Yazarlar tarafından gerçekleştirilen araştırma kısmen hibe Avrupa Birliği Yedinci Çerçeve Programı (FP7/2007-2013) hibe Sözleşmesi No 229239 altında ve araştırmacı araştırma ortak araştırma programı akut AO Vakfı tarafından desteklenmiştir Kıkırdak yaralanma/lezyon/kusur (CRP acı) proje Bioactive altında ve Biomimetic iskele kıkırdak rejenerasyon (BIOCART) için.

1. kendi kendine montaj peptid İskele yapısı-İskele (SAP) hazırlık
<ol><li>Peptid RAD16% 0.5 çözeltisi hazırlamak-ı %20 (w/v) sükroz, bir mikro-santrifüj tüpü. Solüsyon içeren bir ultrasonik banyo maksimum güç ve oda sıcaklığında (RT homojen karıştırma sağlamak için) 20 dk peptid üçün temizleyicide. Not: Hazır olmak için çözüm hacmi istenen encapsulations sayısına bağlı olacaktır. RAD16-ben peptidler bozulma bu sonication koşullar altında acı değil.</li>
	<li>Adım %1.1 10 (w/v) sükroz gerekli hacmi ile istenen son konsantrasyonu elde etmek için hazırlanan peptid çözüm sulandırmak. Not: son matris sertlik bu parametreye bağlıdır beri ilk peptid konsantrasyon düzeltilmesi dikkate alınması gereken önemli bir faktör olduğunu. RAD16-ben peptid çözüm 2 x daha 3D yapı istenen son konsantrasyonu konsantre olmalıdır. Normalde, son RAD16-ben kullanılan peptid konsantrasyonları vardır 0,15-0,5 arasında % (w/v).</li>
	<li>RT homojen karıştırma sağlamak için 20 dk ultrasonik bir banyo içine peptid solüsyon içeren mikro-santrifüj tüpü yerleştirin. Not: Peptid çözüm hemen, kullanılmayan 4 ° C'de birkaç ay saklanabilir</li>
</ol>2. hücre süspansiyon hazırlama
<ol><li>(Tripsin tedavi sonrası elde edilen) hücre süspansiyon 60 x g ve RT için 5 dk santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Bir vakum hattına bağlı bir Pasteur pipet kullanarak süpernatant kaldırmak ve 3-5 mL % 10 (w/v) sükroz bir micropipette kullanarak hücre Pelet askıya. El ile veya otomatik hücre sayaç hücreleri saymak için devam edin. Not: Hücre bakım için izin verir ve peptid jelleşme karıştırma işlemi sırasında önler bir izotonik ve non-iyonik orta % 10 (w/v) sükroz çözümdür.</li>
	<li>Hücre süspansiyon 60 x g ve RT 5 dk. Kaldır süpernatant santrifüj kapasitesi ve hücre Pelet tekrar çift istenen son hücre konsantrasyonu elde etmek için % 10 (w/v) sükroz gerekli hacmindeki askıya alma (tavsiye yaklaşık 4 x 106 hücreler / mL).</li>
	<li>Doku kültürü ekler istenilen bir dizi her şey bir 6-şey plaka (kapsülleme başına bir INSERT) yerleştirin.</li>
	<li>Adım 1-maksimum güç ve RT 5 min için hazırlanan peptid çözüm solüsyon içeren temizleyicide.</li>
	<li>Pipet ve ilave hacminin yaklaşık % 10-15 standart bir mikro-santrifüj tüpüne istenen her Kapsülleme için (2.3 içinde elde edilen) hücre süspansiyon 40 µL yerleştirin.</li>
</ol>3. 3D Cep Encapsulation SAP içine
<ol><li>RAD16 eşit bir hacmi mix-ben % 10 sukroz (w/v) (kapsülleme başına 40 µL) eşit bir birimdeki hücre süspansiyon (kapsülleme başına 40 µL), 2. adımda bir süspansiyon hücre istenen peptid konsantrasyon (içinde % 10 sükroz) elde etmek için hazırlanan çözümde. Yavaş yavaş yukarı ve aşağı yaklaşık 10 kat pipetting tarafından karıştırın. Karıştırma sırasında kabarcık oluşumu kaçının. Not: Bu adım önemlidir ve hücreleri düşük pH peptid (yaklaşık 3.5-4.0) nedeniyle düşmanca koşullarında olduğundan çok dikkatli bir şekilde gerçekleştirilmesi gerekir.</li>
	<li>Bir micropipette kullanarak, dikkatle süspansiyon 80 µL her sokmak içine yükleyin.</li>
	<li>Kültür ortamının 0.5 mL ıslak Ekle membran, medya difüzyon peptid kendinden montajlı tanıtmak izin ve hidrojel oluşumu iyi altýna ekleyin. Yaklaşık 20 dk akış kabine için jel peptid izin. Not: zaman ayarı sırasında örnekleri manipülasyon jel kırılma içinde sonunda olabilir.</li>
	<li>Çok yavaş orta 40 µL Ekle'nin üzerine ekleyin ve izin için jel iç duvar kaydırın. Not: Normalde 20-30 s arasında bir hız bu birim yükleme almalıdır.</li>
	<li>Plaka 20 dk için kuluçka makinesi (37 ° C, % 5 CO2, oksijen atmosfer) yerleştirin. Bu adım ve art arda gelen orta eklemeler sukroz ve denge kültür ortamı içeren hücrelerin leaching lehine.</li>
	<li>60 µL orta duvar akış izin Ekle, iç duvar ekleyin. Sükroz içinde zengin olan şey, orta Aspire edin ve taze orta 0.5 mL ekleyin.</li>
	<li>Orta 60 µL yavaş Ekle'nin üzerine ekleyin ve 10 dakika için kuluçka makinesi (37 ° C, % 5 CO2, oksijen atmosfer) plaka yer.</li>
	<li>İyi orta Aspire edin ve 2.5 mL taze orta kuyunun içine ekleyin. Orta 200 µL sokmak içine ekleyin. Kuluçka (37 ° C, % 5 CO2, oksijen atmosfer) uygun koşullar altında hücreleri korumak için plaka yerleştirin.</li>
	<li>Orta her gün değiştirin. Eski orta kuyu dibinden kaldırın. 2,5 mL taze orta iyi ve 200 µL eklemek için ekleyin. Not: hücre farklılaşması devam ederse, belirli ikna medya istenen hücre türü taahhüt (bkz. aşağıda, farklılaşma hücre) sonuçlanan kültürler, eklenir.</li>
</ol>4. hücre canlılığı 3D-sap içinde
<ol> <li>Not: Hücre canlılığı tahlil canlı/ölü bilinir — canlılığı/sitotoksisite tahlil de.</li>
	<li>Bir 15 mL Tüp, 2 µM calcein AM ve 2 taze bir çözüm gerekli hacmi hazırlamak µM arasında etidyum homodimer-1 (EthD-1) PBS tarafından vortexing için 10 s. almak içinde belgili tanımlık karanlık. Not: aşağıdaki göre iyi boyutu her örnek için kullanılacak birim bağlıdır: 6-multiwell plaka; her şey için 2 mL 1 mL her biri için 12-multiwell plaka ve her şey bir 24-multiwell plaka için 0.5 mL de.</li>
	<li>Bir micropipette kullanarak, 3D-sap örnekleri 3 kez PBS 2 mL ile durulayın ve sonra 4.1. adımda hazırlanan solüsyona ile kapağı. Karanlıkta 40 min için RT kuluçkaya.</li>
	<li>Bir micropipette kullanarak, yapıları PBS 5 kez 2 mL ile yıkayın.</li>
	<li>10 X-20 X büyütme kullanarak bir floresan mikroskop altında örnekleri görselleştirin.</li>
</ol>5. hücre farklılaşması
<ol><li>Kültür (37 ° C, % 5 CO2, oksijen atmosfer) içinde kondrosit bazal Orta (CBM) içeren hücreler büyüme tamamlar. Not: Orta hazırlanması üreticilerin yönergeleri (bkz: Malzemeler tablo) açıklanmıştır.</li>
	<li>Chondrogenic orta içeren rekombinant insan dönüştürme büyüme faktörü-b1 [TGFb1] ile günde 2 hücre farklılaşması teşvik (10 ng/mL), L-askorbik asit 2-fosfat [AA2P] (25 µg/mL) ve deksametazon (100 nM).</li>
	<li>4 hafta içinde 37 ° C ve % 5 CO2oksijen atmosfere sahip bir kuluçka için kültürü korumak. Chondrogenic orta her gün değiştirin.</li>
</ol>6. toluidin Blue (TB) boyama
<ol><li>3D-SAP kültürler ekleme ve PBS 2 mL bir micropipette ile kaldırma tarafından iki kez yıkayın. %2 (w/v) p2 mL ekleyerek düzeltmek-RT. 2 h için PBS içinde formaldehit</li>
	<li>İki kez 2 mL % 0,1 Triton X-100 PBS (PBST) yıkayın.</li>
	<li>2 mL % 0.05 TB için 20 dk RT. az suda ile kuluçkaya</li>
	<li>Kaldırıldı PBS çözüm temizlenene kadar birkaç kez (en az 3 kez) PBS 2 mL ile yıkayın.</li>
	<li>Bir stereoskopik mikroskop11,13,14altında görsel denetim tarafından örnekleri analiz. Not: TB kompleksler oluşturur gibi proteoglikanlar (PG) ve glikozaminoglikan (GAG), hücre dışı matriks, anyonik glycoconjugates ile hangi esas olarak salgılanan kondrosit benzeri hücreleri tarafından. Olumlu örnekleri mavi lekeli.</li>
</ol>7. Western Blot
Not: Bu protokol için kullanılan yordam önceden başvuru11' de tanımlanmıştır.
<ol><li>3D-yapıları RIPA arabellek içeren proteaz inhibitörü kokteyl içinde pipetting tarafından parçalayıcı.</li>
	<li>Akrilamid jel jel-hacim gereksinimleri (teçhizatın belirli jel çalışan) göre hazırlamak ve 150 V16, hücre lysates 90 dk için çalıştırın. Not: Akrilamid jel genellikle bir konsantrasyon bağlı olarak protein molekül ağırlığı (w/v), % 7.5-10 adlı hazırlanmıştır.</li>
	<li>40 RT. 2 h V uygulayarak jel içine polivinilidin difluoride (PVDF) membran bulunan proteinler transfer</li>
	<li>Membran kapak için yeterli hacim ile ayrı bir kapta RT, PVDF membran engelleme arabelleği (%4 (w/v) yağsız süt tozu PBST içinde) 2 h için kuluçkaya.</li>
	<li>1 mg/mL PBST son bir konsantrasyon, birincil antikorlar ile 1 h için RT, membran kuluçkaya. Malzemeler tabloyabakın.</li>
	<li>İkincil antikorlar bir konsantrasyonu 1 mg/ml ekleyin. Malzemeler tablobakın.</li>
	<li>Membran Chemiluminescent substrat16ile hP algılama için hazır olun. Malzemeler tabloyabakın.</li>
	<li>Chemiluminescent görüntüleri16al.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Aggeli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responsive+gels+formed+by+the+spontaneous+self-assembly+of+peptide+into+polymeric+&#946;-sheet+tapes.">Responsive gels formed by the spontaneous self-assembly of peptide into polymeric &#946;-sheet tapes.</a> Nature. 386, 259-262 (1997).</li><li>Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+we+build+artificial+stem+cell+compartments?.">Can we build artificial stem cell compartments?.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 3, 164-169 (2003).</li><li>Kisiday, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembling+peptide+hydrogel+fosters+chondrocyte+extracellular+matrix+production+and+cell+division:+implications+for+cartilage+tissue+repair.">Self-assembling peptide hydrogel fosters chondrocyte extracellular matrix production and cell division: implications for cartilage tissue repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 99, 9996-10001 (2002).</li><li>Narmoneva, D. A., Vukmirovic, R., Davis, M. E., Kamm, R. D., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+promote+cardiac+myocyte+survival+and+spatial+reorganization:+implications+for+cardiac+regeneration.">Endothelial cells promote cardiac myocyte survival and spatial reorganization: implications for cardiac regeneration.</a> Circulation. 110, 962-968 (2004).</li><li>Genov&#233;, E., Shen, C., Zhang, S., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+functionalized+self-assembling+peptide+scaffolds+on+human+aortic+endothelial+cell+function.">The effect of functionalized self-assembling peptide scaffolds on human aortic endothelial cell function.</a> Biomaterials. 26, 3341-3351 (2005).</li><li>Garreta, E., Genov&#233;, E., Borr&#243;s, S., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteogenic+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+and+mouse+embryonic+fibroblasts+in+a+three-dimensional+self-assembling+peptide+scaffold.">Osteogenic differentiation of mouse embryonic stem cells and mouse embryonic fibroblasts in a three-dimensional self-assembling peptide scaffold.</a> Tissue Engineering. 12, 2215-2228 (2006).</li><li>Sieminski, A. L., Semino, C. E., Gong, H., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+sequence+of+ionic+self-assembling+peptide+gels+affects+endothelial+cell+adhesion+and+capillary+morphogenesis.">Primary sequence of ionic self-assembling peptide gels affects endothelial cell adhesion and capillary morphogenesis.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 87 (2), 494-504 (2008).</li><li>Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembling+peptides:+from+bio-inspired+materials+to+bone+regeneration.">Self-assembling peptides: from bio-inspired materials to bone regeneration.</a> Journal of Dental Research. 87 (2008), 606-616 (2008).</li><li>Hern&#225;ndez Vera, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interstitial+fluid+flow+intensity+modulates+endothelial+sprouting+in+restricted+Src-activated+cell+clusters+during+capillary+morphogenesis.">Interstitial fluid flow intensity modulates endothelial sprouting in restricted Src-activated cell clusters during capillary morphogenesis.</a> Tissue Engineering Part A. 15 (1), 175-185 (2009).</li><li>Castells-Sala, C., Mart&#237;nez-Ramos, C., Vall&#233;s-Lluch, A., Monle&#243;n Pradas, M., Semino, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+development+of+bioimplants+made+up+of+elastomeric+scaffolds+with+peptide+gel+filling+seeded+with+human+subcutaneous+adipose+tissue-derived+progenitor+cells.">In vitro development of bioimplants made up of elastomeric scaffolds with peptide gel filling seeded with human subcutaneous adipose tissue-derived progenitor cells.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (11), 3419-3430 (2015).</li><li>Recha-Sancho, L., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparin-based+self-assembling+peptide+scaffold+reestablish+chondrogenic+phenotype+of+expanded+de-differentiated+human+chondrocytes.">Heparin-based self-assembling peptide scaffold reestablish chondrogenic phenotype of expanded de-differentiated human chondrocytes.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (7), 1694-1706 (2016).</li><li>Bussmann, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrogenic+potential+of+human+dermal+fibroblasts+in+a+contractile,+soft,+self-assembling,+peptide+hydrogel.">Chondrogenic potential of human dermal fibroblasts in a contractile, soft, self-assembling, peptide hydrogel.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 10 (2), E54-E62 (2016).</li><li>Recha-Sancho, L., Moutos, F. T., Abell&#224;, J., Guilak, F., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dedifferentiated+Human+Articular+Chondrocytes+Redifferentiate+to+a+Cartilage-Like+Tissue+Phenotype+in+a+Poly+(&#949;-Caprolactone)/Self-Assembling+Peptide+Composite+Scaffold.">Dedifferentiated Human Articular Chondrocytes Redifferentiate to a Cartilage-Like Tissue Phenotype in a Poly (&#949;-Caprolactone)/Self-Assembling Peptide Composite Scaffold.</a> Materials. 9 (6), 472 (2016).</li><li>Recha-Sancho, L., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondroitin+Sulfate+and+Decorin+based+self-assembling+scaffolds+for+cartilage+tissue+engineering.">Chondroitin Sulfate and Decorin based self-assembling scaffolds for cartilage tissue engineering.</a> PlosOne. 11 (6), e0157603 (2016).</li><li>Aloy-Revert&#233;, C., Moreno-Amador, J. L., Nacher, M., Montanya, E., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+RGD-Functionalized+Sandwich+Cultures+to+Promote+Redifferentiation+of+Human+Pancreatic+Beta+Cells+After+In+Vitro+Expansion.">Use of RGD-Functionalized Sandwich Cultures to Promote Redifferentiation of Human Pancreatic Beta Cells After In Vitro Expansion.</a> Tissue Engineering Part A. , (2017).</li><li>Kurien, B. T., Scofield, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+blotting+and+detection.">Protein blotting and detection.</a> Methods in Molecular Biology. 536, (2009).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Daha önce bizim grup ve diğerleri farklı hücre sistemleri3,4,5,6,7,8 ile üç boyutlu (3D) kültür platformlar kullanımını tarif var ,9,10,11,12,13,14,15. Mevcut çalışma, biz kolay ve güvenilir bir yöntem tarif 3D kültür elde memeli hücreleri işlevsel hücre, embriyonik veya yetişkinlere yönelik her türlü dahil olmak üzere herhangi bir türü için geçerli olan sistemleri kök hücre veya sonunda, üzerinden işlevsel olmayan hücreleri izole Biyopsi veya tümörler ve benzeri. Kök hücreler embriyonik veya yetişkin kökeni ise buna ek olarak, bağımsız olarak, onlar daha iyi lineage bağlılık kapasitesi klasik 2D kültür yemekleri10,11,123D ortamda olurdu, 13,14,15. Bu nedenle, bu sistemi hücre kültüründe farklılaşma için farklı uygulamalardan Onarıcı veya rejeneratif Biyomedikal toksikolojik ve farmakolojik platformları için kullanılabilir gibi fonksiyonel doku benzeri yapılar yol açacak.
Hücresel microenvironment matris yapısı ve biyomekanik, Biyofizik ve biyolojik parametreler açısından doğal dokuların benzer çünkü hücre işlevinde bir net kazanç göstermiştir. Sistem daha karmaşık hale geldikçe, yine de, olması gereken parametre sayısı da artar, hangi (kütle transferi olayları ilişkili sorunları önlemek için etkin perfüzyon sistemi gibi bir harici destek platformu ihtiyacını içerir düzenlenir ). Üç boyutlu kültürlü hücreleri geçiş, yayılması ve farklılaşma gibi temel faaliyetleri düzenleyen açısından daha iyi performans. Onlar karmaşık ağları tarafından çok büyüyen ve 3D ayırt önemli bir sonucu olduğu gelişmiş hücresel crosstalk, izin formu. SAPS aslında koşulları vitro bu hücre dışı matriks proteinleri temsil eder (büyüme faktörü, polisakkarit veya sinyal iskele için eklenen her bileşen için bir avantaj etkisi rasyonel bir çalışma beri üretilen benzer oluşturabilirsiniz peptid) kolayca yürütülen.
Kollajen yazın ben ve Matrigel, gibi diğer doğal iskele için karşılaştırıldığında SAP kullanımı net avantajları şunlardır: 1) sap olduğunu sentetik bir biomaterial en az çeşitlemesiyle toplu iş toplu üretim; 2) SAP belirli peptit motiflerle functionalized kapasitesine sahip; ve 3) SAP hediye biodegradability vitrozamanla aynı Biyofizik, biyomekanik ve yapısal özelliklere sahip yapı 3D bakım izin verir, düşük. Ancak, karşı diğer kullanma sınırlaması SAPS iskele hücreleri düşük pH nedeniyle düşman ortamında nerede kapsülleme adımı sırasında bulundu. Bu nedenle, bu tarif yöntembilim kritik bir adımdır. Ayrıca, herhangi bir deneme başlamadan önce her belirli hücre türü için SAP toplama ayarlamak önemlidir. Bu, aslında, her belirli hücre türü en iyi biyomekanik büyüme koşullar sunacak bu yana hücreleri üzerine veya içine bu Biyomalzeme kültürlü zaman önemlidir.
Son olarak, biz geliştirme ve üretim, bu tip biomaterial iskele daha iyi tedavi yaklaşımları geliştirmek için ilaç endüstrisi yardımcı olmak için daha fizyolojik ve güvenilir 3D doku modelleri gelişimi artıracak inanıyorum rejeneratif tıp, kanser ya da herhangi bir tıbbi tedavi.

Uzun yıllar memeli hücre kültür deneysel koşullarda fizyolojik olmayan yönleri ne olursa olsun pratik ve ekonomik sorunlar nedeniyle klasik iki boyutlu (2D) kültür sistemleri kullanılarak yapılmıştır. Her ne kadar bu kültür sistemi çalışma ve en moleküler ve hücresel mekanizmaları anlamak için yardımcı olur, bugün yeni hücre kültür paradigmalar daha karmaşık hücresel sistemleri çalışmaya ihtiyaç vardır biliyorum. Bu nedenle, üç boyutlu (3D) kültür olduğunu biophysically, biomechanically bir microenvironment yeniden oluşturmak için gerekli ve biyolojik olarak daha benzer doğal dokuların sistemlerdir. Çalışmanın yeni bir modeli temsil ettikleri bu yana son yıllarda 3D kültür sistemleri, genel olarak, araştırmacılar ve sanayi arasında daha yaygın hale gelmiştir veya hangi hücrelerin uzayda büyümek, hücre hücre oluşturmak veya hücre matris etkileşimleri eleme, göç ve sonunda belirli hücre soy ayırt etmek.
Bu metodoloji genel amacı için in vivo microenvironment daha yakın bir vitro hücresel microenvironment yeniden sağlamaktır. Özellikle, sentetik kendi kendine montaj peptid iskele (SAP) biomaterial benzersiz özelliklere sahip bir türüdür; nanometre boyutunda gözenekleri peptidler mekanik ve yapısal özellikleri ile arasındaki zayıf etkileşimler benzer bu doğal hücre dışı Matrislerin yapılmış bir ağ oluşturur. Başka bir deyişle, bu malzeme kullanımı arkasında rasyonellik olduğunu bu gerçekten 3D-ortam oluşturur sözde-3D doku veya organ birimleri elde etmek için idealdir. Ancak, en önemlisi, 3D içerik 3D yapısı desenlendirme için doku mimarisi, kütle transferi olaylar, ilgili özellik hücre gibi 2D kültür platformlarında, normalde bulunmayan yeni biyolojik işlevleri elde etmek için izin verir ve sonunda doku morfogenez, gelecekteki araştırma ve geliştirme fonksiyonel doku ve organları1,2anahtar faktörlerdir. Ayrıca, onlar oda sıcaklığında çok kararlı ve post-prodüksiyon, dağıtım veya depolama3,4, için özel koşullar gerektirmez SAP doğal karşılıkları (kollajen, Matrigel) üzerinde bir avantaj olduğunu 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. sap, istendiği takdirde; kolay 3D jelleri sadece iyonik gücü arttırarak veya tarafsızlık1,2pH ayarlama tarafından elde edilebilir. Son olarak, burada açıklanan metodoloji bakım, büyüme ve farklılaşma hücre tipleri, kondrosit, hepatositlerin, endotel hücreleri, dokusunu, nöronal hücre de dahil olmak üzere bir dizi tanıtmak için yaygın olarak kullanılan vitro oldu embriyonik ve somatik kök hücre3,4,5,6,7,8,9,10, 11 , 12 , 13 , 14 , 15. mevcut çalışma, biz insan genişletilmiş artiküler kondrosit (hACh) yukarıda açıklanan11olarak kıkırdak benzeri doku içine ayırt etmek için 3D-kültür sistemi nasıl kullanılacağını açıklar.
Burada, kültür hücrelere bir 3D sisteminde SAP kullanarak bir yöntemi açıklanmıştır. Bu sentetik biomaterial, hücreleri ilk hücrelerin etrafındaki nanometric boyutlarının bir ağ oluşturma ve bu nedenle gerçekten 3D çevre (Şekil 1) oluşturma daha sonra kendi kendine bir araya indüklenen bir peptid çözüm ile karıştırılır. Hücresel davranış (Yani, yayılması, geçiş ve farklılaşma) matris sertlik değerleri tarafından etkilenir dikkate almak önemlidir. Bu nedenle, kültür hücreleri aynı sertlik değerleri (iki boyutlu kültür) ile peptid iskele üzerine ortak bir metodolojik kontrol etmektir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="888">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:371px;">Human articular chondrocytes (Ach)</td>
			<td style="width:127px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">CC-2550</td>
			<td style="width:271px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RAD16-I peptide solution (PuraMatrix)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sucrose (tissue culture grade)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cell culture inserts (0.4 &#181;m pore, 12 mm diameter)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PICM01250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Chondrocyte Basal Medium (CBM)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">SingleQuots of Growth Supplements</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-4409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>DE14-801F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-ascorbic acid 2-phosphate (AA2P)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Human transforming growth factor-&#946;1 (TGF-&#946;1)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GF111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:371px;">RIPA buffer</td>
			<td style="width:127px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">R0278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC 2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:371px;">SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-Actin</td>
			<td>SCBT</td>
			<td>sc-1615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-Collagen I</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab138492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-Collagen II</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab3092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;">Anti-Collagen X</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab182563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Antigoat IgG-HRP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;">Anti-mouse IgG-HRP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Anti-rabbit IgG-HRP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97051</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing mammalian cells in three-dimensional peptide scaffolds

Bir kendi kendine montaj nanofiber üç boyutlu (3D) iskele hücrelerde kültür yararlı bir yöntem açıklanır. Bu kültür sistemi yakından sigara polarize doku yapısal özelliklerini taklit eden bir ortam yeniden oluşturur. Ayrıca, iskele belirli iç nanofiber yapısını şeffaf mikroskobu altında örnek kolay görüntüleme için sağlar görsel ışık yapar. Bu avantaj özel boyalar veya probları ile boyama tarafından hücre göç, organizasyon, nükleer silahların yayılmasına karşı ve farklılaşma ve böylece herhangi bir belirli hücresel işlevlerine gelişimi çalışmaya büyük ölçüde kullanıldı. Ayrıca, bu çalışmada, biz kolayca genişletilmiş insan artiküler kondrosit redifferentiation kıkırdak dokusuna eğitim için bu sistem iyi bir performans tanımlamak. Hücreleri kendi kendini peptid iskele montaj kapsüllenir ve chondrogenesis tanıtmak için belirli koşullar altında kültürlü. Üç boyutlu kültürleri iyi canlılık sırasında 4 hafta deneme gösterdi. Beklendiği gibi örnekleri chondrogenic indükleyicileri (sigara kaynaklı kontrollere göre) ile kültürlü (ki son derece kıkırdak hücre dışı matriks içinde bulunan glikozaminoglikan (GAG) lekeleri) toluidin blue için güçlü pozitif lekeli ve ifade kollajen dahil olmak üzere belirli moleküler işaretleyiciler tip ı, II ve X, Western Blot analizine göre. Bu iletişim kuralı basit-e doğru yapmak ve araştırma laboratuvarlarında, sanayi ve laboratuvar dersleri eğitim amaçlı kullanılabilir.

Mevcut çalışma, kültür hücreleri SAP kullanarak 3D basit ve hızlı bir iletişim kuralına güvenilir nitel ve nicel veri elde etmek için tanımlanır. SAP kültürlü hücreleri hücre bakım, yayılması ve/veya farklılaşma3,4,5,6 devam etmek için istenen koşullar altında izin benzersiz özelliklere sahip bir 3D microenvironment oluşturur , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12. grubumuz, çeşitli çalışmalarda insan Yağ dokusundan elde edilen progenitör hücreler (hAPC), genişletilmiş insan artiküler kondrosit (hACh) ve insan normal dermal fibroblastlar (hNDF) kültürü için kullanılarak yapılır, genişletin ve bunları içine ayırt kıkırdak benzeri doku10,11,12. Burada, biz 3D kültür ve genişletilmiş hACh yeniden farklılaşma kıkırdak benzeri doku, içine daha önce açıklanan11açıklanmaktadır. Bu nedenle, 3D-SAP hücrelerde saklanması ve onları chondrogenic indüksiyon ortamı, Şekil 1 ' deki (ve protokol) anlatılan kültür. 24 saat sonra örnekleri canlılığı ile canlı/ölü canlılığı/sitotoksisite tahlil için değerlendirildi. Sonuçlar birkaç yüzde hücrelerinin öldüğünü gösterir (kırmızı) kapsüllemenin ve neredeyse hiç ölü hücreleri Kültür (Şekil 2) 4 hafta sonra gözlendi 5 gün sonra. Daha sonra onları yöntemi boyama mavi toluidin kullanarak hücre dışı matriks, glikozaminoglikan (GAG) ifade için lekeli. Beklendiği gibi indüksiyon grup düzgün tedavi için güçlü (Şekil 2) boyama gösterilen yanıt verdi.
Son olarak, kollajen dahil olmak üzere chondrogenesis ve hipertrofisi işaretlerinin moleküler işaretleyiciler tip ı, II ve X, Batı leke (Şekil 3) tarafından analiz edildi. Ben (COL1) 2D ve 3D sistemleri ama ~ 130 kDa (hücre dışı matriks monte edilebilir için işlenmiş olgun COL1 protein temsil eden) bir alt grup gözlendi kollajen türü yalnızca 3D gözlendi. Bu sonuç açıkça farklılaşma üç boyutlu gören hücreleri daha fizyolojik bir şekilde devam gösterir. Dikkat çekici, kollajen tip II (COL2) - hücre dışı matriks - sadece 3D yapıları chondrogenic koşullar altında kültürlü içinde beklenen molekül ağırlığı yok tek bir bant olarak algılandı. Son olarak, kollajen tür X (COL10) tespit hem 2D hem de 3D yapıları chondrogenic koşullarda, kültürlü bir dereceye hipertrofisi kültür 4 hafta sonra gösteren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57259/57259fig1v2.jpg"> Şekil 1: 3D-SAP içine hücre kapsüllemenin şematik Gösterim. HACh kapsüllemenin şematik Gösterim rasgele 3D-sap içinde dağınık hücreleri elde etmek için tanımlanır. 1. kendi kendine peptid İskele yapısı-İskele (SAP) hazırlık; montaj 2. hücre süspansiyon hazırlama; ve 3. 3D-hücre encapsulation SAP içine. Şematik sadece adımları 3.1-3.4 gösterdiğine dikkat edin.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57259/57259fig2.jpg"> Şekil 2: hücre performans ve chondrogenic farklılaşma 3D-SAP kültürlerde. Hücre boyama canlılık 5 gün ve floresan mikroskop (canlı hücrelerde kırmızı yeşil ve ölü hücreleri) altında tespit kültür 4 hafta gerçekleştirilen. Ölçek Bar = 200 µm. genel chondrogenesis taahhüt toluidin blue boyama (sülfürlü glikozaminoglikan mavi) 3D-SAP yapıları kültürlü, denetim ve chondrogenic medya tarafından değerlendirildi. Ölçek çubukları 500 µm =. Bu rakam L. Recha-Sancho ve ark. değiştirildi 11. <a href="/files/ftp_upload/57259/57259fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57259/57259fig3.jpg"> Şekil 3: kollajen ı, II ve X ifade chondrogenesis geçiren hACh. 4 hafta içinde chondrogenic medya ve denetimleri kollajen ifade için değerlendirildi sonra 2D monolayer ve 3D-SAP kültürlü hACh tip ı (COL1), kollajen tip II (COL2) ve kollajen türü X (COL10). Aktin ifade bir iç denetimi olarak kullanıldı. Bu rakam L. Recha-Sancho ve ark. değiştirildi 11. <a href="/files/ftp_upload/57259/57259fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds at JoVE.com

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

Üç boyutlu peptid iskele memeli hücrelerinde kültür

Burada, kendi kendine dediferansiye insan artiküler kondrosit farklılaşma kıkırdak benzeri doku içine tanıtmak için peptid iskele montaj içinde 3D-kültür sistemleri elde etmek için bir iletişim kuralı mevcut.

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

culturing-mammalian-cells-in-three-dimensional-peptide-scaffolds

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.1K Görüntüleme.  Ramon Llull University. Burada, kendi kendine dediferansiye insan artiküler kondrosit farklılaşma kıkırdak benzeri doku içine tanıtmak için peptid iskele montaj içinde 3D-kültür sistemleri elde etmek için bir iletişim kuralı mevcut.

Video: Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

Üç boyutlu optik çözünürlük foto akustik Mikroskopi

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Biyomühendislik

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical devices1-3. In this paper, we focus on one- (1D), two- (2D), and three-dimensional (3D) printing of conductive metallic inks in the form of flexible, stretchable, and spanning microelectrodes.
Direct-write assembly4,5 is a 1-to-3D printing technique that enables the fabrication of features ranging from simple lines to complex structures by the deposition of concentrated inks through fine nozzles (~0.1 - 250 &mu;m). This printing method consists of a computer-controlled 3-axis translation stage, an ink reservoir and nozzle, and 10x telescopic lens for visualization. Unlike inkjet printing, a droplet-based process, direct-write assembly involves the extrusion of ink filaments either in- or out-of-plane. The printed filaments typically conform to the nozzle size. Hence, microscale features (&lt; 1 &mu;m) can be patterned and assembled into larger arrays and multidimensional architectures.
In this paper, we first synthesize a highly concentrated silver nanoparticle ink for planar and 3D printing via direct-write assembly. Next, a standard protocol for printing microelectrodes in multidimensional motifs is demonstrated. Finally, applications of printed microelectrodes for electrically small antennas, solar cells, and light-emitting diodes are highlighted.

Planar and three-dimensional printing of conductive metallic inks is described. Our approach provides new avenues for fabricating printed electronic, optoelectronic, and biomedical devices in unusual layouts at the microscale.

İletken Mürekkepler düzlemsel ve Üç Boyutlu Baskı

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound healing, tissue regeneration, and cancer metastasis, cells must navigate through complex, three-dimensional extracellular tissue. To better understand the mechanisms behind these biological processes, it is important to examine the roles of the proteins responsible for driving cell migration. Here, we outline a protocol to study the mechanisms of cell migration using the epithelial cell line (MDCK), and a three-dimensional, fibrous, self-polymerizing matrix as a model system. This optically clear extracellular matrix is easily amenable to live-cell imaging studies and better mimics the physiological, soft tissue environment. This report demonstrates a technique for directly visualizing protein localization and dynamics, and deformation of the surrounding three-dimensional matrix. 
Examination of protein localization and dynamics during cellular processes provides key insight into protein functions. Genetically encoded fluorescent tags provide a unique method for observing protein localization and dynamics. Using this technique, we can analyze the subcellular accumulation of key, force-generating cytoskeletal components in real-time as the cell maneuvers through the matrix. In addition, using multiple fluorescent tags with different wavelengths, we can examine the localization of multiple proteins simultaneously, thus allowing us to test, for example, whether different proteins have similar or divergent roles. Furthermore, the dynamics of fluorescently tagged proteins can be quantified using Fluorescent Recovery After Photobleaching (FRAP) analysis. This measurement assays the protein mobility and how stably bound the proteins are to the cytoskeletal network.
By combining live-cell imaging with the treatment of protein function inhibitors, we can examine in real-time the changes in the distribution of proteins and morphology of migrating cells. Furthermore, we also combine live-cell imaging with the use of fluorescent tracer particles embedded within the matrix to visualize the matrix deformation during cell migration. Thus, we can visualize how a migrating cell distributes force-generating proteins, and where the traction forces are exerted to the surrounding matrix. Through these techniques, we can gain valuable insight into the roles of specific proteins and their contributions to the mechanisms of cell migration.

Cellular processes such as cell migration have traditionally been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. This report describes a technique for directly visualizing protein localization and analyzing protein dynamics in cells migrating in a more physiologically relevant, three-dimensional matrix.

Üç boyutlu Matrix floresan etiketli Proteinler ifade Geçiş Hücreler Canlı hücre Görüntüleme

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and regenerative medicine. With digital control&#160;cells, scaffolds, and growth factors can be precisely deposited to the desired two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) locations rapidly. Therefore, this technology is an ideal approach to fabricate tissues mimicking their native anatomic structures. In order to engineer cartilage with native zonal organization, extracellular matrix composition (ECM), and mechanical properties, we developed a bioprinting platform using a commercial inkjet printer with simultaneous photopolymerization capable for 3D cartilage tissue engineering. Human chondrocytes suspended in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) were printed for 3D neocartilage construction via layer-by-layer assembly. The printed cells were fixed at their original deposited positions, supported by the surrounding scaffold in simultaneous photopolymerization. The mechanical properties of the printed tissue were similar to the native cartilage. Compared to conventional tissue fabrication, which requires longer UV exposure, the viability of the printed cells with simultaneous photopolymerization was significantly higher. Printed neocartilage demonstrated excellent glycosaminoglycan (GAG) and collagen type II production, which was consistent with gene expression. Therefore, this platform is ideal for accurate cell distribution and arrangement for anatomic tissue engineering.

The methods described in this paper show how to convert a commercial inkjet printer into a bioprinter with simultaneous UV polymerization. The printer is capable of constructing 3D tissue structure with cells and biomaterials. The study demonstrated here constructed a 3D neocartilage.

Üç boyutlu Mürekkep Püskürtmeli Baskı Teknolojisi Kullanımı İnsan Kıkırdak Doku Fabrikasyon

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic development, wound healing, and immune responses. However, cell migration is also a key mechanism in cancer enabling these cancer cells to detach from the primary tumor to start metastatic spreading. Within the past years various cell migration assays have been developed to analyze the migratory behavior of different cell types. Because the locomotory behavior of cells markedly differs between a two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) environment it can be assumed that the analysis of the migration of cells that are embedded within a 3D environment would yield in more significant cell migration data. The advantage of the described 3D collagen matrix migration assay is that cells are embedded within a physiological 3D network of collagen fibers representing the major component of the extracellular matrix. Due to time-lapse video microscopy real cell migration is measured allowing the determination of several migration parameters as well as their alterations in response to pro-migratory factors or inhibitors. Various cell types could be analyzed using this technique, including lymphocytes/leukocytes, stem cells, and tumor cells. Likewise, also cell clusters or spheroids could be embedded within the collagen matrix concomitant with analysis of the emigration of single cells from the cell cluster/ spheroid into the collagen lattice. We conclude that the 3D collagen matrix migration assay is a versatile method to analyze the migration of cells within a physiological-like 3D environment.

Cell migration is a biological phenomenon that is involved in a plethora of physiological, such as wound healing and immune responses, and pathophysiological processes, like cancer. The 3D-collagen matrix migration assay is a versatile tool to analyze the migratory properties of different cell types within in a 3D physiological-like environment.

Bir Üç boyutlu Kollajen Matrix içindeki Hücre Göç Analizi

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

Üç-boyutlu Tam Kalınlığı Deri Üretimi Eşdeğer ve Otomatik Yaralama

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, including breast carcinomas, are complex 3D tissues composed of cancer epithelial cells and stromal components, including fibroblasts and extracellular matrix (ECM). Yet most in vitro models of breast carcinoma consist only of cancer epithelial cells, omitting the stroma and, therefore, the 3D architecture of a tumor in vivo. Appropriate 3D modeling of carcinoma is important for accurate understanding of tumor biology, behavior, and response to therapy. However, the duration of culture and volume of 3D models is limited by the availability of oxygen and nutrients within the culture. Herein, we demonstrate a method in which breast carcinoma epithelial cells and stromal fibroblasts are incorporated into ECM to generate a 3D breast cancer surrogate that includes stroma and can be cultured as a solid 3D structure or by using a perfusion bioreactor system to deliver oxygen and nutrients. Following setup and an initial growth period, surrogates can be used for preclinical drug testing. Alternatively, the cellular and matrix components of the surrogate can be modified to address a variety of biological questions. After culture, surrogates are fixed and processed to paraffin, in a manner similar to the handling of clinical breast carcinoma specimens, for evaluation of parameters of interest. The evaluation of one such parameter, the density of cells present, is explained, where ImageJ and CellProfiler image analysis software systems are applied to photomicrographs of histologic sections of surrogates to quantify the number of nucleated cells per area. This can be used as an indicator of the change in cell number over time or the change in cell number resulting from varying growth conditions and treatments.

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

We demonstrate a method to generate 3D breast cancer surrogates, which can be cultured using a perfusion bioreactor system to deliver oxygen and nutrients. Following growth, surrogates are fixed and processed to paraffin for evaluation of parameters of interest. The evaluation of one such parameter, cell density, is explained.

Hazırlama ve Analizler<em&gt; İn Vitro</em&gt; Üç Boyutlu Meme Kanseri Suretler

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.

This manuscript describes a soft lithography-based technique to engineer uniform arrays of three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined geometry surrounded by extracellular matrix. This method is amenable to a wide variety of cell types and experimental contexts and allows for high-throughput screening of identical replicates.

Ekstraselüler Matrix içinde Gömülü Mühendislik Üç boyutlu Epitel Dokular

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Fabrication of Three-dimensional Paper-based Microfluidic Devices for Immunoassays

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and directed within a layer of paper. Moreover, stacking multiple layers of patterned paper creates sophisticated three-dimensional microfluidic networks that can support the development of analytical and bioanalytical assays. Paper-based microfluidic devices are inexpensive, portable, easy to use, and require no external equipment to operate. As a result, they hold great promise as a platform for point-of-care diagnostics. In order to properly evaluate the utility and analytical performance of paper-based devices, suitable methods must be developed to ensure their manufacture is reproducible and at a scale that is appropriate for laboratory settings. In this manuscript, a method to fabricate a general device architecture that can be used for paper-based immunoassays is described. We use a form of additive manufacturing (multi-layer lamination) to prepare devices that comprise multiple layers of patterned paper and patterned adhesive. In addition to demonstrating the proper use of these three-dimensional paper-based microfluidic devices with an immunoassay for human chorionic gonadotropin (hCG), errors in the manufacturing process that may result in device failures are discussed. We expect this approach to manufacturing paper-based devices will find broad utility in the development of analytical applications designed specifically for limited-resource settings.

We detail a method to fabricate three-dimensional paper-based microfluidic devices for use in the development of immunoassays. Our approach to device assembly is a type of multilayer, additive manufacturing. We demonstrate a sandwich immunoassay to provide representative results for these types of paper-based devices.

İmmüno için üç boyutlu Paper-based mikroakışkan Cihazlar İmalat

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and ...

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on two-dimensional surfaces. However, the physiological environment in which in vivo wound healing takes place is three-dimensional rather than two-dimensional. It is becoming increasingly clear that cell behavior differs greatly in two-dimensional vs. three-dimensional environments; therefore, there is a need for more physiologically relevant in vitro models for studying cell migration behaviors in wound closure. The method described herein allows for the study of cell migration in a three-dimensional model that better reflects physiological conditions than previously established two-dimensional scratch assays. The purpose of this model is to evaluate cell outgrowth via the examination of cell migration away from a spheroid body embedded within a fibrin matrix in the presence of pro- or anti-migratory factors. Using this method, cell outgrowth from the spheroid body in a three-dimensional matrix can be observed and is easily quantifiable over time via brightfield microscopy and analysis of spheroid body area. The effect of pro-migratory and/or inhibitory factors on cell migration can also be evaluated in this system. This method provides researchers with a simple method of analyzing cell migration in three-dimensional wound associated matrices in vitro, thus increasing the relevance of in vitro cell studies prior to the use of in vivo animal models.

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

The goal of this protocol is to evaluate the effect of pro- and anti-migratory factors on cell migration within a three-dimensional fibrin matrix.