum disorders, display abnormal dendritic spine morphology or numbers. 
Moreover, recent genetic studies have identified mutations in numerous genes that encode synaptic proteins, leading to suggestions that these 
proteins may contribute to aberrant spine plasticity that, in part, underlie the pathophysiology of these disorders. In order to study the potential 
role of these proteins in controlling dendritic spine morphologies/number, the use of cultured cortical neurons offers several advantages. Firstly, 
this system allows for high-resolution imaging of dendritic spines in fixed cells as well as time-lapse imaging of live cells. Secondly, this in 
vitro system allows for easy manipulation of protein function by expression of mutant proteins, knockdown by shRNA constructs, or pharmacological 
treatments. These techniques allow researchers to begin to dissect the role of disease-associated proteins and to predict how mutations of these 
proteins may function in vivo.

Numerous recent studies have identified mutations in synaptic proteins associated with brain pathologies. Primary cultured cortical neurons offer great flexibility in examining the effects of these disease-associated proteins on dendritic spine morphology and motility.

Kültür MSS Nöronlar Dendritik Omurga Morfoloji Analizi

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

The mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due to the abundance of molecular and genetic data. However, the developing mouse brain is not suitable for easy manipulation and imaging in vivo since the mouse embryo is inaccessible and opaque. Organotypic slice cultures of embryonic brains are therefore widely used to study murine brain development in vitro. Ex-vivo manipulation or the use of transgenic mice allows the modification of gene expression so that subpopulations of neuronal or glial cells can be labeled with fluorescent proteins. The behavior of labeled cells can then be observed using time-lapse imaging. Time-lapse imaging has been particularly successful for studying cell behaviors that underlie the development of the cerebral cortex at late embryonic stages 1-2. Embryonic organotypic slice culture systems in brain regions outside of the forebrain are less well established. Therefore, the wealth of time-lapse imaging data describing neuronal cell migration is restricted to the forebrain 3,4. It is still not known, whether the principles discovered for the dorsal brain hold true for ventral brain areas. In the ventral brain, neurons are organized in neuronal clusters rather than layers and they often have to undergo complicated migratory trajectories to reach their final position. The ventral midbrain is not only a good model system for ventral brain development, but also contains neuronal populations such as dopaminergic neurons that are relevant in disease processes. While the function and degeneration of dopaminergic neurons has been investigated in great detail in the adult and ageing brain, little is known about the behavior of these neurons during their differentiation and migration phase 5. We describe here the generation of slice cultures from the embryonic day (E) 12.5 mouse ventral midbrain. These slice cultures are potentially suitable for monitoring dopaminergic neuron development over several days in vitro. We highlight the critical steps in generating brain slices at these early stages of embryonic development and discuss the conditions necessary for maintaining normal development of dopaminergic neurons in vitro. We also present results from time lapse imaging experiments. In these experiments, ventral midbrain precursors (including dopaminergic precursors) and their descendants were labeled in a mosaic manner using a Cre/loxP based inducible fate mapping system 6.

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

A method to generate organotypic slices from the E12.5 murine embryonic midbrain is described. The organotypic slice cultures can be used to observe the behavior of dopaminergic neurons or other ventral midbrain neurons.

Embriyonik ventral orta beyin Organotipik Dilim Kültürler: dopaminerjik Nöronal Gelişim Eğitim Bir Sistem In vitro</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as colloidal gold can reveal the localization and distribution of specific antigens in various tissues1. The two most widely used techniques are pre-embedding and post-embedding techniques. In pre-embedding immunogold-electron microscopy (EM) techniques, the tissue must be permeabilized to allow antibody penetration before it is embedded. These techniques are ideal for preserving structures but poor penetration of the antibody (often only the first few micrometers) is a considerable drawback2. The post-embedding labeling methods can avoid this problem because labeling takes place on sections of fixed tissues where antigens are more easily accessible. Over the years, a number of modifications have improved the post-embedding methods to enhance immunoreactivity and to preserve ultrastructure3-5.
Tissue fixation is a crucial part of EM studies. Fixatives chemically crosslink the macromolecules to lock the tissue structures in place. The choice of fixative affects not only structural preservation but also antigenicity and contrast. Osmium tetroxide (OsO4), formaldehyde, and glutaraldehyde have been the standard fixatives for decades, including for central nervous system (CNS) tissues that are especially prone to structural damage during chemical and physical processing. Unfortunately, OsO4 is highly reactive and has been shown to mask antigens6, resulting in poor and insufficient labeling. Alternative approaches to avoid chemical fixation include freezing the tissues. But these techniques are difficult to perform and require expensive instrumentation. To address some of these problems and to improve CNS tissue labeling, Phend et al. replaced OsO4 with uranyl acetate (UA) and tannic acid (TA), and successfully introduced additional modifications to improve the sensitivity of antigen detection and structural preservation in brain and spinal cord tissues7. We have adopted this osmium-free post-embedding method to rat brain tissue and optimized the immunogold labeling technique to detect and study synaptic proteins.
We present here a method to determine the ultrastructural localization of synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons. We use organotypic hippocampal cultured slices. These slices maintain the trisynaptic circuitry of the hippocampus, and thus are especially useful for studying synaptic plasticity, a mechanism widely thought to underlie learning and memory. Organotypic hippocampal slices from postnatal day 5 and 6 mouse/rat pups can be prepared as described previously8, and are especially useful to acutely knockdown or overexpress exogenous proteins. We have previously used this protocol to characterize neurogranin (Ng), a neuron-specific protein with a critical role in regulating synaptic function8,9 . We have also used it to characterize the ultrastructural localization of calmodulin (CaM) and Ca2+/CaM-dependent protein kinase II (CaMKII)10. As illustrated in the results, this protocol allows good ultrastructural preservation of dendritic spines and efficient labeling of Ng to help characterize its distribution in the spine8. Furthermore, the procedure described here can have wide applicability in studying many other proteins involved in neuronal functions.

The localization and distribution of proteins provide important information for understanding their cellular functions. The superior spatial resolution of electron microscopy (EM) can be used to determine the subcellular localization of a given antigen following immunohistochemistry. For tissues of the central nervous system (CNS), preserving structural integrity while maintaining antigenicity has been especially difficult in EM studies. Here, we adopt a procedure that has been used to preserve structures and antigens in the CNS to study and characterize synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons.

Hipokampal Dilim Kültürleri Synaptic Proteinler Post-gömme immunogold Etiketleme

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During embryonic and postnatal development they actively proliferate and generate myelinating oligodendrocytes. These cells have commonly been studied in primary dissociated cultures, neuron cocultures, and in fixed tissue. Using newly available transgenic mouse lines slice culture systems can be used to investigate proliferation and differentiation of oligodendrocyte lineage cells in both gray and white matter regions of the forebrain and cerebellum. Slice cultures are prepared from early postnatal mice and are kept in culture for up to 1 month. These slices can be imaged multiple times over the culture period to investigate cellular behavior and interactions. This method allows visualization of NG2 cell division and the steps leading to oligodendrocyte differentiation while enabling detailed analysis of region-dependent NG2 cell and oligodendrocyte functional heterogeneity. This is a powerful technique that can be used to investigate the intrinsic and extrinsic signals influencing these cells over time in a cellular environment that closely resembles that found in vivo.

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

Organotipik Dilim Kültürler Oligodendrosit Dinamikler ve miyelinasyonun incelemek için

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional deficits in the affected patients. Despite intensive research efforts, there is still no effective treatment option available that reduces neuronal injury and protects neurons in the ischemic areas from delayed secondary death. Research in this area typically involves the use of elaborate and problematic animal models. Entorhino-hippocampal organotypic slice cultures challenged with oxygen and glucose deprivation (OGD) are established in&#160;vitro models which mimic cerebral ischemia. The novel aspect of this study is that changes of the brain blood vessels are studied in addition to neuronal changes and the reaction of both the neuronal compartment and the vascular compartment can be compared and correlated. The methods presented in this protocol substantially broaden the potential applications of the organotypic slice culture approach. The induction of OGD or hypoxia alone can be applied by rather simple means in organotypic slice cultures and leads to reliable and reproducible damage in the neural tissue. This is in stark contrast to the complicated and problematic animal experiments inducing stroke and ischemia in vivo. By broadening the analysis to include the study of the reaction of the vasculature could provide new ways on how to preserve and restore brain functions. The slice culture approach presented here might develop into an attractive and important tool for the study of ischemic brain injury and might be useful for testing potential therapeutic measures aimed at neuroprotection.

A protocol for entorhino-hippocampal organotypic slice cultures, which allows reproducing many aspects of ischemic brain injury, is presented. By studying changes of the neurovasculature in addition to changes in the neurons, this protocol is a versatile tool to study plastic changes in neural tissue after injury.

Içinde Neurovascular Yaptırma Analizi Entorhino-hipokampal Organotipik Dilim Kültürler

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly controlled formation and maintenance of complex neuronal networks are not completely understood thus far. The open questions concerning neurons in health and disease are diverse and reaching from understanding the basic development to investigating human related pathologies, e.g.,&#160;Alzheimer&#39;s disease and&#160;Schizophrenia. The most detailed analysis of neurons can be performed in vitro. However, neurons are demanding cells and need the additional support of astrocytes for their long-term survival. This cellular heterogeneity is in conflict with the aim to dissect the analysis of neurons and astrocytes. We present here a cell-culture assay that allows for the long-term cocultivation of pure primary neurons and astrocytes, which share the same chemically defined medium, while being physically separated. In this setup, the cultures survive for up to four weeks and the assay is suitable for a diversity of investigations concerning neuron-glia interaction.

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

This protocol describes the indirect neuron-astrocyte coculture for compartmentalized analysis of neuron-glia interactions.