Yazarlar tarafından gerçekleştirilen araştırma kısmen hibe Avrupa Birliği Yedinci Çerçeve Programı (FP7/2007-2013) hibe Sözleşmesi No 229239 altında ve araştırmacı araştırma ortak araştırma programı akut AO Vakfı tarafından desteklenmiştir Kıkırdak yaralanma/lezyon/kusur (CRP acı) proje Bioactive altında ve Biomimetic iskele kıkırdak rejenerasyon (BIOCART) için.

1. kendi kendine montaj peptid İskele yapısı-İskele (SAP) hazırlık
<ol><li>Peptid RAD16% 0.5 çözeltisi hazırlamak-ı %20 (w/v) sükroz, bir mikro-santrifüj tüpü. Solüsyon içeren bir ultrasonik banyo maksimum güç ve oda sıcaklığında (RT homojen karıştırma sağlamak için) 20 dk peptid üçün temizleyicide. Not: Hazır olmak için çözüm hacmi istenen encapsulations sayısına bağlı olacaktır. RAD16-ben peptidler bozulma bu sonication koşullar altında acı değil.</li>
	<li>Adım %1.1 10 (w/v) sükroz gerekli hacmi ile istenen son konsantrasyonu elde etmek için hazırlanan peptid çözüm sulandırmak. Not: son matris sertlik bu parametreye bağlıdır beri ilk peptid konsantrasyon düzeltilmesi dikkate alınması gereken önemli bir faktör olduğunu. RAD16-ben peptid çözüm 2 x daha 3D yapı istenen son konsantrasyonu konsantre olmalıdır. Normalde, son RAD16-ben kullanılan peptid konsantrasyonları vardır 0,15-0,5 arasında % (w/v).</li>
	<li>RT homojen karıştırma sağlamak için 20 dk ultrasonik bir banyo içine peptid solüsyon içeren mikro-santrifüj tüpü yerleştirin. Not: Peptid çözüm hemen, kullanılmayan 4 ° C'de birkaç ay saklanabilir</li>
</ol>2. hücre süspansiyon hazırlama
<ol><li>(Tripsin tedavi sonrası elde edilen) hücre süspansiyon 60 x g ve RT için 5 dk santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Bir vakum hattına bağlı bir Pasteur pipet kullanarak süpernatant kaldırmak ve 3-5 mL % 10 (w/v) sükroz bir micropipette kullanarak hücre Pelet askıya. El ile veya otomatik hücre sayaç hücreleri saymak için devam edin. Not: Hücre bakım için izin verir ve peptid jelleşme karıştırma işlemi sırasında önler bir izotonik ve non-iyonik orta % 10 (w/v) sükroz çözümdür.</li>
	<li>Hücre süspansiyon 60 x g ve RT 5 dk. Kaldır süpernatant santrifüj kapasitesi ve hücre Pelet tekrar çift istenen son hücre konsantrasyonu elde etmek için % 10 (w/v) sükroz gerekli hacmindeki askıya alma (tavsiye yaklaşık 4 x 106 hücreler / mL).</li>
	<li>Doku kültürü ekler istenilen bir dizi her şey bir 6-şey plaka (kapsülleme başına bir INSERT) yerleştirin.</li>
	<li>Adım 1-maksimum güç ve RT 5 min için hazırlanan peptid çözüm solüsyon içeren temizleyicide.</li>
	<li>Pipet ve ilave hacminin yaklaşık % 10-15 standart bir mikro-santrifüj tüpüne istenen her Kapsülleme için (2.3 içinde elde edilen) hücre süspansiyon 40 µL yerleştirin.</li>
</ol>3. 3D Cep Encapsulation SAP içine
<ol><li>RAD16 eşit bir hacmi mix-ben % 10 sukroz (w/v) (kapsülleme başına 40 µL) eşit bir birimdeki hücre süspansiyon (kapsülleme başına 40 µL), 2. adımda bir süspansiyon hücre istenen peptid konsantrasyon (içinde % 10 sükroz) elde etmek için hazırlanan çözümde. Yavaş yavaş yukarı ve aşağı yaklaşık 10 kat pipetting tarafından karıştırın. Karıştırma sırasında kabarcık oluşumu kaçının. Not: Bu adım önemlidir ve hücreleri düşük pH peptid (yaklaşık 3.5-4.0) nedeniyle düşmanca koşullarında olduğundan çok dikkatli bir şekilde gerçekleştirilmesi gerekir.</li>
	<li>Bir micropipette kullanarak, dikkatle süspansiyon 80 µL her sokmak içine yükleyin.</li>
	<li>Kültür ortamının 0.5 mL ıslak Ekle membran, medya difüzyon peptid kendinden montajlı tanıtmak izin ve hidrojel oluşumu iyi altýna ekleyin. Yaklaşık 20 dk akış kabine için jel peptid izin. Not: zaman ayarı sırasında örnekleri manipülasyon jel kırılma içinde sonunda olabilir.</li>
	<li>Çok yavaş orta 40 µL Ekle'nin üzerine ekleyin ve izin için jel iç duvar kaydırın. Not: Normalde 20-30 s arasında bir hız bu birim yükleme almalıdır.</li>
	<li>Plaka 20 dk için kuluçka makinesi (37 ° C, % 5 CO2, oksijen atmosfer) yerleştirin. Bu adım ve art arda gelen orta eklemeler sukroz ve denge kültür ortamı içeren hücrelerin leaching lehine.</li>
	<li>60 µL orta duvar akış izin Ekle, iç duvar ekleyin. Sükroz içinde zengin olan şey, orta Aspire edin ve taze orta 0.5 mL ekleyin.</li>
	<li>Orta 60 µL yavaş Ekle'nin üzerine ekleyin ve 10 dakika için kuluçka makinesi (37 ° C, % 5 CO2, oksijen atmosfer) plaka yer.</li>
	<li>İyi orta Aspire edin ve 2.5 mL taze orta kuyunun içine ekleyin. Orta 200 µL sokmak içine ekleyin. Kuluçka (37 ° C, % 5 CO2, oksijen atmosfer) uygun koşullar altında hücreleri korumak için plaka yerleştirin.</li>
	<li>Orta her gün değiştirin. Eski orta kuyu dibinden kaldırın. 2,5 mL taze orta iyi ve 200 µL eklemek için ekleyin. Not: hücre farklılaşması devam ederse, belirli ikna medya istenen hücre türü taahhüt (bkz. aşağıda, farklılaşma hücre) sonuçlanan kültürler, eklenir.</li>
</ol>4. hücre canlılığı 3D-sap içinde
<ol> <li>Not: Hücre canlılığı tahlil canlı/ölü bilinir — canlılığı/sitotoksisite tahlil de.</li>
	<li>Bir 15 mL Tüp, 2 µM calcein AM ve 2 taze bir çözüm gerekli hacmi hazırlamak µM arasında etidyum homodimer-1 (EthD-1) PBS tarafından vortexing için 10 s. almak içinde belgili tanımlık karanlık. Not: aşağıdaki göre iyi boyutu her örnek için kullanılacak birim bağlıdır: 6-multiwell plaka; her şey için 2 mL 1 mL her biri için 12-multiwell plaka ve her şey bir 24-multiwell plaka için 0.5 mL de.</li>
	<li>Bir micropipette kullanarak, 3D-sap örnekleri 3 kez PBS 2 mL ile durulayın ve sonra 4.1. adımda hazırlanan solüsyona ile kapağı. Karanlıkta 40 min için RT kuluçkaya.</li>
	<li>Bir micropipette kullanarak, yapıları PBS 5 kez 2 mL ile yıkayın.</li>
	<li>10 X-20 X büyütme kullanarak bir floresan mikroskop altında örnekleri görselleştirin.</li>
</ol>5. hücre farklılaşması
<ol><li>Kültür (37 ° C, % 5 CO2, oksijen atmosfer) içinde kondrosit bazal Orta (CBM) içeren hücreler büyüme tamamlar. Not: Orta hazırlanması üreticilerin yönergeleri (bkz: Malzemeler tablo) açıklanmıştır.</li>
	<li>Chondrogenic orta içeren rekombinant insan dönüştürme büyüme faktörü-b1 [TGFb1] ile günde 2 hücre farklılaşması teşvik (10 ng/mL), L-askorbik asit 2-fosfat [AA2P] (25 µg/mL) ve deksametazon (100 nM).</li>
	<li>4 hafta içinde 37 ° C ve % 5 CO2oksijen atmosfere sahip bir kuluçka için kültürü korumak. Chondrogenic orta her gün değiştirin.</li>
</ol>6. toluidin Blue (TB) boyama
<ol><li>3D-SAP kültürler ekleme ve PBS 2 mL bir micropipette ile kaldırma tarafından iki kez yıkayın. %2 (w/v) p2 mL ekleyerek düzeltmek-RT. 2 h için PBS içinde formaldehit</li>
	<li>İki kez 2 mL % 0,1 Triton X-100 PBS (PBST) yıkayın.</li>
	<li>2 mL % 0.05 TB için 20 dk RT. az suda ile kuluçkaya</li>
	<li>Kaldırıldı PBS çözüm temizlenene kadar birkaç kez (en az 3 kez) PBS 2 mL ile yıkayın.</li>
	<li>Bir stereoskopik mikroskop11,13,14altında görsel denetim tarafından örnekleri analiz. Not: TB kompleksler oluşturur gibi proteoglikanlar (PG) ve glikozaminoglikan (GAG), hücre dışı matriks, anyonik glycoconjugates ile hangi esas olarak salgılanan kondrosit benzeri hücreleri tarafından. Olumlu örnekleri mavi lekeli.</li>
</ol>7. Western Blot
Not: Bu protokol için kullanılan yordam önceden başvuru11' de tanımlanmıştır.
<ol><li>3D-yapıları RIPA arabellek içeren proteaz inhibitörü kokteyl içinde pipetting tarafından parçalayıcı.</li>
	<li>Akrilamid jel jel-hacim gereksinimleri (teçhizatın belirli jel çalışan) göre hazırlamak ve 150 V16, hücre lysates 90 dk için çalıştırın. Not: Akrilamid jel genellikle bir konsantrasyon bağlı olarak protein molekül ağırlığı (w/v), % 7.5-10 adlı hazırlanmıştır.</li>
	<li>40 RT. 2 h V uygulayarak jel içine polivinilidin difluoride (PVDF) membran bulunan proteinler transfer</li>
	<li>Membran kapak için yeterli hacim ile ayrı bir kapta RT, PVDF membran engelleme arabelleği (%4 (w/v) yağsız süt tozu PBST içinde) 2 h için kuluçkaya.</li>
	<li>1 mg/mL PBST son bir konsantrasyon, birincil antikorlar ile 1 h için RT, membran kuluçkaya. Malzemeler tabloyabakın.</li>
	<li>İkincil antikorlar bir konsantrasyonu 1 mg/ml ekleyin. Malzemeler tablobakın.</li>
	<li>Membran Chemiluminescent substrat16ile hP algılama için hazır olun. Malzemeler tabloyabakın.</li>
	<li>Chemiluminescent görüntüleri16al.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Aggeli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responsive+gels+formed+by+the+spontaneous+self-assembly+of+peptide+into+polymeric+&#946;-sheet+tapes.">Responsive gels formed by the spontaneous self-assembly of peptide into polymeric &#946;-sheet tapes.</a> Nature. 386, 259-262 (1997).</li><li>Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+we+build+artificial+stem+cell+compartments?.">Can we build artificial stem cell compartments?.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 3, 164-169 (2003).</li><li>Kisiday, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembling+peptide+hydrogel+fosters+chondrocyte+extracellular+matrix+production+and+cell+division:+implications+for+cartilage+tissue+repair.">Self-assembling peptide hydrogel fosters chondrocyte extracellular matrix production and cell division: implications for cartilage tissue repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 99, 9996-10001 (2002).</li><li>Narmoneva, D. A., Vukmirovic, R., Davis, M. E., Kamm, R. D., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+promote+cardiac+myocyte+survival+and+spatial+reorganization:+implications+for+cardiac+regeneration.">Endothelial cells promote cardiac myocyte survival and spatial reorganization: implications for cardiac regeneration.</a> Circulation. 110, 962-968 (2004).</li><li>Genov&#233;, E., Shen, C., Zhang, S., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+functionalized+self-assembling+peptide+scaffolds+on+human+aortic+endothelial+cell+function.">The effect of functionalized self-assembling peptide scaffolds on human aortic endothelial cell function.</a> Biomaterials. 26, 3341-3351 (2005).</li><li>Garreta, E., Genov&#233;, E., Borr&#243;s, S., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteogenic+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+and+mouse+embryonic+fibroblasts+in+a+three-dimensional+self-assembling+peptide+scaffold.">Osteogenic differentiation of mouse embryonic stem cells and mouse embryonic fibroblasts in a three-dimensional self-assembling peptide scaffold.</a> Tissue Engineering. 12, 2215-2228 (2006).</li><li>Sieminski, A. L., Semino, C. E., Gong, H., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+sequence+of+ionic+self-assembling+peptide+gels+affects+endothelial+cell+adhesion+and+capillary+morphogenesis.">Primary sequence of ionic self-assembling peptide gels affects endothelial cell adhesion and capillary morphogenesis.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 87 (2), 494-504 (2008).</li><li>Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembling+peptides:+from+bio-inspired+materials+to+bone+regeneration.">Self-assembling peptides: from bio-inspired materials to bone regeneration.</a> Journal of Dental Research. 87 (2008), 606-616 (2008).</li><li>Hern&#225;ndez Vera, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interstitial+fluid+flow+intensity+modulates+endothelial+sprouting+in+restricted+Src-activated+cell+clusters+during+capillary+morphogenesis.">Interstitial fluid flow intensity modulates endothelial sprouting in restricted Src-activated cell clusters during capillary morphogenesis.</a> Tissue Engineering Part A. 15 (1), 175-185 (2009).</li><li>Castells-Sala, C., Mart&#237;nez-Ramos, C., Vall&#233;s-Lluch, A., Monle&#243;n Pradas, M., Semino, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+development+of+bioimplants+made+up+of+elastomeric+scaffolds+with+peptide+gel+filling+seeded+with+human+subcutaneous+adipose+tissue-derived+progenitor+cells.">In vitro development of bioimplants made up of elastomeric scaffolds with peptide gel filling seeded with human subcutaneous adipose tissue-derived progenitor cells.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (11), 3419-3430 (2015).</li><li>Recha-Sancho, L., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparin-based+self-assembling+peptide+scaffold+reestablish+chondrogenic+phenotype+of+expanded+de-differentiated+human+chondrocytes.">Heparin-based self-assembling peptide scaffold reestablish chondrogenic phenotype of expanded de-differentiated human chondrocytes.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (7), 1694-1706 (2016).</li><li>Bussmann, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrogenic+potential+of+human+dermal+fibroblasts+in+a+contractile,+soft,+self-assembling,+peptide+hydrogel.">Chondrogenic potential of human dermal fibroblasts in a contractile, soft, self-assembling, peptide hydrogel.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 10 (2), E54-E62 (2016).</li><li>Recha-Sancho, L., Moutos, F. T., Abell&#224;, J., Guilak, F., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dedifferentiated+Human+Articular+Chondrocytes+Redifferentiate+to+a+Cartilage-Like+Tissue+Phenotype+in+a+Poly+(&#949;-Caprolactone)/Self-Assembling+Peptide+Composite+Scaffold.">Dedifferentiated Human Articular Chondrocytes Redifferentiate to a Cartilage-Like Tissue Phenotype in a Poly (&#949;-Caprolactone)/Self-Assembling Peptide Composite Scaffold.</a> Materials. 9 (6), 472 (2016).</li><li>Recha-Sancho, L., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondroitin+Sulfate+and+Decorin+based+self-assembling+scaffolds+for+cartilage+tissue+engineering.">Chondroitin Sulfate and Decorin based self-assembling scaffolds for cartilage tissue engineering.</a> PlosOne. 11 (6), e0157603 (2016).</li><li>Aloy-Revert&#233;, C., Moreno-Amador, J. L., Nacher, M., Montanya, E., Semino, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+RGD-Functionalized+Sandwich+Cultures+to+Promote+Redifferentiation+of+Human+Pancreatic+Beta+Cells+After+In+Vitro+Expansion.">Use of RGD-Functionalized Sandwich Cultures to Promote Redifferentiation of Human Pancreatic Beta Cells After In Vitro Expansion.</a> Tissue Engineering Part A. , (2017).</li><li>Kurien, B. T., Scofield, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+blotting+and+detection.">Protein blotting and detection.</a> Methods in Molecular Biology. 536, (2009).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Daha önce bizim grup ve diğerleri farklı hücre sistemleri3,4,5,6,7,8 ile üç boyutlu (3D) kültür platformlar kullanımını tarif var ,9,10,11,12,13,14,15. Mevcut çalışma, biz kolay ve güvenilir bir yöntem tarif 3D kültür elde memeli hücreleri işlevsel hücre, embriyonik veya yetişkinlere yönelik her türlü dahil olmak üzere herhangi bir türü için geçerli olan sistemleri kök hücre veya sonunda, üzerinden işlevsel olmayan hücreleri izole Biyopsi veya tümörler ve benzeri. Kök hücreler embriyonik veya yetişkin kökeni ise buna ek olarak, bağımsız olarak, onlar daha iyi lineage bağlılık kapasitesi klasik 2D kültür yemekleri10,11,123D ortamda olurdu, 13,14,15. Bu nedenle, bu sistemi hücre kültüründe farklılaşma için farklı uygulamalardan Onarıcı veya rejeneratif Biyomedikal toksikolojik ve farmakolojik platformları için kullanılabilir gibi fonksiyonel doku benzeri yapılar yol açacak.
Hücresel microenvironment matris yapısı ve biyomekanik, Biyofizik ve biyolojik parametreler açısından doğal dokuların benzer çünkü hücre işlevinde bir net kazanç göstermiştir. Sistem daha karmaşık hale geldikçe, yine de, olması gereken parametre sayısı da artar, hangi (kütle transferi olayları ilişkili sorunları önlemek için etkin perfüzyon sistemi gibi bir harici destek platformu ihtiyacını içerir düzenlenir ). Üç boyutlu kültürlü hücreleri geçiş, yayılması ve farklılaşma gibi temel faaliyetleri düzenleyen açısından daha iyi performans. Onlar karmaşık ağları tarafından çok büyüyen ve 3D ayırt önemli bir sonucu olduğu gelişmiş hücresel crosstalk, izin formu. SAPS aslında koşulları vitro bu hücre dışı matriks proteinleri temsil eder (büyüme faktörü, polisakkarit veya sinyal iskele için eklenen her bileşen için bir avantaj etkisi rasyonel bir çalışma beri üretilen benzer oluşturabilirsiniz peptid) kolayca yürütülen.
Kollajen yazın ben ve Matrigel, gibi diğer doğal iskele için karşılaştırıldığında SAP kullanımı net avantajları şunlardır: 1) sap olduğunu sentetik bir biomaterial en az çeşitlemesiyle toplu iş toplu üretim; 2) SAP belirli peptit motiflerle functionalized kapasitesine sahip; ve 3) SAP hediye biodegradability vitrozamanla aynı Biyofizik, biyomekanik ve yapısal özelliklere sahip yapı 3D bakım izin verir, düşük. Ancak, karşı diğer kullanma sınırlaması SAPS iskele hücreleri düşük pH nedeniyle düşman ortamında nerede kapsülleme adımı sırasında bulundu. Bu nedenle, bu tarif yöntembilim kritik bir adımdır. Ayrıca, herhangi bir deneme başlamadan önce her belirli hücre türü için SAP toplama ayarlamak önemlidir. Bu, aslında, her belirli hücre türü en iyi biyomekanik büyüme koşullar sunacak bu yana hücreleri üzerine veya içine bu Biyomalzeme kültürlü zaman önemlidir.
Son olarak, biz geliştirme ve üretim, bu tip biomaterial iskele daha iyi tedavi yaklaşımları geliştirmek için ilaç endüstrisi yardımcı olmak için daha fizyolojik ve güvenilir 3D doku modelleri gelişimi artıracak inanıyorum rejeneratif tıp, kanser ya da herhangi bir tıbbi tedavi.

Uzun yıllar memeli hücre kültür deneysel koşullarda fizyolojik olmayan yönleri ne olursa olsun pratik ve ekonomik sorunlar nedeniyle klasik iki boyutlu (2D) kültür sistemleri kullanılarak yapılmıştır. Her ne kadar bu kültür sistemi çalışma ve en moleküler ve hücresel mekanizmaları anlamak için yardımcı olur, bugün yeni hücre kültür paradigmalar daha karmaşık hücresel sistemleri çalışmaya ihtiyaç vardır biliyorum. Bu nedenle, üç boyutlu (3D) kültür olduğunu biophysically, biomechanically bir microenvironment yeniden oluşturmak için gerekli ve biyolojik olarak daha benzer doğal dokuların sistemlerdir. Çalışmanın yeni bir modeli temsil ettikleri bu yana son yıllarda 3D kültür sistemleri, genel olarak, araştırmacılar ve sanayi arasında daha yaygın hale gelmiştir veya hangi hücrelerin uzayda büyümek, hücre hücre oluşturmak veya hücre matris etkileşimleri eleme, göç ve sonunda belirli hücre soy ayırt etmek.
Bu metodoloji genel amacı için in vivo microenvironment daha yakın bir vitro hücresel microenvironment yeniden sağlamaktır. Özellikle, sentetik kendi kendine montaj peptid iskele (SAP) biomaterial benzersiz özelliklere sahip bir türüdür; nanometre boyutunda gözenekleri peptidler mekanik ve yapısal özellikleri ile arasındaki zayıf etkileşimler benzer bu doğal hücre dışı Matrislerin yapılmış bir ağ oluşturur. Başka bir deyişle, bu malzeme kullanımı arkasında rasyonellik olduğunu bu gerçekten 3D-ortam oluşturur sözde-3D doku veya organ birimleri elde etmek için idealdir. Ancak, en önemlisi, 3D içerik 3D yapısı desenlendirme için doku mimarisi, kütle transferi olaylar, ilgili özellik hücre gibi 2D kültür platformlarında, normalde bulunmayan yeni biyolojik işlevleri elde etmek için izin verir ve sonunda doku morfogenez, gelecekteki araştırma ve geliştirme fonksiyonel doku ve organları1,2anahtar faktörlerdir. Ayrıca, onlar oda sıcaklığında çok kararlı ve post-prodüksiyon, dağıtım veya depolama3,4, için özel koşullar gerektirmez SAP doğal karşılıkları (kollajen, Matrigel) üzerinde bir avantaj olduğunu 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. sap, istendiği takdirde; kolay 3D jelleri sadece iyonik gücü arttırarak veya tarafsızlık1,2pH ayarlama tarafından elde edilebilir. Son olarak, burada açıklanan metodoloji bakım, büyüme ve farklılaşma hücre tipleri, kondrosit, hepatositlerin, endotel hücreleri, dokusunu, nöronal hücre de dahil olmak üzere bir dizi tanıtmak için yaygın olarak kullanılan vitro oldu embriyonik ve somatik kök hücre3,4,5,6,7,8,9,10, 11 , 12 , 13 , 14 , 15. mevcut çalışma, biz insan genişletilmiş artiküler kondrosit (hACh) yukarıda açıklanan11olarak kıkırdak benzeri doku içine ayırt etmek için 3D-kültür sistemi nasıl kullanılacağını açıklar.
Burada, kültür hücrelere bir 3D sisteminde SAP kullanarak bir yöntemi açıklanmıştır. Bu sentetik biomaterial, hücreleri ilk hücrelerin etrafındaki nanometric boyutlarının bir ağ oluşturma ve bu nedenle gerçekten 3D çevre (Şekil 1) oluşturma daha sonra kendi kendine bir araya indüklenen bir peptid çözüm ile karıştırılır. Hücresel davranış (Yani, yayılması, geçiş ve farklılaşma) matris sertlik değerleri tarafından etkilenir dikkate almak önemlidir. Bu nedenle, kültür hücreleri aynı sertlik değerleri (iki boyutlu kültür) ile peptid iskele üzerine ortak bir metodolojik kontrol etmektir.

<table><tbody><tr><td>Human articular chondrocytes (Ach)</td><td>Lonza</td><td>CC-2550</td><td></td></tr><tr><td>RAD16-I peptide solution (PuraMatrix)</td><td>Corning</td><td>354250</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose (tissue culture grade)</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture inserts (0.4 &amp;micro;m pore, 12 mm diameter)</td><td>Millipore</td><td>PICM01250</td><td></td></tr><tr><td>Chondrocyte Basal Medium (CBM)</td><td>Lonza</td><td>CC-3217</td><td></td></tr><tr><td>SingleQuots of Growth Supplements</td><td>Lonza</td><td>CC-4409</td><td></td></tr><tr><td>Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Lonza</td><td>DE14-801F</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>Sigma</td><td>D8893</td><td></td></tr><tr><td>L-ascorbic acid 2-phosphate (AA2P)</td><td>Sigma</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>Human transforming growth factor-&amp;beta;1 (TGF-&amp;beta;1)</td><td>Millipore</td><td>GF111</td><td></td></tr><tr><td>RIPA buffer</td><td>Sigma</td><td>R0278</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Roche</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane</td><td>Invitrogen</td><td>LC 2005</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate</td><td>Thermo Scientific</td><td>34080</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Actin</td><td>SCBT</td><td>sc-1615</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Collagen I</td><td>Abcam</td><td>ab138492</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Collagen II</td><td>Abcam</td><td>ab3092</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Collagen X</td><td>Abcam</td><td>ab182563</td><td></td></tr><tr><td>Antigoat IgG-HRP</td><td>Abcam</td><td>ab97100</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse IgG-HRP</td><td>Abcam</td><td>ab97023</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rabbit IgG-HRP</td><td>Abcam</td><td>ab97051</td><td></td></tr></tbody></table>

culturing mammalian cells in three-dimensional peptide scaffolds

Bir kendi kendine montaj nanofiber üç boyutlu (3D) iskele hücrelerde kültür yararlı bir yöntem açıklanır. Bu kültür sistemi yakından sigara polarize doku yapısal özelliklerini taklit eden bir ortam yeniden oluşturur. Ayrıca, iskele belirli iç nanofiber yapısını şeffaf mikroskobu altında örnek kolay görüntüleme için sağlar görsel ışık yapar. Bu avantaj özel boyalar veya probları ile boyama tarafından hücre göç, organizasyon, nükleer silahların yayılmasına karşı ve farklılaşma ve böylece herhangi bir belirli hücresel işlevlerine gelişimi çalışmaya büyük ölçüde kullanıldı. Ayrıca, bu çalışmada, biz kolayca genişletilmiş insan artiküler kondrosit redifferentiation kıkırdak dokusuna eğitim için bu sistem iyi bir performans tanımlamak. Hücreleri kendi kendini peptid iskele montaj kapsüllenir ve chondrogenesis tanıtmak için belirli koşullar altında kültürlü. Üç boyutlu kültürleri iyi canlılık sırasında 4 hafta deneme gösterdi. Beklendiği gibi örnekleri chondrogenic indükleyicileri (sigara kaynaklı kontrollere göre) ile kültürlü (ki son derece kıkırdak hücre dışı matriks içinde bulunan glikozaminoglikan (GAG) lekeleri) toluidin blue için güçlü pozitif lekeli ve ifade kollajen dahil olmak üzere belirli moleküler işaretleyiciler tip ı, II ve X, Western Blot analizine göre. Bu iletişim kuralı basit-e doğru yapmak ve araştırma laboratuvarlarında, sanayi ve laboratuvar dersleri eğitim amaçlı kullanılabilir.

Mevcut çalışma, kültür hücreleri SAP kullanarak 3D basit ve hızlı bir iletişim kuralına güvenilir nitel ve nicel veri elde etmek için tanımlanır. SAP kültürlü hücreleri hücre bakım, yayılması ve/veya farklılaşma3,4,5,6 devam etmek için istenen koşullar altında izin benzersiz özelliklere sahip bir 3D microenvironment oluşturur , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12. grubumuz, çeşitli çalışmalarda insan Yağ dokusundan elde edilen progenitör hücreler (hAPC), genişletilmiş insan artiküler kondrosit (hACh) ve insan normal dermal fibroblastlar (hNDF) kültürü için kullanılarak yapılır, genişletin ve bunları içine ayırt kıkırdak benzeri doku10,11,12. Burada, biz 3D kültür ve genişletilmiş hACh yeniden farklılaşma kıkırdak benzeri doku, içine daha önce açıklanan11açıklanmaktadır. Bu nedenle, 3D-SAP hücrelerde saklanması ve onları chondrogenic indüksiyon ortamı, Şekil 1 ' deki (ve protokol) anlatılan kültür. 24 saat sonra örnekleri canlılığı ile canlı/ölü canlılığı/sitotoksisite tahlil için değerlendirildi. Sonuçlar birkaç yüzde hücrelerinin öldüğünü gösterir (kırmızı) kapsüllemenin ve neredeyse hiç ölü hücreleri Kültür (Şekil 2) 4 hafta sonra gözlendi 5 gün sonra. Daha sonra onları yöntemi boyama mavi toluidin kullanarak hücre dışı matriks, glikozaminoglikan (GAG) ifade için lekeli. Beklendiği gibi indüksiyon grup düzgün tedavi için güçlü (Şekil 2) boyama gösterilen yanıt verdi.
Son olarak, kollajen dahil olmak üzere chondrogenesis ve hipertrofisi işaretlerinin moleküler işaretleyiciler tip ı, II ve X, Batı leke (Şekil 3) tarafından analiz edildi. Ben (COL1) 2D ve 3D sistemleri ama ~ 130 kDa (hücre dışı matriks monte edilebilir için işlenmiş olgun COL1 protein temsil eden) bir alt grup gözlendi kollajen türü yalnızca 3D gözlendi. Bu sonuç açıkça farklılaşma üç boyutlu gören hücreleri daha fizyolojik bir şekilde devam gösterir. Dikkat çekici, kollajen tip II (COL2) - hücre dışı matriks - sadece 3D yapıları chondrogenic koşullar altında kültürlü içinde beklenen molekül ağırlığı yok tek bir bant olarak algılandı. Son olarak, kollajen tür X (COL10) tespit hem 2D hem de 3D yapıları chondrogenic koşullarda, kültürlü bir dereceye hipertrofisi kültür 4 hafta sonra gösteren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57259/57259fig1v2.jpg"> Şekil 1: 3D-SAP içine hücre kapsüllemenin şematik Gösterim. HACh kapsüllemenin şematik Gösterim rasgele 3D-sap içinde dağınık hücreleri elde etmek için tanımlanır. 1. kendi kendine peptid İskele yapısı-İskele (SAP) hazırlık; montaj 2. hücre süspansiyon hazırlama; ve 3. 3D-hücre encapsulation SAP içine. Şematik sadece adımları 3.1-3.4 gösterdiğine dikkat edin.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57259/57259fig2.jpg"> Şekil 2: hücre performans ve chondrogenic farklılaşma 3D-SAP kültürlerde. Hücre boyama canlılık 5 gün ve floresan mikroskop (canlı hücrelerde kırmızı yeşil ve ölü hücreleri) altında tespit kültür 4 hafta gerçekleştirilen. Ölçek Bar = 200 µm. genel chondrogenesis taahhüt toluidin blue boyama (sülfürlü glikozaminoglikan mavi) 3D-SAP yapıları kültürlü, denetim ve chondrogenic medya tarafından değerlendirildi. Ölçek çubukları 500 µm =. Bu rakam L. Recha-Sancho ve ark. değiştirildi 11. <a href="/files/ftp_upload/57259/57259fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57259/57259fig3.jpg"> Şekil 3: kollajen ı, II ve X ifade chondrogenesis geçiren hACh. 4 hafta içinde chondrogenic medya ve denetimleri kollajen ifade için değerlendirildi sonra 2D monolayer ve 3D-SAP kültürlü hACh tip ı (COL1), kollajen tip II (COL2) ve kollajen türü X (COL10). Aktin ifade bir iç denetimi olarak kullanıldı. Bu rakam L. Recha-Sancho ve ark. değiştirildi 11. <a href="/files/ftp_upload/57259/57259fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds at JoVE.com

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

Üç boyutlu peptid iskele memeli hücrelerinde kültür

Burada, kendi kendine dediferansiye insan artiküler kondrosit farklılaşma kıkırdak benzeri doku içine tanıtmak için peptid iskele montaj içinde 3D-kültür sistemleri elde etmek için bir iletişim kuralı mevcut.

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

culturing-mammalian-cells-in-three-dimensional-peptide-scaffolds

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.1K Görüntüleme.  Ramon Llull University. Burada, kendi kendine dediferansiye insan artiküler kondrosit farklılaşma kıkırdak benzeri doku içine tanıtmak için peptid iskele montaj içinde 3D-kültür sistemleri elde etmek için bir iletişim kuralı mevcut.

Video: Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells within a tissue, however, are typically encased within a closely packed tissue mass in which cells establish intimate connections with many near-neighbors and with extracellular matrix components. Accordingly, the chemical milieu and physical forces experienced by cells within a 3D tissue are fundamentally different than those experienced by cells grown in monolayer culture. This has been shown to markedly impact cellular morphology and signaling. Several methods have been devised to generate 3D cell cultures including encapsulation of cells in collagen gels1or in biomaterial scaffolds2. Such methods, while useful, do not recapitulate the intimate direct cell-cell adhesion architecture found in normal tissues. Rather, they more closely approximate culture systems in which single cells are loosely dispersed within a 3D meshwork of ECM products. Here, we describe a simple method in which cells are placed in hanging drop culture and incubated under physiological conditions until they form true 3D spheroids in which cells are in direct contact with each other and with extracellular matrix components. The method requires no specialized equipment and can be adapted to include addition of any biological agent in very small quantities that may be of interest in elucidating effects on cell-cell or cell-ECM interaction. The method can also be used to co-culture two (or more) different cell populations so as to elucidate the role of cell-cell or cell-ECM interactions in specifying spatial relationships between cells. Cell-cell cohesion and cell-ECM adhesion are the cornerstones of studies of embryonic development, tumor-stromal cell interaction in malignant invasion, wound healing, and for applications to tissue engineering. This simple method will provide a means of generating tissue-like cellular aggregates for measurement of biomechanical properties or for molecular and biochemical analysis in a physiologically relevant model.

We describe a simple, rapid method of generating 3D tissue-like spheroids and their potential application to quantify differences in cell-cell interactions.

3D parçacıklarının Üretimi için Basit Asma Bırak Hücre Kültürü Protokolü

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Biyomühendislik

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

The influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally neuronal differentiation is of great interest in order to find new methods for cell-based and standardised therapies in neurological disorders or neurodegenerative diseases. 3D structures are expected to provide an environment much closer to the in vivo situation than 2D cultures. In the context of regenerative medicine, the combination of biomaterial scaffolds with neural stem and progenitor cells holds great promise as a therapeutic tool.1-5 Culture systems emulating a three dimensional environment have been shown to influence proliferation and differentiation in different types of stem and progenitor cells. Herein, the formation and functionalisation of the 3D-microenviroment is important to determine the survival and fate of the embedded cells.6-8 Here we used PuraMatrix9,10 (RADA16, PM), a peptide based hydrogel scaffold, which is well described and used to study the influence of a 3D-environment on different cell types.7,11-14 PuraMatrix can be customised easily and the synthetic fabrication of the nano-fibers provides a 3D-culture system of high reliability, which is in addition xeno-free.
Recently we have studied the influence of the PM-concentration on the formation of the scaffold.13 In this study the used concentrations of PM had a direct impact on the formation of the 3D-structure, which was demonstrated by atomic force microscopy. A subsequent analysis of the survival and differentiation of the hNPCs revealed an influence of the used concentrations of PM on the fate of the embedded cells. However, the analysis of survival or neuronal differentiation by means of immunofluorescence techniques posses some hurdles. To gain reliable data, one has to determine the total number of cells within a matrix to obtain the relative number of e.g. neuronal cells marked by &beta;III-tubulin. This prerequisites a technique to analyse the scaffolds in all 3-dimensions by a confocal microscope or a comparable technique like fluorescence microscopes able to take z-stacks of the specimen. Furthermore this kind of analysis is extremely time consuming. 
Here we demonstrate a method to release cells from the 3D-scaffolds for the later analysis e.g. by flow cytometry. In this protocol human neural progenitor cells (hNPCs) of the ReNcell VM cell line (Millipore USA) were cultured and differentiated in 3D-scaffolds consisting of PuraMatrix (PM) or PuraMatrix supplemented with laminin (PML). In our hands a PM-concentration of 0.25% was optimal for the cultivation of the cells13, however the concentration might be adapted to other cell types.12 The released cells can be used for e.g. immunocytochemical studies and subsequently analysed by flow cytometry. This speeds up the analysis and more over, the obtained data rest upon a wider base, improving the reliability of the data.

Here we describe the use of a self-assembling 3-dimensional scaffold to culture human neural progenitor cells. We present a protocol to release the cells from the scaffolds to be analysed subsequently e.g. by flow cytometry. This protocol might be adapted to other cell types to perform detailed mechanistically studies.

3 boyutlu montaj Self-Peptid Hidrojel İnsan Sinir Progenitör Hücreler Yetiştiriciliği

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

3-Boyutlu Hücre Kültürü için Self-raporlama iskeleleri

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

Neuroblastoma is the most common extracranial solid tumor in children, accounting for 15% of overall pediatric cancer deaths. The native tumor tissue is a complex three-dimensional (3D) microenvironment involving layers of cancerous and non-cancerous cells surrounded by an extracellular matrix (ECM). The ECM provides physical and biological support and contributes to disease progression, patient prognosis, and therapeutic response.
This paper describes a protocol for assembling a 3D scaffold-based system to mimic the neuroblastoma microenvironment using neuroblastoma cell lines and collagen-based scaffolds. The scaffolds are supplemented with either nanohydroxyapatite (nHA) or glycosaminoglycans (GAGs), naturally found at high concentrations in the bone and bone marrow, the most common metastatic sites of neuroblastoma. The 3D porous structure of these scaffolds allows neuroblastoma cell attachment, proliferation and migration, and the formation of cell clusters. In this 3D matrix, the cell response to therapeutics is more reflective of the in vivo situation.
The scaffold-based culture system can maintain higher cell densities than conventional two-dimensional (2D) cell culture. Therefore, optimization protocols for initial seeding cell numbers are dependent on the desired experimental timeframes. The model is monitored by assessing cell growth via DNA quantification, cell viability via metabolic assays, and cell distribution within the scaffolds via histological staining.
This model&#39;s applications include the assessment of gene and protein expression profiles as well as cytotoxicity testing using conventional drugs and miRNAs. The 3D culture system allows for the precise manipulation of cell and ECM components, creating an environment more physiologically similar to native tumor tissue. Therefore, this 3D in vitro model will advance the understanding of the disease pathogenesis and improve the correlation between results obtained in vitro, in vivo in&#160;animal models, and human subjects.

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

This paper lists the steps required to seed neuroblastoma cell lines on previously described three-dimensional collagen-based scaffolds, maintain cell growth for a predetermined timeframe, and retrieve scaffolds for several cell growth and cell behavior analyses and downstream applications, adaptable to satisfy a range of experimental aims.

Kollajen Bazlı İskeleler Kullanılarak Nöroblastomun Üç Boyutlu İn Vitro Biyomimetik Modeli

Neuroblastoma is the most common extracranial solid tumor in children, accounting for 15% of overall pediatric cancer deaths. The native tumor tissue is a ...

Kanser Araştırmaları

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.

This manuscript describes a soft lithography-based technique to engineer uniform arrays of three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined geometry surrounded by extracellular matrix. This method is amenable to a wide variety of cell types and experimental contexts and allows for high-throughput screening of identical replicates.

Ekstraselüler Matrix içinde Gömülü Mühendislik Üç boyutlu Epitel Dokular

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from brown sea algae. Briefly, the tumor tissue is cut into small pieces and submitted to an enzymatic digestion with collagenase and trypsin. Next, a cell suspension is obtained. The tumor cell suspension is mixed with 1.2% sodium alginate and dropped into a CaCl2 solution, and the alginate/cell suspension is gelled on contact with the CaCl2 to form spherical beads. The cells embedded in the alginate beads are supplied with nutrients provided by the culture media enriched with 20% FBS. Three-dimensional culture in alginate beads maintains the viability of adenoma cells for long periods of time, up to four months. Moreover, the cells can be liberated from the alginate by washing the beads with sodium citrate and seeded on glass coverslips for further immunocytochemical analyses. The use of a cell culture model allows for the fixation and visualization of the actin cytoskeleton with minimal disorganization. In summary, alginate beads provide a reliable culture system for the maintenance of pituitary adenoma cells.

Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.

İnsan Hipofiz Adenom Hücreleri üç boyutlu Aljinat-boncuk Kültür

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Tıp

Controlling Particle Fraction in Microporous Annealed Particle Scaffolds for 3D Cell Culture

Microgels are the building blocks of microporous annealed particle (MAP) scaffolds, which serve as a platform for both in vitro cell culture and in vivo tissue repair. In these granular scaffolds, the innate porosity generated by the void space between microgels enables cell infiltration and migration. Controlling the void fraction and particle fraction is critical for MAP scaffold design, as porosity is a bioactive cue for cells. Spherical microgels can be generated on a microfluidic device for controlled size and shape and subsequently freeze-dried using methods that prevent fracturing of the polymer network. Upon rehydration, the lyophilized microgels lead to controlled particle fractions in MAP scaffolds. The implementation of these methods for microgel lyophilization has led to reproducible studies showing the effect of particle fraction on macromolecule diffusion and cell spreading. The following protocol will cover the fabrication, lyophilization, and rehydration of microgels for controlling particle fraction in MAP scaffolds, as well as annealing the microgels through bio-orthogonal crosslinking for 3D cell culture in vitro.

Minimizing the variability in the particle fraction within granular scaffolds facilitates reproducible experimentation. This work describes methods for generating granular scaffolds with controlled particle fractions for in vitro tissue engineering applications.

3D Hücre Kültürü için Mikro Gözenekli Tavlanmış Partikül İskelelerinde Partikül Fraksiyonunun Kontrol Edilmesi

Microgels are the building blocks of microporous annealed particle (MAP) scaffolds, which serve as a platform for both in vitro cell culture and in vivo ...

<meta charset="utf8"></head><body>Epitel ve Fibroblast hücreleri için gelişmiş iki katmanlı 3D ko-kültür sistemi

Establishing a Three-Dimensional Coculture Module of Epithelial Cells Using Nanofibrous Membranes

Technical hurdles in a culture of epithelial cells include dedifferentiation and loss of function. Biomimetic three-dimensional (3D) cell culture methods can enhance cell culture efficiency. This study introduces an advanced two-layered culture system intended to cultivate epithelial cells as tissue-like layers with the culture of fibroblasts within a 3D environment. Polyvinyl alcohol (PVA) and poly(&#949;-caprolactone) (PCL) nanofibrous membranes (NMs) were fabricated via electrospinning and utilized as a physiologically relevant extracellular matrix for the culture of epithelial cells and fibroblasts, respectively. In the upper insert wells, lung epithelial cells were cultivated on the PVA NM, and in the lower chambers, fibroblasts were cultured on the PCL NM. This configuration eliminates direct cell-cell contact and facilitates the examination of paracrine signaling mediated by soluble factors. Confocal microscopy was employed to analyze the distribution, growth pattern, and expression of intracellular proteins, including zona occludens in epithelial cells. Z-stacking techniques enabled detailed 3D reconstructions, providing precise insights into the integrity of tight junctions and spatial organization within the epithelial layer. Scanning electron microscopy (SEM) assessed the morphological characteristics of cell types on the nanofibrous membranes. SEM imaging revealed intricate cell surface structures and interactions with the nanofibers, offering a comprehensive perspective on cellular architecture and cell interaction with nanofibrous structure. The Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay is a simple method for measuring epithelial cell and fibroblast growth rates over time. It provides the proliferative behaviors and potential synergistic effects of coculturing these cells. These findings highlight the effectiveness of a simple insert co-culture system for simultaneous culture of fibroblasts and epithelial cells, which is crucial in various physiological and pharmacological contexts, including epithelial tissue regeneration, tumor microenvironment with endothelial, immune, and other stroma cells, toxicity assay, and drug activity test.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: PVA-PCL Nanolifli Membranlarla 3D Kokültür Sistemlerini Geliştirme

Here, we demonstrate how epithelial cells cultured with fibroblasts in the nanofibrous membrane-based two-layer system can stably adhere to and grow on the membrane.

Nanolifli membranlar kullanılarak epitel hücrelerinin üç boyutlu bir kokültür modülünün kurulması

Technical hurdles in a culture of epithelial cells include dedifferentiation and loss of function. Biomimetic three-dimensional (3D) cell culture methods ...

Üç boyutlu peptid iskele memeli hücrelerinde kültür

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

3D parçacıklarının Üretimi için Basit Asma Bırak Hücre Kültürü Protokolü

3 boyutlu montaj Self-Peptid Hidrojel İnsan Sinir Progenitör Hücreler Yetiştiriciliği

3-Boyutlu Hücre Kültürü için Self-raporlama iskeleleri

Kollajen Bazlı İskeleler Kullanılarak Nöroblastomun Üç Boyutlu İn Vitro Biyomimetik Modeli

Ekstraselüler Matrix içinde Gömülü Mühendislik Üç boyutlu Epitel Dokular

İnsan Hipofiz Adenom Hücreleri üç boyutlu Aljinat-boncuk Kültür

3D Hücre Kültürü için Mikro Gözenekli Tavlanmış Partikül İskelelerinde Partikül Fraksiyonunun Kontrol Edilmesi

Nanolifli membranlar kullanılarak epitel hücrelerinin üç boyutlu bir kokültür modülünün kurulması

Nanolifli membranlar kullanılarak epitel hücrelerinin üç boyutlu bir kokültür modülünün kurulması

Nanolifli membranlar kullanılarak epitel hücrelerinin üç boyutlu bir kokültür modülünün kurulması