Biz yararlı tartışmalar için Alto laboratuar üyelerine teşekkür. Biz de teknik uzmanlık ve danışmanlık için UT Southwestern Tıp Merkezi, özellikle Dr Chris Gilpin, Tom Januszewski, ve Laurie Mueller de Moleküler ve Hücresel Görüntüleme Tesis ederim. Biz de elyazmasının eleştirel okuma için Dr Xionan Dong ederim. Bu çalışma NMA için NIH hibe AI083359 tarafından desteklenmektedir

1. Memeli Hücre Kültürü <ol><li> Normal Sıçan Böbrek (NRK), (herhangi bir reaktif için Tablo 1&#39;e bakınız veya hücre yemekleri yaşamak yapıştırılmış photoetched cam gridded lamelleri üzerine serviks kanseri (HeLa), ya da diğer uygun memeli hücre hatları 37 kültüre ° C,% 5 CO 2, ölümsüzleştirdi aparatı DMEM +% 10 FBS) Bu protokolde kullanılan ve% 1 Kalem / Strep. Önlemler kültürlü memeli hücreleri ile çalışırken steril bir ortam sağlamak için alınmalıdır. </li><li> Deneme zaman hat (0-5 saat vs 1-2 gün sonra enjeksiyon) bağlı olarak, hücrelerin ~% 50 oranında konfluent için ayarlanabilir ya da sırasıyla,% 25 ~ olmalıdır. </li></ol> 2. Mikroenjeksiyon <ol><li> ~ 50 ul son hacim için, hücre kültürü için kendi amenability bağlı olarak, tampon tercih istenilen protein, DNA, veya küçük moleküller hazırlayın. Gibi Texas Kırmızı veya Cascade Blue olarak İnert floresan boyalarenjekte edilen hücreleri işaretlemek için dahil edilir; enjeksiyon boya ve floresan prob seçimi örtüşmeyen eksitasyon ve emisyon dalga boylarında olmalıdır. Mikroenjeksiyon için ihtiyaç duyulan ilgi, molekülün konsantrasyon ampirik olarak tespit edilmesi gerekmektedir ve floresan boyalar genel olarak takip 0.5-1.0 mg / ml &#39;de kullanılmıştır. Tipik olarak, rodamin ya da başka bir florofor ile kovalent bağ tespit ancak diğer yöntemler hassasiyetine bağlı olarak kullanılabilecek, ticari bir kit kullanılarak, ilgi molekülüne bağlanır. Daha fazla bilgi için, aşağıdaki kritik konuları. </li><li> 0.22 mikron santrifüj filtre yoluyla enjektör (~ 50 ul) filtreleyin. Santrifüj filtreleri vakum ve / veya ölü cilt ilişkilendirdiğiniz şırınga filtrasyon tercih edilir. </li><li> Mikroenjeksiyon iğne oluşturmak için, borosilikat cam pipetler bir Flaming-Brown Mikropipet Çektirme aşağıdaki üreticilerin yönergeleri kullanarak çekilir. Alternatif olarak, mikroenjeksiyoniğneler femtotip mikroenjeksiyon iğne yapar Eppendorf dahil satıcılardan satın alınabilir. </li><li> Dikkatlice Eppendorf 20 Femtotips kullanılarak mikroenjeksiyon iğnenin ucunu içine rahat bırakılmış enjektör 4 ul pipetle. Hava kabarcığı çekti mikroenjeksiyon iğne içinde mevcut olduğundan emin olun. Bir inverted mikroskop bağlı Eppendorf FemptoJet InjectMan arasında mikromanipülatör kolu içine mikroenjeksiyon iğne yerleştirin. Mikroenjeksiyon işlemi iyi bir inceleme için, okuyucu görüntülenmiştir Deneyler Madde 8 önceki Dergisi yönlendirilir. </li><li> Ters Zeiss mikroskop çanak tutucu içine gridded lamel ve kültür hücrelerinin canlı hücre tabak koyun. Bir photoetched ızgara içinde büyüyen hücreleri bulun ve ızgaralar alfanümerik tanımlayıcı unutmayın, bu sonraki tüm adımlarda kullanılacaktır. Daha sonraki adımlar lamel kenarlarında örnek transferi sınırlar İdeal olarak, lamel merkezinde hücreleri bulun. </li><li> Elle düşük enjeksiyon lamel üzerinde yerine kol ve ucu hafifçe kültür hücreleri ve bu noktanın ötesinde iğne hareketini önlemek için basın &#39;Limit yüzeyine temas edene kadar mikromanipülatör joystick ve kontrolleri, düşük enjeksiyon iğne aşağı kullanarak ve böylece kırılgan kırılma borosilikat cam çekti. Hücre mikroenjeksiyon tüm diğer yönleri Eppendorf FemtoJet InjectMan kullanım kılavuzuna göre yapılır. Mikroenjeksiyon tekniği son zamanlarda bakteri 9, tek tek salgılanan proteinleri ölümcüllük anlamak için kullanılmıştır. </li><li> Seçilen ızgara içinde her iki hücreden Microinject. Hücreler konfluense ~% 50 yetiştirilen ile, bir 600 mikron 2 ızgara başına ~ 80 hücreleri (örneğin Şek. 3A) beklenebilir. Bu nedenle, floresans ve elektron mikroskopi incelenmesi üzerine, ~ 30-40 deney ve kontrol hücresi, bir n olacaktır. </li><li> İstenilen için memeli hücre kültürü inkübatör içine geri canlı hücre tabak koyunzaman olarak deney düzeneği tarafından dikte. Alternatif olarak, bir önceki fiksasyon ilgi özellikle hücre içi yapıların görünümünü bekleyecektir mikroenjeksiyon zaman atlamalı mikroskopi analizi doğrudan geçebilirsiniz. </li></ol> 3. Floresan Mikroskopi <ol><li> Eğer istenirse, enjekte edilen hücrelerin canlı hücre hızlandırılmış floresans ölçümleri gerçekleştirmek, bundan sonra, 0.1 M cacodylate tampon maddesi (pH 7.4) içinde% 2.5 glutaraldehid ile medya değiştirmek ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edilir. Canlı hücre ölçümlerinin gerekli değildir, ancak hücre büyüme ortamı olarak atmak ve 10 dakika için oda sıcaklığında 1xPBS içinde 5 ml% 3.7 formaldehit ile hücrelerin düzeltmek. Sabitleştirici atın ve 5 ml 1xPBS ile değiştirin, 3.2 adıma geçin. Not: floresan mikroskobu tamamlanana kadar sonra glutaraldehit eklemek değil önemlidir. </li><li> Bir floresan mikroskop photoetched gridded lamel ile canlı hücre tabak koyun (konfokal thi için gerekli değildirs adım) ve hücrelerin düzenlenmesi (Şekil 4A) belgelemek için 5-10 parlak alan ve uygun ızgara floresan görüntüler toplamak. Atıl enjeksiyon boya (Şekil 4B) ve eksitasyon ve emisyon dalga boyları kullanılarak mikroenjeke edilmiş olan hücrelerin belirlenmesi. Bu elektron mikroskobu içeren sonraki adımlarda enjekte edilen hücrelerin tanımlanması kolaylaştırmak için farklı büyütme (örneğin 10x ve 65X) de görüntüler elde etmek için önemlidir. </li><li> Bir konfokal floresan mikroskop kullanarak yukarıdaki adımı 2,5 tanımlanan ızgara içinde enjekte edilen hücrelerin bir Z-yığın toplamak. Yüksek büyütme (100x) elektron mikroskobu ile tespit edilecek Subselüler yapılar floresan görüntüler korele için gereklidir. </li><li> Lamelleri ticari olarak temin lamel kaldırma sıvı ile canlı hücre yemekler alt çıkarıldı ve 5 ml&#39;lik bir işlenmemiş hücre kültürü çanağı içinde hücre tarafı yukarıya yerleştirilir1xPBS. Aşağıda ayrıntılı olarak lamel sonra elektron mikroskobu için işlenir. </li></ol> 4. Transmisyon Elektron Mikroskobu <ol><li> 0.1 M cacodylate tampon maddesi (pH 7.4) içinde 2 ml% 2.5 glutaraldehid ile 1xPBS tampon değiştirin ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. Uzun inkübasyon, gerekli değil ise, hücre içi yapıların bakım yardımcı olacaktır. Not: yalnız formaldehit EM analiz için yeterli bir sabitleştirici değildir. </li><li> Cacodylate tampon ile üç yıkamadan ve ardından 30 dakika süre ile 0.1 M cacodylate tampon içinde 2 ml% 1 osmiyum tetroksit ilavesi ile sabitleştirici ve leke hücreleri çıkartmak ve son olarak GKD 2 O. Tüm tampon değiştirmek </li><li> Standart EM protokoller sonrasında, etanol kademeli (% 70 ila% 100) seri numune kurutmak. Bir EPON reçine dolu tüpün üstüne EPON reçine ve yer lamel hücre tarafı aşağı hazırlayın. 60 saat için 24 ° C polimerizasyon sahip Photoetched gridded lamel hücre tarafı do yerleştirerekEPON Reçine üzerine WN, ilgi duymaları nedeniyle ızgara deseni hücrelerinin her ikisi de (örneğin, Şek. 3B), polimerizasyon sırasında EPON Reçine aktarılır. </li><li> Hızlı bir şekilde sıvı azot ve / veya kaynar su içine batırılarak EPON reçine lamelleri çıkarın. Ilgi ızgara (: ızgara kalıbında bir ayna görüntüsü olarak yönlendireceğiz notu) bulmak için bir binoküler diseksiyon kapsamında reçine yüzeyini inceleyin. Ilgi sadece ızgara EPON reçine bloğun tepesinde olduğu gibi aşağı steril bir jilet veya neşter, Döşeme EPON bloğu kullanma. </li><li> Bir ultramicrotome kullanarak, istenilen kalınlıkta (tomografik TEM için konvansiyonel TEM ve ~ 250 nm kalınlık için ~ 70 nm kalınlığında) de kesilmiş blok seri kesitler elde. Standart protokoller izleyerek uranil asetat ve kurşun sitrat ile Kontrast bölümleri. </li></ol> 5. Korelatif Işık ve Elektron Mikroskobu <ol><li> Ilgi hücreleri konumlandırmakgörüntüler kullanan elektron mikroskobu önceki adımda elde. İlgi kez microinjected hücreleri bulunan sonra, ilgi vardı hücre içindeki bölgeleri tanımlamak için yüksek çözünürlüklü konfokal floresan görüntülerini kullanın. TEM kullanarak yüksek çözünürlükte görüntü bu. Böyle hücre periferinde ve floresan z-yığını görüntüsü EM dilim karşılık belirlemek için nükleer zarf gibi önemli noktalara kullanın. </li><li> Seçtiğiniz görüntüleme programı (örneğin, Resim J, Adobe Photoshop, vb) kullanarak,% 50 floresan görüntü opacity azaltmak ve ilişkilendirir hangi ile TEM görüntünün üstüne yerleştirir. Ölçeği ayarlama (oranlarını ve alıkoymak için unutmayın) ve TEM görüntü maç konfokal görüntü dönüşü ile görüntüleri hizalayın. Floresan görüntüde kontrast, keskinlik, vb İnce ayarlamalar uyum yardımcı olabilir. Not: bu Heterokromatin, nükleer zarf, ve hücre çevre yardımcı olmak için iyi bir görülecek temsil olduğunu buldukİki görüntünün yönde. </li></ol> 6. Eleştirel Düşünceler <ol><li> Büyük ölçüde enjekte küçük molekül bulma yardımcı olmak için, bu tür Rodamin veya floresein gibi bir floresan etiketi kovalent ticari kitler kullanılarak eklenebilir. Ek bilgi ektopik öncesinde mikroenjeksiyon için floresan hücre içi lokalizasyonu belirteç proteini ifade ederek kazanılır. Bu nedenle, floroforlar ve atıl mikroenjeksiyon izleme boya seçimi önemlidir. </li><li> Yakın lamel merkezine yapışmış olan mikroenjeksiyon için hücreleri seçin ve kenarına yakın bir tablo seçerek kaçının. Bu ilgi hücreleri elektron mikroskopi için kullanılan EPON Reçine aktarılır olduğu en büyük ihtimal sunacaktır. </li><li> Hücrelerin konfluense iun önemli bir tamamen konfluent plaka çok zor elektron mikroskobu enjekte edilen hücrelerin tanımlama yapmak gibi. Aksine, tohum hücreleri gibi kısa bir deney günü ~ 50% konfluent ulaşmak veya daha uzun gün (1-2 gün) deney üzerinde ~ 25% konfluent. Olduğunu Konum ve şekil hücrelerin yanı sıra yönlendirmek için işareti olarak &quot;boş alan elektron mikroskop görüntüsü kullanın. </li><li> Konfokal optik kesit kalınlığı deney ihtiyaçlarına ayarlanmış olmalıdır ve bu nedenle deneysel olarak 10 tespit edilmesi gerekmektedir. </li><li> Fiksatif formaldehit ve gluteraldehit mevcut en yüksek saflıkta olmalıdır. Formaldehit proteinleri ve küçük floresan molekülü (örneğin Rodamin veya FITC gibi) hem de floresans özellikleri korumak, henüz hücreleri çözecektir. Bununla birlikte, bu yapıların yüksek EM çözünürlüğe izin vermek için korumaz. Glutaraldehit analy EM için yüksek derecede membranları ve hücre içi yapıları korursis, ancak önemli ölçüde floresans engel olacaktır. Bu nedenle, iki aşamalı bir tespit iki floresan için büyük önem taşımaktadır ve EM mikroskopisi. Nihai fiksasyon glutaraldehit tedavi ile yapılabilir gibi formaldehit fiksasyon adım, canlı hücre ölçümleri gerçekleştirilirken atlanabilir. </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar Bu işlem doğrudan ökaryotik hücre sitoplazma içine ilgi bir molekül teslim ve çok nanometre çözünürlükte milimetre gelen hücresel ve organeller mimarlığa lokalizasyonu ve / veya etkilerini izlemek olanağı tanıyor. Deneysel düzenek ve işlem şematik bir resmidir Şekil 2 &#39;de gösterilmiştir. Bu teknik (Şek. konfokal mikroskopi sonra, EPON Reçine ilgi gibi ızgara deseni hücrelerinin her iki transfer etmek için mümkün olan bir lazer kazınmış cam lamel ızgara (Şekil 3A), yetişen hücre mikroenjeksiyon üzerine dayanır3B). Tipik bir mikroenjeksiyon CLEM prosedürü edildiği zaman, hücre içi lokalizasyonu ve ultrastrüktürel analizi hem izin floresans görüntüleri ve elektron mikroskop, verir. Bir photoetched cam lamel ızgara üzerinde yetiştirilen hücreler parlak alan görüntüleri elde edilmektedir sonra ilgi çekici bir molekül (Şekil 4A) ile mikroenjeke edilir. Bir atıl izleme boya olmayan enjekte edilen hücreleri (Şekil 4B) dan enjekte edilen hücre ayırt etmek için dahil edilmiştir. Konfokal z-yığınları bir florofor ya da ilgi enjekte edilen küçük molekül (Şek. 4C) bağlı başka bir tanımlayıcı ile elde edilir. Örnek glutaraldehit ile tespit ve elektron mikroskobu için işlenir. Elektron mikroskop karşılık geldikleri hücreleri (Şekil 4D) üzerine elde edilen ve üst üste. Floresan sinyallerini barındıran bölgeleri (Şekil 4E yüksek büyütmede daha detaylı olarak incelenir </strong&gt;). <img src="/files/ftp_upload/3650/3650fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1. Mikroenjeksiyon CLEM prosedürü Timeline. Deney düzeneği bağlı olarak, mikroenjeksiyon ve floresans ölçümleri aynı gün içinde gerçekleştirilebilir. Elektron mikroskobu için numune hazırlama uzun inkübasyonlar adımlara en zaman alıcı nedeniyle ve 2-3 gün sürecek. TEM analiz ve elektron mikroskopi ile görüntü flöresan sinyalleri korele bir gün içinde gerçekleştirilebilir. <img src="/files/ftp_upload/3650/3650fig2.jpg" alt="Şekil 2,"/> Şekil 2 mikroenjeksiyon CLEM prosedürü Genel illüstrasyon Adım 1:.. Lazer kazınmış cam gridded lamel üzerinde büyüyen hücreleri bulup ilgi molekülü microinject Adım 2:.. Parlak bir alan görüntüler ve enjekte edilen hücrelerin konfokal floresan z yığınları hem Yakalama Adım 3: hazırlamakEM için lamel analiz ve EPON reçine gömün. Transfer ızgara deseni kullanarak, ilgi öyle ki hücreler bloke Döşeme apekste şunlardır Adım 4:. Ultramicrotome ile seri kesitler Cut Adım 5:. EM görüntüleri ile floresan görüntüler ilişkilendirir. <img src="/files/ftp_upload/3650/3650fig3.jpg" alt="Şekil 3"/> . Şekil 3. Izgara desen ilgi hücrelerinin belirlenmesini kolaylaştıran Panel A ~ 50% konfluent yetiştirilen hücreler mikroenjeksiyon gösteriyor;. Izgara tanımlayıcı aK unutmayın. Ölçek çubuğu 100 mikron. Panel B ilgi ızgara bir diseksiyon mikroskobu tespit edildikten sonra seri kesitli olacaktır polimerize EPON reçine blok üzerine lamel gelen transfer ızgara deseni gösterir. Panel C kesit için hazırlık transfer ızgara deseni gösterir . Transfer ızgara patter reçine blok üzerinde ters olduğunu unutmayın; scale bar 1200 mikron. <img src="/files/ftp_upload/3650/3650fig4.jpg" alt="Şekil 4,"/> .. Şekil 4 mikroenjeksiyon korelatif ışık ve elektron mikroskobu Temsilcisi sonuçları Panel A lazer kazınmış cam gridded lamel üzerinde büyüyen NRK hücreleri aydınlık alan mikrografı gösterir; ok paneller CD CLEM tarafından görüntülenmiştir iki hücre göstermektedir Panel B floresans gösterir. atıl izleme boya, bu durumda Cascade Blue, microinjected hücreleri belirlemek için kullanılır. Panel C parlak saha tabakasını ve bir Rodamin-etiketli küçük molekülün flüoresan imza göstermektedir. Burada gösterilen iki hücre A ve B. Panel D parlak alan, floresan ve elektron mikroskobu CLEM temsil panellerinde oklarla gösterilir;. Ok başı floresan punktumlarda Panosu E yüksek büyütmede görüntülü işaret Ölçek çubuklar fol gibidiralçak: Paneller A &amp; B, 100 mikron; C &amp; D, 50 um, E, 100 nm.

<ol>
	<li>Schmolze, D. B., Standley, C., Fogarty, K. E., Fischer, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+microscopy+techniques.">Advances in microscopy techniques.</a> Arch. Pathol. Lab Med. 135, 255-263 (2011).</li><li>Giepmans, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridging+fluorescence+microscopy+and+electron+microscopy.">Bridging fluorescence microscopy and electron microscopy.</a> Histochem. Cell Biol. 130, 211-217 (2008).</li><li>Mayhew, T. M., Muhlfeld, C., Vanhecke, D., Ochs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+recent+methods+for+efficiently+quantifying+immunogold+and+other+nanoparticles+using+TEM+sections+through+cells,+tissues+and+organs.">A review of recent methods for efficiently quantifying immunogold and other nanoparticles using TEM sections through cells, tissues and organs.</a> Ann. Anat. 191, 153-170 (2009).</li><li>Razi, M., Tooze, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light+and+electron+microscopy.">Correlative light and electron microscopy.</a> Methods Enzymol. 452, 261-275 (2009).</li><li>Svitkina, T. M., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light+and+electron+microscopy+of+the+cytoskeleton+of+cultured+cells.">Correlative light and electron microscopy of the cytoskeleton of cultured cells.</a> Methods Enzymol. 298, 570-592 (1998).</li><li>van Weering, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+membrane+traffic+at+high+resolution.">Intracellular membrane traffic at high resolution.</a> Methods Cell Biol. 96, 619-648 (2010).</li><li>Polishchuk, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light-electron+microscopy+reveals+the+tubular-saccular+ultrastructure+of+carriers+operating+between+Golgi+apparatus+and+plasma+membrane.">Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane.</a> J. Cell Biol. 148, 45-58 (2000).</li><li>Lim, J., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Cell+Imaging+of+F-actin+Dynamics+via+Fluorescent+Speckle+Microscopy+(FSM).">Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM).</a> J. Vis. Exp. (30), e1325 (2009).</li><li>Selyunin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+assembly+of+a+GTPase-kinase+signalling+complex+by+a+bacterial+catalytic+scaffold.">The assembly of a GTPase-kinase signalling complex by a bacterial catalytic scaffold.</a> Nature. 469, 107-111 (2011).</li><li>Semwogerere, D., Weeks, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Confocal Microscopy in Encyclopedia of Biomaterials and Biomedical Engineering. , (2005).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan edilir.

Burada sunulan yöntem ökaryotik sitoplazmaya saflaştırılmış proteinler, nükleik asitler, veya küçük moleküllerin doğrudan teslim edilmesini sağlayan ve floresan ve elektron mikroskobu korelasyon yoluyla ultra yüksek çözünürlük analizi tanıyor. Bu yöntemin kullanılması basit ama sağlam ve çok sayıda mevcut temel tesisleri ve / veya uygun bir alet elektron mikroskopisi laboratuarları ile in-house gerçekleştirilebilir. Tekniği kullanıcının gerçek zamanlı floresan etiketli moleküllerin d...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Photoetched lamel ve Canlı hücre Plakalı </td><td> Mattek </td><td> P35G-2-14-CGRD </td><td></td></tr><tr><td> Texas Red </td><td> Invitrogen </td><td> D3329 </td><td></td></tr><tr><td> Cascade Mavi </td><td> Invitrogen </td><td> D7132 </td><td></td></tr><tr><td> Rodamin Etiketleme Kiti </td><td> Thermo Scientific </td><td> 53002 </td><td></td></tr><tr><td> 0.22 mikron santrifüj ile filtrasyon ünitesi </td><td> Millipore </td><td> UFC30GV00 </td><td></td></tr><tr><td> Borosilikat Cam Pipetler </td><td> Sutter Aletleri </td><td> BF100-50-10 </td><td></td></tr><tr><td> Mikropipet Çektirme </td><td> Sutter Aletleri </td><td> Model P-97 </td><td> Rampa testi yaptıktan sonra programı # 4 kullanın </td></tr><tr><td> FemtoJet Mikroenjeksiyon Sistemi </td><td> Eppendorf </td><td> InjectMan NI2 </td><td></td></tr><tr><td> Lamel Temizleme Sıvısı </td><td> Mattek </td><td> PDCF OS 30 </td><td></td></tr><tr><td> Technai Transmisyon Elektron Mikroskobu </td><td> FEI </td><td> Technai G2 BioTWIN </td><td></td></tr><tr><td> Ultramicrotombe </td><td> Leica </td><td> EM UC6 </td><td></td></tr></tbody></table>

correlative light and electron microscopy (clem) as a tool to visualize microinjected molecules and their eukaryotic sub-cellular targets

Ökaryotik hücre, kompleks dayanan son derece düzenlenir ve uygun hücre fonksiyonu için gerekli olan biyokimyasal polarite koruma işlevsel farklı membrana bağlı bölmeleri. Enzimler, proteinler ve hücre iskelet yapısı bu biyokimyasal segregasyon yöneten ve bakımını nasıl anlamak büyük önem taşımaktadır. Floresan etiketli moleküllerin kullanımı veya perturb Subselüler bölmeleri bilgi hazinesi vermiştir ve hücresel düzenleme anlayışımızı ilerlemiştir ve / yerelleştirilmesine. Böyle floresan ve konfokal mikroskopi gibi görüntüleme teknikleri nispeten basit bir floresan etiketli küçük molekülün konumunu ascertaining olun, çok küçük yapıların ancak çözünürlük 1 sınırlıdır. Diğer taraftan, elektron mikroskobu çok yüksek çözünürlükte Subselüler morfoloji detayları ortaya koymuştur, ancak statik doğa zor derece dinamik yanlısı ölçmek için yaparHassas 2,3 ile lerle. Böylece, aynı numunenin elektron mikroskobu, adlandırılır Korelatif Işık ve Elektron Mikroskobu (CLEM) 4,5 ile ışık mikroskobu birleşimi, elektron mikroskobu 6 yüksek çözünürlüklü ultrafast floresan görüntüleme ikili avantajları tanıyor. Bu güçlü teknik hücre biyolojisi 5,7 birçok yönlerini incelemek amacıyla uygulamaya konmuştur. Kuruluşundan bu yana, bu prosedür yüksek çözünürlükte Subselüler mimarileri ve morfolojileri ayırt yeteneğimizi artmıştır. Burada, CLEM (Şekil 1), ardından hızlı mikroenjeksiyon gerçekleştirilmesi için düzenlenmiş bir yöntem sunulmaktadır. Mikroenjeksiyon CLEM işlem doğrudan ökaryotik hücre sitoplazması içine küçük molekülleri ve / ya da proteinlerin spesifik miktarlarda tanıtmak ve (Şek. 2), çok nm çözünürlüğe kadar milimetre olan etkilerini incelemek için kullanılabilir. Bu teknik, microinjecting dayanmaktadırhücreler hem konfokal floresan ve elektron mikroskobu ile canlı hücre yemekleri ve görüntüleme altına yapıştırılmıştır lazer kazınmış cam gridded lamelleri üzerine büyüdü. İlgi hücre lokalizasyonu (ler) kolaylıkla (Şek. 3) örneklerinin immobilizasyon için kullanılan EPON Reçine, ilgi hücreleri ile birlikte, transfer edilen önceki ve elektron mikroskopi ile analiz kesit bir ızgara deseni ile kolaylaştırılır. Floresan ve EM görüntü Kaplama kullanıcı hücre içi lokalizasyonu hem de ilgi enjekte edilen molekül (Şekil 4) tarafından oluşturulan herhangi bir morfolojik ve / veya yapısal değişikliklerin belirlemesini sağlar. Bu teknik, enjekte edilen örnek doğasına bağlı olarak, birkaç saat ≤ 5 sn kadar değişen zaman noktaları için müsait.

Watch this Scientific Journal Video about Correlative Light and Electron Microscopy CLEM as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets at JoVE.com

Correlative Light and Electron Microscopy CLEM as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

CLEM tekniği enjekte edilen moleküller tarafından etkilenen membranlar, organeller ve hücre içi yapıların ultrastrüktürel morfolojisini analiz etmek için adapte edilmiştir. Bu yöntem çok nanometre çözünürlükte milimetre izin mikromanipülasyon / mikroenjeksiyon güçlü teknikleri, konfokal floresan mikroskopi ve elektron mikroskopi birleştirir. Bu teknik, uygulamaların geniş bir çeşitliliği için müsait.

Bir Aracı Olarak Korelatif Işık ve Elektron Mikroskobu (CLEM) microinjected Moleküller ve Ökaryotik Alt hücresel Hedefler Visualize&#39;a


The eukaryotic cell relies on complex, highly regulated, and functionally distinct membrane bound compartments that preserve a biochemical polarity ...

correlative-light-electron-microscopy-clem-as-tool-to-visualize

Research

JoVE Journal

Biology

Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

19.0K Görüntüleme.  University of Texas Southwestern Medical Center. CLEM tekniği enjekte edilen moleküller tarafından etkilenen membranlar, organeller ve hücre içi yapıların ultrastrüktürel morfolojisini analiz etmek için adapte edilmiştir. Bu yöntem çok nanometre çözünürlükte milimetre izin mikromanipülasyon / mikroenjeksiyon güçlü teknikleri, konfokal floresan mikroskopi ve elektron mikroskopi birleştirir. Bu teknik, uygulamaların geniş bir çeşitliliği için müsait.

Video: Correlative Light and Electron Microscopy CLEM as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host plant.1,2 When a host plant is an important agronomic commodity feeding damage by insect pests can inflict serious economic losses to growers. Accordingly, kairomones can be used as attractants to lure or confuse these insects and, thus, offer an environmentally friendly alternative to pesticides for insect control.3 Unfortunately, plants can emit a vast number volatiles with varying compositions and ratios of emissions dependent upon the phenology of the commodity or the time of day. This makes identification of biologically active components or blends of volatile components an arduous process. To help identify the bioactive components of host plant volatile emissions we employ the laboratory-based screening bioassay electroantennography (EAG). EAG is an effective tool to evaluate and record electrophysiologically the olfactory responses of an insect via their antennal receptors. The EAG screening process can help reduce the number of volatiles tested to identify promising bioactive components. However, EAG bioassays only provide information about activation of receptors. It does not provide information about the type of insect behavior the compound elicits; which could be as an attractant, repellent or other type of behavioral response. Volatiles eliciting a significant response by EAG, relative to an appropriate positive control, are typically taken on to further testing of behavioral responses of the insect pest. The experimental design presented will detail the methodology employed to screen almond-based host plant volatiles4,5 by measurement of the electrophysiological antennal responses of an adult insect pest navel orangeworm (Amyelois transitella) to single components and simple blends of components via EAG bioassay. The method utilizes two excised antennae placed across a "fork" electrode holder. The protocol demonstrated here presents a rapid, high-throughput standardized method for screening volatiles. Each volatile is at a set, constant amount as to standardize the stimulus level and thus allow antennal responses to be indicative of the relative chemoreceptivity. The negative control helps eliminate the electrophysiological response to both residual solvent and mechanical force of the puff. The positive control (in this instance acetophenone) is a single compound that has elicited a consistent response from male and female navel orangeworm (NOW) moth. An additional semiochemical standard that provides consistent response and is used for bioassay studies with the male NOW moth is (Z,Z)-11,13-hexdecadienal, an aldehyde component from the female-produced sex pheromone.6-8

A method to rapidly screen host plant volatiles by measurement of the electrophysiological response of adult navel orangeworm (Amyelois transitella) antennae to single components and blends via electroantennographic analysis is demonstrated.

Konak Bitki uçucu için bir tarama aracı olarak Electroantennographic Biyoassay

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

Biyoloji

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Ribozom Ciltli Polipeptitler izole bir aracı olarak SECM Tutuklanma sırası kullanılarak

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

Eşodaklı ve multiphoton Mikroskopi kullanarak beş Floresan Proteinleri ile işaretlenmiş Hematopoetik kök hücrelerin in vivo klonal Takip

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused throughout tissues made of diverse cell types, such as enteroendocrine cells of the intestinal epithelium. These gastrointestinal sensors of food and bacteria have been difficult to study because they are dispersed among other epithelial cells at a ratio of 1:1,000. Recently, transgenic reporter mice have been generated to identify enteroendocrine cells by means of fluorescence. One of those is the peptide YY-GFP mouse. Using this mouse, we developed a method to correlate confocal and serial block-face scanning electron microscopy. We named the method cocem3D and applied it to identify a specific enteroendocrine cell in tissue and unveil the cell&#8217;s ultrastructure in 3D. The resolution of cocem3D is sufficient to identify organelles as small as secretory vesicles and to distinguish cell membranes for volume rendering. Cocem3D can be easily adapted to study the 3D ultrastructure of other specific cell types in their native tissue.

Here, we introduce a method, cocem3D, to unveil the ultrastructure of a specific cell in its native tissue by bridging confocal and serial block-face scanning electron microscopy.

Belirli Duyu Hücre bağıntılı Konfokal ve 3D Elektron Mikroskobu

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused ...

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix biology, there are still major gaps related to how the matrix is formed, how physiological and pathological remodeling differ, and most importantly how matrix dynamics might be manipulated to promote healing and inhibit fibrosis. There is currently no treatment option for controlling, preventing, or reversing cardiac fibrosis. Part of the reason is likely the sheer complexity of cardiac scar formation, such as occurs after myocardial infarction to immediately replace dead or dying cardiomyocytes. The extracellular matrix itself participates in remodeling by activating resident cells and also by helping to guide infiltrating cells to the defunct lesion. The matrix is also a storage locker of sorts for matricellular proteins that are crucial to normal matrix turnover, as well as fibrotic signaling. The matrix has additionally been demonstrated to play an electromechanical role in cardiac tissue. Most techniques for assessing fibrosis are not qualitative in nature, but rather provide quantitative results that are useful for comparing two groups but that do not provide information related to the underlying matrix structure. Highlighted here is a technique for visualizing cardiac matrix ultrastructure. Scanning electron microscopy of decellularized heart tissue reveals striking differences in structure that might otherwise be missed using traditional quantitative research methods.

Shown here is a method for visualizing extracellular matrix ultrastructure in decellularized cardiac tissues.

Macerated Tissue taramalı elektron mikroskobu Ekstraselüler Matrix Visualize&#39;a

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM)

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to cells, tissues, organelles, and even whole organisms. This protocol focuses on two chemical drying methods, hexamethyldisilazane (HMDS) and t-butyl alcohol (TBA), and their application to imaging of both prokaryotic and eukaryotic organisms using SEM. In this article, we describe how to fix, wash, dehydrate, dry, mount, sputter coat, and image three types of organisms: cyanobacteria (Toxifilum mysidocida, Golenkina sp., and an unknown sp.), two euglenoids from the genus Monomorphina (M. aenigmatica and M. pseudopyrum), and the fruit fly (Drosophila melanogaster). The purpose of this protocol is to describe a fast, inexpensive, and simple method to obtain detailed information about the structure, size, and surface characteristics of specimens that can be broadly applied to a large range of organisms for morphological assessment. Successful completion of this protocol will allow others to use SEM to visualize samples by applying these techniques to their system.

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy SEM

SEM analysis is an effective method to aid in species identification or phenotypic discrimination. This protocol describes the methods for examining specific morphological details of three representative types of organisms and would be broadly applicable to examining features of many organismal and tissue types.

Elektron mikroskobu (SEM) tarama morfolojik analiz için kimyasal kurutma kullanarak prokaryotik ve ökaryotik organizmaların hazırlanması

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

Yüksek basınç dondurucu, mikrodalga destekli kontrast geliştirme ve en az reçine birim görüntüleme için katıştırma tarafından biyolojik örnek hazırlama

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental challenge of great interest to the field of cryo-electron microscopy (cryo-EM). A few methodological strategies have been developed that support these &#34;time-resolved&#34; studies, one of which, Spotiton-a novel robotic system-combines the dispensing of picoliter-sized sample droplets with precise temporal and spatial control. The time-resolved Spotiton workflow offers a uniquely efficient approach to interrogate early structural rearrangements from minimal sample volume. Fired from independently controlled piezoelectric dispensers, two samples land and rapidly mix on a nanowire EM grid as it plunges toward the cryogen. Potentially hundreds of grids can be prepared in rapid succession from only a few microliters of a sample. Here, a detailed step-by-step protocol of the operation of the Spotiton system is presented with a focus on troubleshooting specific problems that arise during grid preparation.

The protocol presented here describes the use of Spotiton, a novel robotic system, to deliver two samples of interest onto a self-wicking, nanowire grid that mix for a minimum of 90 ms prior to vitrification in liquid cryogen.

Yeni Bir Robotik Sistem Kullanarak Zaman Çözümlenen Çalışmalar için Kriyo-Elektron Mikroskobik Izgara Hazırlığı, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Ultrastructural Localization of Endogenous LC3 by On-Section Correlative Light-Electron Microscopy

The visualization of autophagic organelles at the ultrastructural level by electron microscopy (EM) is essential to establish their identity and reveal details that are important for understanding the autophagic process. However, EM methods often lack molecular information, obstructing the correlation of ultrastructural information obtained by EM to fluorescence microscopy-based localization of specific autophagy proteins. Furthermore, the rarity of autophagosomes in unaltered cellular conditions hampers investigation by EM, which requires high magnification, and hence provides a limited field of view.
In answer to both challenges, an on-section correlative light-electron microscopy (CLEM) method based on fluorescent labeling was applied to correlate a common autophagosomal marker, LC3, to EM ultrastructure. The method was used to rapidly screen cells in fluorescence microscopy for LC3 labeling in combination with other relevant markers. Subsequently, the underlying ultrastructural features of selected LC3-labeled spots were identified by CLEM. The method was applied to starved cells without adding inhibitors of lysosomal acidification.
In these conditions, LC3 was found predominantly on autophagosomes and rarely in autolysosomes, in which LC3 is rapidly degraded. These data show both the feasibility and sensitivity of this approach, demonstrating that CLEM can be used to provide ultrastructural insights on LC3-mediated autophagy in native conditions-without drug treatments or genetic alterations. Overall, this method presents a valuable tool for ultrastructural localization studies of autophagy proteins and other scarce antigens by bridging light microscopy to EM data.

Here, we present a protocol for optimized on-section correlative light-electron microscopy based on endogenous, fluorescent labeling as a tool to investigate the localization of rare proteins in relation to cellular ultrastructure. The power of this approach is demonstrated by ultrastructural localization of endogenous LC3 in starved cells without Bafilomycin treatment.

Kesit Üzerinde Korbağül Işık-Elektron Mikroskobu ile Endojen LC3'ün Ultrastrüktürel Lokalizasyonu

The visualization of autophagic organelles at the ultrastructural level by electron microscopy (EM) is essential to establish their identity and reveal ...

Eş Zamanlı Floresan ve Üst Yapı Koruması için Yeni Protokol

Epon Post Embedding Correlative Light and Electron Microscopy

Correlative light and electron microscopy (CLEM) is a comprehensive microscopy that combines the localization information provided by fluorescence microscopy (FM) and the context of cellular ultrastructure acquired by electron microscopy (EM). CLEM is a trade-off between fluorescence and ultrastructure, and usually, ultrastructure compromises fluorescence. Compared with other hydrophilic embedding resins, such as glycidyl methacrylate, HM20, or K4M, Epon is superior in ultrastructure preservation and sectioning properties. Previously, we had demonstrated that mEosEM can survive osmium tetroxide fixation and Epon embedding. Using mEosEM, we achieved, for the first time, Epon post embedding CLEM, which maintains the fluorescence and the ultrastructure simultaneously. Here, we provide step-by-step details about the EM sample preparation, the FM imaging, the EM imaging, and the image alignment. We also improve the procedures for identifying the same cell imaged by FM imaging during the EM imaging and detail the registration between the FM and EM images. We believe one can easily achieve Epon post embedding correlative light and electron microscopy following this new protocol in traditional EM facilities.

Yazar Spotlight: Floresan Protein Koruma ile İlişkili Işık ve Elektron Mikroskobundaki Gelişmeler

We present a detailed protocol for Epon post-embedding correlative light and electron microscopy using a fluorescent protein called mScarlet. This method can maintain the fluorescence and the ultrastructure simultaneously. This technique is amenable to a wide variety of biological applications.