Proteinlerin hücrenin üst yapısı bağlamında lokalizasyonu, onlarca yıldır güçlü bir araştırma aracı olmuştur. Bu protokol ile bol miktarda bulunan veya bulunması zor olan proteinleri genişlettik. Proteinleri hassas ve taranabilir bir şekilde etiketlemek için floresan mikroskobu kullanıyoruz ve hücrenin üst yapısını yeniden doldurmak için elektron mikroskobu ile birleştiriyoruz.
Burada, otofaji proteinleri üzerine bölüm CLEM'i göstereceğiz, ancak hücrenin üst yapısının ilgi çekici olduğu herhangi bir biyolojik soruya, özellikle de nadir olayların incelenmesine gerçekten uygulanabilir. Prosedürü benimle birlikte gösteren, laboratuvarımızdan kıdemli bir araştırma teknisyeni olan Tineke Veenendaal olacak. Başlamak için, %0.15 glisin içeren PBS'yi, 37 santigrat dereceye önceden ısıtılmış PBS'de %1 jelatin ile değiştirin.
Jelatin içindeki hücreleri kazıyın ve bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Hücreleri bir mikrosantrifüjde oda sıcaklığında bir dakika boyunca 6.000 G'de pelet haline getirin ve ardından peleti bozmadan jelatini çıkarın. Pelete 37 santigrat dereceye kadar ısıtılmış %12 jelatin ekleyin ve pipet uçlarıyla veya aynı sıcaklığa önceden ısıtılmış cam mera pipetleriyle pipetleyerek nazikçe yeniden süspanse edin.
37 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin ve ardından hücreleri bir dakika boyunca 6.000 G'de peletleyin. Jelatini buz üzerinde 30 dakika katılaştırın. Jelatin gömülü hücreleri tüpten çıkarmak için, peleti içeren tüp ucunu tüpün geri kalanından bir jiletle kesin.
Daha sonra tüp ucunu hücre peleti ile ilk kesime dik olarak ikiye bölün. Hücre peletini içeren iki tüp ucu yarısını 2.3 molar sükroz içine yerleştirin ve dört santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. Bu, hücre pelet yarımlarının hafifçe küçülmesine ve plastik tüpten çıkmasına neden olur.
Jelatin gömülü hücre peletli tüp yarımlarını sakarozdan çıkarın ve ardından hücre pelet yarımlarını cımbızla plastik tüp yarımlarından çıkarın. Peletleri bir tıraş bıçağıyla uygun boyutta bloklar halinde manuel olarak kesin ve kesim sırasında konuyu büyütmek için bir stereo diseksiyon mikroskobu kullanın. Hücre bloklarını gece boyunca dört santigrat derecede 2.3 molar sükroz içinde inkübe edin.
Bunları alüminyum bir numune tutucu pim üzerine yerleştirin. Bloğun kenarlarında, blok ile pim arasında ince bir yaka oluşturacak kadar sükroz bırakın. Dondurun ve sıvı nitrojen içinde saklayın.
Yaklaşık 250 nanometre kalınlığında bölümler elde etmek için yüzeyini düzleştirmek için bloğun önünü kesin. Ardından, bıçak köşesi ile numune blok yüzünün yan tarafına 50 ila 100 mikrometre kesit vererek bloğun kenarlarını kesin. Numune blok yüzünün dört tarafının kırpılması, yaklaşık 250 x 375 mikrometre dikdörtgen şeklinde çıkıntılı bir yapı oluşturacaktır.
Bölümlerin 70 ila 90 nanometre kalınlığında olmasını ve gümüşi altın parlaklığına sahip olmasını sağlamak için çıkıntılı dikdörtgenden bir şerit ayırın. Uzun bir şerit oluşturmak için bir çubuk üzerinde bir saç teli ile bölümleri elmas bıçağın kenarından uzağa yönlendirin. Üç milimetrelik toplama halkasını bire bir 2.3 molar sükroz ve %2 metilselüloz karışımına batırarak şeridi alın.
Halkayı mikrotomun kriyo odasına yerleştirin ve damlacık donmaya başladığında, damlacığı onlara doğru hafifçe bastırarak bölümleri derhal alın. Döngüyü kriyo odasından çıkarın. Damlacık tamamen çözülene kadar bekleyin ve damlacığı hazırlanmış bir ızgaraya bastırın.
Kesitleri olan ızgaraları küçük bir tabağa veya çok kuyulu bir tabağa yaklaşık bir mililitre PBS üzerine yerleştirin ve 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Izgaraları Parafilm üzerinde yaklaşık 75 mikrolitre damlacık üzerinde işleyin ve oda sıcaklığında PBS glisin yıkamaları ile başlayın. Izgaraları, bloke etme adımı olarak oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS'de% 0.1 sığır serum albümini C ve% 0.5 balık derisi jelatininden yapılmış bir bloke edici tampon ile inkübe edin.
PBS'deki tamponu bloke etmede birincil antikorları seyreltin ve ızgaraları bu çözeltinin yaklaşık 10 mikrolitrelik damlacıkları üzerinde oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Izgaraları oda sıcaklığında beş kez PBS'de% 0.1 sığır serum albümininde yıkayın. PBS'deki bloke edici tampondaki ikincil antikorları ve DAPI'yi seyreltin.
Daha sonra, ızgaraları daha önce gösterildiği gibi PBS'de beş kez yıkamadan önce, ızgaraları bu çözeltinin yaklaşık 10 mikrolitrelik damlacıkları üzerinde oda sıcaklığında 30 dakika veya daha uzun süre inkübe edin. Numuneleri ışık mikroskobu için monte etmek için, ızgaraları oda sıcaklığında beş dakika boyunca iki kez damıtılmış suya% 50 gliserol batırın. Bir cam slayt ile %50 gliserolde bir kapak mendili arasına kapak kızağı başına bir ızgara yerleştirin ve bölümlerin kapak kızağına baktığından emin olun.
Işık mikroskobu için, sıkıştırılmış ızgaraları olan bir cam slaytı otomatik bir aşamaya sahip geniş bir alan mikroskobuna alın. Yüksek büyütmeli bir yağ hedefi seçin ve bölüm şeridinden oluşan bir görüntü döşeme seti oluşturun. Ardından, sökme ve elektron mikroskobu veya EM kontrastı için, cam sürgülü kapaklı kaymalı sandviçin yan tarafına 10 mikrolitre damıtılmış su ekleyin ve cam kapaklı kaymalı sandviç arayüzünü doldurmak için kılcal hareketin olmasını bekleyin.
Daldırma yağını gliserole karıştırmadan kapak fişini dikkatlice çıkarın. Izgaraları cımbızla alın ve% 50 gliserolü yıkamak için oda sıcaklığında üç kez damıtılmış suya batırın. Izgaranın arkasını tüy bırakmayan bir kağıt mendille dikkatlice kurulayın ve ızgara bölümlerini damıtılmış su damlacıklarının üzerine yerleştirin.
Elektron mikroskobunda kontrast için bölümleri boyamak için, oda sıcaklığında beş dakika boyunca uranil asetat ile inkübe edin. Uranil asetat metilselüloz çözeltisini, damlacıkları buz üzerindeki metal bir plaka üzerine Parafilm üzerine yerleştirerek soğutun. Daha sonra ızgaraları bu buz gibi soğuk solüsyonla iki kez yıkayın ve 10 dakika boyunca solüsyonda inkübe edin.
Her bir ızgaranın altındaki uranil asetat metilselüloz damlacığına bir ızgara kurutma halkası yerleştirerek ve ızgara damlacıktan çekilene kadar yavaşça kaldırarak ızgaraları dışarı çıkarın. Fazla çözeltiyi lekelemek için, ilmeği tüy bırakmayan filtre kağıdına yaklaşık 60 derecelik bir açıyla dokundurun ve daha fazla çözelti emilmeyene kadar kağıt boyunca yavaşça sürükleyin. Halkayı ızgara ile uygun bir rafa yerleştirin ve oda sıcaklığında 10 dakikadan fazla kurumasını bekleyin.
Transmisyon elektron mikroskobu veya TEM'de görüntüleme için ilgilenilen bir bölgeyi bulmak için ışık mikroskobu ile elde edilen genel bakışı kullanın ve ışık mikroskobu veri kümesindeki yatırım getirisine açıklama ekleyin. Bir bölge seçildikten sonra, TEM'de 20.000x ila 50.000x büyütme olarak ayarlanmış bir görüntü döşemesi edinin. Görüntü döşeme setini son işleme yazılımında yeniden oluşturun.
Elektron mikroskobunda DAPI sinyaline ve floresan ve nükleer ana hatlara dayalı korelasyonu gerçekleştirin. Görüntüleri tam olarak üst üste bindirmek için kaydırın ve manuel korelasyonu doğru bir şekilde gerçekleştirin. Hepatoblastomdan türetilen HEPG2 hücreleri, iki saat boyunca %4 paraldehit ile fiksasyondan önce EBSS'de iki saat aç bırakıldı.
LC3 ve LAMP1'in kesitlerde görüntülenmesi, nispeten az LC3 punktası ve LAMP1 ile çok az kolokalizasyon ortaya koymaktadır. IF'den elde edilen moleküler bilgiler, DAPI ve nükleer ana hatlara dayalı iki görüntüleme modalitesinin üst üste bindirilmesiyle elektron mikroskobunda elde edilen ultra yapısal bilgilerle ilişkilendirildi. LC3 pozitif organellerinin EM ultrastrüktürü ile korelasyonu, farklı punktaların otofajinin farklı aşamalarını temsil ettiğini ortaya koydu.
Birinci kutuda örneklendiği gibi ayrı ayrı LC3 etiketli bölmelerin üst yapısı burada gösterilmektedir. Bağıntılı ışık elektron mikroskobu görüntüleri solda, sözde renkli elektron mikroskobu görüntüleri ise sağda gösterilmektedir. İç ve dış otofagozomal membranlar beyaz ve siyah ok uçları ile gösterilir.
İlginç bir şekilde, EM, yoğun içerik ve intraluminal veziküller ile karakterize edilen LC3 pozitif otolizozomlar olarak nispeten zayıf floresan lekeleri tanımladı. Bu, ultra ince kriyo bölümlerinin IF'sinde minimum LC3 görünürlüğünü ortaya çıkarır ve bozunma ortamına rağmen kararlı durum otolizozomlarında saptanabilir LC3 olduğunu düşündürür. Bununla birlikte, LC3 pozitif punkta esas olarak otofagozomları temsil eder ve çok azı otolizozomları temsil eder.
Kesit CLEM yerine immünogold etiketleme yapmak isteyen araştırmacılar için, burada açıklanan protokoller ve ipuçları immünogold etiketleme için de tamamen geçerlidir. Başlangıçta düşük bolluktaki endozomal düzenleyici proteinlere kesit CLEM uyguladık ve ilk kez endojen ultrastrüktürel lokalizasyonlarını gösterdik.
