Bu proje, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Zhifei Fu'ya 32201235), Çin'in Fujian Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (2022J01287'den Zhifei Fu'ya), Fujian Tıp Üniversitesi'ndeki İleri Yetenekler Araştırma Vakfı, Çin (XRCZX2021013'den Zhifei Fu'ya), Çin'in Fujian Eyaleti Finans Özel Bilim Vakfı (22SCZZX002'den Zhifei Fu'ya), NHC İnsan Olmayan Primat için Doğurganlık Düzenlemesinin Teknik Değerlendirmesi Anahtar Laboratuvarı ve Fujian Doğum ve Çocuk Sağlığı Hastanesi'nin kurulması (2022-NHP-04'ten Zhifei Fu'ya). Fujian Tıp Üniversitesi Kamu Teknoloji Hizmet Merkezi'nden Linying Zhou, Minxia Wu, Xi Lin ve Yan Hu'ya EM numune hazırlama ve EM görüntüleme konusundaki destekleri için teşekkür ederiz.

Hayvancılık ve deneyler, Fujian Tıp Üniversitesi Tıp Merkezi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı. Geçerli protokolün adım adım iş akışı Şekil 1'de gösterilmektedir.
1. Numune hazırlama
<ol><li>Fare beyni<ol><li>Bu fareleri genotiplemek için transgenik fareler (Malzeme Tablosuna bakınız) ve oligonükleotid primerleri (Malzeme Tablosuna bakınız) satın alın.</li>
		<li>Daha önce yayınlanmış protokol 12,13'ü izleyerek sağlam beyni kraniyal tonozdan perfüze edin ve çıkarın.</li>
		<li>Fare beynini gece boyunca 4 °C'de 10 mL fiksatif solüsyon ( Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarak sabitleyin.</li>
		<li>Fiksatif çözeltiyi 0,1 M fosfat tamponu (PB) ile 3 x 10 dakika durulayın.</li>
		<li>Fare beynini salınımlı bir mikrotom kullanarak 500 μm kalınlığında bölümlere ayırın (bkz.</li>
		<li>Floresan bölgeleri bir stereomikroskop kullanarak bir neşter ile küçük bloklar halinde kesin (bkz. NOT: Küçük blokların hacmi 1 mm'den büyük olmamalıdır3.</li>
	</ol></li>
	<li>Kültürlenmiş hücreler<ol><li>HeLa hücrelerini 6 cm'lik hücre kültürü kaplarına tohumlayın ve bunları büyüme ortamında tutun (Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamı [DMEM] düşük glikozu,% 10 fetal sığır serumu [FBS] ile desteklenmiştir).</li>
		<li>Ertesi gün, mScarlet içeren plazmitleri, transfeksiyon kitinin talimat kitabını izleyerek DNA transfeksiyon reaktifi (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarak hücrelere aktarın.</li>
		<li>Transfeksiyondan kırk sekiz saat sonra, transfekte edilmiş hücreleri tripsinize edin ve 1.000 × g'da hücre peletleri elde etmek için santrifüjleyin. Hücre peletlerine numune blokları denir.</li>
	</ol></li>
</ol>2. EM numune hazırlama
<ol><li>Fiksasyon<ol><li>Numune bloklarını sabitleyici bir çözelti kullanarak sabitleyin (Malzeme Tablosuna bakın) gece boyunca 4 °C'de.</li>
		<li>Fiksatif solüsyonu çıkarın ve fiksatif solüsyonu numune bloklarından 0,1 M PB ile 3 x 10 dakika durulayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Osmiyum tetroksit (OsO4) boyama<ol><li>Numune bloklarını OsO4 çözeltisi ile sabitleyin (Malzeme Tablosuna bakın) 4 °C'de 1 saat.</li>
		<li>OsO4 çözeltisini çıkarın ve OsO4 çözeltisini 3 x 10 dakika ddH2O ile durulayın.ampbloklar.</li>
	</ol></li>
	<li>Uranil asetat (UA) boyama<ol><li>Numune bloklarını %2 UA çözeltisi kullanarak boyayın ( Malzeme Tablosuna bakın) 4 °C'de 1 saat.</li>
		<li>UA çözeltisini çıkarın ve numune bloklarını ddH2O ile 3 x 10 dakika durulayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Gradyan dehidrasyonu<ol><li>Numune bloklarını gradyan etanol ile şu şekilde kurutun: 10 dakika boyunca %50, 10 dakika boyunca %70, 10 dakika boyunca %80, 10 dakika boyunca %90 ve %100 etanol içinde 2 x 10 dakika.</li>
		<li>Numune bloklarını susuz asetonla 3 x 10 dakika kurutun.</li>
	</ol></li>
	<li>Reçine infiltrasyonu<ol><li>Numune bloklarına gradyan reçine ile sızın (Malzeme Tablosuna bakın): asetondan reçineye 3 saat boyunca 1:1, asetondan reçineye 1:1 2 saat, asetondan reçineye 1:3 3 saat.</li>
		<li>Saf reçine ile 3 x 12 saat değiştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Reçine gömme<ol><li>Numune bloklarını bir kürdan kullanarak kapsüllere aktarın (Malzeme Tablosuna bakın).</li>
		<li>Numune bloğunu içeren kapsüle saf reçine ekleyin ve reçineyi fırında 60 °C'de 14-16 saat polimerize edin.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Kapak camının altın nanopartiküllerle kaplanması
<ol><li>Kapak camı temizliği<ol><li>Koruyucu gözlükleri temizleme tamponu ile (Malzeme Tablosuna bakın) 142 °C'de 2 saat yıkayın.</li>
		<li>Temizleme tamponunu ddH2O ile 3 x 10 dakika durulayın.</li>
		<li>Kapak bardaklarını dikkatlice susuz etil alkol içeren bir behere aktarın ve gece boyunca inkübe edin.</li>
		<li>Kapakları temiz bir tezgahta birkaç dakika havayla kurutun.</li>
	</ol></li>
	<li>Kapak gözlüklerini altın nanopartiküllerle kaplayın.<ol><li>Cam çimento kullanarak bir masaüstü santrifüjün dönüşünün ortasına bir cam sürgü sabitleyin (Malzeme Tablosuna bakın).</li>
		<li>Yapışkan notlar kullanarak cam sürgünün ortasına bir kapak camı monte edin.</li>
		<li>Kapak camına 75 μL% 1 pioloform ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakın). NOT: Formvar'ı da test ettik (Malzeme Tablosuna bakın) ve iyi çalışıyor.</li>
		<li>Kapak camının yüzeyinde ince bir pioloform tabakası oluşturmak için 1.360 × g'da (Şekil 2A) 3 dakika döndürün.</li>
		<li>Kapak camı yüzeyini 250 μL% 0.1 poli-L-lizin ile oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin (Malzeme Tablosuna bakın) (Şekil 2B).</li>
		<li>ddH2O ile durulayın ve kapak camını birkaç dakika havayla kurutun.</li>
		<li>80 nm altın nanopartikülleri (Malzeme Tablosuna bakınız) ddH2O ile% 25 (v / v, OD600 = 0.07) (Malzeme Tablosuna bakınız) ile seyreltin ve 15 dakika boyunca sonikat yapın.</li>
		<li>Kapak camı yüzeyini seyreltilmiş altın nanopartikülleri ile oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin (Şekil 2C).</li>
		<li>ddH2O ile durulayın ve kapak camını birkaç dakika havayla kurutun. NOT: Pioloform ve altın nanopartiküller ile kaplandıktan 2 hafta sonra iyi çalışır. Ancak kaplandıktan hemen sonra kullanmanızı öneririz.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Ultra ince kesit alma
<ol><li>Numune bloğunun yüzeyini dik açılı bir yamuk şeklinde kesin. Elmas bıçak kullanarak 100 nm kalınlığında kesitler kesin (bkz . Malzeme Tablosu) ve ultramikrotom (bkz. Malzeme Tablosu). Tek bir bölümü kesit bandından ayırın ve tek bölümü su banyosunda yüzdürün.</li>
	<li>Altın nanopartikül kaplı kapak camının ortasına bir damla ddH2O ekleyin. Bir numune döngüsü kullanarak bir kesit alın ve numune döngüsünü su damlasının yüzeyine ters çevirin. Numune halkasını çıkarın, bölümü su damlasının yüzeyinde bırakın.</li>
	<li>Kapak camını birkaç dakika havayla kurutun. Bir keçeli kalem kullanarak kapak camının karşı tarafındaki bölümün etrafına bir halka çizin.</li>
</ol>5. Işık mikroskobu görüntüleme
<ol><li>Floresan geri kazanımı NOT: İş akışı Şekil 3A'da gösterilmiştir.<ol><li>Kapak camındaki ultra ince bölüme 10 μL montaj tamponu ( Malzeme Tablosuna bakın) ekleyin. Montaj tamponuna yeni, temiz bir kapak camı yerleştirin. NOT: Montaj tamponunun temel bileşeni, floresan proteinlerin floresansını geri kazanmak için kullanılan DABCO'dur. Bu, floresan geri kazanımı için çok önemlidir.</li>
		<li>Bu iki kapak camını ultra ince bölümle birlikte bir görüntüleme odasına koyun (bkz. Çizilmiş halkalı kapak camının üstte olduğundan emin olun.</li>
	</ol></li>
	<li>Navigasyon haritasını toplayın.<ol><li>Ters çevrilmiş bir floresan mikroskobunun parlak alan görüntüleme modunda bir işaretleyici olarak çizilen halkayı kullanan kesiti bulun (bkz. Bölümün bir köşesine gitme. Beyaz ışığı açın ve parlak alan görüntüsünü alın.</li>
		<li>Beyaz ışığı kapatın. Lazeri (561 nm) açın ve aynı görüş alanının (FOV) floresan görüntülerini çekin.</li>
		<li>Lazeri kapatın. Bu iki FOV'un %10 örtüştüğünden emin olarak bitişik FOV'a gidin. İkinci FOV'un parlak alan görüntüsünü ve floresan görüntüsünü alın.</li>
		<li>Tüm bölüm kaplanana kadar bu işlemi tekrarlayın. FOV'u dikmek için kullanılabilecek görüntüleme yolunu kaydedin. NOT: Görüntünün daha yüksek kalitesi için konfokal mikroskobu kullanmanızı öneririz.</li>
	</ol></li>
	<li>İlgilenilen görüntü hücreleri.<ol><li>İlgilendiğiniz hücreleri kolayca hedeflemek için navigasyon haritasını kullanın. Lazeri (561 nm) açın ve ilgilendiğiniz hücrenin 300 kare floresan görüntüsünü alın. Lazeri kapatın.</li>
		<li>Beyaz ışığı açın ve ardışık parlak alan görüntüleri (~100 kare) çekin.</li>
		<li>İlgilendiğiniz başka bir hücreye gidin.</li>
	</ol></li>
</ol>6. EM görüntüleme için hazırlık
NOT: İş akışı Şekil 3B'de gösterilmiştir.
<ol><li>Ultra ince bölümü yuva ızgarasına aktarın.<ol><li>Bir cam kavanozu ddH2O ile doldurun.</li>
		<li>Kapak camlarını hazneden çıkarın ve iki kapak camını cımbızla ayırın. Bölümün bulunduğu kapak camını sıkıştırın, montaj tamponunu yıkayın ve havayla kurutun.</li>
		<li>Tek taraflı bir bıçak kullanarak ultra ince bölümün etrafına bir # puan verin ve #'nin her köşesine 10 μL %12 hidroflorik asit (Malzeme Tablosuna bakın) damlatın. Kapak camını yavaşça suya koyun. NOT: Hidroflorik asit camla reaksiyona girerek pioloform filmin kapak camından çıkarılmasını kolaylaştırır. Hidroflorik asit toksiktir. Eldivenli kimyasal bir başlıkta kullanın. Cilt ile temas acil tıbbi müdahale gerektirir.</li>
		<li>Pioloform filmi ve ultra ince bölümü su yüzeyinde birlikte yüzdürün. Izgaranın ortasındaki bölümü yakalamak için bölüme kaplanmamış bir yuva ızgarası yerleştirin.</li>
		<li>Bir cam slaytı parafilm ile kaplayın ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve ızgarayı pioloform filmle alın. Izgarayı oda sıcaklığında havayla kurutun.</li>
	</ol></li>
	<li>Bölüm boyama<ol><li>Bölümü% 2 UA ve Sato'nun üçlü kurşunu ile boyayın. Daha fazla ayrıntı için, daha önce yayınlanan protokol2'ye bakın.</li>
	</ol></li>
</ol>7. Görüntü analizi
<ol><li>Navigasyon haritasını birleştirin.<ol><li>Ham verilerin konumunu bulun. Navigasyon haritasını dikmek için ImageJ yazılımını açın ( Malzeme Tablosuna bakın).</li>
		<li>Eklentiler'e tıklayın | Dikiş | Izgara/Koleksiyon birleştirme | (Türü) Izgara: sütuna göre yılan | (Sipariş) Yukarı ve Sol (çekim sırasına göre) | Dilim boyutunu ayarlama | Veri yolunu seç | Dosya adını ayarla | Ekran füzyonunu kontrol edin. Farklı FOV'ların birkaç parlak alan görüntüsünden oluşan bir navigasyon haritası olan sonucu gözlemleyin.</li>
		<li>Bir floresan navigasyon haritasını birleştirmek için aynı yöntemi kullanın.</li>
	</ol></li>
	<li>Parlak alan görüntülerini floresan görüntülerle birleştirin.<ol><li>ImageJ yazılımında, Dosya | İthalat | İlgilenilen hücrenin sıralı parlak alan görüntülerini içe aktarmak için Görüntü Sırası.</li>
		<li>Resmin üzerine tıklayın | Yığınlar | Z Projeksiyon | Sıralı parlak alan görüntülerinin toplam yoğunluk projeksiyonu (SIP) görüntüsünü elde etmek için Dilimleri Topla.</li>
		<li>Düzenle | Altın nanoparçacıkların sinyallerinin parlak beyaz noktalar haline gelmesi için parlak alanın SIP görüntüsünü ters çevirmek için ters çevirin.</li>
		<li>ImageJ'de Dosya | İthalat | Sıralı FM görüntülerini içe aktarmak için Görüntü Sırası.</li>
		<li>Resmin üzerine tıklayın | Yığınlar | Z Projeksiyon | Sıralı FM görüntülerinin SIP görüntüsünü elde etmek için Dilimleri Topla.</li>
		<li>Resmin üzerine tıklayın | Renk | SIP parlak alan görüntüsünü SIP FM görüntüsüyle bileşik görüntü olarak birleştirmek için Kanalları Birleştir'i seçin.</li>
		<li>Altın nanopartiküller yeşildir ve floresan proteini kırmızıdır. Resmin üzerine tıklayın | Türü | RGB Rengi , bileşik görüntünün formatını RGB'ye dönüştürmek için kullanılır.</li>
	</ol></li>
</ol>8. EM görüntüleme
<ol><li>Izgaranın kesit tarafını yukarı doğru tutarak ızgarayı numune tutucusuna yerleştirin.</li>
	<li>Ultra ince kesitin sağ yamuğunun dört farklı köşesine dört bağıl mesafe boyunca bir elektron mikroskobu altında karşılık gelen hücrelerin konumunu kabaca belirlemek için navigasyon haritasını kullanın.</li>
	<li>Altın nanopartikülleri kullanarak hücreleri onaylayın.</li>
	<li>Transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ile farklı büyütmelerde (4,200x, 6,000x veya 8,200x) EM görüntüleri çekin (Malzeme Tablosuna bakın).</li>
</ol>9. FM görüntüsünün EM görüntüsü ile kaydedilmesi
<ol><li>Kayıt yazılımını açın (Malzeme Tablosuna bakın). Arama penceresine easyCLEMv014yazın. easyCLEMv0'ı açmak için easyCLEMv0'a tıklayın. Resim/Sekans üzerine tıklayın | EM görüntüsünü ve bileşik görüntüyü yazılım paneline aktarmak için açın.</li>
	<li>EasyCLEMv0 penceresinde, hizalama modu olarak rijit olmayan (2D veya 3D) seçmek için 2D'ye (x,y,[T]) tıklayın.</li>
	<li>EasyCLEMv0 penceresinde, Kompozit (RGB)color.tif'yi seçmek için dönüştürülecek ve yeniden boyutlandırılacak görüntüyü seçin (muhtemelen FM) seçeneğinin sağındaki açılır kutuya tıklayın. Ardından, EMimage. tif seçmek için Değiştirilmeyecek (muhtemelen EM) görüntü seçin'in sağındaki açılır kutuya tıklayın.</li>
	<li>Kaydı başlatmak için Başlat'a tıklayın.</li>
	<li>EMimage. tif adlı EM görüntü penceresinde, Nokta 1'i altın nanoparçacığın üzerine koymak için bir altın nanoparçacığa tıklayın. Kompozit (RGB)color.tif adlı FM görüntü penceresinde, Nokta 1'i altın nanopartikülün üzerine koymak için karşılık gelen altın nanopartiküle tıklayın.</li>
	<li>LM sinyalini altın nanopartiküllerin EM sinyaliyle onaylamak için Dönüşümü Güncelle'ye tıklayın.</li>
	<li>Yukarıdaki işlemi EMimage. tif adlı EM görüntü penceresinde tekrarlayın ve LM sinyalini aynı altın nanoparçacığın EM sinyaliyle tek tek eşleştirin.</li>
	<li>Kaydı tamamlamak için Durdur'a tıklayın.</li>
	<li>Görüntü hizalamasından sonra, Üst üste bindirilmiş görüntü'ye tıklayın ve Görüntü/Sekans | Dört kanallı görüntüler (kırmızı, yeşil, mavi, gri) içeren bir görüntü yığınını dışa aktarmak için Farklı kaydet.</li>
	<li>ImageJ'yi açın ve Dosya | Bindirmeli görüntüyü içe aktarmak için açın. Resmin üzerine tıklayın | Yığınlar | Katmanlara Yığ Görüntüsü dört kanallı görüntülere ayırmak için. </li>
	<li>Resmin üzerine tıklayın | Renk | Üç kanaldaki (kırmızı, yeşil ve gri) görüntüleri bileşik bir görüntüde birleştirmek için Kanalları Birleştir.</li>
	<li>Resmin üzerine tıklayın | Türü | RGB Rengi, bileşik görüntüyü bir CLEM görüntüsüne dönüştürmek için kullanılır.</li>
</ol>

Eş Zamanlı Floresan ve Üst Yapı Koruması için Yeni Protokol

<ol>
	<li>de Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+light+and+electron+microscopy:+ultrastructure+lights+up.">Correlated light and electron microscopy: ultrastructure lights up.</a> Nat Methods. 12 (6), 503-513 (2015).</li><li>Kopek, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+protocols+for+correlative+super-resolution+fluorescence+imaging+and+electron+microscopy+of+chemically+fixed+samples.">Diverse protocols for correlative super-resolution fluorescence imaging and electron microscopy of chemically fixed samples.</a> Nat Protoc. 12 (5), 916-946 (2017).</li><li>Watanabe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+localization+in+electron+micrographs+using+fluorescence+nanoscopy.">Protein localization in electron micrographs using fluorescence nanoscopy.</a> Nat Methods. 8 (1), 80-84 (2011).</li><li>Johnson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+in-resin+super-resolution+and+electron+microscopy+using+standard+fluorescent+proteins.">Correlative in-resin super-resolution and electron microscopy using standard fluorescent proteins.</a> Sci Rep. 5 (1), 9583 (2015).</li><li>Paez-Segala, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation-resistant+photoactivatable+fluorescent+proteins+for+CLEM.">Fixation-resistant photoactivatable fluorescent proteins for CLEM.</a> Nat Methods. 12 (3), 215-218 (2015).</li><li>Fu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mEosEM+withstands+osmium+staining+and+Epon+embedding+for+super-resolution+CLEM.">mEosEM withstands osmium staining and Epon embedding for super-resolution CLEM.</a> Nat Methods. 17 (1), 55-58 (2020).</li><li>Kukulski, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+fluorescence+and+3D+electron+microscopy+with+high+sensitivity+and+spatial+precision.">Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision.</a> J Cell Biol. 192 (1), 111-119 (2011).</li><li>Peng, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+fluorescent+proteins+for+dual-colour+post-embedding+CLEM.">Improved fluorescent proteins for dual-colour post-embedding CLEM.</a> Cells. 11 (7), 1077 (2022).</li><li>Campbell, B. C., Paez-Segala, M. G., Looger, L. L., Petsko, G. A., Liu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+stable+fluorescent+proteins+for+advanced+microscopy.">Chemically stable fluorescent proteins for advanced microscopy.</a> Nat Methods. 19 (12), 1612-1621 (2022).</li><li>Tanida, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-color+in-resin+CLEM+of+Epon-embedded+cells+using+osmium+resistant+green+and+red+fluorescent+proteins.">Two-color in-resin CLEM of Epon-embedded cells using osmium resistant green and red fluorescent proteins.</a> Sci Rep. 10 (1), 21871 (2020).</li><li>Tanida, I., Kakuta, S., Oliva Trejo, J. A., Uchiyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+cytoplasmic+organelles+via+in-resin+CLEM+using+an+osmium-resistant+far-red+protein.">Visualization of cytoplasmic organelles via in-resin CLEM using an osmium-resistant far-red protein.</a> Sci Rep. 10 (1), 11314 (2020).</li><li>MacManus, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excision+of+whole+intact+mouse+brain.">Excision of whole intact mouse brain.</a> MethodsX. 10, 102246 (2023).</li><li>Lu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preserving+extracellular+space+for+high-quality+optical+and+ultrastructural+studies+of+whole+mammalian+brains.">Preserving extracellular space for high-quality optical and ultrastructural studies of whole mammalian brains.</a> Cell Rep Methods. 3 (7), 24 (2023).</li><li>Paul-Gilloteaux, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=eC-CLEM:+flexible+multidimensional+registration+software+for+correlative+microscopies.">eC-CLEM: flexible multidimensional registration software for correlative microscopies.</a> Nat Methods. 14 (2), 102-103 (2017).</li><li>Fenno, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+dual-+and+triple-feature+intersectional+single-vector+delivery+of+diverse+functional+payloads+to+cells+of+behaving+mammals.">Comprehensive dual- and triple-feature intersectional single-vector delivery of diverse functional payloads to cells of behaving mammals.</a> Neuron. 107 (5), 836-853 (2020).</li><li>Shcherbo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Far-red+fluorescent+tags+for+protein+imaging+in+living+tissues.">Far-red fluorescent tags for protein imaging in living tissues.</a> Biochem J. 418 (3), 567-574 (2009).</li><li>Shen, Y., Chen, Y., Wu, J., Shaner, N. C., Campbell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+mCherry+variants+with+long+Stokes+shift,+red-shifted+fluorescence,+and+low+cytotoxicity.">Engineering of mCherry variants with long Stokes shift, red-shifted fluorescence, and low cytotoxicity.</a> PLoS One. 12 (2), e0171257 (2017).</li><li>Ai, H. W., Olenych, S. G., Wong, P., Davidson, M. W., Campbell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hue-shifted+monomeric+variants+of+Clavularia+cyan+fluorescent+protein:+identification+of+the+molecular+determinants+of+color+and+applications+in+fluorescence+imaging.">Hue-shifted monomeric variants of Clavularia cyan fluorescent protein: identification of the molecular determinants of color and applications in fluorescence imaging.</a> BMC Biol. 6 (13), 1741 (2008).</li><li>Ogoh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-color-emitting+green+fluorescent+protein+from+the+sea+cactus+Cavernularia+obesa+and+its+use+as+a+pH+indicator+for+fluorescence+microscopy.">Dual-color-emitting green fluorescent protein from the sea cactus Cavernularia obesa and its use as a pH indicator for fluorescence microscopy.</a> Luminescence. 28 (4), 582-591 (2013).</li><li>Bindels, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mScarlet:+a+bright+monomeric+red+fluorescent+protein+for+cellular+imaging.">mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging.</a> Nat Methods. 14 (1), 53-56 (2017).</li><li>Xu, P., Xu, T., Zhang, M., Fu, Z., He, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+Epon-embedding-based+correlative+super-resolution+light+and+electron+microscopy.">A protocol for Epon-embedding-based correlative super-resolution light and electron microscopy.</a> Research Square. , (2019).</li><li>Johnson, E., Kaufmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preserving+the+photoswitching+ability+of+standard+fluorescent+proteins+for+correlative+in-resin+super-resolution+and+electron+microscopy.">Preserving the photoswitching ability of standard fluorescent proteins for correlative in-resin super-resolution and electron microscopy.</a> Methods Cell Biol. 140, 49-67 (2017).</li><li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid-liquid+phase+separation+mediates+the+formation+of+herpesvirus+assembly+compartments.">Liquid-liquid phase separation mediates the formation of herpesvirus assembly compartments.</a> J Cell Biol. 222 (1), 17 (2023).</li><li>Tao, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+characterization+of+excitatory+and+inhibitory+synapses+by+cryo-electron+tomography+and+correlative+microscopy.">Differentiation and characterization of excitatory and inhibitory synapses by cryo-electron tomography and correlative microscopy.</a> J Neurosci. 38 (6), 1493-1510 (2018).</li></ol>

Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Burada sunulan protokol, ışık mikroskobundan (LM) hedef proteinin lokalizasyon bilgisini ve elektron mikroskobundan (EM) hedef proteini çevreleyen bağlamı birleştirebilen çok yönlü bir görüntüleme yöntemidir6. Mevcut floresan proteinlerin sınırlamaları ile yaygın olarak kullanılan yöntem, korelasyon ışığı ve elektron mikroskobunun (CLEM) önceden gömülmesidir, bu da LM görüntülemenin EM numune hazırlığından önce yapıldığı anlamına gelir. Hemen hemen tüm mev...

Floresan mikroskobu (FM), hedef proteinin lokalizasyonunu ve dağılımını elde etmek için kullanılabilir. Bununla birlikte, hedef proteini çevreleyen bağlam kaybolur, bu da hedef proteini iyice araştırmak için çok önemlidir. Elektron mikroskobu (EM), birkaç hücre altı ayrıntı sağlayan en yüksek görüntüleme çözünürlüğüne sahiptir. Bununla birlikte, EM hedef etiketlemeden yoksundur. FM tarafından alınan floresan görüntüsünü EM tarafından elde edilen gri görüntü ile doğru bir şekilde birleştirerek, bağıntılı ışık ve elektron mikroskobu (CLEM), bu iki görüntüleme modu 1,2,3,4 tarafından elde edilen bilgileri birleştirebilir.
CLEM, floresan ve üst yapı1 arasında bir değiş tokuştur. Mevcut floresan proteinlerin sınırlamaları ve geleneksel EM numune hazırlama prosedürleri, özellikle osmik asit (OsO4) ve Epon gibi hidrofobik reçinelerin kullanımı nedeniyle, üst yapı her zaman floresan5'i tehlikeye atar. OsO4 , EM görüntülerinin kontrastını iyileştirmek için kullanılan EM numune hazırlamada vazgeçilmez bir reaktiftir. Diğer gömme reçineleri ile karşılaştırıldığında, Epon ultrastrüktür koruma ve kesit alma özelliklerinde üstündür5. Bununla birlikte, hiçbir floresan proteini,OSo4 ve Epon gömme6'nın tedavisinden sonra floresan sinyalini tutamaz. Floresan proteinlerin sınırlamalarının üstesinden gelmek için, EM numune hazırlamadan önce FM görüntülemenin yapıldığı önceden gömülü CLEM geliştirilmiştir6. Bununla birlikte, CLEM'i önceden gömmenin dezavantajı, FM ve EM görüntüleri arasındaki kesin olmayan kayıttır5.
Aksine, gömme sonrası CLEM yöntemi, kayıt doğruluğu 6-7 nm 5,6'ya ulaşabilen EM numune hazırlığından sonra FM görüntülemeyi gerçekleştirir. Floresan proteinlerin floresansını korumak için, çok düşük konsantrasyonlarda OsO4 (% 0.001)3 veya yüksek basınçlı dondurulmuş (HPF) ve dondurarak ikame (FS) EM hazırlama yöntemleri 4,7, bozulmuş üst yapı veya EM görüntüsünün kontrastı pahasına kullanılmıştır. Gömme reçinesi5 olarak glisidil metakrilat kullanılmasına rağmen, mEos4b'nin geliştirilmesi, gömme sonrası CLEM'in ilerlemesini büyük ölçüde destekler. OsO4 boyama ve Epon gömme hayatta kalabilen mEosEM'in geliştirilmesiyle, floresan ve üst yapıyı aynı anda koruyarak ilk kez Epon gömme sonrası süper çözünürlüklü CLEM elde edildi6. mEosEM'den sonra,OsO4 boyamaya ve Epon gömmeye dayanabilen birkaç floresan proteini geliştirildi 8,9,10,11. Bu, CLEM'in gelişimini büyük ölçüde teşvik eder.
Epon gömme sonrası CLEM'in üç temel yönü vardır. Birincisi, EM numune hazırlığından sonra floresan sinyalini koruması gereken floresan proteindir. Deneyimlerimize göre, mScarlet bildirilen diğer floresan proteinlerden üstündür. İkincisi, EM görüntülemede FM görüntüleme ile görüntülenen aynı hücrenin nasıl bulunacağıdır. Bu sorunu çözmek için, hedeflenen hücreyi kolayca bulabilmeniz için bu adımın prosedürünü iyileştiriyoruz. Sonuncusu, FM görüntüsünü EM görüntüsüyle hizalama yöntemidir. Burada, FM ve EM görüntüleri arasındaki kaydı detaylandırıyoruz. Bu protokolde, VGLUT2 nöronlarında mScarlet'i eksprese ediyoruz ve mScarlet'in Epon post-embedding CLEM kullanarak ikincil lizozomları hedefleyebileceğini gösteriyoruz. Floresan ve üst yapıdan ödün vermeden Epon gömme sonrası CLEM için adım adım ayrıntılar sunuyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 M Phosphate Buffer (PB)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>NaH2PO4 &#183; 2H2O+Na2HPO4 &#183; 12H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 M Tris-Cl (pH 8.5)</td>
			<td>Shanghai yuanye Bio-Technology</td>
			<td>R26284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25% Glutaraldehyde (GA)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A17876</td>
			<td>Hazardous chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Abbelight 3D</td>
			<td>Nanolnsights</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>SCR</td>
			<td>10000418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide</td>
			<td>J&#38;K Scientific</td>
			<td>335213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioPhotometer D30</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaning buffer of cover glasses</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mL Ammonium hydroxide, 50 mL Hydrogen peroxide, 250 mL H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass</td>
			<td>Warner</td>
			<td>64-0715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>290734</td>
			<td>Hazardous chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDSA</td>
			<td>SPI company</td>
			<td>GS02827</td>
			<td>Hazardous chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop centrifuge</td>
			<td>WIGGENS</td>
			<td>MINICEN 10E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife</td>
			<td>DiATOME</td>
			<td>MX6353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMP-30</td>
			<td>SPI company</td>
			<td>GS02823</td>
			<td>Hazardous chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA transfection reagent</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>2696953</td>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epon 812&#160;</td>
			<td>SPI company</td>
			<td>GS02659</td>
			<td>Hazardous chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>SCR</td>
			<td>10009218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji image J</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixative solution&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4% PFA+0.25% GA+0.02 M PB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>SCR</td>
			<td>10010618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold nanoparticles</td>
			<td>Corpuscular</td>
			<td>790120-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gradient resin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Acetone to resin 3:1, 1:1, 1:3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrofluoric acid</td>
			<td>SCR</td>
			<td>10011118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>SCR</td>
			<td>10011218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ICY (https://icy.bioimageanalysis.org/about/)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Easy CLEMv0 Plugin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging chamber</td>
			<td>Thermo Fisher&#160;</td>
			<td>A7816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large gelatin capsules</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mowiol 4-88, Glycerol, 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5), DABCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol 4-88</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9002-89-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#160;&#382;12H2O</td>
			<td>SCR</td>
			<td>10020318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#160;&#382;2H2O</td>
			<td>SCR</td>
			<td>20040718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMA</td>
			<td>SPI company</td>
			<td>GS02828</td>
			<td>Hazardous chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotide primers</td>
			<td>Takara Biomedical Technology (Beijing)</td>
			<td></td>
			<td>Three oligonucleotides primers were used to detect Vglut2-ires-Cre and wild-type simultaneously. The primers 5,-ATCGACCGGTAATGCAGGCAA-3, and 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, aimed to detect Vglut2-ires-Cre. The primers&#160; 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, and 5,-CATGGTCTGTTTTGAATTCAG-3, aimed to detect wild-type.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscillating microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide</td>
			<td>SCR</td>
			<td>L01210302</td>
			<td>Hazardous chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OsO4 solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1% Osmium tetroxide+1.5% K4Fe (CN)6&#183;3H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Amcor</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>SCR</td>
			<td>80096618</td>
			<td>Hazardous chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4% PFA+0.1 M PB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pioloform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>63148-65-2</td>
			<td>Hazardous chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>25986-63-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium ferrocyanide (K4Fe (CN)6&#183;3H2O)&#160;</td>
			<td>SCR</td>
			<td>10016818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blades</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S2771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handles</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S2896-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>MVX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transgenic mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
			<td>Vglut2-ires-Cre mice (strain: 129S6/SvEvTac) were housed in standard conditions (25 &#176;C, a 12 h light/dark cycle, with water and food given ad libitum. Male and Female mice were used at 2&#8211;3 months old, weight range 20-30 g.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope (TEM)</td>
			<td>FEI</td>
			<td></td>
			<td>TECNAL G2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UA solution (2% UA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Aqueous solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LEICA EM UC6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate (UA)</td>
			<td>TED PELLA</td>
			<td>19481</td>
			<td>Hazardous chemical</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

epon post embedding correlative light and electron microscopy

Bağıntılı ışık ve elektron mikroskobu (CLEM), floresan mikroskobu (FM) tarafından sağlanan lokalizasyon bilgilerini ve elektron mikroskobu (EM) tarafından elde edilen hücresel üst yapı bağlamını birleştiren kapsamlı bir mikroskopidir. CLEM, floresan ve üst yapı arasında bir değiş tokuştur ve genellikle üst yapı floresansı tehlikeye atar. Glisidil metakrilat, HM20 veya K4M gibi diğer hidrofilik gömme reçineleri ile karşılaştırıldığında, Epon, üst yapı koruma ve kesit alma özelliklerinde üstündür. Daha önce, mEosEM'nin osmiyum tetroksit fiksasyonuna ve Epon gömülmesine dayanabileceğini göstermiştik. mEosEM'i kullanarak, ilk kez, floresan ve üst yapıyı aynı anda koruyan Epon post gömme CLEM'i elde ettik. Burada, EM numune hazırlama, FM görüntüleme, EM görüntüleme ve görüntü hizalama hakkında adım adım ayrıntılar sunuyoruz. Ayrıca, EM görüntüleme sırasında FM görüntüleme ile görüntülenen aynı hücreyi tanımlama prosedürlerini iyileştiriyoruz ve FM ve EM görüntüleri arasındaki kaydı detaylandırıyoruz. Geleneksel EM tesislerinde bu yeni protokolü takiben Epon post gömülü bağıntılı ışık ve elektron mikroskobunun kolayca elde edilebileceğine inanıyoruz.

Fluorescence microscopy (FM) can be used to obtain the localization and distribution of the target protein. However, the context that surrounds the target protein is lost, which is crucial for investigating the target protein thoroughly. Electron microscopy (EM) has the highest imaging resolution, providing several subcellular details. Nevertheless, EM lacks target labeling. By accurately merging the fluorescence image taken by FM with the gray image acquired by EM, correlative light and electron microscopy (CLEM) can combine the information obtained by these two imaging modes1,2,3,4.
CLEM is a trade-off between fluorescence and the ultrastructure1. Because of the limitations of current fluorescent proteins and the traditional EM sample preparation procedures, especially the use of osmic acid (OsO4) and hydrophobic resins such as Epon, the ultrastructure always compromises fluorescence5. OsO4 is an indispensable reagent in EM sample preparation, which is used to improve the contrast of EM images. Compared with other embedding resins, Epon is superior in ultrastructure preservation and sectioning properties5. However, no fluorescent proteins can retain the fluorescence signal after the treatment of OsO4 and Epon embedding6. To overcome the limitations of fluorescent proteins, pre embedding CLEM was developed, in which FM imaging is done before EM sample preparation6. However, the drawback of pre embedding CLEM is the imprecise registration between the FM and the EM images5.
On the contrary, post embedding CLEM method performs the FM imaging after the EM sample preparation, the registration accuracy of which can reach 6-7 nm5,6. To retain the fluorescence of fluorescent proteins, very low concentrations of OsO4 (0.001%)3 or the high-pressure frozen (HPF) and freeze substitution (FS) EM preparation methods4,7 have been used at the expense of compromised ultrastructure or the contrast of the EM image. The development of mEos4b greatly promotes the progress of post embedding CLEM, although glycidyl methacrylate is used as the embedding resin5. With the development of mEosEM, which can survive the OsO4 staining and Epon embedding, Epon post embedding super-resolution CLEM was achieved for the first time, maintaining the fluorescence and ultrastructure simultaneously6. After mEosEM, several fluorescent proteins that can survive the OsO4 staining and the Epon embedding were developed8,9,10,11. This greatly promotes the development of CLEM.
There are three key aspects to Epon post-embedding CLEM. The first is the fluorescent protein, which should maintain the fluorescent signal after EM sample preparation. According to our experience, mScarlet is superior to other reported fluorescent proteins. The second is how to find the same cell imaged by FM imaging in EM imaging. To solve this problem, we improve the procedure for this step so that one can readily find the targeted cell. The last is the method to align the FM image with the EM image. Here, we detail the registration between the FM and the EM images. In this protocol, we express mScarlet in VGLUT2 neurons and demonstrate that mScarlet can target secondary lysosomes using Epon post-embedding CLEM. We provide step-by-step details for Epon post-embedding CLEM, without compromising the fluorescence and the ultrastructure.

Yazar Spotlight: Floresan Protein Koruma ile İlişkili Işık ve Elektron Mikroskobundaki Gelişmeler

Epon Post Gömme Korbağıntılı Işık ve Elektron Mikroskobu

Correlative light and electron microscopy is a completely stable microscopy technique, which can combine the localization information provided by fluorescent microscopy and is the ultra structure by electron microscopy. However, the mentality of this technique is to preserve the fluorescence of after you have a simple preparation. Using this fluorescent protein, we can achieve correlative light and the electron microscope which can maintain fluorescence and ultra structure simultaneously.

Önceki raporlar, mScarlet'in lizozom15'i hedefleyebileceğini gösterdi. Bu protokolde AAV eksprese eden mScarlet (rAAV-hSyn-DIO-mScarlet-WPRE-pA) stereotaksik aletler kullanılarak Vglut2-ires-cre fare beyninin M1 (ML: ±1.2 AP: +1.3 DV: -1.5) içine enjekte edildi. Yukarıda açıklanan protokolü takiben, nihai ilişkili görüntü Şekil 4A'da gösterilmektedir. FM görüntüsü, referans belirteçleri olarak altın nanopartiküller (yeşil nokta...

Watch this Scientific Journal Video about Epon Post Embedding Correlative Light and Electron Microscopy at JoVE.com

mScarlet adı verilen bir floresan proteini kullanarak Epon gömme sonrası bağıntılı ışık ve elektron mikroskobu için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, floresan ve üst yapıyı aynı anda koruyabilir. Bu teknik, çok çeşitli biyolojik uygulamalara uygundur.

Correlative light and electron microscopy (CLEM) is a comprehensive microscopy that combines the localization information provided by fluorescence ...

Bağıntılı ışık ve elektron mikroskobu, floresan mikroskobu tarafından sağlanan lokalizasyon bilgilerini birleştirebilen ve elektron mikroskobu ile ultra yapı olan tamamen kararlı bir mikroskopi tekniğidir. Bununla birlikte, bu tekniğin zihniyeti, basit bir hazırlık yaptıktan sonra floresansı korumaktır. Bu floresan proteini kullanarak, floresan ve ultra yapıyı aynı anda koruyabilen bağıntılı ışık ve elektron mikroskobu elde edebiliriz.

epon-post-embedding-correlative-light-and-electron-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

Epon Post Embedding Correlative Light and Electron Microscopy

841 Görüntüleme.  Fujian Medical University. Bağıntılı ışık ve elektron mikroskobu, floresan mikroskobu tarafından sağlanan lokalizasyon bilgilerini birleştirebilen ve elektron mikroskobu ile ultra yapı olan tamamen kararlı bir mikroskopi tekniğidir. Bununla birlikte, bu tekniğin zihniyeti, basit bir hazırlık yaptıktan sonra floresansı korumaktır. Bu floresan proteini kullanarak, floresan ve ultra yapıyı aynı anda koruyabilen bağıntılı ışık ve elektron mikroskobu elde edebiliriz.

Video: Yazar Spotlight: Floresan Protein Koruma ile İlişkili Işık ve Elektron Mikroskobundaki Gelişmeler

Correlative light and electron microscopy (CLEM) is a comprehensive microscopy that combines the localization information provided by fluorescence microscopy (FM) and the context of cellular ultrastructure acquired by electron microscopy (EM). CLEM is a trade-off between fluorescence and ultrastructure, and usually, ultrastructure compromises fluorescence. Compared with other hydrophilic embedding resins, such as glycidyl methacrylate, HM20, or K4M, Epon is superior in ultrastructure preservation and sectioning properties. Previously, we had demonstrated that mEosEM can survive osmium tetroxide fixation and Epon embedding. Using mEosEM, we achieved, for the first time, Epon post embedding CLEM, which maintains the fluorescence and the ultrastructure simultaneously. Here, we provide step-by-step details about the EM sample preparation, the FM imaging, the EM imaging, and the image alignment. We also improve the procedures for identifying the same cell imaged by FM imaging during the EM imaging and detail the registration between the FM and EM images. We believe one can easily achieve Epon post embedding correlative light and electron microscopy following this new protocol in traditional EM facilities.

We present a detailed protocol for Epon post-embedding correlative light and electron microscopy using a fluorescent protein called mScarlet. This method can maintain the fluorescence and the ultrastructure simultaneously. This technique is amenable to a wide variety of biological applications.