Organotipik dilim kültürü nörogelişimsel ve dejeneratif veya rejeneratif süreçleri incelemek için güçlü bir araçtır. Bu teknik, aday molekülleri nöroprotektif potansiyellerine göre hızla taramak için kullanılabilir. Doku seti mimarisi ve doğal hücre-hücre bağlantıları bölümlerin düzlemleri içinde korunduğundan, bu yöntem, ayrışmış birincil hücre kültürlerine kıyasla invivo koşullarda yakından taklit eder.
Burada gelişmekte olan beyincik Purkinje hücre ölümü çalışma göstermektedir. Ama organotipik dilim kültürü eşit hemen hemen her merkezi sinir sistemi bölgesinde nörodejeneratif hastalıkların modellemek için uygundur. Jennifer Rakotomamonjy ile prosedürü gösteren Sean McDermott, benim laboratuvar bir teknisyen olacaktır.
Serebellar dilimhasat önce, sterilleştirilmiş bir biyogüvenlik kabininde, vakum filtreli kültür ortamı bir mililitre ile altı kuyukültür plaka her kuyu doldurun ve tedavi kuyuları ilgi farmakolojik ajan ekleyin, ve kontrol kuyuları araç eşit hacimli. Steril forsepskullanarak, her kuyuya 0,4 mikrometre lik gözenek boyutunda PTFE membran filtre yerleştirin, her bir membran ın ve ortamın arabirimindeki kabarcıkları önlemeye özen gösterir ve ortayı 37 derece santigrat ve %5 karbondioksit kuluçka makinesinde iki saat boyunca dengeleyin. Beyincik hasat etmek için, burun tarafından yavru başını kavramak için düz pansuman forceps kullanın, ve orta hatta yanal arka ucundan kafa derisi açmak kesmek için düz göz makası kullanın.
Aynı şekilde kafatasını kesin, serebellumzarar önlemek için dışa makas ipuçları işaret, ve soğuk HBSS ve glikoz mililitre başına beş miligram içeren 60 milimetrelik bir çanak beyin aktarmak için bir spatula kullanın. Dikkatle beyincik dışarı incelemek için düz pansuman forceps kullanın ve bir doku helikopter kesme masasında plastik bir disk üzerine doku yerleştirmek için steril kavisli ince forceps kullanın. Parasagittal kesitlerin edinimine izin vermek için dokuyu yönlendirmek için kesme masasını döndürün ve bıçak dokunun kenarına yerleştirilene kadar kesme masasını hareket ettirmek için masa serbest bırakma tonunu sağa çekin.
Daha sonra dilim kalınlığını 350 mikrometreye, bıçak hızını orta hıza ayarlayın ve helikopteri çalıştırın. Tüm beyincik dilimlendiğinde helikopteri kapatın. Steril forceps kullanarak, yeni bir 60 milimetrelik çanak üzerinde disk tutun.
HbSS artı glikozu diskin üzerine yıkamak için bir transfer pipeti kullanın, böylece dilimler yemeğin içine düşer. Daha sonra, numunelere mümkün olduğunca az dokunmak, dilimleri ayırmak için bir mikroprob kullanın. Vermisyakın beyincik bölümlerini altı kuyu plakadaki tek tek hücre kültürü uçlarına seçmek için transfer pipetini kullanın ve dilimleri her kesici ucun ortasına yerleştirmek için mikroprobu kullanın.
Tüm dilimler yerleştirildiğinde, herhangi bir fazla HBSS artı glikozu dikkatlice aspire edin ve plakayı hücre kültürü kuluçka makinesine geri döndürün. İmmünofloresan boyama için, her kuyudan supernatant çıkarın ve PBS ile ekler yıkayın. Dilimleri her kesici uç kuyunun kuyusında bir mililitre soğuk %4 paraformaldehit ve her bir kesici ucun üzerine bir saat boyunca 500 mikrolitre ile sabitleyin.
Fiksasyonun sonunda, kesici uçları her kesicinin altında bir mililitre taze PBS ve her bir kesici nin üzerine 500 mikrolitre taze PBS ile 10 dakika boyunca dört kez yıkayın. PBS-TB 500 mikrolitre ile 24 kuyuplaka her kuyu önceden doldurun ve 24-iyi plaka bireysel kuyular eklemek her hücre kültüründen serebellar dilimleri aktarmak için bir paintbrush kullanın. Permeabilize ve bir saat oda sıcaklığında dilimleri bloke.
Kuluçka sonunda, orbital shaker üzerinde dört derece santigrat de iyi bir gecede pBS-TB seyreltilmiş ilgi birincil antikor 200 mikrolitre ile hücreleri etiket. Ertesi sabah, dilimleri 10 dakika boyunca dört kez yıkayın ve shaker üzerinde yıkama başına taze PBS 500 mikrolitre, shaker oda sıcaklığında iki saat boyunca uygun florofor konjuge ikincil antikorlar ile etiketlemeden önce, ışıktan korunan. Kuluçka sonunda, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca kuyu başına uygun bir nükleer leke 500 mikrolitre ile kesitler karşı leke, ışıktan korunmuş.
Ve cam slaytlar üzerine dilimleri monte etmek için bir transfer pipet kullanın. Daha sonra PBS ile rehydrating ve montaj ortamı yaklaşık 80 mikrolitre ile kaplı kapakları ile dokuları montaj önce bölümleri tamamen kurumasına izin verin. Montaj ortamı iyileştikten sonra serebellar kesitler görüntülenmeye hazırdır.
Doğum sonrası altıncı günde, Purkinje hücre sağkalım kontrol örnekleridüşük, bilinen güvenlik açığı penceresi ile tutarlı. Donör hayvan yaşlandıkça ve bu kritik dönemden çıktıkça hayatta kalma artar. Yüksek potasyum klorür konsantrasyonu ile serebellar dilimlerin tedavisi, depolarizasyon ve sağkalımların başarılı bir şekilde indüksiyonu ile sonuçlanır.
Tutarlı ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için sağlıklı serebellar kesitler seçmek ve kültür kurulumünü mümkün olduğunca verimli bir şekilde gerçekleştirmek çok önemlidir. Kültür sonrası uygulamalar immünoresans ötesine geçer. Organotipik dilimler genom protein ekspresyonu çalışmaları için ve elektrofizyoloji ve kalsiyum canlı görüntüleme kullanarak nöronal devre aktivitesinin izlenmesi için kullanılabilir gibi.
