DIY kriyojenik alma cihazı projeler Kanser Araştırma programı, Fen Virginia Akademisi Mary Louise Andrews Ödülü sponsorluğunda &quot;biyoinformatik ve moleküler yaklaşımlar kullanılarak ökaryotik hücrelerde Modelleme bakteriyel protein prenylation&quot;, &quot;Plazma RNA Düzenleme Fizyolojik Anlam sırasında test edilmiştir Thomas F. Jeffress ve Kate Miller Jeffress Memorial Trust ve Devlet Sözleşme 16.740.11.0364 (Bilim ve Eğitim Bakanlığı, Rusya) tarafından desteklenen dendritik hücreler &quot;. Biz RNA bütünlük deneyi için yardım Beth Eom teşekkür etmek istiyorum.

1. Cryoboxes Almak İçin Cryotolerant Cihaz Meclisi <ol><li> . Pense kullanarak, 3 taraflı güçlü bağı (Şekil 1A) yapmak için bir L şeklinde güçlü-kravat Şekil 1B gösterildiği Not bir tarafı düzeltmek: güçlü-kravat boyutları Dewar boyun çapına bağlı olarak seçilebilir . </li><li> . Şekil 3 (AB) &#39;de gösterildiği gibi Cryoscoop temel teşkil Crown somun, pul ve vida kullanarak güçlü bir kravat-T kayışı (Şekil 2) Not böyle iki güçlü bağları Güvenli: İki güçlü bağları alınmasını sağlamak için kullanılır 5 ½ inç X 5 ½ inç cryoboxes. </li><li> Bir oluklu levha (Şekil 4) kullanarak, oluklu levha bir ucunda yuvaları ile güçlü-kravat T kayışı yuvalara hizalayın ve Hillman somun ve cıvatalar (Şekil 5) yardımıyla birlikte iki sabitleyin. Not: Eğer oluklu levha ve güçlü bir bağ Kullanıcı birlikte değilBana önceden delinmiş delikleri ile, delik karbür matkap kullanılarak delinmiş sahip olmak zorunda kalacaktır. </li><li> Şekil 6&#39;da gösterildiği gibi, pense yardımı ile yarılmış plakanın diğer ucu bükülür. (Bu adım isteğe bağlıdır). </li><li> Zaman sıvı azot içinde, Şekil 6&#39;da gösterildiği gibi daha iyi cihazı kavramak için köpük ile sap kaydırılır. (Isteğe bağlı) Not: otoklav öncesinde köpük çıkarın. </li></ol> 2. Cryovials Almak İçin Cryotolerant Cihaz Meclisi Cryotolerant DIY alma cihazı da cryovials alımı için adapte edilebilir. Bu sıvı azot (Şekil 7) şişeleri dışarı karıştırıyordu değiştirilmiş gösterildiği gibi bir paslanmaz çelik süzgeç ile düz taban yerine içerir. <ol><li> Sökün Crown fındık ve oluklu levha için güçlü-kravat T kayışı takılarak civatalar. </li><li> Oluklu levha paslanmaz çelik süzgeç takmadan önce, hafifçe boyun eğmek., bu kolay cihaz ile manevra yapacak süzgeç bir dudak gelirse, dudak aşağı eğmek için pense kullanın: Bir kepçe (Şekil 8) Not benzemek için bir açıyla yönlendirmek tabanına pense yardımı ile boşaltın. </li><li> Oluklu plaka üzerinde delikler ile birlikte süzgeç sap üzerinde delik hizalayın ve Hillman fındık ve Şekil 8&#39;de gösterildiği gibi cıvata yardımıyla Not süzgeci sabitleyin:. Süzgeç ön delikli gelmezse, size ihtiyacınız olacak karbür matkap ile delinmiş deliklere sahip düzenlemek. </li></ol> 3. Dewar itibaren Cryoboxes ve Cryovials alınıyor <ol><li> Başlamak için, kriyojenik eldiven takın ve manevra için oda izin Dewar 1 veya 2 Dondurucu rafları çıkarın. </li><li> Yavaşça güçlü-kravat T taban kayışı (Şekil 5) ile donatılmış dik Cryotolerant DIY alma cihazı ile Dewar alt kısmındaki kazıyorum ve kutu falle toplamak, hemen bir ılımanlaştırma nesne ile temas üzerine Sıvı azot kaynar azot gazı (Leidenfrost etkisi) yalıtım nesnesi zarflama. Dewar tankı Not altına n. Örneklerin alma önce cihaza soğutmak için, yavaş yavaş Dewar içine batırmak cihazı ve sıvı azot yukarıda adım geçmeden önce yeterince cihazı soğutulur. </li><li> Tankın dışına dondurucu kutusunun oymak için Dewar duvarları boyunca dik cihazı çekin. </li><li> Dewar altına alınan kutu tut. </li><li> Cryovials almak için, hafifçe bir süzgeç (Şekil 9) ile donatılmış cryoscoop ile Dewar alt kazıyın. </li><li> Cryobox alma benzer, dik cihaz çekin ve süzgeç toplanan şişeleri yakala. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Gen çalışmaları büyük bir zorluk RNA kalitesini saklama koşullarına bağlı olduğunudondurulmuş doku örnekleri ve RNA 4 ayıklanır. Şekil 10 ikisi için toplam RNA bütünlüğü üzerine numune işleme etkisini gösterir. Aynı doku kaynağı (insan adipoz) toplam RNA farklı numune işleme tabi tutuldu. Önce deneme için, sağlam toplam RNA preperatı yaklaşık iki kat 18S rRNA bant (Şekil 10, hat 1) gibi yoğun olarak 28S rRNA bandı ile net 28S ve 18S rRNA bantları gösterir. 18S yoğunluk oranı 2:1 5 ayrılmaktadır: Bu, 2:1 oranında (28S: 18S) kısmen bozulmuş RNA yayma, ya da 28S olarak görünürken, RNA sağlam olduğunu bir göstergesidir. 3-4 Lanes önemli ölçüde bozulma ile RNA örnekleri gösteriyor. Bu RNA örnekleri böylece periyodik düşmüş şişeleri ve kutuları hatırlama (Şekil 10, Lane 3-4 gerekliliği nedeniyle boşaltılması ile uzun süreli depolama modelleme, Dewar (Yöntem A) kısa vadeli alımlar tarafından tekrar kısmi defreezing tabi tutuldu ). Bununla birlikte, örnekler Dewar servisli saklananDIY cihazı (Yöntem B) kullanılarak ve böylece herhangi bir kısmi defreezing, bozulmamış RNA (Şekil 10, Lane 2) içerir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig1.jpg" /> Şekil 1.. A) 3 temel iki taraflı güçlü-kravat gösterilen boyutları oluşur. Her güçlü-kravat büyük bir önceden delinmiş delik (katı ok) ve her yüzünde birden fazla küçük delik (küçük ok) içerir. Bu somun ve civata ile bağlantı sağlamak için bir seçenek sağlar. Ayrıca küçük delikler numune alımı sırasında sıvı azot hızlı drenaj sağlar. B) güçlü-kravat her bir tarafı L şeklinde güçlü-kravat yapmak için pense yardımı ile doğruldu edilir. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig2.jpg" /> Şekil 2. Güçlü-kravat T kayışı birlikte güçlü bağları korumak için kullanılır. Güçlü-kravat gibi, T-kayışı büyük bir önceden delinmiş delik (katı ok) ve iki küçük delik (smal varHer köşesinde l ok). Somun ve cıvata kullanılarak Askı - Bu T uzunluğu boyunca güçlü bağları güvence sağlar. Ayrıca, yarıklı plakasına T-kayışı sabitleme sağlar. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig3.jpg" /> Şekil 3. A) Her bir güçlü-kravat) B. Taç cıvata somun, cıvata ve pullar kullanarak uzunluğu boyunca, T-kayışı bir köşesine bağlanır İki güçlü bağları 5 ½ inç X 5 ½ almak için birbirine bitişik güvenli cryoboxes inç. X 2 inç 2 gibi küçük cryoboxes için içeri, tek bir güçlü-kravat bir T-kemersiz oluklu levha doğrudan bağlanabilir. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig4.jpg" /> Şekil 4. Düz plaka kolu olarak kullanılır Oluklu. Oluklu plakası uzunluğu Dewar derinliği bağlıdır. Bu durumda, yarıklı plakanın 4 ayak kullanılmıştır. Oluklu levha kalınlığı kritik sDewar dolu sıvı azot örnekler alınırken ince oluklu levhalar (&lt;14 ölçü) cihazı dayanıksız hale ince. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/3903/3903fig5.jpg" /> Şekil 5. Güçlü bağları ve T kayışı oluşan düz taban sonra oluklu levha bir ucunda sabitlenir. T kayışı kalan köşesinde büyük delik düz plaka üzerinde yuva ile uyumlu ve hex cıvata ve somun ile bağlanır. Bu cihaz şu anda Dewar gelen cryoboxes almak için de kullanılabilir. <img alt="Şekil 6" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig6.jpg" /> Şekil 6. Oluklu düz plaka bir ucu, pense ile bükülür ve özellikle de, bu durumda gösterilen derin Dewar, daha iyi kavrama sağlamak için köpük ile kaplıdır. <img alt="Şekil 7" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig7.jpg" /> Şekil 7. Tel örgü ve paslanmaz çelik saplı SüzgeçDewar gelen cryovials almak için kullanılır. Kolu yuvası ile sağlanan değilse, karbür matkap ucu ile delik delmek için gerekli olacaktır. <img alt="Şekil 8" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig8.jpg" /> Şekil 8. Cryovials alınmasını kolaylaştırmak için, süzgeç kepçe şeklindeki süzgeç almak için pense ile birlikte boyun bükülür. Süzgeç Bu durumda olduğu gibi dudağı sağlanmamışsa, bu pense bükmek için kullanılabilir. Bu süzgeç Dewar içinde yakalanmak değil sağlar. <img alt="Şekil 9" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig9.jpg" /> Şekil 9. Süzgeç altıgen somun ve cıvata kullanılarak bir ucunda oluklu düz plaka üzerine sabitlenir. <img alt="Şekil 10" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig10.jpg" /> 10 Şekil. RNA örnek bütünlüğünü farklı numune alma şartlarına tabi. Keşfetmek için RNA kalite c işleme örnek tarafından nasıl etkilendiğinionditions, aynı kaynaktan RNA örnekleri arasında bir dizi handlings için iki yöntem tabi tutuldu. Yöntem A böylece DIY cihaz kullanarak örnek almasını tabi Dewar, hiçbir kısmi defreezing RNA depolama oluşuyordu. Yöntem B böylece periyodik düşmüş örnekleri almak için boşaltma ile uzun süreli depolama modelleme, Dewar kısa vadeli alımlar tarafından tekrar kısmi defreezing maruz Dewar RNA depolama oluşuyordu. Toplam RNA bütünlük sonra jel elektroforezi ile analiz edildi. Lane1: Örnek önce Dewar depolama; Lane 2: Yöntem A tarafından alınmalarını tabi Dewar örnek; Lane 3, 4: Yöntem B tarafından alınmalarını tabi Dewar örnek; M: 100 bp merdiveni.

<ol>
	<li>Kittel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advances in Cryogenic Engineering. , 41 (1996).</li><li>Edeskuty, F. J., Walter, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Stewart Safety in the handling of cryogenic fluids. , (1996).</li><li>Council, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Prudent Practices in the Laboratory: Handling and Management of Chemical Hazards. , (2011).</li><li>Muyal, J., Muyal, V., Kaistha, B., Seifart, C., Fehrenbach, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+comparison+of+RNA+extraction+techniques+from+frozen+and+fresh+lung+tissues:+checkpoint+towards+gene+expression+studies.">Systematic comparison of RNA extraction techniques from frozen and fresh lung tissues: checkpoint towards gene expression studies.</a> Diagnostic Pathology. 4, 9 (2009).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (2001).</li><li>Holland, N. T., Smith, M. T., Eskenazi, B., Bastaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+sample+collection+and+processing+for+molecular+epidemiological+studies.">Biological sample collection and processing for molecular epidemiological studies.</a> Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 543, 217-234 (2003).</li><li>Lynch, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CELL,+TISSUE+AND+ORGAN+CULTURE+|+Storage+and+Cryopreservation.">CELL, TISSUE AND ORGAN CULTURE | Storage and Cryopreservation.</a> Encyclopedia of Rose Science. , 106-111 (2003).</li><li>Crawford, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plastics Engineering. , (1998).</li><li>Gorenc, B., Tinyou, R., Syam, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Steel designers' handbook. , (1996).</li><li>Harper, C. A., Petrie, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastics+materials+and+processes:+a+concise+encyclopedia.">Plastics materials and processes: a concise encyclopedia.</a> Wiley-Interscience. , (2003).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Dewar tankın dibinden cryoboxes ve cryovials almak en yaygın yöntemlerden biri yedek bir kap içine sıvı azot boşaltacaktır ve şişede kalan veya dekante sıvı azot içinde yüzen örnekleri çekin etmektir. Ancak bu, sıvı azot buharı uzun süre maruz 2. nedeniyle kriyojenik yanıklara veya boğulmaya neden olabilecek güvenli olmayan bir uygulamadır. Düşmüş cryovials alımı Diğer yaygın yolu cryovial maşa 3 kullanımını gerektirir. Bununla birlikte, sıvı azot ile doldurulm...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Hillman Grup Kaplama Oluklu Düz 1-3/8 x 4 metre; 14 Gauge </td><td> Yerel Donanım dükkanı </td><td> N / A </td><td> 1 birim gerekli </td></tr><tr><td> Taç Bolt Paslanmaz Çelik # 6 - Oval Başkanı Phillips Sürücü Makine Vida 32 inç x 3/8 </td><td> Yerel Donanım dükkanı </td><td> Model # 42281 </td><td> Gerekli 4 adet </td></tr><tr><td> Taç Bolt Çinko Kaplama Çelik Fender Yıkayıcılar inç x 1-1/2 3/8 inç </td><td> Yerel Donanım dükkanı </td><td> Model # 20122 </td><td> Gerekli 4 adet </td></tr><tr><td> Taç Bolt Çinko Kaplama # 8-32 Makine Vida Somun </td><td> Yerel Donanım dükkanı </td><td> Model # 18512 </td><td> Gerekli 4 adet </td></tr><tr><td> Simpson Güçlü-Kravat BC40Z Yarım Baz 4 inç In.x4 </td><td> Yerel Donanımalışveriş </td><td> Model # BC40Z </td><td> Gerekli 2 adet </td></tr><tr><td> T Askı inç x 6 inç Simpson Strong-Tie 6 </td><td> Yerel Donanım dükkanı </td><td> Model # 66T </td><td> 1 birim gerekli </td></tr><tr><td> Oneida 6 &quot;Mesh Süzgeç </td><td> Yerel Bakkal dükkanı </td><td> Model # 7859W </td><td> 1 birim gerekli </td></tr><tr><td> Hillman Grup Hex Fındık 3/8-16 Galvanizli </td><td> Yerel Donanım dükkanı </td><td> Model #: 810.509 </td><td> Gerekli 6 adet </td></tr><tr><td> Hillman Grup Hex Cıvata 3/8- 16 Galvanizli </td><td> Yerel Donanım dükkanı </td><td></td><td> Gerekli 4 adet </td></tr><tr><td> Izolasyonu için köpük </td><td> Yerel Donanım dükkanı </td><td></td><td> 1 birim gerekli </td></tr><tr><td> Sürücü Vida </td><td> Yerel Donanım dükkanı </td><td></td><td> 1 birim gerekli </td></tr><tr><td> Kerpeten </td><td> Yerel Donanım dükkanı </td><td></td><td> 1 birim gerekli </td></tr></tbody></table>

do-it-yourself device for recovery of cryopreserved samples accidentally dropped into cryogenic storage tanks

Sıvı nitrojen (-196 ° C) sıvı basıncı altında tutulması son derece soğuk, kokusuz, renksiz. Bu, genellikle kan, hücre ve doku 1,2 gibi biyolojik maddeler uzun süreli depolama için bir kriyojenik sıvısı olarak kullanılır. Sıvı azot kriyojenik doğası, numune korunması için ideal iken, kişi canlı dokuların hızlı dondurma neden olabilir - &#39;kriyojenik yanık&#39; 2 olarak bilinen, yakın depolama ve Dewar numune alımı ilgili kişiler şiddetli soğuk yakmasına yol açabilir. Ayrıca sıvı azot buharlaşır gibi, havadaki oksijen konsantrasyonu azaltır ve özellikle kapalı alanlarda 2, asfiksi neden olabilir. Laboratuvarlarımızda, biyolojik örnekler genellikle Dewar tankları 1 içinde paslanmaz çelik raflara yığılmış cryovials veya cryoboxes saklanır. Bu depolama rafları rafları dışarı kaymasını kutuları önlemek için uzun bir şaft ile ve dibine verilmektedirRutin kullanım sırasında Dewar. Tüm çok sık, ancak, değerli örnekleri ile kutular veya şişeleri dışarı kayma ve sıvı nitrojen dolu tankın dibine çöker. Bu gibi durumlarda, numuneler tediously yedek bir kap veya atmadan içine sıvı azot transfer sonra elde edilebilir. Kutuları ve şişeleri sonra nispeten güvenli boşalttı Dewar kurtarıldı olabilir. Ancak, sıvı azot, genişleme hızının kriyojenik doğa batık numune alma tehlikeli hale getirir. Genellikle numune alma tek bir kişi tarafından gerçekleştirilen asla bu Emniyet Müdürlükleri tarafından önerilir. Başka bir alternatif flakon 3 çıkarmak için piyasada bulunan serin gaspçı veya maşa kullanmaktır. Ancak, koyu sıvı dolu Dewar içinde sınırlı görünürlük kullanımı önemli bir sınırlama teşkil etmektedir. Bu makalede, güvenli bir iki kriyojenik sıvılar içeren Dewar numune alma yapan bir Cryotolerant DIY alma cihazı, inşaat tarifnd kolay.

Watch this Scientific Journal Video about Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks at JoVE.com

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Burada sıvı nitrojen dolu Dewar tanklardan numune alımı için düşük maliyetli, dayanıklı cryotolerant cihaz sunuyoruz. Inşaat ve cihaz modüler tasarım kolaylığı kriyojenik tanklarından numune alma işlemi güvenli ve kolay hale getirir.

KRİYOPREZERVE Numune Kurtarma için Do-It-Yourself Aygıt yanlışlıkla Kriyojenik Depolama Tankları içine Dropped

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

do-it-yourself-device-for-recovery-cryopreserved-samples-accidentally

Research

JoVE Journal

Biology

25.0K Görüntüleme.  George Mason University. Burada sıvı nitrojen dolu Dewar tanklardan numune alımı için düşük maliyetli, dayanıklı cryotolerant cihaz sunuyoruz. Inşaat ve cihaz modüler tasarım kolaylığı kriyojenik tanklarından numune alma işlemi güvenli ve kolay hale getirir.

Video: Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for culturing neurons. Previously, a silicon wafer was patterned with the design for the neuron microfluidic device using SU-8 and photolithography to create a master mold, or what we simply refer to as a "master". Next, we pour the silicon polymer PDMS on top of the master which is then cured by heating the PDMS to 80&deg;C for 1 hour. The PDMS forms a negative mold of the device. The PDMS is then carefully cut and lifted away from the master. Holes are punched where the reservoirs will be and the excess PDMS trimmed away from the device. Nitrogen is used to blow away any excess debris from the device. At this point the devices are now ready for use and can either bonded to corning No. 1 cover glass with a plasma sterilizer/cleaner or can be reversibly bound to the cover glass by simply placing the device on top of the cover glass. The reversible bonding of the device to glass is covered in a separate video and requires first that the device be sterilized either with 70% ethanol or by autoclaving. Plasma treating sterilizes the devices so no further treatment is necessary. It is, however, important, when plasma-treating the devices, to add liquid to the devices within 10 minutes of the plasma treatment while the surfaces are still hydrophilic. Waiting longer than 10 minutes to add liquid to the device makes it difficult for the liquid to enter the device. The neuron devices are typically plasma-bound to cover glass and 0.5 mg/ml poly-L-lysine (PLL) in pH 8.5 borate buffer is immediately added to the device. After a minimum of 3 hours incubating with PLL, the devices are washed with dH2O water a minimum of 3 times with at least 15 minutes between each wash. Next, the water is removed and fresh media is added to the device. At this point the device is ready for use. It is important to remember at this point to never remove all the media from the device. Always leave media in the main channel.

In this video we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to farbricate a microfluidic device for culturing neurons.

Nöron Soma ve Aksonlar compartmentalization mikroakışkan Aygıt Fabrikasyon

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for ...

Biyoloji

A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an enabling experimental tool, because it can precisely manipulate fluid flows, enable high-throughput experiments, and generate stable soluble concentration gradients.  Compared to conventional gradient generators, poly(dimethylsiloxane) (PDMS)-based  microfluidic devices can generate stable concentration gradients of growth factors with well-defined profiles.  Here, we developed simple gradient-generating microfluidic devices with three separate inlets.  Three microchannels combined into one microchannel to generate concentration gradients.  The stability and shape of growth factor gradients were confirmed by fluorescein isothyiocyanate (FITC)-dextran with a molecular weight similar to epidermal growth factor (EGF).  Using this microfluidic device, we demonstrated that fibroblasts exposed to concentration gradients of EGF migrated toward higher concentrations.  The directional orientation of cell migration and motility of migrating cells were quantitatively assessed by cell tracking analysis.  Thus, this gradient-generating microfluidic device might be useful for studying and analyzing the behavior of migrating cells.

We describe a protocol for the microfabrication of the gradient-generating microfluidic device that can generate spatial and temporal gradients in well-defined microenvironment. In this approach, the gradient-generating microfluidic device can be used to study directed cell migration, embryogenesis, wound healing, and cancer metastasis.

Hücre Biyolojisi Degrade üreten mikroakışkan Aygıt

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

Doğrudan Yetişkin Zebra balığı Böbrek Hücre Nakli

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy techniques. However, as the image is acquired in a very different way than normal, by building up an image molecule-by-molecule, there are some significant challenges for users in trying to optimize their image acquisition. In order to aid this process and gain more insight into how STORM works we present the preparation of 3 test samples and the methodology of acquiring and processing STORM super-resolution images with typical resolutions of between 30-50 nm. By combining the test samples with the use of the freely available rainSTORM processing software it is possible to obtain a great deal of information about image quality and resolution. Using these metrics it is then possible to optimize the imaging procedure from the optics, to sample preparation, dye choice, buffer conditions, and image acquisition settings. We also show examples of some common problems that result in poor image quality, such as lateral drift, where the sample moves during image acquisition and density related problems resulting in the 'mislocalization' phenomenon.

We describe the preparation of three test samples and how they can be used to optimize and assess the performance of STORM microscopes. Using these examples we show how to acquire raw data and then process it to acquire super-resolution images in cells of approximately 30-50 nm resolution.

Optimize STORM Süper Çözünürlük Mikroskopi Testi Örnekleri

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

Yüksek verim Uygulamaları Yetişkin Zebra Hearts Kurtarma

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Quasi-metagenomics sequencing refers to the sequencing-based analysis of modified microbiomes of food and environmental samples. In this protocol, microbiome modification is designed to concentrate genomic DNA of a target foodborne pathogen contaminant to facilitate the detection and subtyping of the pathogen in a single workflow. Here, we explain and demonstrate the sample preparation steps for the quasi-metagenomics analysis of Salmonella enterica from representative food and environmental samples including alfalfa sprouts, ground black pepper, ground beef, chicken breast and environmental swabs. Samples are first subjected to the culture enrichment of Salmonella for a shortened and adjustable duration (4&#8211;24 h). Salmonella cells are then selectively captured from the enrichment culture by immunomagnetic separation (IMS). Finally, multiple displacement amplification (MDA) is performed to amplify DNA from IMS-captured cells. The DNA output of this protocol can be sequenced by high throughput sequencing platforms. An optional quantitative PCR analysis can be performed to replace sequencing for Salmonella detection or assess the concentration of Salmonella DNA before sequencing.

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Here, we present a protocol to prepare DNA samples from food and environmental microbiomes for concerted detection and subtyping of Salmonella through quasimetagenomic sequencing. The combined use of culture enrichment, immunomagnetic separation (IMS), and multiple displacement amplification (MDA) allows effective concentration of Salmonella genomic DNA from food and environmental samples.&#160;

Metagenomic yarı analiz Salmonella gıda ve çevre örnekleri

Quasi-metagenomics sequencing refers to the sequencing-based analysis of modified microbiomes of food and environmental samples. In this protocol, ...

Reproductive Techniques for Ovarian Monitoring and Control in Amphibians

Ovarian control and monitoring in amphibians require a multi-faceted approach. There are several applications that can successfully induce reproductive behaviors and the acquisition of gametes and embryos for physiological or molecular research. Amphibians contribute to one-quarter to one-third of vertebrate research, and of interest in this context is their contribution to the scientific community&#39;s knowledge of reproductive processes and embryological development. However, most of this knowledge is derived from a small number of species. In recent times, the decimation of amphibians across the globe has required increasing intervention by conservationists. The captive recovery and assurance colonies that continue to emerge in response to the extinction risk make existing research and clinical applications invaluable to the survival and reproduction of amphibians held under human care. The success of any captive population is founded on its health and reproduction and the ability to develop viable offspring that carry forward the most diverse genetic representation of their species. For researchers and veterinarians, the ability to monitor and control ovarian development and health is, therefore, imperative. The focus of this article is to highlight the different assisted reproductive techniques that can be used to monitor and, where appropriate or necessary, control ovarian function in amphibians. Ideally, any reproductive and health issues should be reduced through proper captive husbandry, but, as with any animal, issues of health and reproductive pathologies are inevitable. Non-invasive techniques include behavioral assessments, visual inspection and palpation and morphometric measurements for the calculation of body condition indices and ultrasound. Invasive techniques include hormonal injections, blood sampling, and surgery. Ovarian control can be exercised in a number of ways depending on the application required and species of interest.

The study of amphibian biology provides valuable information on the reproductive, physiological, embryological and developmental processes that drive organisms of many taxonomic groups. Here, we present a comprehensive guide on different methodologies that can be used to study ovarian control and monitoring in amphibians.

Anbürlerde Ovaryalı Izleme ve kontrol için üreme teknikleri

Ovarian control and monitoring in amphibians require a multi-faceted approach. There are several applications that can successfully induce reproductive ...

Cryogenic Sample Loading into a Magic Angle Spinning Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer that Preserves Cellular Viability

Dynamic nuclear polarization (DNP) can dramatically increase the sensitivity of magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. These sensitivity gains increase as temperatures decrease and are large enough to enable the study of molecules at very low concentrations at the operating temperatures (~100 K) of most commercial DNP-equipped NMR spectrometers. This leads to the possibility of in-cell structural biology on cryopreserved cells for macromolecules at their endogenous levels in their native environments. However, the freezing rates required for cellular cryopreservation are exceeded during typical sample handling for DNP MAS NMR and this results in loss of cellular integrity and viability. This article describes a detailed protocol for the preparation and cryogenic transfer of a frozen sample of mammalian cells into a MAS NMR spectrometer.

Presented here is a protocol for cryogenic transfer of frozen samples into the dynamic nuclear polarization (DNP) magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) probe. The protocol includes directions for rotor storage prior to the experiment and directions for viability measurements before and after the experiment.

Hücresel Canlılığı Koruyan Sihirli Açı Dönen Nükleer Manyetik Rezonans Spektrometresine Kriyojenik Örnek Yükleme

Dynamic nuclear polarization (DNP) can dramatically increase the sensitivity of magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. ...

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits obesity and many associated diseases including cardiovascular disorders, type II diabetes, and cancer. To advance the current understanding of lipid metabolic regulation, quantitative methods to precisely measure in vivo lipid storage levels in time and space have become increasingly important and useful. Traditional approaches to analyze lipid storage are semi-quantitative for microscopic assessment or lacking spatio-temporal information for biochemical measurement. Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology that enables rapid and quantitative detection of lipids in live cells with a subcellular resolution. As the contrast is exploited from intrinsic molecular vibrations, SRS microscopy also permits four-dimensional tracking of lipids in live animals. In the last decade, SRS microscopy has been widely used for small molecule imaging in biomedical research and overcome the major limitations of conventional fluorescent staining and lipid extraction methods. In the laboratory, we have combined SRS microscopy with the genetic and biochemical tools available to the powerful model organism, Caenorhabditis elegans, to investigate the distribution and heterogeneity of lipid droplets across different cells and tissues and ultimately to discover novel conserved signaling pathways that modulate lipid metabolism. Here, we present the working principles and the detailed setup of the SRS microscope and provide methods for its use in quantifying lipid storage at distinct developmental timepoints of wild-type and insulin signaling deficient mutant C. elegans.

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy allows selective, label-free imaging of specific chemical moieties and it has been effectively employed to image lipid molecules in vivo. Here, we provide a brief introduction to the principle of SRS microscopy and describe methods for its use in imaging lipid storage in Caenorhabditis elegans.

Uyarılmış Raman Saçılma Mikroskopisi Kullanılarak Caenorhabditis elegans Lipid Depolama Dinamiklerinin Etiketsiz Görüntülenmesi

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits ...

Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current state-of-the-art cryoET combined with subtomogram averaging analysis enables the high-resolution structural determination of macromolecular complexes that are present in multiple copies within tomographic reconstructions. Tomographic experiments usually require a vast amount of tilt series to be acquired by means of high-end transmission electron microscopes with important operational running-costs. Although the throughput and reliability of automated data acquisition routines have constantly improved over the recent years, the process of selecting regions of interest at which a tilt series will be acquired cannot be easily automated and it still relies on the user's manual input. Therefore, the set-up of a large-scale data collection session is a time-consuming procedure that can considerably reduce the remaining microscope time available for tilt series acquisition. Here, the protocol describes the recently developed implementations based on the SerialEM package and the PyEM software that significantly improve the time-efficiency of grid screening and large-scale tilt series data collection. The presented protocol illustrates how to use SerialEM scripting functionalities to fully automate grid mapping, grid square mapping, and tilt series acquisition. Furthermore, the protocol describes how to use PyEM to select additional acquisition targets in off-line mode after automated data collection is initiated. To illustrate this protocol, its application in the context of high-end data collection of Sars-Cov-2 tilt series is described. The presented pipeline is particularly suited to maximizing the time-efficiency of tomography experiments that require a careful selection of acquisition targets and at the same time a large amount of tilt series to be collected.

The increasing demand for large-scale data collection in cryogenic electron tomography requires high-throughput image acquisition routines. Described here is a protocol that implements the recent developments of advanced acquisition strategies aimed at maximizing the time-efficiency and throughput of tomographic data collection.