Yazarlar metodolojinin geliştirilmesine katkıları için laboratuar geçmiş ve mevcut üyelerin tavsiyesi için buraya ve Alan Cochrane özetlenen teşekkür ederim. LA Fraser, Monat ve MacPherson Kariyer Ödülü tarafından desteklenen Sağlık Araştırması (CIHR) Doktora Bursu ve AJM Kanadalı bir Enstitüleri bir alıcı olduğunu. Bu çalışma CIHR (hibe # MOP-56.974) bir hibe ile desteklenmektedir.

1. Prob Hazırlık <ol><li> In vitro transkripsiyonu vektör içinde digest 1 ug, 1 saat boyunca PKS (+) pol 37 ° C&#39;de Kpn1 enzim ile 236nt 9 ve bir agaroz jeli üzerine lineerize DNA ürünü çalıştırın. Fragmanı yaklaşık 2500 bp olması gerekir. </li><li> Jel parçası kesip Roche Micro Zehir Jel Ekstraksiyon Kiti (kullanılan tüm reaktifler Tablo 1&#39;de verilmiştir) kullanarak arındırmak. 30 ul elüsyon tampon içinde nihai elüsyon gerçekleştirmek. Saflaştırma doğrulamak için bir agaroz jeli üzerine ürün 5 ul çalıştırın. </li><li> 2 saat 37 ° C&#39;de Roche DIG RNA etiketleme seti ve inkübe kullanılarak in vitro transkripsiyon reaksiyonu (aşağıdaki tarife bakınız) bir karıştırın. </li></ol> In vitro transkripsiyon reaksiyonunda: <table border="1"><tbody><tr><td> Lineerleştirilmiş DNA </td><td> 23 ul </td></tr><tr><td> 1X DIG RNA etiketleme karışımı (Roche) </td><td> 4 ul </td></tr><tr><td> 1X Traoyma yazıyı tampon </td><td> 8 ul </td></tr><tr><td> 20U RNaz OUT </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> 80U T7 RNA polimeraz </td><td> 4 ul </td></tr><tr><td> Toplam </td><td> 40 ul </td></tr></tbody></table><ol start="4"><li> 15 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe DNase I ve 228 U ekleyin. </li><li> 20 mM nihai bir konsantrasyona EDTA pH 8.0 ilave edilerek reaksiyon durdur. </li><li> Üretici tarafından belirtilen şekilde Roche Hızlı Spin Sütunlar kullanarak reaksiyon arındırın. </li><li> 1/10 hacim DEPC tedavi edilen 3M NaOAc pH 5.2 ve buz gibi soğuk% 95 etanol 2.5 hacim ile yağış tarafından prob arındırın. Karıştırmak ve bir gece boyunca 30 dakika süreyle -80 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> 15,000 x g hızında 15 dakika 4 ° C&#39;de santrifüje prob. </li><li> Süpernatantı ve buz gibi soğuk% 70 etanol içinde pelet yıkayın. 15,000 x g hızında 5 dakika 4 ° C&#39;de tekrar santrifüje. </li><li> Süpernatantı ve pelet kurulayın. 50 ul w pelletini10 U Invitrogen RNaz OUT içeren ater (DNaz / RNaz ücretsiz). </li><li> Spektrofotometri ile prob konsantrasyonu (260 nm ölçüsü RNA) tahmin ve ul ng / 5 &#39;lik bir konsantrasyon ye tamamlanır. ° C uzun süreli depolama için kısa süreli kullanım veya -80 -20 ° C&#39;de kısım halinde saklayın. O yüzden bu bir kısım tasarruf arası karşılaştırmalar testi yapılması tavsiye edilir. </li></ol> 2. Hücre Sabitleme <ol><li> Hasat sonrasında nihai konfluense yaklaşık% 70-80 olup bu yüzden tedavi edilmezse, steril cam lamelleri üzerine yapışık tohum hücreleri başlangıçta önemlidir. Yapışmaz hücreleri, normal olarak büyümeye ve ne zaman toplamak için hazır, 1 saat için 0.01% w / v poli-L-lisin (Sigma-Aldrich, Inc) ile tedavi edilmiştir lamelleri ile bunları tasarlamak. Tipik bir 12-kuyucuklu polistiren doku kültürü plakası (3,8 cm 2) için, 150,000 hücreler (örneğin, HeLa) transfeksiyondan 24 saat önce az kaplanır. Sigara yapışık hücreleri enfekte veya transfekte her zamanki gibi ve reklam için izin verilebilirBurada fiksasyon 3 önce cam kapak slipleri için. </li><li> Medya atın ve 1 dakika süreyle çift distile su (DPBS) hazırlanan fosfat tamponlu 1X salinle hücreleri yıkayın. Diethylpyrocarbonate (DEPC, Sigma-Aldrich, Inc) 1X PBS de kullanılabilir-muamele, bununla birlikte bunun arıtılmamış PBS RNaz enzim ihtiva edebilir olamaz gibi. </li><li> PBS atın ve tamamen hücre kapsayacak kadar% 4 paraformaldehit, ekleyin. 15-20 dakika inkübe edin. </li><li> Paraformaldeyhyde atın ve 1 dakika 1X DPBS hücreler yıkayın. </li><li> DPBS atın ve 0.1 M glisin (1X DPBS çözünmüş) ekleyin. 10 dakika inkübe edin. </li><li> Glisin atın ve 1 dakika 1X DPBS hücreleri yıkayın. </li><li> DPBS atın ve Triton-X (1X DPBS çözünmüş)% 0,2 ekleyin. 5-10 dakika inkübe edin. Nükleoler veya nükleer zarf proteinleri için boyama ise, Triton en fazla 5 dk veya protein lokalizasyonu için X-100 diffüz olacak olan geçirgenliği artar. </li><li> Triton X-100 atın ve bir kez yıkayın1 dakika 1X DPBS. </li><li> Uzun süreli depolama için, dört ay için 4 ° C de% 70 etanol ve mağaza ile PBS değiştirin. Alternatif olarak, 1X DPBS ile bir kez daha yıkayın ve FISH geçin. </li></ol> 3. In situ Hibridizasyon Floresans (FISH) <ol><li> Lamelleri etanol içinde bekletildi ise, 1X DPBS ile etanol yerine ve hücreler 30 dakika süreyle rehidre izin verir. Lamelleri 4 ° C&#39;de saklandığında rehidrasyon gecede yapılabilir </li><li> 1 dakika boyunca 1X DPBS ile lamelleri yıkanır. </li><li> Temiz ve iyi etiketlemek için özen üzerinde lamelleri inkübe için slaytlar hazırlayın. </li><li> 18mm coverslip için, sürgüye DNase çözeltisi (ticari olarak mevcut 25 ünite / coverslip), 50 ul ilave edin. Bu hücre yüzü aşağı yerleştirin ve oda sıcaklığında 15 dakika için inkübe emin olmak, coverslip ekleyin. </li><li> 1 dakika boyunca 1X DPBS ile lamelleri yıkanır. </li><li> Coverslip başına 50 ul hibridizasyon karışımı (aşağıdaki tarife bakınız) üzerine ekle42&#39;de bir slayt ve 16-18 saat coverslip hücre yüzü aşağı kuluçkaya ° C İnkübasyon,% 50 formamid, 2X SSPE karışımı (12.5 ml deiyonize formamid, 2.5 ml 20X SSPE, 10 ml su) ihtiva eden bir tepsi yapılmalıdır. </li></ol> Karışım hibridizasyon (bir coverslip, 50 ul için): <table border="1"><tbody><tr><td> Stok miktarı </td><td> Malzeme (son konsantrasyonda) </td></tr><tr><td> 25 ul </td><td> Formamid,% 50 (deiyonize; herhangi bir kaynak) </td></tr><tr><td> 5 ul (10 mg / ml) </td><td> tRNA, 1 mg / ml (Sigma-Aldrich, Inc) </td></tr><tr><td> 5 ul (20X arasında) </td><td> SSPE, 2X </td></tr><tr><td> 5 ul (50X arasında) </td><td> Denharts, 5X </td></tr><tr><td> 0,125 ul (5 adet) </td><td> RNaz OUT </td></tr><tr><td> 5 ul (ul / 5 ng 25 ng) </td><td> Sonda </td></tr><tr><td> 5 ul </td><td> Nihai yapmak H2O DEPC,hacminin 50 ul </td></tr></tbody></table><ol start="7"><li> 42 az 15 dakika boyunca 50 ul% 50 formamid (1X DPBS ile sulandırılmış) içinde inkübe lamelleri hücre yüzü aşağı ° C </li><li> 42 az 5 dakika her biri için 50 ul 2X SSPE (20X SSPE 1X DPBS inceltilmiş) onları hücre tarafı aşağı kuluçkaya ° C ile 2X SSPE iki kez lamelleri yıkayın </li><li> 1 dakika boyunca 1X DPBS in lamelleri yıkanır. </li></ol> 4. İmmünofloresan Boyama <ol><li> 30 dakika 50 ul 1X Roche engelleme çözümü (1X DPBS inceltilmiş 10X Roche engelleme çözümü) bunları hücre tarafı aşağı koyarak lamelleri engelleyin. </li><li> 37 de 1 saat için 50 ul primer antikor çözeltisi içinde lamelleri hücre tarafı aşağı inkübe ° C. Anti-DIG antikoru 1X engelleme çözelti içinde üreticinin yönüne göre seyreltilmiş edilmelidir. Diğer antikor proteinleri leke kullanıldığı takdirde, kullanılan tüm antikorlar ev sahibi farklı Spec türetilen koşuluyla doğru konsantrasyonda eklenebilirler. </li><li> 1X DPBS içinde 10 dakika süreyle lamelleri yıkanır. </li><li> 37 de 1 saat için 50 ul sekonder antikor çözeltisi içinde lamelleri hücre tarafı aşağı inkübe ° C. Alexa Fluor-konjuge antikor (Invitrogen) bir renk aralığında üretmek için kullanılabilir ve 1X bloke edici bir çözüm, 1X DPBS olarak 1:500 kullanılmaktadır. </li><li> 10 dakika 1X DPBS Her iki kez lamelleri yıkayın. </li><li> Whatman kağıda lamelleri hücre tarafı yukarı kurulayın. Işık ve ağartma etkilenmemesi için lamelleri kapsayacak emin olun. </li><li> Tüm sıvı buharlaştırılır sonra, 8 ul ImmunoMount (Thermo Scientific, Inc) kullanarak taze Slaytlarınıza lamelleri monte edin. Yavaşça hava kabarcıkları ortadan kaldırmak için coverslip aşağı dokunun. </li><li> Yerine sabitlemek için lameller kenarlarına tırnak cilası sürün. </li><li> Mikroskopi teknikleri ile RNA ve protein görselleştirme de bu tekniğin başarısı için çok önemlidir. Bu anahtar yani kullanılan mikroskop Ayarlar görselleştirme yardımcı veya engel olabilirmikroskop ayarları doğru ve bir örnek, belirli bir deneyde başka tutarlı olması gerekir. Ayrıntılı mikroskopi ayarları için, optik ve antikor kombinasyonları referanslar 1,10 bakın. </li></ol> 5.. Temsilcisi Sonuçlar Viral RNA boyanması için bir örnek, Şekil 2&#39;de görülebilir. Küçük sitoplazmik punctae nadir olmamasına rağmen, HIV-1 için viral RNA, çoğunlukla yaygın gösterilmiştir sitoplazması içinde görülmüştür. Spesifisite herhangi floresans gösterilecek çevreleyen hücrelere pozitif hücrelerin karşılaştırma tarafından görülebilir. Bu çekirdeğinde parlak bir sinyal olarak görüntülenmiştir olabilir ve sitoplazmadaki RNA floresans sinyal eksikliği: olarak Girişte belirtildiği gibi, düzenleyici Rev proteini eksikliği, HIV-1 çekirdek içinde tutulur RNA üretir. Hücresel protein aşırı ekspresyonu, aynı zamanda, HIV-1 viral RNA&#39;nın dağılımı vites değiştirme yeteneğine sahiptir. Şekil 2 içinde </strong&gt;, endosome vezikül kaçakçılığına karışmış proteinlerin ekspresyonu (örneğin, Rab7-etkileşim lizozomal protein (UHP) 11 veya N-terminal silinmiş UHP (RILPN) 11 ve dynein motor fonksiyonu ile [örneğin p50/dynamitin 1 müdahale proteinler, 12], FISH analizleri ile belirlenen viral genomik RNA normal kararlı durum lokalizasyon müdahale UHP ifade mikrotübül organizasyonu merkezi (MTOC) 13 viral genomik RNA&#39;nın yeniden yerelleştirme yol açar. RILPN geç dağılır içinde endozomlar dynein motoru kompleks 14 ve p50/dynamitin blokları dynein motor ve bültenleri büyük subünitinin Tutkallı P150 bağlamak için alamaması nedeniyle sitoplazma geç endozomlar aynı zamanda hücre perifere viral genomik RNA ve HIV-1 yapısal protein 1 (Şekil 2). Viral genomik RNA&#39;nın kararlı durum lokalizasyon manipülasyon, en bulaşıcı olduğu önemli bir katkıVirüs partiküllerinin, terapötikler nihai geliştirilmesi için önemli olabilir. Bizim ellerde, viral RNA gibi erken 3 saat sonrası transfeksiyon ve enfeksiyon 10 olarak hücrede görünür ve 12 saat bu FISH tekniği ile kolayca gözlemlenebilir hale gelir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4002/4002fig1.jpg" /> Şekil 1.. BALIK / co-analizleri IF. Hücreler için protokol akış şeması lamelleri yetişen ve daha sonra paraformaldehid ile sabitlenir. Hücreleri ya BALIK / IF için kullanılabilir veya depolanması için% 70&#39;lik etanol içinde saklanan önceki glisin ve Triton X-tedavileri gerçekleştirilir. Depolama için susuz Hücreler FISH / IF devam etmeden önce 1X DPBS (DEPC tedavi edilen PBS) rehidrate edilir. Hücreler DNaz I ile tedavi ve prob ile melezleşme gece bırakılır. Bir kez hibridizasyon tamamlanınca, hücrelerin yanı SSPE ile olduğu gibi, formamit ile yıkanmış, ve nihai bir 1X DPBS durulama edilir. Engelleme çözeltisi ile inkübasyondan, ardından hücreler uygulananPrimer antikor. Yıkandıktan sonra sekonder antikor uygulanır. 1X DPBS İki son yıkar görüntüleme için lamelleri üzerinde kurutulur ve slaytlar monte boyama işlemi tamamlayın. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/4002/4002fig2.jpg" /> Şekil 2. Temsilci sonuçlar BALIK / co-analizi kullanılarak IF. A), HIV-1 hücresel protein aşırı ekspresyonu (UHP, p50/Dynamitin ve RILPΔN (bir amino-terminal iptal mutantı) neden yapıları ile HeLa hücreleri içine ve bazı durumlarda transfekte edilir) . BALIK / co-IF analizleri yapıldı: RNA ayırt etmek G3BP veya LAMP1 (kırmızı) ile ya yeşil tanımlanır. B), HIV-1 HeLa ifade ve farklı zaman noktalarında toplanır. Hücresel protein, hnRNP A1, kırmızı lekeli ise viral RNA ifade yeşil olarak izlenir. Büyüklüğü 10 mikron çubuklar vardır. Referanslar 1 (; UHP, p50/Dynamitin ve UHP deltaN panel A select rakamlar) değiştirilerek Görüntülerve 17 (panel B).

<ol>
	<li>Lehmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+transport+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+genomic+RNA+and+viral+production+are+dependent+on+dynein+motor+function+and+late+endosome+positioning.">Intracellular transport of human immunodeficiency virus type 1 genomic RNA and viral production are dependent on dynein motor function and late endosome positioning.</a> J. Biol. Chem. 284, 14572-14585 (2009).</li><li>Zurla, C., Lifland, A. W., Santangelo, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+mRNA+interactions+with+RNA+granules+during+translation+initiation+inhibition.">Characterizing mRNA interactions with RNA granules during translation initiation inhibition.</a> PLoS One. 6, e19727 (2011).</li><li>Abrahamyan, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Staufen1+ribonucleoproteins+prevent+formation+of+stress+granules+but+favour+encapsidation+of+HIV-1+genomic+RNA.">Novel Staufen1 ribonucleoproteins prevent formation of stress granules but favour encapsidation of HIV-1 genomic RNA.</a> J. Cell Sci. 123, 369-383 (2010).</li><li>Milev, M. P., Brown, C. M., Mouland, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+visualization+of+the+interactions+between+HIV-1+Gag+and+the+cellular+RNA-binding+protein+Staufen1.">Live cell visualization of the interactions between HIV-1 Gag and the cellular RNA-binding protein Staufen1.</a> Retrovirology. 7, 41-41 (2010).</li><li>Vercruysse, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+cooperative+Rev+protein-protein+interactions+on+Rev+responsive+RNA+by+fluorescence+resonance+energy+transfer.">Measuring cooperative Rev protein-protein interactions on Rev responsive RNA by fluorescence resonance energy transfer.</a> RNA Biol. 8, 316-324 (2011).</li><li>Cullen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+mRNA+export:+insights+from+virology.">Nuclear mRNA export: insights from virology.</a> Trends Biochem. Sci. 28, 419-424 (2003).</li><li>Cmarko, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rev+inhibition+strongly+affects+intracellular+distribution+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+RNAs.">Rev inhibition strongly affects intracellular distribution of human immunodeficiency virus type 1 RNAs.</a> J Virol. 76, 10473-10484 (2002).</li><li>Ajamian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unexpected+roles+for+UPF1+in+HIV-1+RNA+metabolism+and+translation.">Unexpected roles for UPF1 in HIV-1 RNA metabolism and translation.</a> RNA. 14, 914-927 (2008).</li><li>Beriault, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+late+role+for+the+association+of+hnRNP+A2+with+the+HIV-1+hnRNP+A2+response+elements+in+genomic+RNA,+Gag,+and+Vpr+localization.">A late role for the association of hnRNP A2 with the HIV-1 hnRNP A2 response elements in genomic RNA, Gag, and Vpr localization.</a> J. Biol. Chem. 279, 44141-44153 (2004).</li><li>Monette, A., Pante, N., Mouland, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+remodels+the+nuclear+pore+complex.">HIV-1 remodels the nuclear pore complex.</a> J. Cell Biol. 193, 619-631 (2011).</li><li>Jordens, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rab7+effector+protein+RILP+controls+lysosomal+transport+by+inducing+the+recruitment+of+dynein-dynactin+motors.">The Rab7 effector protein RILP controls lysosomal transport by inducing the recruitment of dynein-dynactin motors.</a> Curr. Biol. 11, 1680-1685 (2001).</li><li>Schrader, M., King, S. J., Stroh, T. A., Schroer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real+time+imaging+reveals+a+peroxisomal+reticulum+in+living+cells.">Real time imaging reveals a peroxisomal reticulum in living cells.</a> J. Cell Sci. 113 (Pt. 20), 3663-3671 (2000).</li><li>Levesque, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+of+HIV-1+RNA+is+mediated+by+heterogeneous+nuclear+ribonucleoprotein+A2+expression+and+impacts+on+viral+assembly.">Trafficking of HIV-1 RNA is mediated by heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2 expression and impacts on viral assembly.</a> Traffic. 7, 1177-1193 (2006).</li><li>Rocha, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+sensor+ORP1L+contacts+the+ER+protein+VAP+to+control+Rab7-RILP-p150+Glued+and+late+endosome+positioning.">Cholesterol sensor ORP1L contacts the ER protein VAP to control Rab7-RILP-p150 Glued and late endosome positioning.</a> J. Cell Biol. 185, 1209-1225 (2009).</li><li>Soros, V. B., Carvajal, H. V., Richard, S., Cochrane, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+Rev+function+by+a+dominant-negative+mutant+of+Sam68+through+sequestration+of+unspliced+RNA+at+perinuclear+bundles.">Inhibition of human immunodeficiency virus type 1 Rev function by a dominant-negative mutant of Sam68 through sequestration of unspliced RNA at perinuclear bundles.</a> J. Virol. 75, 8203-8215 (2001).</li><li>Sanchez-Velar, N., Udofia, E. B., Yu, Z., Zapp, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hRIP,+a+cellular+cofactor+for+Rev+function,+promotes+release+of+HIV+RNAs+from+the+perinuclear+region.">hRIP, a cellular cofactor for Rev function, promotes release of HIV RNAs from the perinuclear region.</a> Genes Dev. 18, 23-34 (2004).</li><li>Monette, A., Ajamian, L., Lopez-Lastra, M., Mouland, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+type+1+(HIV-1)+induces+the+cytoplasmic+retention+of+heterogeneous+nuclear+ribonucleoprotein+A1+by+disrupting+nuclear+import:+implications+for+HIV-1+gene+expression.">Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) induces the cytoplasmic retention of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1 by disrupting nuclear import: implications for HIV-1 gene expression.</a> J. Biol. Chem. 284, 31350-31362 (2009).</li><li>Malim, M. H., Hauber, J., Le, S. Y., Maizel, J. V., Cullen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HIV-1+rev+trans-activator+acts+through+a+structured+target+sequence+to+activate+nuclear+export+of+unspliced+viral+mRNA.">The HIV-1 rev trans-activator acts through a structured target sequence to activate nuclear export of unspliced viral mRNA.</a> Nature. 338, 254-257 (1989).</li><li>Klein, K. C., Reed, J. C., Lingappa, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+destinies:+degradation,+targeting,+assembly,+and+endocytosis+of+HIV+Gag.">Intracellular destinies: degradation, targeting, assembly, and endocytosis of HIV Gag.</a> AIDS Rev. 9, 150-161 (2007).</li><li>Molle, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomal+trafficking+of+HIV-1+gag+and+genomic+RNAs+regulates+viral+egress.">Endosomal trafficking of HIV-1 gag and genomic RNAs regulates viral egress.</a> J. Biol. Chem. 284, 19727-19743 (2009).</li><li>Jouvenet, N., Bieniasz, P. D., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+biogenesis+of+individual+HIV-1+virions+in+live+cells.">Imaging the biogenesis of individual HIV-1 virions in live cells.</a> Nature. 454, 236-240 (2008).</li><li>Kemler, I., Meehan, A., Poeschla, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+coimaging+of+the+genomic+RNAs+and+Gag+proteins+of+two+lentiviruses.">Live-cell coimaging of the genomic RNAs and Gag proteins of two lentiviruses.</a> J. Virol. 84, 6352-6366 (2010).</li><li>Paige, J. S., Wu, K. Y., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+mimics+of+green+fluorescent+protein.">RNA mimics of green fluorescent protein.</a> Science. 333, 642-646 (2011).</li><li>Eckhardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+SNAP-tagged+derivative+of+HIV-1--a+versatile+tool+to+study+virus-cell+interactions.">A SNAP-tagged derivative of HIV-1--a versatile tool to study virus-cell interactions.</a> PLoS One. 6, e22007 (2011).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

BALIK / co-analizler IF şimdi 9,15,16 rafine edilmiş hücrelerde viral RNA görselleştirmek için güvenilir bir yöntemdir. Birkaç yıl boyunca, biz RNA için boyama zarif bir yöntem geliştirdik. Bu teknik, prob hedef RNA 17 özgü sağlanan hücre tipleri arasında geniş bir yelpaze üzerinde kullanılabilmektedir. DIG ile etiketlenmesi prob olarak, bu basit bir boyama ile RNA görselleme yeteneğine sahiptirler. RNA ve diğer proteinler için boyama birleştirildiğinde, BALIK / IF co-analizler hücresel yapılar ve protein / RNA lokalizasyon gözlemlemek için güçlü bir araç haline gelir. RNA tespit özgüllük oldukça yüksektir. Bu, Şekil 2 &#39;de gösterilmiştir. Rev eksikliği çekirdeğinde 18 viral RNA tuzağa tespit viral genomik RNA lokalizasyonu, BALIK odaklanmış özgün çalışma bazılarında. Bu yana, viral genomik RNA lokalizasyonuna bol yeni bilgiler techniqu kullanılarak elde edilmiştire burada özetlenen. Eksprese eden hücresel protein tarafından, belirli bir popülasyonları-değil, viral RNA&#39;nın her bir hücrenin farklı bölgelere lokalize etmek için zorlanır. HnRNP A2 siRNA tarafından boşaldığında fenotipi benzer UHP ekspresyonu, elde edilen HIV-1-salgılayan hücrelerin 13 RNA gözle MTOC birikmeye neden olur. (Hücresel perifere hücre içi etki viral genomik RNA sürümde dynein ağır zincir 1 sonuç p50/Dynamitin aşırı veya demonte: viral genomik RNA eksi uç motor protein, dynein devre dışı bırakarak hücre perifere itilebilir Şekil 2). Artık aktif juxtanuclear etki lokalize çünkü artık dynein motoru bağlar UHP, RILPΔN, bir mutant, dağılır sitoplazmaya (LAMP1 tarafından etiketlenir) endozomlar. Bu sonuçlar, HIV-1 genomik RNA ve özellikle de bir plastik nüfusun kavramı işaret ettiği, HIV-1 genomik farklı havuzlarıViral replikasyon döngüsünde bazen tanımlanabilen rolleri ile var RNA. Bunlar aynı kavramlar zaten bu mRNA, Gag 19 tarafından kodlanan proteinin tespit edilmiştir. BALIK / antikor seçimi ve yer durumu ile ilgili ortak analizler IF kullanımlarına sınırlamalar vardır. Primer ve sekonder antikorlar ve bunların konsantrasyonları, en iyi kombinasyonu optimizasyonu (Tablo 1 ve 2) optimize etmek zaman alacaktır. Büyük şirketler tarafından hibridomlar yapılan veya üretilen antikorlar 01:02 dan 1:2000 her yerde değişir, fakat en iyi sonuç için üretici tarafından sağlanan yönergelere emin olun konsantrasyonları olabilir. Antikorun üretildiği ev sahibi, aynı zamanda dikkat edilmesi gerekir. Keçi antikorları ile karıştırılarak koyun da çapraz türleri tanıma (veriler gösterilmemiştir) nedeniyle yüksek arka planda bu kombinasyon sonucu olarak birincil ve ikincil antikor kaçınılmalıdır. Alexa-Fluor orta dereceli içinry antikorlar, konsantrasyon set hemen hemen herhangi bir antikor 1:500 de kullanılabilir. Bu raporda açıklanan BALIK / co-analizleri IF diğer dezavantajı hücreler tespit ve formaldehit ve deterjan (Şekil 1) kullanarak permeabilize edilmiştir sonra, kararlı durumda olan yerde RNA yakalar olduğunu. Ancak, canlı hücrelerde RNA görüntüleme çoğunlukla gibi GFP gibi floresan proteinleri tarafından etiketlenir viral RNA genomu varyasyonları kullanarak, aracı 20-22 çeşitli yoluyla elde edilmiştir. Bununla birlikte, canlı hücreler içinde RNA Lokalizasyon tanımlamak için ek aracı yüzey devam eder. Bu yeni yöntemler Ispanak 23, 24 vasıtası SNAP veya MTRIP 2 tarafından etiketleme RNA içerir. Bu teknikler aynı zamanda bir parçası mikroskop ile mRNA tespit amacıyla mRNA etiketlemek için tasarlanmış olması gerektiğini yüzeylerde eklemeden önce veya hücre geçirgenliği gereksinimi de dahil olmak üzere birkaç dezavantajları muzdarip. Gerçekten de, büyük AdvaBu raporda özetlenen FISH analiz ntage yerli RNA en fizyolojik ilgili sonuçlara yol değişmeden olduğu gerçeği yatıyor.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> 18mm lamelleri </td><td> VWR </td><td> 48380 046 </td><td></td></tr><tr><td> % 16 paraformaldehit </td><td> JT Baker </td><td> S898-07 </td><td> % 4 yapmak için: 5 damla NaOH ile 60 ° C 500ml 1XDPBS içinde 20g eritin. -20 ° C&#39;de ısı ve mağaza kapatma 7.2 pH 70 aşmayın ° C! </td></tr><tr><td> Triton-X </td><td> OmniPur </td><td> 9400 </td><td></td></tr><tr><td> Mikro Zehir Jel Ekstraksiyon Kiti </td><td> Roche </td><td> D6294-02 </td><td></td></tr><tr><td> DIG RNA Etiketleme Mix </td><td> Roche </td><td> 11277073910 </td><td></td></tr><tr><td> Transkripsiyon T7 RNA polimeraz </td><td> Invitrogen </td><td> 18033-019 </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Hızlı Spin Sütunlar </td><td> Roche </td><td> 11814427001 </td><td></td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Invitrogen </td><td> 18047-019 </td><td></td></tr><tr><td> 1X DPBS </td><td> Gibco </td><td> 14190-250 </td><td></td></tr><tr><td> Formamid </td><td> EMD </td><td> FX0420-8 </td><td></td></tr><tr><td> tRNA </td><td> Invitrogen </td><td> 15401-021 </td><td></td></tr><tr><td> RNaz OUT </td><td> Invitrogen </td><td> 10777-019 </td><td></td></tr><tr><td> Floresan Antikor Enhancer DIG Algılama için # 4 (engelleme çözüm) ayarlayın </td><td> Roche </td><td> 1768506 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor sekonder antikorlar </td><td> Invitrogen </td><td> Tablo 2&#39;ye bakınız </td><td></td></tr><tr><td> Hibridizasyon Fırını </td><td> Boekel Bilimşan birçok çıkar </td><td> Model 24100 </td><td></td></tr><tr><td> Lamlar </td><td> VWR </td><td> 48300-047 </td><td></td></tr><tr><td> Immunomount </td><td> Thermoscientific </td><td> 9990402 </td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 1. Spesifik reaktifler ve ekipman kimlik <table border="1"><tbody><tr><td> Anti-DIG antikoru Türlerinin (seyreltme; şirketi, katalog numarası) </td><td> Renkler </td><td> Alexa Fluor used (1:500) </td></tr><tr><td rowspan="3"> Fare (1:500; Sigma, B7405) </td><td> yeşil </td><td> Alexa Fluor 488 eşek anti-fare (Invitrogen, A21202) </td></tr><tr><td> kırmızı </td><td> Alexa Fluor 594 eşek anti-fare (Invitrogen, A21203) </td></tr><tr><td> mavi </td><td> Alexa Fluor 647 eşek anti-fare (Invitrogen, A31571) </td></tr><tr><td rowspan="3"> Koyun (1:200; Roche, 11.376.623) </td><td> yeşil </td><td> Alexa Fluor 488 eşek anti-koyun (Invitrogen, A11015) </td></tr><tr><td> kırmızı </td><td> Alexa Fluor 594 eşek anti-koyun (Invitrogen, A11016) </td></tr><tr><td> mavi </td><td> Alexa Fluor 647 eşek anti-koyun (Invitrogen, A21448) </td></tr></tbody></table> Tablo 2. Sekonder antikor kombinasyonları ve anti-DIG katalog numaraları ve konsantrasyonları ile birlikte listelenir.

detection of viral rna by fluorescence in situ hybridization (fish)

Hücrelerin viral replikasyon için enerji ve kaynak aktarmak için hizmet normal hücre fonksiyonları belirli değişiklikler ortaya çıkarmak etkileyecek virüsler. Konak hücre fonksiyonunda birçok açıdan genellikle viral gen ürünlerinin ifadesi ile, virüsler tarafından el edilmektedir işe konak hücre proteinleri ve makine bu. Ayrıca, mobil veziküller ve motor proteinleri virüs mühendisi spesifik membran organelleri veya etiket hücre (de novo enfeksiyon sırasında, virüslerin eş-opt moleküler motor protein çekirdeğinin hedef bölgeleri hedeflemek; sonra, virüs montaj sırasında, onlar hücresel kaçırmak olacaktır ) virüslerin mecliste yardımcı olacak makine. Daha az virüsler, özellikle de RNA genomu olan, protein ve RNA bileşenleri her ikisinin intraselüler ticareti koordine ve bunlar, hücre özel lokuslar bulaşıcı parçacıklar montaj elde nasıl nasıl anlaşılmaktadır. RNA yerelleşme çalışmada daha önceki çalışmaları başladı. Düşük ökaryotik em geliştirilmesibryos ve nöronal hücrelerin önemli biyolojik bilgiler, hem de gen ekspresyonu şelaleden oluşan programlama RNA yerelleşmenin önemi vurgulamıştır. Diğer organizmalar ve hücre sistemleri çalışmada da benzer önemli bilgiler vermiştir. Virüsler zorunlu parazitlerdir ve çoğaltmak için bunların ana hücre kullanmalıdır. Bu nedenle, RNA virüsleri döl virüs partikülleri 1 içine sitoplazma yoluyla ve nihai varış noktalarından biri nükleer gözenek yoluyla nükleus,,, kendi RNA genomu yönlendirmek anlamak önemlidir. BALIK viral RNA kararlı durum lokalizasyon değişiklikleri tanımlamak için yararlı bir araç olarak hizmet vermektedir. Co-analiz viral RNA 3 ile proteinlerin ortak lokalizasyon hakkında bilgi sağlayacak IF immunfloresan (IF) analizi 22, FISH ile / birleştirildiği zaman. Bu analiz, bu nedenle diğer biyokimyasal ve biyofiziksel olarak, RNA-protein etkileşimleri test etmek için iyi bir başlangıç ​​noktası sağlarkendisi tarafından eş-lokalizasyon yana 4,5 testler, bir etkileşim belli olması için yeterli kanıt değildir. Böyle bir yöntemi kullanarak viral RNA yerelleştirme incelerken, bol bilgi viral ve hücresel RNA kaçakçılığı olayları 6 hem de elde edilmiştir. Örneğin, HIV-1 hücre çekirdeğine RNA üretir, ancak, sadece RNA sitoplazmadaki tercüme edilir. bir anahtar viral proteini eksik (Rev) 7, viral RNA&#39;nın BALIK viral için blok çekirdeği 8&#39;de HIV-1 genomik RNA&#39;nın retansiyon bağlı olduğunu ortaya çıkarmıştır. Burada, in situ viral genom RNA &#39;nın görsel analizi için yöntem sunmaktadır. Yöntem bir etiketli RNA prob yararlanır. Bu prob viral genom RNA tamamlayıcı olacak şekilde tasarlanmıştır. Boyunca antisens RNA prob, digoxigenin (DIG) ile değiştirilmiştir ribonukleotid in vitro sentezinde vitro transcr bir dahildiription reaksiyon. Prob hücreleri hedef RNA ile melezleştirilebilir sonra BALIK / IF gerçekleştirirken, daha sonra antikorun etiketleme adım (Şekil 1) mRNA Lokalizasyon gibi ilgi proteinleri ortaya çıkaracaktır.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH at JoVE.com

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

Bir floresan<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizasyon (FISH) yöntemi görsel floresan mikroskobu kullanarak viral genomik RNA algılamak için geliştirilmiştir. Bir prob daha sonra hibridizasyon ve immünfloresan teknikleri bir arada kullanarak tespit edilebilir viral RNA özgüllük ile yapılır. Bu teknik, hücre içi virüs kaçakçılık olaylarının kontrolü hakkında bilgi veren, kararlı durumda viral RNA veya DNA&#39;nın yerelleştirme belirleme avantajı sunuyor.

Floresans tarafından viral RNA tespit edilmesi<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizasyon (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

detection-of-viral-rna-by-fluorescence-in-situ-hybridization-fish

Research

JoVE Journal

Biology

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

38.4K Görüntüleme.  Sir Mortimer B. Davis Jewish General Hospital. Bir floresan In situ Hibridizasyon (FISH) yöntemi görsel floresan mikroskobu kullanarak viral genomik RNA algılamak için geliştirilmiştir. Bir prob daha sonra hibridizasyon ve immünfloresan teknikleri bir arada kullanarak tespit edilebilir viral RNA özgüllük ile yapılır. Bu teknik, hücre içi virüs kaçakçılık olaylarının kontrolü hakkında bilgi veren, kararlı durumda viral RNA veya DNA'nın yerelleştirme belirleme avantajı sunuy...

Video: Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

Floresan In situ İnsan Sperm hibridizasyon (FISH) Protokolü

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Biyoloji

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence (T7, T3, SP6) and the gene to be transcribed (Figure 1A). A typical transcription reaction consists of the template DNA, RNA polymerase, ribonucleotide triphosphates, RNase inhibitor and buffer containing Mg2+ ions.
Large amounts of high quality RNA are often required for a variety of applications. Use of in vitro transcription has been reported for RNA structure and function studies such as splicing1, RNAi experiments in mammalian cells2, antisense RNA amplification by the "Eberwine method"3, microarray analysis4 and for RNA vaccine studies5. The technique can also be used for producing radiolabeled and dye labeled probes6. Warren, et al. recently reported reprogramming of human cells by transfection with in vitro transcribed capped RNA7. The T7 High Yield RNA Synthesis Kit from New England Biolabs has been designed to synthesize up to 180 &mu;g RNA per 20 &mu;l reaction. RNA of length up to 10kb has been successfully transcribed using this kit. Linearized plasmid DNA, PCR products and synthetic DNA oligonucleotides can be used as templates for transcription as long as they have the T7 promoter sequence upstream of the gene to be transcribed.
Addition of a 5' end cap structure to the RNA is an important process in eukaryotes. It is essential for RNA stability8, efficient translation9, nuclear transport10 and splicing11. The process involves addition of a 7-methylguanosine cap at the 5' triphosphate end of the RNA. RNA capping can be carried out post-transcriptionally using capping enzymes or co-transcriptionally using cap analogs. In the enzymatic method, the mRNA is capped using the Vaccinia virus capping enzyme12,13. The enzyme adds on a 7-methylguanosine cap at the 5' end of the RNA using GTP and S-adenosyl methionine as donors (cap 0 structure). Both methods yield functionally active capped RNA suitable for transfection or other applications14 such as generating viral genomic RNA for reverse-genetic systems15 and crystallographic studies of cap binding proteins such as eIF4E16.
In the method described below, the T7 High Yield RNA Synthesis Kit from NEB is used to synthesize capped and uncapped RNA transcripts of Gaussia luciferase (GLuc) and Cypridina luciferase (CLuc). A portion of the uncapped GLuc RNA is capped using the Vaccinia Capping System (NEB). A linearized plasmid containing the GLuc or CLuc gene and T7 promoter is used as the template DNA. The transcribed RNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity. Capped CLuc RNA is used as the internal control to normalize GLuc expression.

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

This method describes high yield in vitro synthesis of both capped and uncapped mRNA from a linearized plasmid containing the Gaussia luciferase (GLuc) gene. The RNA is purified and a fraction of the uncapped RNA is enzymatically capped using the Vaccinia virus capping enzyme. In the final step, the mRNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity.

HeLa Hücre Transfeksiyon Ardından Gaussia Lusiferaz mRNA in vitro transkripsiyon ve Kapatma yılında

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 protein variants encoded by the var genes.
The haploid P. falciparum genome harbors approximately 60 different var genes of which only one has been believed to be transcribed per cell at a time during the blood stage of the infection. How such mutually exclusive regulation of var gene transcription is achieved is unclear, as is the identification of individual var genes or sub-groups of var genes associated with different receptors and the consequence of differential binding on the clinical outcome of P. falciparum infections. Recently, the mutually exclusive transcription paradigm has been called into doubt by transcription assays based on individual P. falciparum transcript identification in single infected erythrocytic cells using RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis of var gene transcription by the parasite in individual nuclei of P. falciparum IE1.
Here, we present a detailed protocol for carrying out the RNA-FISH methodology for analysis of var gene transcription in single-nuclei of P. falciparum infected human erythrocytes. The method is based on the use of digoxigenin- and biotin- labeled antisense RNA probes using the TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopic analyses and freshly selected P. falciparum IE. The in situ hybridization method can be used to monitor transcription and regulation of a variety of genes expressed during the different stages of the P. falciparum life cycle and is adaptable to other malaria parasite species and other organisms and cell types.

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify mRNA transcripts in individual cells allows analysis of polygenic activity such as the simultaneous transcription of more than one member of the var multigene family in Plasmodium falciparum infected erythrocytes 1. The technique is adaptable and can be used on different types of genes, cells and organisms.

RNA Floresan tarafından Tek hücreli Gen Transkripsiyon Analizi<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridizasyon (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

Tüm Dağı RNA Floresan<em&gt; In situ</emVe&gt; Hibridizasyon<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Marine elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity and have unique mechanisms for osmoregulation 1-3. As the most primitive living jawed-vertebrates with paired appendages, elasmobranchs are an evolutionarily important model, especially for studies in evolution and development. Marine elasmobranchs have also been used to study aquatic toxicology and stress physiology in relationship to climate change 4. Thus, development and adaptation of methodologies is needed to facilitate and expand the use of these primitive vertebrates to multiple biological disciplines. Here I present the successful adaptation of RNA whole mount in situ hybridization and histological techniques to study gene expression and cell histology in elasmobranchs.
Monitoring gene expression is a hallmark tool of developmental biologists, and is widely used to investigate developmental processes 5. RNA whole mount in situ hybridization allows for the visualization and localization of specific gene transcripts in tissues of the developing embryo. The expression pattern of a gene's message can provide insight into what developmental processes and cell fate decisions a gene may control. By comparing the expression pattern of a gene at different developmental stages, insight can be gained into how the role of a gene changes during development.
While whole mount in situ's provides a means to localize gene expression to tissue, histological techniques allow for the identification of differentiated cell types and tissues. Histological stains have varied functions. General stains are used to highlight cell morphology, for example hematoxylin and eosin for general staining of nuclei and cytoplasm, respectively. Other stains can highlight specific cell types. For example, the alcian blue stain reported in this paper is a widely used cationic stain to identify mucosaccharides. Staining of the digestive tract with alcian blue can identify the distribution of goblet cells that produce mucosaccharides. Variations in mucosaccharide constituents on short peptides distinguish goblet cells by function within the digestive tract 6. By using RNA whole mount in situ's and histochemical methods concurrently, cell fate decisions can be linked to gene-specific expression.
Although RNA in situ's and histochemistry are widely used by researchers, their adaptation and use in marine elasmobranchs have met limited and varied success. Here I present protocols developed for elasmobranchs and used on a regular basis in my laboratory. Although further modification of the RNA in situ's hybridization method may be needed to adapt to different species, the protocols described here provide a strong starting point for researchers wanting to adapt the use of marine elasmobranchs to their scientific inquiries.

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

By combining methods for RNA whole mount in situ hybridization and histology, gene expression can be linked with cell fate decisions in the developing embryo. These methods have been adapted to marine elasmobranchs and facilitate the use of these animals as model organisms for biomedical, toxicology and comparative studies.

RNA<em&gt; Yerinde</emTüm Dağı Embriyolar ve Hücre histolojisi&gt; Hibridizasyon Deniz Elasmobranchs İçin Uyarlanmış

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Floresan kullanarak mRNA Moleküllerin Görselleştirme ve Analiz<em&gt; Yerinde</emIn&gt; Hibridizasyon<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in cytogenetics and cancer diagnostics, and can detect aberrations of the genome, which often has important clinical implications. RNA FISH can be used to detect RNA molecules in cells and has provided important insights in regulation of gene expression. Combining DNA and RNA FISH within the same cell is technically challenging, as conditions suitable for DNA FISH might be too harsh for fragile, single stranded RNA molecules. We here present an easily applicable protocol which enables the combined, simultaneous detection of Xist RNA and DNA encoded by the X chromosomes. This combined DNA-RNA FISH protocol can likely be applied to other systems where both RNA and DNA need to be detected.

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization FISH to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) allows the detection of nucleic acids in their native environment within cells. We here describe a protocol for the combined, simultaneous detection of RNA and DNA by means of FISH, which can be used to study X chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells.

Kombine DNA-RNA Floresan<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizasyon (FISH) Farklılaştırılmış Kadın Fare Embriyonik Kök Hücreleri X kromozomu inaktivasyonu Eğitim için

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in ...

Quick Fluorescent In Situ Hybridization Protocol for Xist RNA Combined with Immunofluorescence of Histone Modification in X-chromosome Inactivation

Combining RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) with immunofluorescence (immuno-FISH) creates a technique that can be employed at the single cell level to detect the spatial dynamics of RNA localization with simultaneous insight into the localization of proteins, epigenetic modifications and other details which can be highlighted by immunofluorescence. X-chromosome inactivation is a paradigm for long non-coding RNA (lncRNA)-mediated gene silencing. X-inactive specific transcript (Xist) lncRNA accumulation (called an Xist cloud) on one of the two X-chromosomes in mammalian females is a critical step to initiate X-chromosome inactivation. Xist RNA directly or indirectly interacts with various chromatin-modifying enzymes and introduces distinct epigenetic landscapes to the inactive X-chromosome (Xi). One known epigenetic hallmark of the Xi is the Histone H3 trimethyl-lysine 27 (H3K27me3) modification. Here, we describe a simple and quick immuno-FISH protocol for detecting Xist RNA using RNA FISH with multiple oligonucleotide probes coupled with immunofluorescence of H3K27me3 to examine the localization of Xist RNA and associated epigenetic modifications. Using oligonucleotide probes results in a shorter incubation time and more sensitive detection of Xist RNA compared to in vitro transcribed RNA probes (riboprobes). This protocol provides a powerful tool for understanding the dynamics of lncRNAs and its associated epigenetic modification, chromatin structure, nuclear organization and transcriptional regulation.

Quick Fluorescent In Situ Hybridization Protocol for Xist RNA Combined with Immunofluorescence of Histone Modification in X-chromosome Inactivation

We developed an easily customized strand-specific fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol combined with immunofluorescence. This allows for a detailed examination of RNA dynamics with simultaneous insight into the chromatin structure, nuclear organization, and transcriptional regulation at the single cell level.

Hızlı Floresan<em&gt; In Situ</emX-kromozomu İnaktivasyonu içinde histon Modifikasyon İmmünofloresan ile Xist RNA Kombine için&gt; Hibridizasyon Protokolü

Combining RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) with immunofluorescence (immuno-FISH) creates a technique that can be employed at the single cell ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly effective at mapping highly repetitive sequences to heterochromatic regions, where computational approaches face prohibitive challenges. Here we describe a streamlined protocol for DNA ISH that circumvents formamide washes that are standard steps in other DNA ISH protocols. Our protocol is optimized for hybridization with short single strand DNA probes that carry fluorescent dyes, which effectively mark repetitive DNA sequences within heterochromatic chromosomal regions across a number of different insect tissue types. However, applications may be extended to use with larger probes and visualization of single copy (non-repetitive) DNA sequences. We demonstrate this method by mapping several different repetitive sequences to squashed chromosomes from Drosophila melanogaster neural cells and Nasonia vitripennis spermatocytes. We show hybridization patterns for both small, commercially synthesized probes and for a larger probe for comparison. This procedure uses simple laboratory supplies and reagents, and is ideal for investigators who have little experience with performing DNA ISH.

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

Floresan DNA için Basit Bir Yöntem<em&gt; In Situ</em&gt; Ezilmiş Kromozomlar için Hibridizasyon

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression regulation at posttranscriptional levels by affecting the stability and translational efficiency of target mRNAs. RNA pull-down technique has been widely used to study RNA-protein interaction, which is necessary to elucidate the mechanism underlying RBPs&#39; as well as long non-coding RNAs&#39; (lncRNAs) function. However, the high lipid abundance in adipocytes poses a technical challenge in conducting this experiment. Here a detailed RNA pull-down protocol is optimized for primary adipocyte culture. An RNA fragment from androgen receptor&#39;s (AR) 3&#39; untranslated region (3&#39;UTR) containing an adenylate-uridylate-rich elementwas used as an example to demonstrate how to retrieve its RBP partner, HuR protein, from adipocyte lystate. The method described here can be applied to detect the interactions between RBPs and noncoding RNAs, as well as between RBPs and coding RNAs.

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

An RNA pull-down protocol is optimized here for detection of interactions between RNA-binding proteins (RBPs) and noncoding as well as coding RNAs. An RNA fragment from androgen receptor (AR) was used as an example to demonstrate how to retrieve its RBP from lystate of primary brown adipocytes.

RNA bağlama proteinlerinin tespiti ile<em&gt; İn Vitro</emAdiposit Kültür&gt; RNA pull-down

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...