Bu çalışma, ABD Deniz Kuvvetleri Araştırma Laboratuvarı temel fonları yoluyla Deniz Kuvvetleri Araştırma Ofisi tarafından desteklenmiştir.

1. LNA probları ve deneysel tasarım <ol><li> Transkripsiyonu Srna / mRNA ters tamamlayıcı ya da onlara özel tasarlanmış Tasarım LNA probları <a href="http://www.exiqon.com">www.exiqon.com</a> . Eğer özel bir tasarım seçeneği kullanarak, sırası biliyorum, ama LNA spike desen değil. T m arasında değişen bir artış DNA veya RNA oligonükleotid sonuçları her LNA kalıntı yanı sıra iki ve 10 ° C LNA-RNA hibridizasyon dubleks 14. İdeal olarak, tasarlanan LNA probları, uzunluğu 20-25 nükleotidler (uzun probları sentezlemek için daha zordur) arasında olmalı ve T m ° C arasında 85-90 RNA hibridizasyon olmalıdır . </li><li> Dizisi tasarladıktan sonra, BLAST kullanımlı <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</a> veya prob sadece Srna / ilgi mRNA özgü olduğundan emin olmak için yerel veritabanı prob dizisi karşılaştırmak. </li><li>LNA prob sipariş ederken, LNA oligonükleotid 5 &#39;uç bir biotin-TEG değişiklik ekleyin. Biyotinilasyon streptavidin-boya konjuge post-hibridizasyon boyama için gerekli. 3. Bu değişiklik eklemek mümkün &#39;gerekirse sonu, ancak&#39; son 5 için ek daha az pahalı ve daha yüksek verim sonuçlanması gerekiyor. </li><li> Üç negatif kontroller yöntemi dahil edilmelidir: (i) LNA prob hibridizasyon adım sırasında eklenen olduğu bir &#39;hayır LNA kontrolü, (ii)&#39; boya &#39;kontrol LNA prob melezleşmiştir hedef Srna ama hibridizasyon olay floresan leke olmaması nedeniyle tespit ve (iii) &#39;olmayan ifade Srna / mRNA&#39; kontrolü için bir olmayan veya non-ifade Srna hedefleyen bir LNA prob kullanan değil non-spesifik hibridizasyon izlemek için. </li><li> Burada belirli bir LNA prob (LNA monomerlerin Srna CsrB tamamlayıcı ve &#39;5&#39;-biotin-TEG-gTccAttTccCgtCctTagCagC-3 dizisi varharfleri büyük). </li><li> -20 ° C&#39;de 10-20 mcL alikotları nükleaz içermeyen su ile tekrar süspansiyon 50 mg / ml ve mağaza liyofilize LNA alınmasından sonra </li></ol> Çözümler <ul><li> % 8 paraformaldehye (PFA), PBS içinde% 10 asetik asit: Mix 1 ml% 32 pfa, 400 mcL asetik asit, 400 mcL 10X PBS, pH = 7.4 ve 2.2 mL nükleaz içermeyen su. Dondurulmuş alikot için, -20 ° C&#39;de asetik asit olmadan tek kullanımlık alikotları dondurma. </li><li> % 60 dekstran sülfat çözeltisi: 50 ml konik boru 6.0 g dekstran sülfat ekleyin ve son hacim 10 ml su ekleyin. Dekstran sülfat eriyene kadar (1-2 saat sürebilir) bu karışıma bir su banyosunda 65 ° C ısıtın. İlave su, 10 ml hacmi korumak için çözünürleştirme süreci boyunca eklenmesi gerekir. Kısım, kullanılıncaya kadar -20 ° C&#39;de% 60 dekstran sülfat çözeltisi ve mağaza. </li></ul> 2. Tespit <ol><li> Hasat 1x10 bioluminescent, 8 hücre <em&gt; Vibrio campbellii veya bakteri ilgi ve 1.5 mL mikrosantrifüj tüp içine aktarabilirsiniz. Bu miktar hücre dört akış FISH örnekleri (belirli bir LNA prob örneği ve üç negatif kontroller) için yeterli başlangıç ​​materyali sağlar. Ek 1.5 mL mikrosantrifüj tüp alikotları diğer Srna / mRNA türleri test edilmesi gerekiyorsa alınmalıdır. </li><li> Pelet, beş dakika boyunca 2300 xg santrifüj yoluyla bakteri hücrelerinin. Pipetleme süpernatantı atın ve 1X PBS 400 mcL hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> Bu karışıma, (1X PBS) çözümü tamponlu tuz iyice karıştırın 400 mcL 1X fosfat,% 8 paraformaldehye (PFA) ve% 10 asetik asit, 25, 10 dakika boyunca inkübe ° C beş dakika sonra bir kez karıştırma. Aksi belirtilmediği sürece tüm inkubasyon, ısıtılan bir tüp tutucu yapılmaktadır. Pfa çözelti taze olarak hazırlanır veya asetik asit ilave edildikten sonra dondurulmuş alikot kullanılmalıdır gerekir. Paraformaldehit crosslinking fiksatif bu helps korumak hücre morfolojisi ve hücre içi RNA korumak için. </li><li> Pelet, iki dakika boyunca 4500 xg santrifüj bu karışım hücreleri ve pipetleme süpernatant kaldırmak. Santrifüj gerektiren tüm gelecekteki adımları aynı ayarları (7K, 2 dak.) Kullanmanız gerekir. Süpernatantlar pipetleme ve şişeden kaldırılması gerektiğini aşağıdaki santrifüj dikkat etmek önemlidir. </li><li> Hücreler 400 mcL 1X PBS ile iki kez yıkayın ve 400 mcL 1X PBS nihai hücre pelletini tekrar süspansiyon haline getirin. Hücreler artık sabit ve 4 ° C 400 mcL 1X PBS yedi gün kadar saklanabilir. </li></ol> 3. Dietil pyrocarbonate tedavisi <ol><li> 1X PBS (400 bu çözüm, mcL buna göre ölçekli test edilecek her bir örnek için gereklidir) dietil pyrocarbonate (DEPC)% 0,1 çözüm 400 mcL hazırlayın. DEPC çözüm DEPC bir stok taze olarak hazırlanması gerekir. DEPC tedavi carbethoxylation RNases inaktive ve azalırarka plan sinyali. </li><li> Pipetleme tarafından her sabit bakteri hücre örneği için% 0.1 DEPC çözüm 400 mcL ekleyin ve iyice karıştırın. Bu karışımı 12 dakika boyunca 25 ° C&#39;de inkübe edin. 400 mcL 1X PBS, pelet hücreleri (7K, 2 dk) ile iki kez yıkayın ve hücrelerin süpernatantı kaldırmak. </li></ol> 4. Permeabilization <ol><li> Lizozim, 1.0 mg, 1.0 mg / ml çözümü için 1 ml Tris-EDTA tamponu (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0) ekleyin. Bu çözüm, taze olarak hazırlanması gerekir. 25 800 hücrelerine 1 mg / ml lizozim çözüm mcL pipetleme ile iyice karıştırın ve inkübe ° C ile 30 dakika boyunca zaman zaman karıştırma. Pelet hücreleri (7K, 2 dk) ve süpernatant kaldırmak. Lizozim bakteri hücre duvarları peptidoglikan mevcut hidrolize permeabilization reaktif olarak görür. </li><li> TE tamponunda proteinaz K 3.0 mcg / mL solüsyon hazırlayın. Bu çözüm, -20 ° C&#39;de saklanan bir 20 mg / ml proteinaz K stok taze hazırlanmalıdırProteinaz K çeşitli proteinleri sindirir ve RNA probları ve reaktifler erişilebilirlik yardımcı bir serin proteaz. </li><li> Pipetleme ile 3.0 mikrogram / ml proteinaz K çözümü hücre pelletini 800 mcL ekleyin ve iyice karıştırın. Inkübasyon yarısına vorteks ile 15 dakika boyunca 25 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Pelet hücreleri (7K, 2 dak), süpernatant kaldırmak ve hücrelerin 400 mcL 1X PBS ile bir kez yıkayın. Yıkama süpernatant çıkardıktan sonra, 400 mcL 1X PBS hücrelerin tekrar süspansiyon ve dört yeni 1.5 ml mikrosantrifüj tüpler içine tabanda 100 mcL ekleyin. Pelet hücreleri (7K, 2 dk) ve süpernatant kaldırmak. </li></ol> 5. Melezleme <ol><li> Her bir örnek için hibridizasyon tamponu (HB) 100 mcL hazırlayın. HB, hacim, kütle olarak% 10 dekstran sülfat (her 100 mcL için 16,7% 60 dekstran sülfat çözeltisi mcL eklemek), 1X Denhardt çözümü, 50 mM sodyum fosfat pH değeri 7.0 ile% 50 formamid oluşur2X sodyum sitrat (SSC), makaslanmış somon sperm DNA (SSSD) ve 20 mg maya tRNA, 20 mg. </li><li> HB bileşenleri her biri farklı bir amacı vardır. Formamid, böylece RNA denatürasyon ve hücre hasarını en aza indirmek yardımcı nükleik asit dublekslerden erime sıcaklığını düşürür. Dekstran sülfat hacim hariç polimer konsantresi ve prob hibridizasyon oranını artırmak için kullanılır. Denhardts çözüm, maya tRNA ve SSSD, non-spesifik bağlanma azaltmak için bir bloke edici ajanlar olarak hizmet. </li><li> Tabanda içeren 1,5 mL mikrosantrifüj tüpler hücrenin her birinde 95 mcL Srna / HB ve 5.0 mcL eklemek mRNA özel LNA ya da su (LNA negatif kontrol için) [özel LNA final konsantrasyonu 20 pmol]. Örneğin: <ol class="lalpha"><li> Tüp 1 - 95 mcL HB + 5.0 mcL Srna / mRNA özel prob </li><li> Tüp 2 - 95 mcL HB + 5.0 mcL Srna / mRNA özel probu (&#39;hiçbir boya&#39; negatif kontrol) </li><li> Tüp 3 - 95 mcL HB + 5.0 mcL Srna/ MRNA&#39;nın prob (&#39;non-ifade Srna / mRNA&#39; negatif kontrol) </li><li> Tüp 4 - 95 mcL HB + 5.0 mcL su (&#39;hayır LNA&#39; negatif kontrol) </li></ol></li></ol><ol start="4"><li> Dört örneğin 60 ° C&#39;de 60 dakika inkübe edin. Hibridizasyon sıcaklığı LNA prob (ler) T m bağlıdır ve yaklaşık 30 ° C tavlama RNA T m tahmin altında. HB yükseltilmiş hibridizasyon sıcaklık ve formamid Her iki Srna veya ilgi mRNA ikincil yapı denatürasyon sağlar. </li></ol> 6. Post-hibridizasyon yıkar <ol><li> Hibridizasyon sonra,% 0.1 arasında-20 (SSCT) hibridizasyon karışıma 1,0 mL 0.1x SSC ekleyin. Bu hücrelerin viskoz hibridizasyon çözüm kaldırıldı izin vermek için gerekli. Pelet hücreleri (7K, 2 dk) ve süpernatant kaldırmak. </li><li> % 50 formamid 200 mcL, 2X SSC,% 0.1 arasında-20 hücre pelletleri, iyice karıştırın ve incub30 dakika boyunca 65 ° C ısıtma bloğu yedik. </li><li> 1 ml 0.1x SSCT ekleyin ve karışımı, pelet hücreleri (7K, 2 dak) süpernatantı kaldırmak. </li><li> Hücrelerin tekrar süspansiyon haline getirin ve bir ısı bloğu içinde 40 dakika 65 ° C inkübe 500 mcL 0.1x SSCT ekleyin. Pelet hücreleri (7K, 2 dk) ve süpernatant kaldırmak. </li></ol> 7. Engelleme ve boyama <ol><li> (BB) engelleme tampon ve streptavidin-boya boyama çözüm hazırlayın. 5X stok (piyasada, Reaktifler bakınız) bir 1X BB çözüm hazırlayın. Dört tüplerin her set için 1.2 ml 1X BB hazırlamak. </li><li> Hücre pelet, tekrar süspansiyon 200 mcL 1X BB ekleyin ve 30 dakika boyunca inkübe 25 ° C </li><li> Streptavidin-konjuge boya biotinlenmiş LNA probları saptamak için kullanılır. Bloke ederken, 2 mcg / ml DyLight 488 streptavidin veya 30 dakika (üç örnekleri için, 300 mcL) 1X BB istenen boya streptavidin konjuge bir solüsyon hazırlanır. </li><li> Incub sonra1X BB, pelet hücreleri (7K, 2 dk) ve süpernatant kaldırmak ation. Hücre pelletleri streptavidin-boya çözüm 50 mcL ekleyin, iyice karıştırın ve 12 dakika boyunca inkübe 25 ° C sabit bir girdap veya bir Thermomixer karıştırma. &#39;Boya&#39; kontrol için, sadece 50 mcL 1X engelleme tampon ekleyin. Protokolün geri kalanı için, alüminyum folyo kullanarak ışık tüpleri korumak. </li><li> 500 mcL 0.1x SSCT tampon hücreler ile bir kez yıkayın ve bir kez 400 mcL 1X PBS ile% 0.1 arasında-20 (PBST). Pelet hücreleri (7K, 2 dk) ve süpernatant kaldırmak. </li><li> Ilk streptavidin-konjuge boyama ardından streptavidin-boya konjuge biotinlenmiş bir anti-streptavidin antikor tanıtan ve daha sonra ikinci kez (Şekil 2) melezleşmiş LNA prob başı sinyal çıkışı artırarak böylece streptavidin-boya ile boyanması, sinyal yükseltilir . </li><li> 100 mcL ekleyin, 1 mcg / ml, anti-1X PBS, resuspen streptavidin antikor biotinlenmiş25 d hücreleri ve inkübe ° C ile 30 dakika boyunca zaman zaman karıştırma. Pelet hücreleri (7K, 2 dak), süpernatant kaldırmak ve 400 mcL 1X PBST ile iki kez yıkayın. </li><li> 50 mcL 2 mcg / mL hücrelerin streptavidin-boya çözüm ekleyin, iyice karıştırın ve 12 dakika boyunca inkübe 25 ° C bir girdap veya bir Thermomixer sürekli karıştırma. &#39;Boya&#39; kontrol için, sadece 50 mcL 1X engelleme tampon ekleyin. </li><li> 500 mcL 0.1x SSCT tampon hücreler ile bir kez yıkayın ve bir kez 400 mcL 1X PBST. </li><li> 4 200 mcL 1X PBST ve mağaza hücrelerin yeniden süspanse ° C akış sitometri analizi için hazır olana kadar. Küçük bakteri hücrelerinin çekirdek büyüklüğünü azaltmak için yavaş akış hızı ayarlayın. Buna ek olarak, forward scatter eşik kesilecek akış sitometrelerinde, kesim küçük bakteri hücreleri tespit sağlamak için mümkün olduğu kadar düşük olmalıdır. </li><li> DyLight 488 tespiti için, akış sitometresinin, 488 nm lazer ve standart emisyon ile donatılmış olmalıdırFITC için filtreler. En az 2x10 4 olayları alınmalıdır. Diğer streptavidin-konjuge fluorophores farklı lazer ile donatılmış akış sitometrelerinde ile uyumluluk için, bu protokol için kullanılabilir. </li></ol> 8. Temsilcisi sonuçları Şekil 3A akım sitometri nokta arsa içinde, sabit ve etkin bir şekilde permeabilize hücrelerinin bir örnek gösterilmiştir . Permeabilization için yukarıda açıklanan koşullar kullanırken, hücre popülasyonu, küçük ve homojen gösteren birkaç hücre agrega. Lizozim yüksek konsantrasyonlarda (5 mg / ml) kullanıldığı zaman, hücreler agrega için daha sık ve daha büyük parçacıklar (Şekil 3B) göstergesi ileri artan dağılım değerleri göstermek. Başarılı bir LNA akış BALIK deney flow sitometri verileri bir örnek Şekil 4&#39;te gösterilmiştir. Histogram üç negatif kontroller ile birlikte, belirli bir hedef Srna algılama gösteriyor.&#39;Boya&#39; negatif kontrol &#39;hayır LNA&#39; ve &#39;olmayan ifade Srna&#39; negatif kontrollerin ardından en floresan üretir. Son olarak, Srna özel LNA prob ile örnek büyük floresan üretir. Yöntem ve LNA sondalar bu şekilde doğrulandıktan sonra, ek deneyler, mutasyonlar ya da çeşitli kültür koşulları, vb yanıt olarak, zaman içinde Srna sinyal değişiklikleri izlemek için tasarlanmıştır. <img alt="Şekil 1." src="/files/ftp_upload/3655/3655fig1.jpg" /> Şekil 1 genel bakteriyel Srna tespiti için bir LNA akış FISH deney düzeni tasviri. <img alt="Şekil 2." src="/files/ftp_upload/3655/3655fig2.jpg" /> Şekil 2 Boyama ve LNA akış BALIK sinyal amplifikasyon. a) biotinlenmiş LNA prob hibridizasyon. b) floresan DyLight 488 streptavidin konjuge Boyama. c) biotinlenmiş anti-s CiltDyLight 488 streptavidin treptavidin antikor. Antikor, antijen-bağlayıcı sitesi aracılığıyla streptavidin bağlamak veya biotin artıkları ile streptavidin bağlı olabilir. d) floresan DyLight 488 streptavidin konjuge daha fazla boyama ile sinyal Amplifikasyon. <img alt="Şekil 3." src="/files/ftp_upload/3655/3655fig3.jpg" /> Şekil 3: a) 1 mg / ml lizozim, 3 mg / ml proteinaz K permeabilization ve b) 5 mg / ml lizozim, 3 mg / ml proteinaz K permeabilization yan dağılım sonuçları karşısında ileri gösteren Flow sitometri nokta araziler . <img alt="Şekil 4." src="/files/ftp_upload/3655/3655fig4.jpg" /> Şekil 4 LNA akış-FISH sonuçları Histogram analizi. Her örnekten üretilen floresan sinyal dört izleri gösterilmiştir: siyah - Srna özel LNA prob, kırmızı - &#39;olmayan ifade Srna&#39; negatif kontrol, mavi - &#39;hiçbir LNA&#39; negatif kontrol, mor -&#39;Hayır boya&#39; negatif kontrol.

<ol>
	<li>Rufer, N., Dragowska, W., Thornbury, G., Roosnek, E., Lansdorp, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+length+dynamics+in+human+lymphocyte+subpopulations+measured+by+flow+cytometry.">Telomere length dynamics in human lymphocyte subpopulations measured by flow cytometry.</a> Nat. Biotechnol. 16, 743-747 (1998).</li><li>Lansdorp, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+telomere+length+of+human+chromosomes.">Heterogeneity in telomere length of human chromosomes.</a> Hum. Mol. Genet. 5, 685-691 (1996).</li><li>Pernthaler, A., Amann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Fluorescence+In+Situ+Hybridization+of+mRNA+and+rRNA+in+Environmental+Bacteria.">Simultaneous Fluorescence In Situ Hybridization of mRNA and rRNA in Environmental Bacteria.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70, 5426-5433 (2004).</li><li>Jen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-FISH+analysis+and+isolation+of+clostridial+strains+in+an+anaerobic+semi-solid+bio-hydrogen+producing+system+by+hydrogenase+gene+target.">Flow-FISH analysis and isolation of clostridial strains in an anaerobic semi-solid bio-hydrogen producing system by hydrogenase gene target.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 74, 1126-1134 (2007).</li><li>Robertson, K. L., Verhoeven, A. B., Thach, D., Chang, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+Viral+RNA+in+Infected+Cells+with+LNA+Flow-FISH.">Monitoring Viral RNA in Infected Cells with LNA Flow-FISH.</a> RNA. 16, 1679-1685 (2010).</li><li>Friedrich, U., Lenke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Enumeration+of+Lactic+Acid+Bacteria+in+Mesophilic+Dairy+Starter+Cultures+by+Using+Multiplex+Quantitative+Real-Time+PCR+and+Flow+Cytometry-Fluorescence+In+Situ+Hybridization.">Improved Enumeration of Lactic Acid Bacteria in Mesophilic Dairy Starter Cultures by Using Multiplex Quantitative Real-Time PCR and Flow Cytometry-Fluorescence In Situ Hybridization.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 4163-4171 (2006).</li><li>Thomsen, R., Nielsen, P. S., Jensen, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatically+improved+RNA+in+situ+hybridization+signals+using+LNA-modified+probes.">Dramatically improved RNA in situ hybridization signals using LNA-modified probes.</a> RNA. 11, 1745-1748 (2005).</li><li>Silahtaroglu, A. N., Tommerup, N., Vissing, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FISHing+with+locked+nucleic+acids+(LNA):+evaulation+of+different+LNA/DNA+mixmers.">FISHing with locked nucleic acids (LNA): evaulation of different LNA/DNA mixmers.</a> Mol. Cell. Probes. 17, 165-169 (2003).</li><li>Obika, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+2'-O,+4'-C-methyleneuridine+and+-cytidine.+Novel+bicyclic+nucleosides+having+a+fixed+C3'-endo+sugar+puckering.">Synthesis of 2'-O, 4'-C-methyleneuridine and -cytidine. Novel bicyclic nucleosides having a fixed C3'-endo sugar puckering.</a> Tetrahedron. Lett. 38, 8735-8738 (1997).</li><li>Koshkin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LNA+(locked+nucleic+acids):+synthesis+of+the+adenine,+cytosine,+guanine,+5-methylcytosine,+thymine,+and+uracil+bicyclonucleoside+monomers+oligomerisation,+and+unprecedented+nucleic+acid+recognition.">LNA (locked nucleic acids): synthesis of the adenine, cytosine, guanine, 5-methylcytosine, thymine, and uracil bicyclonucleoside monomers oligomerisation, and unprecedented nucleic acid recognition.</a> Tetrahedron. 54, 3607-3630 (1998).</li><li>Kubota, K., Ohashi, A., Imachi, H., Harada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+in+situ+hybridization+efficiency+with+locked-nucleic-acid-incorporated+DNA+probes.">Improved in situ hybridization efficiency with locked-nucleic-acid-incorporated DNA probes.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 5311-5317 (2006).</li><li>Robertson, K. L., Thach, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LNA+flow-FISH:+A+flow+cytometry-fluorescence+in+situ+hybridization+method+to+detect+messenger+RNA+using+locked+nucleic+acid+probes.">LNA flow-FISH: A flow cytometry-fluorescence in situ hybridization method to detect messenger RNA using locked nucleic acid probes.</a> Anal. Biochem. 390, 109-114 (2009).</li><li>Waters, L., Storz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+RNAs+in+bacteria.">Regulatory RNAs in bacteria.</a> Cell. 136, 615-628 (2009).</li><li>Petersen, M., Wengel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LNA:+a+versatile+tool+for+therapeutics+and+genomics.">LNA: a versatile tool for therapeutics and genomics.</a> Trends. Biotechnol. 21, 74-81 (2003).</li><li>Corput, M. P. C. v. d., Grosveld, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+Situ+Hybridization+Analysis+of+Transcript+Dynamics+in+Cells.">Fluorescence in Situ Hybridization Analysis of Transcript Dynamics in Cells.</a> Methods. 25, 111-118 (2001).</li><li>Silveira, A. C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+non-coding+RNAs+in+environmental+vibrios.">Identification of non-coding RNAs in environmental vibrios.</a> Microbiology. 156, 2452-2458 (2010).</li></ol>

Yazarlar ifşa etmek başka bir şey var.

Burada sunulan LNA akış FISH yöntemi olan ifade önceden mikroarray tabanlı ifade profilleme ve ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu 16 ile teyit edilmiştir Gram-negatif deniz bir bakteri Vibrio campbellii bir Srna ifade algılamak için kullanılır oldu . Bugüne kadar, çeşitli RNA&#39;lar (protein aktivitesi, riboswitches ve mRNA modüle örneğin Trans-kodlanmış Srna, Srna) ifadesi izlemek için bu yöntemi kullanmıştır. Bunun gibi, biz yöntemi uyarlanabilir ve herhangi bir Srna veya mRNA hedef tespit etmek için kullanılan ve kullanılmak üzere, herhangi bir bakteri türlerinin ya da hücre tipi değiştirilebilir olabilir eminiz. Bu protokol değişikliği, diğer hücre türleri için gerekli ise, en önemli değişken manipüle dikkate permeabilization adımdır. Örneğin, burada açıklanan permeabilization koşullarını değiştirirken, lizozim ve proteinaz K konsantrasyonlarında değişiklikler test edilmelidir. Veya bu iki katına bulundu.lizozim ve proteinaz K miktarını üç katına LNA akış-FISH sonuçları büyük değişikliklere neden olmuştur. Ayrıca, ek permeabilization koşullarında test ederken, hücreler, hücre kaybı ve arka plan floresans oranı elde edilebilecek en iyi sinyal topaklanma için analiz edilmelidir. Hücre topaklanma ölçüde mikroskopi ve / veya akım sitometri test edilebilir. Ileri karşı tarafında dağılım nokta arsa ve doğru permeabilization yöntemi kuyrukları bu atık etkisini en aza indirmek olarak akış sitometri, hücre kümeleri bulunmaktadır. Bu yöntem ayrıca böyle digoxigenin gibi diğer hapten etiketli ek LNA probları hibridizasyon adımı sırasında eklenir ve daha sonra bir anti-digoxigenin antikor ve sekonder antikor fluorofor konjuge ile tespit olarak açıklanan protokole büyük değişiklikler olmadan multipleks Srna tespiti için uygun. Şu anda, biz bu yöntem ile karşılaştığım tek sınırlama, zayıf eski yeterli sinyal oluşturmak için onun yeteneksizliğialgılama eşiğini belirlemek için (hücre başına mutlak kopya sayısı) basıldığında Srna türler ve çabaları devam etmektedir. Genel olarak, LNA akış FISH yöntemi varlığı ve bir Srna türlerin göreceli bolluk ve kendi ifadesini değişir derece anlayışlar sağlamak için yüksek kapasiteli bir şekilde tek bir hücre seviyesinde bakteriyel Srna veya mRNA ölçmek için bir fırsat sunuyor bir nüfus.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifi Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> 10X Fosfat salin (PBS), pH 7.4 tamponlu </td><td> Uygulamalı Biyosistem / Ambion </td><td> AM9625 </td><td></td></tr><tr><td> Nükleazlar-serbest su </td><td> Uygulamalı Biyosistem / Ambion </td><td> AM9932 </td><td> (DEPC tedavi edilmezse) </td></tr><tr><td> 32% paraformaldehid </td><td> Elektron Mikroskopi Bilimleri </td><td> RT 15.714 </td><td> Etanol ücretsiz </td></tr><tr><td> Asetik asit </td><td> Acros Organics </td><td> 327290010 </td><td></td></tr><tr><td> Dietil pyrocarbonate (DEPC) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D5758 </td><td&gt; tutun kurutulmuş </td></tr><tr><td> Lizozim </td><td> Sigma Aldrich </td><td> L2879 </td><td></td></tr><tr><td> Proteinaz K (20 mg / ml) </td><td> Uygulamalı Biyosistem / Ambion </td><td> AM2546 </td><td></td></tr><tr><td> Formamid </td><td> Uygulamalı Biyosistem / Ambion </td><td> AM9342 </td><td> Deiyonize, kısım ve donma </td></tr><tr><td> Dekstran sülfat MW&gt; 500.000 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D8906 </td><td> Kısım% 60 çözüm ve donma </td></tr><tr><td> Denhardt çözümü 50X konsantre </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D2532 </td><td> Kısım ve donma </td></tr><tr><td> Sodyum sitrat tampon 20X </td><td> Uygulamalı Biyosistem / Ambion </td><td> AM9770 </td><td></td></tr><tr> &lt;td&gt; Somon sperm DNA (makaslanmış) 10 mg / ml </td><td> Uygulamalı Biyosistem / Ambion </td><td> AM9680 </td><td> Kısım ve donma </td></tr><tr><td> Maya tRNA (10 mg / ml) </td><td> Yaşam Teknolojileri / Invitrogen </td><td> 15401-011 </td><td> Kısım ve donma </td></tr><tr><td> Tween-20 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P9416 </td><td></td></tr><tr><td> In situ hibridizasyon engelleme çözümü 5x </td><td> Vektör Laboratuvarları </td><td> MB-1220 </td><td></td></tr><tr><td> DyLight 488 streptavidin </td><td> Vektör Laboratuvarları </td><td> SA-5488-1 </td><td></td></tr><tr><td> Biotinlenmiş, anti-streptavidin </td><td> Vektör Laboratuvarları </td><td> BA-0500 </td><td> Kısım ve donma </td></tr></tbody></table>

locked nucleic acid flow cytometry-fluorescence in situ hybridization (lna flow-fish): a method for bacterial small rna detection

Floresan in situ hibridizasyon (FISH), hücresel ortamda özel nükleik asit dizileri tespit ve lokalize için kullanılan güçlü bir tekniktir. Verimi arttırmak amacıyla, BALIK, tek tek hücrelerin binlerce hedef nükleik asit dizilerinin algılamayı etkinleştirmek için flow sitometri (flow-FISH) ile kombine edilebilir. Sonuç olarak, akış-FISH her hücre, böylece güçlü bir istatistik ve varyans analizleri izin, bağımsız bir gözlem olarak kabul edilir, çünkü lizat / topluluğu tabanlı nükleik asit algılama yöntemleri üzerinde ayrı bir avantaj sunuyor. Bu nitelikleri, FISH ve akış-FISH yöntemleri farklı uygulamaları bir dizi teşvik etmiştir ve bu yöntemlerin programını başarıyla viral çarpma izleme, telomer uzunluğu belirlenmesi 1,2, hücresel kimlik ve gen ekspresyonu 3,4 gösterilmiştir enfekte hücreleri 5, ve bakteriyel topluluk analizi ve numaralandırma6. Geleneksel olarak, özgüllük FISH ve akış-FISH yöntemleri, DNA oligonükleotit probları tarafından aktarılırdı olmuştur. Ancak, FISH ve akış-FISH probları olarak nükleik asit analogları ile DNA oligonükleotid problar değiştirilmesi nedeniyle doğal nükleik asitler 7,8 için bu analogları yüksek erime sıcaklığına (T m), her iki tekniğin de duyarlılık ve özgüllük arttı . Kilitli nükleik asit (LNA) probları nükleik asit analog bir DNA veya RNA dizisi 9,10 boyunca çivili LNA nükleotidler içeren bir tür. Akış FISH ile birleştiğinde, LNA problar daha önce geleneksel DNA probları 7,11 daha iyi performans göstermiştir edilmiş ve başarılı bir şekilde 5 memeli hücrelerinin ökaryotik mRNA 12 ve viral RNA tespit etmek için kullanılır olmuştur. İşte biz bu kapasitesini artırmak ve bakteri hücre RNA belirli algılama izin veren bir LNA akış FISH yöntemi tarif(Şekil 1). Özellikle, biz tespiti ile ilgilenen küçük olmayan kodlama düzenleyici RNA (Srna) çok kritik hücresel süreçleri 13 anahtar düzenleyici unsurları olarak hizmet olduğu gibi son birkaç yıl içinde oldukça büyük ilgi topladı. Ancak, sRNAs ve bakteri hücrelerinin Srna tespit zorlukları çalışma sınırlı araçlar bölümünde (genellikle uzunluğu 50-300 nükleotidler) nispeten küçük boyutu ve Srna moleküllerin düşük bolluk yanı sıra çalışma genel zorluk nedeniyle değişen hücre zarının küçük biyolojik hücreleri ile. Bu yöntemde, bakteri hücrelerinin yapısını korumak ve LNA probları penetrasyon yanı sıra düşük bolluk Srna belirli algılama (Şekil 2) sağlayan sinyal amplifikasyonu adımları izin fiksasyon ve permeabilzation koşulları açıklar.

Watch this Scientific Journal Video about Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization LNA flow-FISH: a Method for Bacterial Small RNA Detection at JoVE.com

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization LNA flow-FISH: a Method for Bacterial Small RNA Detection

Yeni yüksek verimli bir yöntem kilitli nükleik asit probları ve flow sitometri floresan kullanarak tek bir bakteri hücrelerinin algılama ve göreceli küçük RNA ve mRNA ekspresyonu kantitatif açıklanan<em&gt; Yerinde</em&gt; Melezleşme.

Kilitli Nükleik Asit Sitometrisi-floresan Yerinde Hibridizasyon (LNA akış FISH): Bakteriyel Küçük RNA Algılama Yöntemi

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular ...

locked-nucleic-acid-flow-cytometry-fluorescence-situ-hybridization

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization (LNA flow-FISH): a Method for Bacterial Small RNA Detection

25.2K Görüntüleme.  Naval Research Laboratory. Yeni yüksek verimli bir yöntem kilitli nükleik asit probları ve flow sitometri floresan kullanarak tek bir bakteri hücrelerinin algılama ve göreceli küçük RNA ve mRNA ekspresyonu kantitatif açıklanan Yerinde Melezleşme.

Video: Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization LNA flow-FISH: a Method for Bacterial Small RNA Detection

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

Yapışkan bant tabanlı Örnekleme ve Floresans kombinasyonu In situ</emHızlı Algılama> Hibridizasyon Salmonella Taze üretin

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Transfection and Mutagenesis of Target Genes in Mosquito Cells by Locked Nucleic Acid-modified Oligonucleotides

Plasmodium parasites, the causative agent of malaria, are transmitted through the bites of infected Anopheles mosquitoes resulting in over 250 million new infections each year. Despite decades of research, there is still no vaccine against malaria, highlighting the need for novel control strategies. One innovative approach is the use of genetically modified mosquitoes to effectively control malaria parasite transmission. Deliberate alterations of cell signaling pathways in the mosquito, via targeted mutagenesis, have been found to regulate parasite development 1. From these studies, we can begin to identify potential gene targets for transformation. Targeted mutagenesis has traditionally relied upon the homologous recombination between a target gene and a large DNA molecule. However, the construction and use of such complex DNA molecules for generation of stably transformed cell lines is costly, time consuming and often inefficient. Therefore, a strategy using locked nucleic acid-modified oligonucleotides (LNA-ONs) provides a useful alternative for introducing artificial single nucleotide substitutions into episomal and chromosomal DNA gene targets (reviewed in 2). LNA-ON-mediated targeted mutagenesis has been used to introduce point mutations into genes of interest in cultured cells of both yeast and mice 3,4. We show here that LNA-ONs can be used to introduce a single nucleotide change in a transfected episomal target that results in a switch from blue fluorescent protein (BFP) expression to green fluorescent protein (GFP) expression in both Anopheles gambiae and Anopheles stephensi cells. This conversion demonstrates for the first time that effective mutagenesis of target genes in mosquito cells can be mediated by LNA-ONs and suggests that this technique may be applicable to mutagenesis of chromosomal targets in vitro and in vivo.

Oligonucleotides can be used to site specifically substitute a single nucleotide of transfected target genes in both Anopheles gambiae and Anopheles stephensi cells.

Kilitli Nükleik Asit modifiye Oligonükleotidler Transfeksiyon ve Sivrisinek Hücreler Hedef Genler Mutagenez

Plasmodium parasites, the causative agent of malaria, are transmitted through the bites of infected Anopheles mosquitoes resulting in over 250 million new ...

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. Although the natural occurrence of both diseases&#39; is now relatively rare, the possibility of terrorist groups using these pathogens as a bioweapon is real. Because of the disease&#39;s inherent communicability, rapid clinical course, and high mortality rate, it is critical that an outbreak be detected quickly. Therefore methodologies that provide rapid detection and diagnosis are essential to ensure immediate implementation of public health measures and activation of crisis management.
Recombinant reporter phage may provide a rapid and specific approach for the detection of Y. pestis and B. anthracis. The Centers for Disease Control and Prevention currently use the classical phage lysis assays for the confirmed identification of these bacterial pathogens 2-4. These assays take advantage of naturally occurring phage which are specific and lytic for their bacterial hosts. After overnight growth of the cultivated bacterium in the presence of the specific phage, the formation of plaques (bacterial lysis) provides a positive identification of the bacterial target. Although these assays are robust, they suffer from three shortcomings: 1) they are laboratory based; 2) they require bacterial isolation and cultivation from the suspected sample, and 3) they take 24-36 h to complete. To address these issues, recombinant &#34;light-tagged&#34; reporter phage were genetically engineered by integrating the Vibrio harveyi luxAB genes into the genome of Y. pestis and B. anthracis specific phage 5-8. The resulting luxAB reporter phage were able to detect their specific target by rapidly (within minutes) and sensitively conferring a bioluminescent phenotype to recipient cells. Importantly, detection was obtained either with cultivated recipient cells or with mock-infected clinical specimens 7.
For demonstration purposes, here we describe the method for the phage-mediated detection of a known Y. pestis isolate using a luxAB reporter phage constructed from the CDC plague diagnostic phage &#934;A1122 6,7 (Figure 1). A similar method, with minor modifications (e.g. change in growth temperature and media), may be used for the detection of B. anthracis isolates using the B. anthracis reporter phage W&#946;::luxAB 8. The method describes the phage-mediated transduction of a biolumescent phenotype to cultivated Y. pestis cells which are subsequently measured using a microplate luminometer. The major advantages of this method over the traditional phage lysis assays is the ease of use, the rapid results, and the ability to test multiple samples simultaneously in a 96-well microtiter plate format.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/2740/2740fig1.jpg" /> 
Figure 1. Detection schematic. The phage are mixed with the sample, the phage infects the cell, luxAB are expressed, and the cell bioluminesces. Sample processing is not necessary; the phage and cells are mixed and subsequently measured for light.

&#039;Bioluminescent&#039; Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

A simple method for the identification of priority bacterial pathogens is to use genetically engineered reporter phage. These reporter phage, which are specific to their particular host species, are capable of rapidly transducing a bioluminescent signal response to host cells. Herein, we describe the use of reporter phage for the detection of Yersinia pestis.

Kategori Algılama Bir Bakteriyel Patojenler &#39;Bioluminescent&#39; Muhabir Faj

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes. Investigation of transcripts and gene regulators that are expressed in tissues in which the mosquito host and pathogen interact, and in organs involved in reproduction are of great interest for strategies to reduce mosquito-borne disease transmission and disrupt egg development. A number of tools have been employed to study and validate the temporal and tissue-specific regulation of gene expression. Here, we describe protocols that have been developed to obtain spatial information, which enhances our understanding of where specific genes are expressed and their products accumulate. The protocol described has been used to validate expression and determine accumulation patterns of transcripts in tissues related to mosquito-borne pathogen transmission, such as female salivary glands, as well as subcellular compartments of ovaries and embryos, which relate to mosquito reproduction and development. 
 The following procedures represent an optimized methodology that improves the efficiency of various steps in the protocol without loss of target-specific hybridization signals. Guidelines for RNA probe preparation, dissection of soft tissues and the general procedure for fixation and hybridization are described in Part A, while steps specific for the collection, fixation, pre-hybridization and hybridization of mosquito embryos are detailed in Part B.

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Temporal and spatial gene expression analyses have a crucial role in functional genomics. Whole-mount hybridization in situ is useful for determining the localization of transcripts within tissues and subcellular compartments. Here we outline a hybridization in situ protocol with modifications for specific target tissues in mosquitoes.

Melezleme<em&gt; In situ</em&gt; Bezler, Yumurtalık ve Vektör Sivrisinek ve Embriyoların

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes.  Investigation of transcripts and gene ...

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. One important application of this method is the development of high-quality physical maps useful for improving the genome assemblies for various organisms. The natural banding pattern of polytene and mitotic chromosomes provides guidance for the precise ordering and orientation of the genomic supercontigs. Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, a well-established chromosome-based mapping technique has been developed only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes 1. As a result of genome mapping efforts, 88% of the An. gambiae genome has been placed to precise chromosome positions 2,3 . Two other mosquito genera, Aedes and Culex, have poorly polytenized chromosomes because of significant overrepresentation of transposable elements in their genomes 4, 5, 6. Only 31 and 9% of the genomic supercontings have been assigned without order or orientation to chromosomes of Ae. aegypti 7 and Cx. quinquefasciatus 8, respectively. Mitotic chromosome preparation for these two species had previously been limited to brain ganglia and cell lines. However, chromosome slides prepared from the brain ganglia of mosquitoes usually contain low numbers of metaphase plates 9. Also, although a FISH technique has been developed for mitotic chromosomes from a cell line of Ae. aegypti 10, the accumulation of multiple chromosomal rearrangements in cell line chromosomes 11 makes them useless for genome mapping. Here we describe a simple, robust technique for obtaining high-quality mitotic chromosome preparations from imaginal discs (IDs) of 4th instar larvae which can be used for all three genera of mosquitoes. A standard FISH protocol 12 is optimized for using BAC clones of genomic DNA as a probe on mitotic chromosomes of Ae. aegypti and Cx. quinquefasciatus, and for utilizing an intergenic spacer (IGS) region of ribosomal DNA (rDNA) as a probe on An. gambiae chromosomes. In addition to physical mapping, the developed technique can be applied to population cytogenetics and chromosome taxonomy/systematics of mosquitoes and other insect groups.

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, physical genome mapping techniques were established only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes. For the genera of Aedes and Culex, however, cytogenetic mapping remains challenging because of the poor quality of polytene chromosomes. Here we present a universal protocol for obtaining high-quality preparations of mitotic chromosomes and an optimized FISH protocol for all three genera of mosquitoes.

Floresan<em&gt; In situ</emSivrisinekler ve Mitotik Kromozomlar üzerinde&gt; Hibridizasyon

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose genomes have the same polarity as cellular mRNA. The cDNA-based reverse genetics system is a seminal method that enables direct manipulation of the viral genomic RNA, thereby generating recombinant viruses for molecular and genetic studies of both viral RNA elements and gene products in viral replication and pathogenesis. It also provides a valuable platform that allows the development of genetically defined vaccines and viral vectors for the delivery of foreign genes. For many positive-strand RNA viruses such as Japanese encephalitis virus (JEV), however, the cloned cDNAs are unstable, posing a major obstacle to the construction and propagation of the functional cDNA. Here, the present report describes the strategic considerations in creating and amplifying a genetically stable full-length infectious JEV cDNA as a bacterial artificial chromosome (BAC) using the following general experimental procedures: viral RNA isolation, cDNA synthesis, cDNA subcloning and modification, assembly of a full-length cDNA, cDNA linearization, in vitro RNA synthesis, and virus recovery. This protocol provides a general methodology applicable to cloning full-length cDNA for a range of positive-strand RNA viruses, particularly those with a genome of &gt;10 kb in length, into a BAC vector, from which infectious RNAs can be transcribed in vitro with a bacteriophage RNA polymerase.

Here, a protocol is presented for creating an infectious bacterial artificial chromosome containing a full-length cDNA of the positive-strand genomic RNA of Japanese encephalitis virus. This protocol can be used to construct a functional cDNA of other positive-strand RNA viruses, making it a powerful genomic tool for studying virus biology.

Bakteriyel Yapay Kromozom: RNA Virüsler Pozitif iplikli Araştırmaları Fonksiyonel Genomik Aracı

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for the rapid bedside inactivation of the Ebola virus during blood sampling for safe nucleic acid (NA) tests by adding a commercial lysis/binding buffer directly into the vacuum blood collection tubes. Using this bedside inactivation approach, we have developed a safe, rapid, and simplified bedside NA extraction method for the subsequent detection of a virus in lysis/binding buffer-inactivated whole blood. The NA extraction is directly performed in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. 
After the blood is collected into the lysis/binding buffer, the contents are mixed by flipping the tube by hand, and the mixture is incubated for 20 min at room temperature. Magnetic glass particles (MGPs) are added to the tube, and the contents are mixed by flipping the collection tube by hand. The MGPs are then collected on the side of the blood collection tube using a magnetic holder or a magnet and a rubber band. The MGPs are washed three times, and after the addition of elution buffer directly into the collection tube, the NAs are ready for NA tests, such as qPCR or isothermal loop amplification (LAMP), without the removal of the MGPs from the reaction. The NA extraction method is not dependent on any laboratory facilities and can easily be used anywhere (e.g., in field hospitals and hospital isolation wards). When this NA extraction method is combined with LAMP and a portable instrument, a diagnosis can be obtained within 40 min of the blood collection.

Here, we present a protocol for the rapid virus nucleic acid extraction from the virus-inactivated whole blood. The extraction is performed directly in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. The method is not dependent on laboratory facilities and can be used anywhere (e.g., in field hospitals).

Tam kan örneklerinde virüs tespiti için hızlı, güvenli ve basit el ile başucu nükleik asit çıkarma

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) and Immunofluorescence (IF) of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout the cell at specific times can be captured with fluorescence in situ hybridization (FISH) and immunofluorescence (IF). During lytic herpesvirus infection, the virus hijacks the host cell to preferentially express viral genes, causing changes in cell morphology and behavior of biomolecules. Lytic activities are centered in nuclear factories, termed viral replication compartments, which are discernable only with FISH and IF. Here we describe an adaptable protocol of RNA FISH and IF techniques for Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV)-infected cells, both adherent and in suspension. The method includes steps for the development of specific anti-sense oligonucleotides, double RNA FISH, RNA FISH with IF, and quantitative calculations of fluorescence intensities. This protocol has been successfully applied to multiple cell types, uninfected cells, latent cells, lytic cells, time-courses, and cells treated with inhibitors to analyze the spatiotemporal activities of specific RNAs and proteins from both the human host and KSHV.

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization FISH and Immunofluorescence IF of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

We describe a protocol utilizing fluorescence in situ hybridization (FISH) to visualize multiple herpesviral RNAs within lytically infected human cells, either in suspension or adherent. This protocol includes quantification of fluorescence producing a nucleocytoplasmic ratio and can be extended for simultaneous visualization of host and viral proteins with immunofluorescence (IF).

KSHV Enfekte Hücrelerde Spesifik Gen Ürünlerinin Situ Hibridizasyonunda (FISH) ve İmmünfloresansında (IF) Kantitatif Floresan

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout ...

Modeling Hepatitis B Virus Infection in Non-Hepatic 293T-NE-3NRs Cells

HBV mainly infects human hepatocytes, but it has also been found to infect extrahepatic tissues such as kidney and testis. Nonetheless, cell-based HBV models are limited to hepatoma cell lines (such as HepG2 and Huh7) overexpressing a functional HBV receptor, sodium taurocholate co-transporting polypeptide (NTCP). Here, we used 293T-NE-3NRs (293T&#160;overexpressing human NTCP, HNF4&#945;, RXR&#945; and PPAR&#945;) and HepG2-NE (HepG2 overexpressing NTCP) as model cell lines.&#160;HBV infection in these cell lines was performed either by using concentrated HBV virus particles from HepG2.2.15 or co-culturing HepG2.2.15 with the target cell lines. HBcAg immunofluorescence for HBcAg was performed to confirm HBV infection. The two methods presented here will help us study HBV infection in non-hepatic cell lines.&#160;&#160;

This manuscript describes a detailed protocol for Hepatitis B virus (HBV) infection in novel engineered 293T cells (293T-NE-3NRs, expressing human NTCP, HNF4&#945;, RXR&#945; and PPAR&#945;) and traditional hepatic cells (HepG2-NE, expressing human NTCP).

Hepatik Olmayan 293T-NE-3NR Hücrelerinde Hepatit B Virüs Enfeksiyonunun Modelilmesi

HBV mainly infects human hepatocytes, but it has also been found to infect extrahepatic tissues such as kidney and testis. Nonetheless, cell-based HBV ...

A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis

A non-coding small RNA (sRNA) is a new factor to regulate gene expression at the post-transcriptional level. A kind of sRNA MicC, known in Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, could repress the expression of outer membrane proteins. To further investigate the regulation function of micC in Salmonella Enteritidis, we cloned the micC gene in the Salmonella Enteritidis strain 50336, and then constructed the mutant 50336&#916;micC by the &#955; Red-based recombination system and the complemented mutant 50336&#916;micC/pmicC carrying recombinant plasmid pBR322 expressing micC. qRT-PCR results demonstrated that transcription of ompD in 50336&#916;micC was 1.3-fold higher than that in the wild type strain, while the transcription of ompA and ompC in 50336&#916;micC were 2.2-fold and 3-fold higher than those in the wild type strain. These indicated that micC represses the expression of ompA and ompC. In the following study, the pathogenicity of 50336&#916;micC was detected by both infecting 6-week-old Balb/c mice and 1-day-old chickens. The result showed that the LD50 of the wild type strain 50336, the mutants 50336&#916;micC and 50336&#916;micC/pmicC for 6-week-old Balb/c mice were 12.59 CFU, 5.01 CFU, and 19.95 CFU, respectively. The LD50 of the strains for 1-day-old chickens were 1.13 x 109 CFU, 1.55 x 108 CFU, and 2.54 x 108 CFU, respectively. It indicated that deletion of micC enhanced virulence of S. Enteritidis in mice and chickens by regulating expression of outer membrane proteins.

A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis

An &#955;-Red-mediated recombination system was used to create a deletion mutant of a small non-coding RNA micC.

Kodlamayan küçük RNA MicC, salmonella enteritidisteki dış zar proteinlerinde virülansa katkıda bulunur

A non-coding small RNA (sRNA) is a new factor to regulate gene expression at the post-transcriptional level. A kind of sRNA MicC, known in Escherichia ...