Yazarlar metodolojinin geliştirilmesine katkıları için laboratuar geçmiş ve mevcut üyelerin tavsiyesi için buraya ve Alan Cochrane özetlenen teşekkür ederim. LA Fraser, Monat ve MacPherson Kariyer Ödülü tarafından desteklenen Sağlık Araştırması (CIHR) Doktora Bursu ve AJM Kanadalı bir Enstitüleri bir alıcı olduğunu. Bu çalışma CIHR (hibe # MOP-56.974) bir hibe ile desteklenmektedir.

1. Prob Hazırlık <ol><li> In vitro transkripsiyonu vektör içinde digest 1 ug, 1 saat boyunca PKS (+) pol 37 ° C&#39;de Kpn1 enzim ile 236nt 9 ve bir agaroz jeli üzerine lineerize DNA ürünü çalıştırın. Fragmanı yaklaşık 2500 bp olması gerekir. </li><li> Jel parçası kesip Roche Micro Zehir Jel Ekstraksiyon Kiti (kullanılan tüm reaktifler Tablo 1&#39;de verilmiştir) kullanarak arındırmak. 30 ul elüsyon tampon içinde nihai elüsyon gerçekleştirmek. Saflaştırma doğrulamak için bir agaroz jeli üzerine ürün 5 ul çalıştırın. </li><li> 2 saat 37 ° C&#39;de Roche DIG RNA etiketleme seti ve inkübe kullanılarak in vitro transkripsiyon reaksiyonu (aşağıdaki tarife bakınız) bir karıştırın. </li></ol> In vitro transkripsiyon reaksiyonunda: <table border="1"><tbody><tr><td> Lineerleştirilmiş DNA </td><td> 23 ul </td></tr><tr><td> 1X DIG RNA etiketleme karışımı (Roche) </td><td> 4 ul </td></tr><tr><td> 1X Traoyma yazıyı tampon </td><td> 8 ul </td></tr><tr><td> 20U RNaz OUT </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> 80U T7 RNA polimeraz </td><td> 4 ul </td></tr><tr><td> Toplam </td><td> 40 ul </td></tr></tbody></table><ol start="4"><li> 15 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe DNase I ve 228 U ekleyin. </li><li> 20 mM nihai bir konsantrasyona EDTA pH 8.0 ilave edilerek reaksiyon durdur. </li><li> Üretici tarafından belirtilen şekilde Roche Hızlı Spin Sütunlar kullanarak reaksiyon arındırın. </li><li> 1/10 hacim DEPC tedavi edilen 3M NaOAc pH 5.2 ve buz gibi soğuk% 95 etanol 2.5 hacim ile yağış tarafından prob arındırın. Karıştırmak ve bir gece boyunca 30 dakika süreyle -80 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> 15,000 x g hızında 15 dakika 4 ° C&#39;de santrifüje prob. </li><li> Süpernatantı ve buz gibi soğuk% 70 etanol içinde pelet yıkayın. 15,000 x g hızında 5 dakika 4 ° C&#39;de tekrar santrifüje. </li><li> Süpernatantı ve pelet kurulayın. 50 ul w pelletini10 U Invitrogen RNaz OUT içeren ater (DNaz / RNaz ücretsiz). </li><li> Spektrofotometri ile prob konsantrasyonu (260 nm ölçüsü RNA) tahmin ve ul ng / 5 &#39;lik bir konsantrasyon ye tamamlanır. ° C uzun süreli depolama için kısa süreli kullanım veya -80 -20 ° C&#39;de kısım halinde saklayın. O yüzden bu bir kısım tasarruf arası karşılaştırmalar testi yapılması tavsiye edilir. </li></ol> 2. Hücre Sabitleme <ol><li> Hasat sonrasında nihai konfluense yaklaşık% 70-80 olup bu yüzden tedavi edilmezse, steril cam lamelleri üzerine yapışık tohum hücreleri başlangıçta önemlidir. Yapışmaz hücreleri, normal olarak büyümeye ve ne zaman toplamak için hazır, 1 saat için 0.01% w / v poli-L-lisin (Sigma-Aldrich, Inc) ile tedavi edilmiştir lamelleri ile bunları tasarlamak. Tipik bir 12-kuyucuklu polistiren doku kültürü plakası (3,8 cm 2) için, 150,000 hücreler (örneğin, HeLa) transfeksiyondan 24 saat önce az kaplanır. Sigara yapışık hücreleri enfekte veya transfekte her zamanki gibi ve reklam için izin verilebilirBurada fiksasyon 3 önce cam kapak slipleri için. </li><li> Medya atın ve 1 dakika süreyle çift distile su (DPBS) hazırlanan fosfat tamponlu 1X salinle hücreleri yıkayın. Diethylpyrocarbonate (DEPC, Sigma-Aldrich, Inc) 1X PBS de kullanılabilir-muamele, bununla birlikte bunun arıtılmamış PBS RNaz enzim ihtiva edebilir olamaz gibi. </li><li> PBS atın ve tamamen hücre kapsayacak kadar% 4 paraformaldehit, ekleyin. 15-20 dakika inkübe edin. </li><li> Paraformaldeyhyde atın ve 1 dakika 1X DPBS hücreler yıkayın. </li><li> DPBS atın ve 0.1 M glisin (1X DPBS çözünmüş) ekleyin. 10 dakika inkübe edin. </li><li> Glisin atın ve 1 dakika 1X DPBS hücreleri yıkayın. </li><li> DPBS atın ve Triton-X (1X DPBS çözünmüş)% 0,2 ekleyin. 5-10 dakika inkübe edin. Nükleoler veya nükleer zarf proteinleri için boyama ise, Triton en fazla 5 dk veya protein lokalizasyonu için X-100 diffüz olacak olan geçirgenliği artar. </li><li> Triton X-100 atın ve bir kez yıkayın1 dakika 1X DPBS. </li><li> Uzun süreli depolama için, dört ay için 4 ° C de% 70 etanol ve mağaza ile PBS değiştirin. Alternatif olarak, 1X DPBS ile bir kez daha yıkayın ve FISH geçin. </li></ol> 3. In situ Hibridizasyon Floresans (FISH) <ol><li> Lamelleri etanol içinde bekletildi ise, 1X DPBS ile etanol yerine ve hücreler 30 dakika süreyle rehidre izin verir. Lamelleri 4 ° C&#39;de saklandığında rehidrasyon gecede yapılabilir </li><li> 1 dakika boyunca 1X DPBS ile lamelleri yıkanır. </li><li> Temiz ve iyi etiketlemek için özen üzerinde lamelleri inkübe için slaytlar hazırlayın. </li><li> 18mm coverslip için, sürgüye DNase çözeltisi (ticari olarak mevcut 25 ünite / coverslip), 50 ul ilave edin. Bu hücre yüzü aşağı yerleştirin ve oda sıcaklığında 15 dakika için inkübe emin olmak, coverslip ekleyin. </li><li> 1 dakika boyunca 1X DPBS ile lamelleri yıkanır. </li><li> Coverslip başına 50 ul hibridizasyon karışımı (aşağıdaki tarife bakınız) üzerine ekle42&#39;de bir slayt ve 16-18 saat coverslip hücre yüzü aşağı kuluçkaya ° C İnkübasyon,% 50 formamid, 2X SSPE karışımı (12.5 ml deiyonize formamid, 2.5 ml 20X SSPE, 10 ml su) ihtiva eden bir tepsi yapılmalıdır. </li></ol> Karışım hibridizasyon (bir coverslip, 50 ul için): <table border="1"><tbody><tr><td> Stok miktarı </td><td> Malzeme (son konsantrasyonda) </td></tr><tr><td> 25 ul </td><td> Formamid,% 50 (deiyonize; herhangi bir kaynak) </td></tr><tr><td> 5 ul (10 mg / ml) </td><td> tRNA, 1 mg / ml (Sigma-Aldrich, Inc) </td></tr><tr><td> 5 ul (20X arasında) </td><td> SSPE, 2X </td></tr><tr><td> 5 ul (50X arasında) </td><td> Denharts, 5X </td></tr><tr><td> 0,125 ul (5 adet) </td><td> RNaz OUT </td></tr><tr><td> 5 ul (ul / 5 ng 25 ng) </td><td> Sonda </td></tr><tr><td> 5 ul </td><td> Nihai yapmak H2O DEPC,hacminin 50 ul </td></tr></tbody></table><ol start="7"><li> 42 az 15 dakika boyunca 50 ul% 50 formamid (1X DPBS ile sulandırılmış) içinde inkübe lamelleri hücre yüzü aşağı ° C </li><li> 42 az 5 dakika her biri için 50 ul 2X SSPE (20X SSPE 1X DPBS inceltilmiş) onları hücre tarafı aşağı kuluçkaya ° C ile 2X SSPE iki kez lamelleri yıkayın </li><li> 1 dakika boyunca 1X DPBS in lamelleri yıkanır. </li></ol> 4. İmmünofloresan Boyama <ol><li> 30 dakika 50 ul 1X Roche engelleme çözümü (1X DPBS inceltilmiş 10X Roche engelleme çözümü) bunları hücre tarafı aşağı koyarak lamelleri engelleyin. </li><li> 37 de 1 saat için 50 ul primer antikor çözeltisi içinde lamelleri hücre tarafı aşağı inkübe ° C. Anti-DIG antikoru 1X engelleme çözelti içinde üreticinin yönüne göre seyreltilmiş edilmelidir. Diğer antikor proteinleri leke kullanıldığı takdirde, kullanılan tüm antikorlar ev sahibi farklı Spec türetilen koşuluyla doğru konsantrasyonda eklenebilirler. </li><li> 1X DPBS içinde 10 dakika süreyle lamelleri yıkanır. </li><li> 37 de 1 saat için 50 ul sekonder antikor çözeltisi içinde lamelleri hücre tarafı aşağı inkübe ° C. Alexa Fluor-konjuge antikor (Invitrogen) bir renk aralığında üretmek için kullanılabilir ve 1X bloke edici bir çözüm, 1X DPBS olarak 1:500 kullanılmaktadır. </li><li> 10 dakika 1X DPBS Her iki kez lamelleri yıkayın. </li><li> Whatman kağıda lamelleri hücre tarafı yukarı kurulayın. Işık ve ağartma etkilenmemesi için lamelleri kapsayacak emin olun. </li><li> Tüm sıvı buharlaştırılır sonra, 8 ul ImmunoMount (Thermo Scientific, Inc) kullanarak taze Slaytlarınıza lamelleri monte edin. Yavaşça hava kabarcıkları ortadan kaldırmak için coverslip aşağı dokunun. </li><li> Yerine sabitlemek için lameller kenarlarına tırnak cilası sürün. </li><li> Mikroskopi teknikleri ile RNA ve protein görselleştirme de bu tekniğin başarısı için çok önemlidir. Bu anahtar yani kullanılan mikroskop Ayarlar görselleştirme yardımcı veya engel olabilirmikroskop ayarları doğru ve bir örnek, belirli bir deneyde başka tutarlı olması gerekir. Ayrıntılı mikroskopi ayarları için, optik ve antikor kombinasyonları referanslar 1,10 bakın. </li></ol> 5.. Temsilcisi Sonuçlar Viral RNA boyanması için bir örnek, Şekil 2&#39;de görülebilir. Küçük sitoplazmik punctae nadir olmamasına rağmen, HIV-1 için viral RNA, çoğunlukla yaygın gösterilmiştir sitoplazması içinde görülmüştür. Spesifisite herhangi floresans gösterilecek çevreleyen hücrelere pozitif hücrelerin karşılaştırma tarafından görülebilir. Bu çekirdeğinde parlak bir sinyal olarak görüntülenmiştir olabilir ve sitoplazmadaki RNA floresans sinyal eksikliği: olarak Girişte belirtildiği gibi, düzenleyici Rev proteini eksikliği, HIV-1 çekirdek içinde tutulur RNA üretir. Hücresel protein aşırı ekspresyonu, aynı zamanda, HIV-1 viral RNA&#39;nın dağılımı vites değiştirme yeteneğine sahiptir. Şekil 2 içinde </strong&gt;, endosome vezikül kaçakçılığına karışmış proteinlerin ekspresyonu (örneğin, Rab7-etkileşim lizozomal protein (UHP) 11 veya N-terminal silinmiş UHP (RILPN) 11 ve dynein motor fonksiyonu ile [örneğin p50/dynamitin 1 müdahale proteinler, 12], FISH analizleri ile belirlenen viral genomik RNA normal kararlı durum lokalizasyon müdahale UHP ifade mikrotübül organizasyonu merkezi (MTOC) 13 viral genomik RNA&#39;nın yeniden yerelleştirme yol açar. RILPN geç dağılır içinde endozomlar dynein motoru kompleks 14 ve p50/dynamitin blokları dynein motor ve bültenleri büyük subünitinin Tutkallı P150 bağlamak için alamaması nedeniyle sitoplazma geç endozomlar aynı zamanda hücre perifere viral genomik RNA ve HIV-1 yapısal protein 1 (Şekil 2). Viral genomik RNA&#39;nın kararlı durum lokalizasyon manipülasyon, en bulaşıcı olduğu önemli bir katkıVirüs partiküllerinin, terapötikler nihai geliştirilmesi için önemli olabilir. Bizim ellerde, viral RNA gibi erken 3 saat sonrası transfeksiyon ve enfeksiyon 10 olarak hücrede görünür ve 12 saat bu FISH tekniği ile kolayca gözlemlenebilir hale gelir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4002/4002fig1.jpg" /> Şekil 1.. BALIK / co-analizleri IF. Hücreler için protokol akış şeması lamelleri yetişen ve daha sonra paraformaldehid ile sabitlenir. Hücreleri ya BALIK / IF için kullanılabilir veya depolanması için% 70&#39;lik etanol içinde saklanan önceki glisin ve Triton X-tedavileri gerçekleştirilir. Depolama için susuz Hücreler FISH / IF devam etmeden önce 1X DPBS (DEPC tedavi edilen PBS) rehidrate edilir. Hücreler DNaz I ile tedavi ve prob ile melezleşme gece bırakılır. Bir kez hibridizasyon tamamlanınca, hücrelerin yanı SSPE ile olduğu gibi, formamit ile yıkanmış, ve nihai bir 1X DPBS durulama edilir. Engelleme çözeltisi ile inkübasyondan, ardından hücreler uygulananPrimer antikor. Yıkandıktan sonra sekonder antikor uygulanır. 1X DPBS İki son yıkar görüntüleme için lamelleri üzerinde kurutulur ve slaytlar monte boyama işlemi tamamlayın. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/4002/4002fig2.jpg" /> Şekil 2. Temsilci sonuçlar BALIK / co-analizi kullanılarak IF. A), HIV-1 hücresel protein aşırı ekspresyonu (UHP, p50/Dynamitin ve RILPΔN (bir amino-terminal iptal mutantı) neden yapıları ile HeLa hücreleri içine ve bazı durumlarda transfekte edilir) . BALIK / co-IF analizleri yapıldı: RNA ayırt etmek G3BP veya LAMP1 (kırmızı) ile ya yeşil tanımlanır. B), HIV-1 HeLa ifade ve farklı zaman noktalarında toplanır. Hücresel protein, hnRNP A1, kırmızı lekeli ise viral RNA ifade yeşil olarak izlenir. Büyüklüğü 10 mikron çubuklar vardır. Referanslar 1 (; UHP, p50/Dynamitin ve UHP deltaN panel A select rakamlar) değiştirilerek Görüntülerve 17 (panel B).

<ol>
	<li>Lehmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+transport+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+genomic+RNA+and+viral+production+are+dependent+on+dynein+motor+function+and+late+endosome+positioning.">Intracellular transport of human immunodeficiency virus type 1 genomic RNA and viral production are dependent on dynein motor function and late endosome positioning.</a> J. Biol. Chem. 284, 14572-14585 (2009).</li><li>Zurla, C., Lifland, A. W., Santangelo, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+mRNA+interactions+with+RNA+granules+during+translation+initiation+inhibition.">Characterizing mRNA interactions with RNA granules during translation initiation inhibition.</a> PLoS One. 6, e19727 (2011).</li><li>Abrahamyan, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Staufen1+ribonucleoproteins+prevent+formation+of+stress+granules+but+favour+encapsidation+of+HIV-1+genomic+RNA.">Novel Staufen1 ribonucleoproteins prevent formation of stress granules but favour encapsidation of HIV-1 genomic RNA.</a> J. Cell Sci. 123, 369-383 (2010).</li><li>Milev, M. P., Brown, C. M., Mouland, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+visualization+of+the+interactions+between+HIV-1+Gag+and+the+cellular+RNA-binding+protein+Staufen1.">Live cell visualization of the interactions between HIV-1 Gag and the cellular RNA-binding protein Staufen1.</a> Retrovirology. 7, 41-41 (2010).</li><li>Vercruysse, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+cooperative+Rev+protein-protein+interactions+on+Rev+responsive+RNA+by+fluorescence+resonance+energy+transfer.">Measuring cooperative Rev protein-protein interactions on Rev responsive RNA by fluorescence resonance energy transfer.</a> RNA Biol. 8, 316-324 (2011).</li><li>Cullen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+mRNA+export:+insights+from+virology.">Nuclear mRNA export: insights from virology.</a> Trends Biochem. Sci. 28, 419-424 (2003).</li><li>Cmarko, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rev+inhibition+strongly+affects+intracellular+distribution+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+RNAs.">Rev inhibition strongly affects intracellular distribution of human immunodeficiency virus type 1 RNAs.</a> J Virol. 76, 10473-10484 (2002).</li><li>Ajamian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unexpected+roles+for+UPF1+in+HIV-1+RNA+metabolism+and+translation.">Unexpected roles for UPF1 in HIV-1 RNA metabolism and translation.</a> RNA. 14, 914-927 (2008).</li><li>Beriault, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+late+role+for+the+association+of+hnRNP+A2+with+the+HIV-1+hnRNP+A2+response+elements+in+genomic+RNA,+Gag,+and+Vpr+localization.">A late role for the association of hnRNP A2 with the HIV-1 hnRNP A2 response elements in genomic RNA, Gag, and Vpr localization.</a> J. Biol. Chem. 279, 44141-44153 (2004).</li><li>Monette, A., Pante, N., Mouland, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+remodels+the+nuclear+pore+complex.">HIV-1 remodels the nuclear pore complex.</a> J. Cell Biol. 193, 619-631 (2011).</li><li>Jordens, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rab7+effector+protein+RILP+controls+lysosomal+transport+by+inducing+the+recruitment+of+dynein-dynactin+motors.">The Rab7 effector protein RILP controls lysosomal transport by inducing the recruitment of dynein-dynactin motors.</a> Curr. Biol. 11, 1680-1685 (2001).</li><li>Schrader, M., King, S. J., Stroh, T. A., Schroer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+time+imaging+reveals+a+peroxisomal+reticulum+in+living+cells.">Real time imaging reveals a peroxisomal reticulum in living cells.</a> J. Cell Sci. 113 (Pt. 20), 3663-3671 (2000).</li><li>Levesque, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+of+HIV-1+RNA+is+mediated+by+heterogeneous+nuclear+ribonucleoprotein+A2+expression+and+impacts+on+viral+assembly.">Trafficking of HIV-1 RNA is mediated by heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2 expression and impacts on viral assembly.</a> Traffic. 7, 1177-1193 (2006).</li><li>Rocha, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+sensor+ORP1L+contacts+the+ER+protein+VAP+to+control+Rab7-RILP-p150+Glued+and+late+endosome+positioning.">Cholesterol sensor ORP1L contacts the ER protein VAP to control Rab7-RILP-p150 Glued and late endosome positioning.</a> J. Cell Biol. 185, 1209-1225 (2009).</li><li>Soros, V. B., Carvajal, H. V., Richard, S., Cochrane, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+Rev+function+by+a+dominant-negative+mutant+of+Sam68+through+sequestration+of+unspliced+RNA+at+perinuclear+bundles.">Inhibition of human immunodeficiency virus type 1 Rev function by a dominant-negative mutant of Sam68 through sequestration of unspliced RNA at perinuclear bundles.</a> J. Virol. 75, 8203-8215 (2001).</li><li>Sanchez-Velar, N., Udofia, E. B., Yu, Z., Zapp, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hRIP,+a+cellular+cofactor+for+Rev+function,+promotes+release+of+HIV+RNAs+from+the+perinuclear+region.">hRIP, a cellular cofactor for Rev function, promotes release of HIV RNAs from the perinuclear region.</a> Genes Dev. 18, 23-34 (2004).</li><li>Monette, A., Ajamian, L., Lopez-Lastra, M., Mouland, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+type+1+(HIV-1)+induces+the+cytoplasmic+retention+of+heterogeneous+nuclear+ribonucleoprotein+A1+by+disrupting+nuclear+import:+implications+for+HIV-1+gene+expression.">Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) induces the cytoplasmic retention of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1 by disrupting nuclear import: implications for HIV-1 gene expression.</a> J. Biol. Chem. 284, 31350-31362 (2009).</li><li>Malim, M. H., Hauber, J., Le, S. Y., Maizel, J. V., Cullen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HIV-1+rev+trans-activator+acts+through+a+structured+target+sequence+to+activate+nuclear+export+of+unspliced+viral+mRNA.">The HIV-1 rev trans-activator acts through a structured target sequence to activate nuclear export of unspliced viral mRNA.</a> Nature. 338, 254-257 (1989).</li><li>Klein, K. C., Reed, J. C., Lingappa, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+destinies:+degradation,+targeting,+assembly,+and+endocytosis+of+HIV+Gag.">Intracellular destinies: degradation, targeting, assembly, and endocytosis of HIV Gag.</a> AIDS Rev. 9, 150-161 (2007).</li><li>Molle, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomal+trafficking+of+HIV-1+gag+and+genomic+RNAs+regulates+viral+egress.">Endosomal trafficking of HIV-1 gag and genomic RNAs regulates viral egress.</a> J. Biol. Chem. 284, 19727-19743 (2009).</li><li>Jouvenet, N., Bieniasz, P. D., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+biogenesis+of+individual+HIV-1+virions+in+live+cells.">Imaging the biogenesis of individual HIV-1 virions in live cells.</a> Nature. 454, 236-240 (2008).</li><li>Kemler, I., Meehan, A., Poeschla, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+coimaging+of+the+genomic+RNAs+and+Gag+proteins+of+two+lentiviruses.">Live-cell coimaging of the genomic RNAs and Gag proteins of two lentiviruses.</a> J. Virol. 84, 6352-6366 (2010).</li><li>Paige, J. S., Wu, K. Y., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+mimics+of+green+fluorescent+protein.">RNA mimics of green fluorescent protein.</a> Science. 333, 642-646 (2011).</li><li>Eckhardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+SNAP-tagged+derivative+of+HIV-1--a+versatile+tool+to+study+virus-cell+interactions.">A SNAP-tagged derivative of HIV-1--a versatile tool to study virus-cell interactions.</a> PLoS One. 6, e22007 (2011).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

BALIK / co-analizler IF şimdi 9,15,16 rafine edilmiş hücrelerde viral RNA görselleştirmek için güvenilir bir yöntemdir. Birkaç yıl boyunca, biz RNA için boyama zarif bir yöntem geliştirdik. Bu teknik, prob hedef RNA 17 özgü sağlanan hücre tipleri arasında geniş bir yelpaze üzerinde kullanılabilmektedir. DIG ile etiketlenmesi prob olarak, bu basit bir boyama ile RNA görselleme yeteneğine sahiptirler. RNA ve diğer proteinler için boyama birleştirildiğinde, BALIK / IF co-analizler hücresel yapılar ve protein / RNA lokalizasyon gözlemlemek için güçlü bir araç haline gelir. RNA tespit özgüllük oldukça yüksektir. Bu, Şekil 2 &#39;de gösterilmiştir. Rev eksikliği çekirdeğinde 18 viral RNA tuzağa tespit viral genomik RNA lokalizasyonu, BALIK odaklanmış özgün çalışma bazılarında. Bu yana, viral genomik RNA lokalizasyonuna bol yeni bilgiler techniqu kullanılarak elde edilmiştire burada özetlenen. Eksprese eden hücresel protein tarafından, belirli bir popülasyonları-değil, viral RNA&#39;nın her bir hücrenin farklı bölgelere lokalize etmek için zorlanır. HnRNP A2 siRNA tarafından boşaldığında fenotipi benzer UHP ekspresyonu, elde edilen HIV-1-salgılayan hücrelerin 13 RNA gözle MTOC birikmeye neden olur. (Hücresel perifere hücre içi etki viral genomik RNA sürümde dynein ağır zincir 1 sonuç p50/Dynamitin aşırı veya demonte: viral genomik RNA eksi uç motor protein, dynein devre dışı bırakarak hücre perifere itilebilir Şekil 2). Artık aktif juxtanuclear etki lokalize çünkü artık dynein motoru bağlar UHP, RILPΔN, bir mutant, dağılır sitoplazmaya (LAMP1 tarafından etiketlenir) endozomlar. Bu sonuçlar, HIV-1 genomik RNA ve özellikle de bir plastik nüfusun kavramı işaret ettiği, HIV-1 genomik farklı havuzlarıViral replikasyon döngüsünde bazen tanımlanabilen rolleri ile var RNA. Bunlar aynı kavramlar zaten bu mRNA, Gag 19 tarafından kodlanan proteinin tespit edilmiştir. BALIK / antikor seçimi ve yer durumu ile ilgili ortak analizler IF kullanımlarına sınırlamalar vardır. Primer ve sekonder antikorlar ve bunların konsantrasyonları, en iyi kombinasyonu optimizasyonu (Tablo 1 ve 2) optimize etmek zaman alacaktır. Büyük şirketler tarafından hibridomlar yapılan veya üretilen antikorlar 01:02 dan 1:2000 her yerde değişir, fakat en iyi sonuç için üretici tarafından sağlanan yönergelere emin olun konsantrasyonları olabilir. Antikorun üretildiği ev sahibi, aynı zamanda dikkat edilmesi gerekir. Keçi antikorları ile karıştırılarak koyun da çapraz türleri tanıma (veriler gösterilmemiştir) nedeniyle yüksek arka planda bu kombinasyon sonucu olarak birincil ve ikincil antikor kaçınılmalıdır. Alexa-Fluor orta dereceli içinry antikorlar, konsantrasyon set hemen hemen herhangi bir antikor 1:500 de kullanılabilir. Bu raporda açıklanan BALIK / co-analizleri IF diğer dezavantajı hücreler tespit ve formaldehit ve deterjan (Şekil 1) kullanarak permeabilize edilmiştir sonra, kararlı durumda olan yerde RNA yakalar olduğunu. Ancak, canlı hücrelerde RNA görüntüleme çoğunlukla gibi GFP gibi floresan proteinleri tarafından etiketlenir viral RNA genomu varyasyonları kullanarak, aracı 20-22 çeşitli yoluyla elde edilmiştir. Bununla birlikte, canlı hücreler içinde RNA Lokalizasyon tanımlamak için ek aracı yüzey devam eder. Bu yeni yöntemler Ispanak 23, 24 vasıtası SNAP veya MTRIP 2 tarafından etiketleme RNA içerir. Bu teknikler aynı zamanda bir parçası mikroskop ile mRNA tespit amacıyla mRNA etiketlemek için tasarlanmış olması gerektiğini yüzeylerde eklemeden önce veya hücre geçirgenliği gereksinimi de dahil olmak üzere birkaç dezavantajları muzdarip. Gerçekten de, büyük AdvaBu raporda özetlenen FISH analiz ntage yerli RNA en fizyolojik ilgili sonuçlara yol değişmeden olduğu gerçeği yatıyor.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> 18mm lamelleri </td><td> VWR </td><td> 48380 046 </td><td></td></tr><tr><td> % 16 paraformaldehit </td><td> JT Baker </td><td> S898-07 </td><td> % 4 yapmak için: 5 damla NaOH ile 60 ° C 500ml 1XDPBS içinde 20g eritin. -20 ° C&#39;de ısı ve mağaza kapatma 7.2 pH 70 aşmayın ° C! </td></tr><tr><td> Triton-X </td><td> OmniPur </td><td> 9400 </td><td></td></tr><tr><td> Mikro Zehir Jel Ekstraksiyon Kiti </td><td> Roche </td><td> D6294-02 </td><td></td></tr><tr><td> DIG RNA Etiketleme Mix </td><td> Roche </td><td> 11277073910 </td><td></td></tr><tr><td> Transkripsiyon T7 RNA polimeraz </td><td> Invitrogen </td><td> 18033-019 </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Hızlı Spin Sütunlar </td><td> Roche </td><td> 11814427001 </td><td></td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Invitrogen </td><td> 18047-019 </td><td></td></tr><tr><td> 1X DPBS </td><td> Gibco </td><td> 14190-250 </td><td></td></tr><tr><td> Formamid </td><td> EMD </td><td> FX0420-8 </td><td></td></tr><tr><td> tRNA </td><td> Invitrogen </td><td> 15401-021 </td><td></td></tr><tr><td> RNaz OUT </td><td> Invitrogen </td><td> 10777-019 </td><td></td></tr><tr><td> Floresan Antikor Enhancer DIG Algılama için # 4 (engelleme çözüm) ayarlayın </td><td> Roche </td><td> 1768506 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor sekonder antikorlar </td><td> Invitrogen </td><td> Tablo 2&#39;ye bakınız </td><td></td></tr><tr><td> Hibridizasyon Fırını </td><td> Boekel Bilimşan birçok çıkar </td><td> Model 24100 </td><td></td></tr><tr><td> Lamlar </td><td> VWR </td><td> 48300-047 </td><td></td></tr><tr><td> Immunomount </td><td> Thermoscientific </td><td> 9990402 </td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 1. Spesifik reaktifler ve ekipman kimlik <table border="1"><tbody><tr><td> Anti-DIG antikoru Türlerinin (seyreltme; şirketi, katalog numarası) </td><td> Renkler </td><td> Alexa Fluor used (1:500) </td></tr><tr><td rowspan="3"> Fare (1:500; Sigma, B7405) </td><td> yeşil </td><td> Alexa Fluor 488 eşek anti-fare (Invitrogen, A21202) </td></tr><tr><td> kırmızı </td><td> Alexa Fluor 594 eşek anti-fare (Invitrogen, A21203) </td></tr><tr><td> mavi </td><td> Alexa Fluor 647 eşek anti-fare (Invitrogen, A31571) </td></tr><tr><td rowspan="3"> Koyun (1:200; Roche, 11.376.623) </td><td> yeşil </td><td> Alexa Fluor 488 eşek anti-koyun (Invitrogen, A11015) </td></tr><tr><td> kırmızı </td><td> Alexa Fluor 594 eşek anti-koyun (Invitrogen, A11016) </td></tr><tr><td> mavi </td><td> Alexa Fluor 647 eşek anti-koyun (Invitrogen, A21448) </td></tr></tbody></table> Tablo 2. Sekonder antikor kombinasyonları ve anti-DIG katalog numaraları ve konsantrasyonları ile birlikte listelenir.

detection of viral rna by fluorescence in situ hybridization (fish)

Hücrelerin viral replikasyon için enerji ve kaynak aktarmak için hizmet normal hücre fonksiyonları belirli değişiklikler ortaya çıkarmak etkileyecek virüsler. Konak hücre fonksiyonunda birçok açıdan genellikle viral gen ürünlerinin ifadesi ile, virüsler tarafından el edilmektedir işe konak hücre proteinleri ve makine bu. Ayrıca, mobil veziküller ve motor proteinleri virüs mühendisi spesifik membran organelleri veya etiket hücre (de novo enfeksiyon sırasında, virüslerin eş-opt moleküler motor protein çekirdeğinin hedef bölgeleri hedeflemek; sonra, virüs montaj sırasında, onlar hücresel kaçırmak olacaktır ) virüslerin mecliste yardımcı olacak makine. Daha az virüsler, özellikle de RNA genomu olan, protein ve RNA bileşenleri her ikisinin intraselüler ticareti koordine ve bunlar, hücre özel lokuslar bulaşıcı parçacıklar montaj elde nasıl nasıl anlaşılmaktadır. RNA yerelleşme çalışmada daha önceki çalışmaları başladı. Düşük ökaryotik em geliştirilmesibryos ve nöronal hücrelerin önemli biyolojik bilgiler, hem de gen ekspresyonu şelaleden oluşan programlama RNA yerelleşmenin önemi vurgulamıştır. Diğer organizmalar ve hücre sistemleri çalışmada da benzer önemli bilgiler vermiştir. Virüsler zorunlu parazitlerdir ve çoğaltmak için bunların ana hücre kullanmalıdır. Bu nedenle, RNA virüsleri döl virüs partikülleri 1 içine sitoplazma yoluyla ve nihai varış noktalarından biri nükleer gözenek yoluyla nükleus,,, kendi RNA genomu yönlendirmek anlamak önemlidir. BALIK viral RNA kararlı durum lokalizasyon değişiklikleri tanımlamak için yararlı bir araç olarak hizmet vermektedir. Co-analiz viral RNA 3 ile proteinlerin ortak lokalizasyon hakkında bilgi sağlayacak IF immunfloresan (IF) analizi 22, FISH ile / birleştirildiği zaman. Bu analiz, bu nedenle diğer biyokimyasal ve biyofiziksel olarak, RNA-protein etkileşimleri test etmek için iyi bir başlangıç ​​noktası sağlarkendisi tarafından eş-lokalizasyon yana 4,5 testler, bir etkileşim belli olması için yeterli kanıt değildir. Böyle bir yöntemi kullanarak viral RNA yerelleştirme incelerken, bol bilgi viral ve hücresel RNA kaçakçılığı olayları 6 hem de elde edilmiştir. Örneğin, HIV-1 hücre çekirdeğine RNA üretir, ancak, sadece RNA sitoplazmadaki tercüme edilir. bir anahtar viral proteini eksik (Rev) 7, viral RNA&#39;nın BALIK viral için blok çekirdeği 8&#39;de HIV-1 genomik RNA&#39;nın retansiyon bağlı olduğunu ortaya çıkarmıştır. Burada, in situ viral genom RNA &#39;nın görsel analizi için yöntem sunmaktadır. Yöntem bir etiketli RNA prob yararlanır. Bu prob viral genom RNA tamamlayıcı olacak şekilde tasarlanmıştır. Boyunca antisens RNA prob, digoxigenin (DIG) ile değiştirilmiştir ribonukleotid in vitro sentezinde vitro transcr bir dahildiription reaksiyon. Prob hücreleri hedef RNA ile melezleştirilebilir sonra BALIK / IF gerçekleştirirken, daha sonra antikorun etiketleme adım (Şekil 1) mRNA Lokalizasyon gibi ilgi proteinleri ortaya çıkaracaktır.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH at JoVE.com

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

Bir floresan<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizasyon (FISH) yöntemi görsel floresan mikroskobu kullanarak viral genomik RNA algılamak için geliştirilmiştir. Bir prob daha sonra hibridizasyon ve immünfloresan teknikleri bir arada kullanarak tespit edilebilir viral RNA özgüllük ile yapılır. Bu teknik, hücre içi virüs kaçakçılık olaylarının kontrolü hakkında bilgi veren, kararlı durumda viral RNA veya DNA&#39;nın yerelleştirme belirleme avantajı sunuyor.

Floresans tarafından viral RNA tespit edilmesi<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizasyon (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

detection-of-viral-rna-by-fluorescence-in-situ-hybridization-fish

Research

JoVE Journal

Biology

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

38.4K Görüntüleme.  Sir Mortimer B. Davis Jewish General Hospital. Bir floresan In situ Hibridizasyon (FISH) yöntemi görsel floresan mikroskobu kullanarak viral genomik RNA algılamak için geliştirilmiştir. Bir prob daha sonra hibridizasyon ve immünfloresan teknikleri bir arada kullanarak tespit edilebilir viral RNA özgüllük ile yapılır. Bu teknik, hücre içi virüs kaçakçılık olaylarının kontrolü hakkında bilgi veren, kararlı durumda viral RNA veya DNA'nın yerelleştirme belirleme avantajı sunuy...