Yazarlar bu yazının yayınlanmasından onun yardım ve destek için Fondazione Filarete minnettarız. Biz de Tecnai G2 transmisyon elektron mikroskobu kullanımı için Centro Europeo di Nanomedicina teşekkür etmek istiyorum.

1.. ER Floresan Proteinleri ile plazmid, Hücre Kültürü ve Transfection <ol><li> Bu çalışmada kullanılan fare plasmid sitokrom b&#39;nin ER izoformunun kuyruk bölgeye C-terminalinde kaynaşmış GFP geliştirilmiş bir versiyonu olan (5) bir bağ dizisi yoluyla (b olarak (5) burada kısaltılmıştır). Kuyruk bölgesi (5), üst ve alt polar diziler tarafından eteklenen 17-artık TMB (transmembran domain), (UPS ve DPS) de dahil olmak üzere, doğal B tripsin bölünmesinden sonra ilişkili membran kalan bütün dizisi (Pro94-Asp134) içerir . Bağlayıcı [(Gly) 4, Ser] 3 ve ardından myc epitopu oluşur ve tüm cDNA, memeli ekspresyon vektörü pCDNA3 ve Hind3-Xba1 sitelerine sokulur. Bu plazmidin yapımı ayrıntılar GFP-ER 16 olarak adlandırılır edildiği önceki bir yayında tarif edilmiştir. </li><li> ,% 10 beyaz peynir ile takviye edilmiş Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) içinde COS-7 hücrelerinin büyütünl sığır serumu, 2 mM L-glutamin, 37 ° C&#39;de bir inkübatör içinde% 1 penisilin / streptomisin ve% 10 CO2. </li><li> Transfeksiyon. Üretici tarafından tarif edildiği gibi plaka 3 x 10 5, 6 oyuklu bir plaka içerisinde yuvarlak cam lamel üzerinde hücreleri ve, bir sonraki gün, JetPEI sistemi ile transfekte. Optimal JetPEI / DNA oranı, kullanılan plazmid ve hücre serisine bağlı olarak en fazla transfeksiyon verimi kurmak amacıyla test edilmiştir Not: bizim durumda, bir JetPEI: 2:1 DNA oranı,% 70-80 transfeksiyon verimliliği sağlanır. </li></ol> 2. Canlı Floresan Tarama Eşodaklı Mikroskopi <ol><li> Canlı hücre görüntüleme. Transfekte hücreler, w /% 10 FBS, 2 mM L-glutamin,% 1 pen / strep, 25 mM HEPES ile desteklenmiş fenol kırmızısı, o DMEM dolu 24 mm kapak için bir çelik hücre kültür odası içine ekildi üzerinde lamel koyun , ışıkla ağartma gelen örnekleri önlemek için 50 ug / ml sikloheksimidin ve 1:100 OxyFluor. Bir SP5 konfokal mikroskopd GFP-ER 488 nm lazer ve bir 525/50 bant geçiş emisyon filtresi kullanılarak görselleştirilmiştir olması ile ısı kontrollü bir CO2 inkübatör (37 ° C ve% 5 CO2) e sahip, canlı hücre görüntüleme deneyleri için kullanılır. </li><li> (Sıkı bağlamak) photobleaching sonra floresan kurtarma. Bir OSER yapısına karşılık gelen, (ROI) bir bölge çizin ve (örnek olarak 5,5-6 μW tekabül eden, 30 mW argon lazer% 100) 20 tekrar ve 488 nm bir kombinasyonu kullanılarak ve 405 nm çamaşır suyu bizim deneyim, verimli ve hızlı ağartmanın yol açar, (numune 11.6 μW tekabül eden 30 mW Diyot 405 lazerin% 60) lazerler. </li><li> 10 dakika (piksel süresi = 1.61 mikro saniye olduğu / px) için tek bir kare her 10 sn alarak ağartılmış ROI&#39;lardaki floresan kurtarma kaydedin. </li><li> (FLIP) Photobleaching floresan kaybı. A, bir OSER yapısına karşılık gelen YG ve yukarıda tarif edildiği gibi ağartıcı çizin. Ağartma her 30 saniye tekrar edilir,ve post-beyazlatma görüntüleri 30 dakika (piksel süresi = 1.61 mikro saniye olduğu / px) boyunca her 10 sn kaydedilir. </li><li> Sıkı bağlamak ve FLIP analizi. Görüntülerin tüm ImageJ yazılımı (kullanarak analiz edilir <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html</a> ). FRAP deneylerde, ağartılmış ROI floresan iyileşme süresi ve her zaman içinde sabit olduğu kontrol edilir ağartılmış hücrenin toplam floresan, normalize boyunca ölçülür. </li><li> FLIP deneyler için, ağartılmış OSER ve bütün bir hücresinin kaplayan bir dış ROI çizin. Zaman içinde floresan yoğunluğu ölçülür ve görüntüleme kendisinin neden floresan herhangi bir azalma için düzeltme amacıyla bir beyazlatılmamış hücre üzerinde çekilen bir ROI floresan seviyeleri için normalize. </li><li> Deneylerin tamamında, İB&#39;nin floresan şiddetleri dan (hücrelerin dışındaki bir alanda belirlenen) bir arka plan sinyali çıkarılır. Son olarak, Gr kullanarak sonuçları arsaaphPad Prism yazılımı. </li></ol> 3. Transmisyon Elektron Mikroskobu Yoluyla Ultrastrüktürel Analizi Reaktiflerin birçok toksisite göz önüne alındığında, tüm prosedürleri, uygun bir laboratuarı giyen yürütülmelidir. davlumbaz altında ceket ve eldiven. <ol><li> Petri kabı lamel ayrılmasından sonra, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 0.1 M kakodilat tampon maddesi, pH 7.4 içinde, süzüldü% 2 glutaraldehid ile bir tek tabaka olarak çanak alt, üzerinde yetiştirilen kalan hücreleri gidermek. </li><li> Bir Teflon kazıyıcı kullanarak hücreleri kazıyın ve 1.5 ml Eppendorf tüpleri içine aktarın. 10 dakika boyunca 9000 g&#39;de santrifüj vasıtasıyla Pelet hücreleri. Süpernatantı taze fiksatif ekleyin ve 4 ° C&#39;de gece bekletin </li><li> Tamponu ile yıkayın peletleri, daha sonra oda sıcaklığında 1 saat boyunca kakodilat tampon içinde% 1 ozmiyum tetroksit çözeltisi ile post-sabitleyin. </li><li> MilliQ su ile durulayın, ve ile blok leke tr20-60 arasında dakika için damıtılmış su içinde% 1 uranil asetat. </li><li> Etanol serisi (% 70,% 80,% 90,% 100 ve 10 dakika her biri için% 100) artan örnekleri dihidrat ve (15 dk) propilen oksit içinde kısa süreyle iki kez yıkayın. </li><li> (2 saat ilâ gece boyunca) propilen oksit + EPON (1:1) oluşan bir karışım içerisinde örnekleri sızmak. </li><li> En az 24 saat boyunca 60 ° C&#39;de tedavi Epon epoksi reçine gömme. </li><li> Bölüm 60-70 nm kalınlığında bölümleri elde etmek için bir 45 ° bir elmas bıçak ile donatılmış bir ultramikrotom LEICA UC6 kullanarak el ile kesilmiş reçine bloklar. 300 örgü bakır ızgaralar üzerinde bölümleri toplayın. </li><li> Uranil asetat (20 dakika) içinde doymuş bir çözeltisi ile ızgara üzerinde bölümleri leke ve sitrat (7 dakika) yol, iyice bi damıtılmış süzüldü, su içine daldırılarak ızgaraları yıkama ve bunları oda sıcaklığında kurumaya bırakın. </li><li> Boyanan ızgaraları Tecnai G2 transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak gözlenmiştir, ve görüntüler bir Bott kullanılarak yakalanır(genelde 6,000-39,000 X kadar) farklı nihai büyütme om monte CCD kamera. </li></ol>

<ol>
	<li>Fasana, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+VAPB+mutant+linked+to+amyotrophic+lateral+sclerosis+generates+a+novel+form+of+organized+smooth+endoplasmic+reticulum.">A VAPB mutant linked to amyotrophic lateral sclerosis generates a novel form of organized smooth endoplasmic reticulum.</a> FASEB J. 24, 1419-1430 (2010).</li><li>Borgese, N., Francolini, M., Snapp, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum+architecture:+structures+in+flux.">Endoplasmic reticulum architecture: structures in flux.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 18, 358-364 (2006).</li><li>Ronchi, P., Colombo, S., Francolini, M., Borgese, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+domain-dependent+partitioning+of+membrane+proteins+within+the+endoplasmic+reticulum.">Transmembrane domain-dependent partitioning of membrane proteins within the endoplasmic reticulum.</a> J. Cell Biol. 181, 105-118 (2008).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+protein+dynamics+in+living+cells.">Studying protein dynamics in living cells.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 444-456 (2001).</li><li>Lee, M. C., Miller, E. A., Goldberg, J., Orci, L., Schekman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bi-directional+protein+transport+between+the+ER+and.">Bi-directional protein transport between the ER and.</a> 20, 87-123 (2004).</li><li>Snapp, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+stacked+ER+cisternae+by+low+affinity+protein+interactions.">Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions.</a> J. Cell Biol. 163, 257-269 (2003).</li><li>Papiani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restructured+endoplasmic+reticulum+generated+by+mutant+amyotrophic+lateral+sclerosis-linked+VAPB+is+cleared+by+the+proteasome.">Restructured endoplasmic reticulum generated by mutant amyotrophic lateral sclerosis-linked VAPB is cleared by the proteasome.</a> J. Cell Sci. 125, 3601-3611 (2012).</li><li>Almsherqi, Z. A., Kohlwein, S. D., Deng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cubic+membranes:+a+legend+beyond+the+Flatland*+of+cell+membrane+organization.">Cubic membranes: a legend beyond the Flatland* of cell membrane organization.</a> J. Cell Biol. 173, 839-844 (2006).</li><li>Federovitch, C. M., Ron, D., Hampton, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+ER:+experimental+approaches+and+current+questions.">The dynamic ER: experimental approaches and current questions.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 17, 409-414 (2005).</li><li>Takei, K., Mignery, G. A., Mugnaini, E., Sudhof, T. C., De Camilli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+1,4,5-trisphosphate+receptor+causes+formation+of+ER+cisternal+stacks+in+transfected+fibroblasts+and+in+cerebellar+Purkinje+cells.">Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor causes formation of ER cisternal stacks in transfected fibroblasts and in cerebellar Purkinje cells.</a> Neuron. 12, 327-342 (1994).</li><li>Feldman, D., Swarm, R. L., Becker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+study+of+rat+liver+and+liver+neoplasms+after+long-term+treatment+with+phenobarbital.">Ultrastructural study of rat liver and liver neoplasms after long-term treatment with phenobarbital.</a> Cancer Res. 41, 2151-2162 (1981).</li><li>Sprocati, T., Ronchi, P., Raimondi, A., Francolini, M., Borgese, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+and+reversible+restructuring+of+the+endoplasmic+reticulum+induced+by+PDMP+in+cultured+cells.">Dynamic and reversible restructuring of the endoplasmic reticulum induced by PDMP in cultured cells.</a> J. Cell Sci. 119, 3249-3260 (2006).</li><li>Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+tendency+of+fluorescent+proteins+to+oligomerize+under+physiologic+conditions.">Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions.</a> Traffic. 13, 643-649 (2012).</li><li>Pyszniak, A. M., Welder, C. A., Takei, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+distribution+of+high-avidity+LFA-1+detected+by+soluble+ICAM-1-coated+microspheres.">Cell surface distribution of high-avidity LFA-1 detected by soluble ICAM-1-coated microspheres.</a> J. Immunol. 152, 5241-5249 (1994).</li><li>Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxic+proteins+in+neurodegenerative+disease.">Toxic proteins in neurodegenerative disease.</a> Science. 296, 1991-1995 (2002).</li><li>Winklhofer, K. F., Tatzelt, J., Haass, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+faces+of+protein+misfolding:+gain-+and+loss-of-function+in+neurodegenerative+diseases.">The two faces of protein misfolding: gain- and loss-of-function in neurodegenerative diseases.</a> EMBO J. 27, 336-349 (2008).</li><li>Borgese, N., Gazzoni, I., Barberi, M., Colombo, S., Pedrazzini, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+a+tail-anchored+protein+to+endoplasmic+reticulum+and+mitochondrial+outer+membrane+by+independent+but+competing+pathways.">Targeting of a tail-anchored protein to endoplasmic reticulum and mitochondrial outer membrane by independent but competing pathways.</a> Mol. Biol. Cell. 12, 2482-2496 (2001).</li><li>Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+and+their+applications+in+imaging+living+cells+and+tissues.">Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues.</a> Physiol Rev. 90, 1103-1163 (2010).</li><li>Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+perturbation+techniques+to+study+mobility+and+molecular+dynamics+of+proteins+in+live+cells+FRAP,+photoactivation,+photoconversion,+and+FLIP.">Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells FRAP, photoactivation, photoconversion, and FLIP.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2010, (2010).</li><li>Michida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+endothelin+1+in+hemorrhagic+shock-induced+gastric+mucosal+injury+in+rats.">Role of endothelin 1 in hemorrhagic shock-induced gastric mucosal injury in rats.</a> Gastroenterology. 106, 988-993 (1994).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu yazıda anlatılan protokoller ve görüntüleme yaklaşımlar canlı hücrelerin ER ikamet transfekte TA floresan proteinlerinin dağılımını ve hareketliliği araştırmak için kullanılmıştır. Ayrıca mikroskobik analizler vasıtasıyla bu hücre içi bölmesinin mimarisi bu proteinlerin aşırı ifadesinin etkisini analiz ettik. Canlı hücre konfokal görüntüleme ve elektron mikroskobu birleşimi proteinlerin dinamik özelliklerini araştıran bir çok güçlü bir araç old...

Yeşil floresan proteininin (GFP) ve spektral varyantları, ve floresan mikroskopi paralel gelişme keşif, hücrelerin protein davranış soruşturma için tamamen yeni yollar açtı. Çünkü yoğun bir aydınlatma altında floresan söndürmek için Flüoroforlann içsel kapasitesinin mümkündür (FLIP), ışıkla in (sıkı bağlamak) ve floresan kaybı photobleaching sonra floresan kurtarma gibi teknikler, konfokal canlı hücre görüntüleme dayalı ve kullanımı transfekte floresan füzyon proteinleri 1-3. Çıktıkları fonksiyon 4 ile ilgili önemli ipuçları ortaya çıkarabilir proteinlerin lokalizasyonu, aynı zamanda onların hareketlilik ve veziküler taşıma, sadece değerlendirmek için kullanılır. Ökaryotik hücrelerin benzersiz özelliği spesifik lipid ve protein bileşimleri olan hücre içi bölmelerin varlığıdır. Organelleri fiziksel isolat rağmened, birbirleriyle iletişim ve hücresel homeostazı sürdürmek için moleküler bileşenleri paylaşmak gerekir. Salgı yolu ER sentezlenen proteinler ve lipidler onların işlevini uyguladıkları doğru son hedefe ulaşmasını garanti eder. Hücre içi organelleri de moleküller (lipidler) doğrudan bölmeleri arasında değiş tokuş edilmesine izin dinamik iletişim siteleri tarafından bağlanabilir. Ayrıca, birçok protein büyük heteromerik komplekslerine asamblajı ya da işlevsel olarak aktif olmaya ya da nihai hedefe taşınması amacıyla özel lipid türleri (lipid sal / mikro bölgeleri) ile bağlantılı olması. Bu biyolojik açıdan tüm büyük proteinlerin kinetik özelliklerini etkileyen ve bu nedenle, uygun bir şekilde aşağıda tarif edilen teknikler vasıtasıyla incelenebilir. Grubumuz ER mimarisi ve farklı alt incelemek için yaygın olarak kullanılan sıkı bağlamak ve elektron mikroskobu ile birlikte FLIPetki. ER salgı yolunun ilk istasyonu ve protein ve lipid 5 sıralama önemli bir rol oynar. Bu kimin ayrı alt alan birçok farklı işlevleri (yani protein ve lipit biyosentezi ve ticareti, protein katlanması, Ca 2 + depolama ve serbest ve ksenobiyotik metabolizma) yansıtan son derece dinamik bir organelidir. Bu uzaysal olarak, morfolojik, ve fonksiyonel olarak farklı olmasına rağmen, ancak, bu etki birbirleri ile süreklidir ve bunların nispi bolluk fizyolojik ve patolojik koşullar altında hücrelerde değiştirilebilir. Iyi bilinen ve ER genellikle mekansal ayrılmış alanlar nükleer zarf ve pürüzsüz ve pürüzlü ER olmakla birlikte, biz ve diğerleri ER yapı, çeşitli hücre tiplerinde daha ayrıntılı mimari ve üç boyutlu organizasyon ile olduğunu göstermiştir ve var Ayrıca, hipoksi, ilaç olarak stresli uyaranlara vasıtasıyla tahrik edilebilir, fizyolojik koşullar altında dokularınuygulama veya ER-yerleşik transmembran proteinlerin 2,6 arasında aşırı ekspresyonu (ve buradaki referanslar). Ayrıca son zamanlarda insan hastalıklarının 1,7 hücre modellerinde bu tür yapıların varlığını göstermiştir. Pürüzsüz ER yığılmış sisternalarında kaynaklanan onlar da kendi mimarlık temelinde karmellae, lameller ve kristalloid ER olarak bilinmesine rağmen, onlar, 2003 6 düzenlenen düz endoplazmik retikulum (OSER) kolektif adı verildi, hangi gibi onların boyutu, değişebilir. Hücreler kuyruk demirlemiş (TA) ER-yerleşik proteinler (d EGFP-ER), trans GFP zayıf dimerize eğilimi dramatik ER organizasyon ve yapısını değiştirir sitozolik bölgeye kaynaşmış GFP ile transfekte sonra. Sıkı bağlamak ve FLIP deneyler d EGFP-ER OSERs içinde yayılmak için serbest olduğunu gösterdi ve OSER için retiküler ER hareket eder ve tersi &lt;gerçeği/ Em&gt; agrega çevreleyen retiküler ER sürekli olduğunu göstermektedir. Ultrastrüktürel analizi bize nano düzeyde OSER mimarlık ve örgüt ayrıntılı bir açıklama ile floresan veri ilişkilendirmek için izin verdi: OSERs her zaman düzgün ER eşleştirilmiş sisternalarında yığınlarının kadar yapılır ama böyle düzenli sinüs düzenlenmiş gibi mekansal organizasyon farklı biçimlere sahip olabilir diziler veya ağırşak, veya altıgen &quot;kristalloid&quot; boru şeklinde diziler. Bu yeniden düzenlemeler de fizyolojik koşullar 9 ve hipoksi 10, 11, ilaç tedavisi ve kanser 9 Aşağıdaki gibi stresler altında hücrelerde bulunan edilmiş olarak, ultrastrüktürel marker olarak önemli bir potansiyele sahip olabilir, kübik morfolojileri 8 yol açar. GFP füzyon proteinleri kullanılarak bu ilk gösteri sonra, farmakolojik tedavilere 12, asse tepki olarak ER etki proliferasyonunu analiz etmek için kullanılan deneyler görüntülemep hücreleri 13 oligomerize etmek, ve 1,8 patojenite ile ilgili olabilir ER kaynaklı hücre içi agrega oluşumunda bir mutant, ALS TA-bağlantılı protein rolünü araştırmak için floresan protein eğilimidir. Bu, (çok sayıda nörodejeneratif hastalıkların 14 oluşur) hücre içi agrega oluşumu toksik mutant proteinleri ve çevreleyen hücre bileşenleri 15 arasındaki etkileşimleri önlemek için tasarlanan bir koruyucu mekanizma olabileceğini öne sürülmüştür. Aşağıda olan C-terminal hidrofobik alanları, ER&#39;nin zarı içine sokulur ve dinamik davranış bir analiz ve ER alanı üzerindeki aşırı ifade yapıları etkileri araştırmak için, optik ve elektron mikroskopi yöntemlerin bir kombinasyonu bir açıklamasıdır kültürlenmiş hücrelerde mimarisi (deney protokolünün bir akış şeması için Şekil 1&#39;e bakınız).

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41966029</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM) w/o phenol red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31053028</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>jetPEI</td>
			<td>Polyplus Transfection</td>
			<td>PP10110</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>OxyFluor</td>
			<td>Oxyrase Inc.</td>
			<td>OF-0005</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Glutaraldehyde Grade I</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium Cacodylate Trihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C0250</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Osmium Tetroxide 4% solution</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>19150</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Uranyl Acetate dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>73943</td>
			<td>slightly radioactive</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Propylene Oxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>82320</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>EPON embedding medium kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>45359-1EA-F</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Lead Citrate </td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>17800</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bench top centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415 D</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Spectral Confocal Microscope </td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>TCS SP5</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>CO2 Microscope Cage Incubation System </td>
			<td>OkoLab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ultramicrotome </td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>UC6</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Diamond knife </td>
			<td>Diatome</td>
			<td>Ultra 45 &deg;</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Transmission Electron Microscope </td>
			<td>FEI</td>
			<td>Tecnai G2</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>GraphPad Prism Software</td>
			<td>GraphPad Software, Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>steel culture cell chamber for 24 mm coverslip</td>
			<td>Bioscience Tools</td>
			<td>CSC-25</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Electron Microscopy grids</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>G300Cu</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

visualization of endoplasmic reticulum subdomains in cultured cells

Bu yoğun interorganelle moleküler trafik rağmen ayırt edici bileşimin ve fonksiyonlarını muhafaza rağmen ökaryotik hücrelerde lipidler ve proteinlerin sürekli hücre bölmelerine arasında değiş tokuş edilir. Bu yazıda anlatılan teknikler in vivo ve fizyolojik ortamda protein ve lipid hareketlilik ve kaçakçılığı okuyan güçlü araçlardır. (FLIP) Photobleaching içinde (sıkı bağlamak) ve floresan kaybı photobleaching sonra floresan kurtarma yaygın exo-endositik yolu, organellere veya alt bölme arasındaki süreklilik, protein komplekslerinin oluşumu ve protein yerelleştirme yoluyla hücre içi ticaretini incelemek için canlı hücre görüntüleme teknikleri kullanılır Lipid mikro bölgeleri olarak, her biri, fizyolojik ve patolojik koşullar altında gözlemlenebilir. Bu yaklaşımların sınırlamaları nedeniyle floresan füzyon proteinlerinin kullanımı ile esas olarak ve potansiyel sakıncaları aşırı ifade suni içerirhücrelerde iyonu ve etiketli ve yerli protein katlanması ve lokalizasyon farklılıklar olasılığı. Son olarak, optik mikroskopi (yaklaşık 200 nm) çözünürlük limiti olarak stres altında hücrelerde kaynaklı olabilir ER veya belirli bir alt bölme ve ince yapısı soruşturma izin vermez (örneğin, hipoksi, ilaç uygulama, transmembran aşırı ifadesi ER ikamet proteinler) ya da patolojik koşullar altında, ultrastrüktürel ile kültür transfekte edilmiş hücrelerin canlı hücre görüntüleme kombine transmisyon elektron mikroskobu göre analiz eder.

Şekil 2, protein hareketlilik örnek FRAP çalışmayı gösterir. D EGFP-ER proteininin hareketlilik beyazlatılmış OSERs olarak ışıkla ağartma sonra hızlı bir floresan kurtarma ile gösterilir. Nicel analiz için, yarım saat ve cep kısmı, aşağıdaki denklem monoexponential uydurularak deneysel ölçümlere dayanan verilerden elde edilmiştir: F (t) = F post + (F rec-F sonrası) (1-e-t / τ) <p class="jove...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells at JoVE.com

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

Biz canlı hücre konfokal görüntüleme vasıtasıyla, endoplazmik retikulum (ER) içerisinde yerleşik transfekte floresan protein dağılımı ve hareketliliği incelemek için kullanılan görüntüleme yaklaşımı tarif eder. Biz de ultrastruktural bu subselüler bölmesinin mimarisi üzerine kendi ifade etkisini analiz.

Kültür Hücrelerinin retikulum Subdomain&#39;ler Görselleştirme

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

visualization-of-endoplasmic-reticulum-subdomains-in-cultured-cells

Research

JoVE Journal

Biology

12.9K Görüntüleme.  Fondazione Filarete.  Biz canlı hücre konfokal görüntüleme vasıtasıyla, endoplazmik retikulum (ER) içerisinde yerleşik transfekte floresan protein dağılımı ve hareketliliği incelemek için kullanılan görüntüleme yaklaşımı tarif eder. Biz de ultrastruktural bu subselüler bölmesinin mimarisi üzerine kendi ifade etkisini analiz. 

Video: Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A hemacytometer is a thick glass slide with a central area designed as a counting chamber. Cell suspension is applied to a defined area and counted so cell density can be calculated. 

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. In this video, we demonstrate how cells are counted using a hemacytometer.

Doku ve Hücre Sayım ve Canlılık Belirlenmesi

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A ...

Biyoloji

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal (ICC) Network in Mice

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves required for peristalsis and mediate neuronal input from the enteric nervous system1. Different subtypes of ICC form distinct networks in the muscularis of the GI tract 2,3. Loss or injury to these networks is associated with a number of motility disorders4. ICC cells express the KIT receptor tyrosine kinase on the plasma membrane and KIT immunostaining has been used for the past 15 years to label the ICC network5,6. Importantly, normal KIT activity is required for ICC development5,6. Neoplastic transformation of ICC cells results in gastrointestinal stromal tumor (GIST), that frequently harbor gain-of-function KIT mutations7,8. We recently showed that ETV1 is a lineage-specific survival factor expressed in the ICC/GIST lineage and is a master transcriptional regulator required for both normal ICC network formation and for of GIST tumorigenesis9. We further demonstrate that it cooperates with activating KIT mutations in tumorigenesis. Here, we describe methods for visualization of ICC networks in mice, largely based on previously published protocols10,11. More recently, the chloride channel anoctamin 1 (ANO1) has also been characterized as a specific membrane marker of ICC11,12. Because of their plasma membrane localization, immunofluorescence of both proteins can be used to visualize the ICC networks. Here, we describe visualization of the ICC networks by fixed-frozen cyrosections and whole mount preparations.

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal ICC Network in Mice

The interstitial cells of Cajal (ICC) are the pacemaker cells of the gastrointestinal (GI) tract. They form complex networks between smooth muscle cells and post-ganglionic neuronal fibers to regulate GI contractility. Here, we present immunofluorescence methods cross-sectional and whole-mount visualization of murine ICC networks.

Farelerde Cajal (ICC) Ağ İnterstisyel Hücreler Görselleştirme

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum (ER). However, the visualization of these mRNAs can be challenging. This is especially true when only a fraction of the mRNA is ER-associated and their distribution to this organelle is obstructed by non-targeted (i.e. "free") transcripts. In order to monitor ER-associated mRNAs, we have developed a method in which cells are treated with a short exposure to a digitonin extraction solution that selectively permeabilizes the plasma membrane, and thus removes the cytoplasmic contents, while simultaneously maintaining the integrity of the ER. When this method is coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH), one can clearly visualize ER-bound mRNAs by fluorescent microscopy. Using this protocol the degree of ER-association for either bulk poly(A) transcripts or specific mRNAs can be assessed and even quantified. In the process, one can use this assay to investigate the nature of mRNA-ER interactions.

Here we describe a method to visualize endoplasmic reticulum-associated mRNAs in mammalian tissue culture cells. This technique involves the selective permeabilization of the plasma membrane with digitonin to remove cytoplasmic contents followed by fluorescent in situ hybridization to detect either bulk poly(A) mRNA or specific transcripts.

Memeli hücrelerinde endoplazmik retikulum lokalize mRNA&#39;ların görselleştirilmesi

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

Chromosome Preparation From Cultured Cells

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as fluorescence in situ hybridization (FISH), this assay has the powerful ability to analyze individual cells for aberrations that involve gains or losses of portions of the genome&#160;and rearrangements involving one or more chromosomes. In humans, chromosome abnormalities occur in approximately 1 per 160 live births1,2, 60-80% of all miscarriages3,4, 10% of stillbirths2,5, 13% of individuals with congenital heart disease6, 3-6% of infertility cases2, and in many patients with developmental delay&#160;and birth defects7. Cytogenetic analysis of malignancy is routinely used by researchers and clinicians, as observations of clonal chromosomal abnormalities have been shown to have both diagnostic and prognostic significance8,9.&#160; Chromosome isolation is invaluable for gene therapy and stem cell research of organisms including nonhuman primates and rodents10-13.
Chromosomes can be isolated from cells of live tissues, including blood lymphocytes, skin fibroblasts, amniocytes, placenta, bone marrow, and tumor specimens. Chromosomes are analyzed at the metaphase stage of mitosis, when they are most condensed and therefore more clearly visible. The first step of the chromosome isolation technique involves the disruption of the spindle fibers by incubation with Colcemid, to prevent the cells from proceeding to the subsequent anaphase stage. The cells are then treated with a hypotonic solution and preserved in their swollen state with Carnoy&#39;s fixative. The cells are then dropped on to slides and can then be utilized for a variety of procedures. G-banding involves trypsin treatment followed by staining with Giemsa to create characteristic light and dark bands. The same procedure to isolate chromosomes can be used for the preparation of cells for procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY)14,15.

Chromosomes can be isolated from live cells such as lymphocytes or skin fibroblasts, and from organisms including humans or mice. These chromosome preparations can be further utilized for routine G-banding and molecular cytogenetic procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY).

Kültür Hücrelerinin itibaren Kromozom Hazırlık

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as ...

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized microtubules. Organelles move along these processes by microtubule motors. Easy maintenance, high sensitivity to RNAi-mediated protein knock-down and efficient procedure for creating stable cell lines make Drosophila S2 cells an ideal model system to study cargo transport by live imaging. The results obtained with S2 cells can be further applied to a more physiologically relevant system: axonal transport in primary neurons cultured from dissociated Drosophila embryos. Cultured neurons grow long neurites filled with bundled microtubules, very similar to S2 processes. Like in S2 cells, organelles in cultured neurons can be visualized by either organelle-specific fluorescent dyes or by using fluorescent organelle markers encoded by DNA injected into early embryos or expressed in transgenic flies. Therefore, organelle transport can be easily recorded in neurons cultured on glass coverslips using living imaging. Here we describe procedures for culturing and visualizing cargo transport in Drosophila S2 cells and primary neurons. We believe that these protocols make both systems accessible for labs studying cargo transport.

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Drosophila S2 cells and cultured neurons are great systems for imaging of motor-driven organelle transport in vivo. Here we describe detailed protocols for culturing both cell types, their imaging and analysis of transport.

Kültürlü organel Ulaşım<em&gt; Drosophila</em&gt; Hücreler: S2 Hücre Hattı ve İlköğretim Nöronlar.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized ...

Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly and fate is important to understand the cellular response to stress. The deficiency in key factors of SGs like G3BP (RasGAP SH3 domain Binding Protein) leads to developmental defects in mice&#160;and alterations of the Central Nervous System. To study the dynamics of SGs in cells from an organism, one can culture primary cells and follow the localization of a transfected tagged component of SGs. We describe time-lapse experiment to observe G3BP1-containing SGs in Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs). This technique can also be used to study G3BP-containing SGs in live neurons, which is crucial as it was recently shown that these SGs are formed at the onset of neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease. This approach can be adapted to any other cellular body and granule protein component, and performed with transgenic animals, allowing the live study of granules dynamics for example in the absence of a specific factor of these granules.

Stress granules (SGs) are cytoplasmic RNA granules containing stalled ribonucleoprotein particles (RNPs), and important in cellular response to various stresses. Dynamics of SGs can be followed in live cells by visualizing the localization of a tagged component of SGs in transfected primary cells after stress.

Canlı İlköğretim Hücrelerde G3BP Stres Granül Dinamiği Görselleştirme

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.

Kültürlenmiş memeli hücrelerinde büyük çapta paralel Raportör Tahliller

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

Görüntüleme Yerel Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Kültürlenmiş memeli hücrelerinde sinyaller

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic levels. Tight control over ER calcium is imperative for protein folding, modification and trafficking. Perturbations to ER calcium can result in the activation of the unfolded protein response, a three-prong ER stress response mechanism, and contribute to pathogenesis in a variety of diseases. The ability to monitor ER calcium alterations during disease onset and progression is important in principle, yet challenging in practice. Currently available methods for monitoring ER calcium, such as calcium-dependent fluorescent dyes and proteins, have provided insight into ER calcium dynamics in cells, however these tools are not well suited for in vivo studies. Our lab has demonstrated that a modification to the carboxy-terminus of Gaussia luciferase confers secretion of the reporter in response to ER calcium depletion. The methods for using a luciferase based, secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) for in vitro and in vivo applications are described herein. This video highlights hepatic injections, pharmacological manipulation of GLuc-SERCaMP, blood collection and processing, and assay parameters for longitudinal monitoring of ER calcium.

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Endoplasmic reticulum calcium homeostasis is disrupted in diverse pathologies. A secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) reporter can be used to detect disruptions in the ER calcium store. This protocol describes the use of a Gaussia luciferase SERCaMP to examine ER calcium homeostasis in vitro and in vivo.

Bir kullanılması Endoplazmik retikulum kalsiyum dengesi İzleme<em&gt; Gaussia</em&gt; Lusiferaz SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic ...

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall health. A significant portion of intracellular Ca2+ content is found within the SR stores in VSMCs. As the only intracellular organelle with a close association to the surrounding extracellular space through plasma membrane-SR junctions, the SR can be considered to constitute the first line of response to any irregularity in Ca2+ transients, or stress experienced by the cell. Among its many functions, one of the most important is its role in the transmission of Ca2+-regulated signals throughout the cell to induce further cell-wide reactions downstream. The more common use of cytoplasmic Ca2+ indicators in this regard is overall insufficient for research into the highly dynamic changes to the intraluminal SR Ca2+ store that have yet to be fully characterized. Here, we provide a detailed protocol for the direct and clear measurement of luminal SR Ca2+. This tool is useful for investigation into the nuanced changes in SR Ca2+ that have significant subsequent effects on the normal function and health of the cell. Fluctuations in SR Ca2+ content specifically can provide us with a significant amount of information pertaining to cellular responses to disease or stress conditions experienced by the cell. In this method, a modified version of a SR-targeted Ca2+ indicator, D1SR, is used to detect Ca2+ fluctuations in response to the introduction of agents to cultured rat aortic smooth muscle cells (SMCs). Following incubation with the D1SR indicator, confocal fluorescence microscopy and fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based imaging are used to directly observe changes to intraluminal SR Ca2+ levels under control conditions and with the addition of agonist agents that function to induce intracellular Ca2+ movement.

Currently, most available calcium indicators are used to quantify cytoplasmic calcium transients as indirect measures of calcium released from the sarcoplasmic reticulum in cultured smooth muscle cells. This protocol describes the use of a specific FRET-based indicator that allows direct measurement of calcium signals within the sarcoplasmic reticulum lumen.

Kullanımı Kültür düz kas hücrelerinin sarkoplazmik retikulum içinde Kalsiyum Değişiminin Ölçülmesi FRET tabanlı Konfokal Görüntüleme

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...