Biz Hisayoshi Nozaki (Tokyo Üniversitesi), Takashi Nakada (Keio Üniversitesi), Yuka Marukawa Hashimoto (Japonya Kadın Üniversitesi) ve Hiroyuki Sekimoto (Japonya Kadın Üniversitesi) teşekkür ederim. Gözden geçirenler kendi yorum için teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışmada bilim promosyon, Japonya, Japonya toplumdan bilimsel araştırma (No. 26440223 ve 15 H 04413) için bir Grant-in-Aid ve yeni teknoloji geliştirme Vakfı Hibe Yuki Tsuchikane için tarafından desteklenmiştir.

1. toplama algler içeren su örneği
Not: Tek hücreli conjugatophytes gölleri, bataklıklar ve çeltik alanları gibi durgun tatlı su alanlarda büyümek. Bir yosun içeren su örneği bir kültür yük üretmek için bu ortamların birini toplanır. Aşağıdaki öğeler işlemine başlamadan önce ihtiyaç vardır: bir plankton net, tek kullanımlık bir pipet ve bir şişe veya su örnekleri toplamak için bir 50 mL tüp.
<ol><li>Bir göl ortamında net bir plankton yosun denizden toplamak için kullanın. Amaca bağlı olarak uygun bir net kullanın. Not: Net üst kısmındaki Su geçirgen. Tarafından net yakaladı yosun plankton net alt kapsayıcıya yoğunlaşmıştır. Kaba bir kafes küçük yosun geçmesine izin verir. İyi bir kafes kolayca tıkanmış.</li>
	<li>(Yaklaşık 50 mL) su 50 mL tüp ya da 100 mL plastik şişe aktarmak. Konsantre su örneği laboratuvara getir.</li>
	<li>Tek hücreli conjugatophytes de bataklıklar veya çeltik alanlarını büyümeye. Bu sığ su gibi yerlerde, algler içeren su örneği doğrudan bir damlalık ile tatmak mümkündür. Ardından 50 mL tüp ya da 50 mL plastik şişe su (30-50 mL) aktarın. Not: örnek herhangi bir toprak içermiyor olabilir böylece su dikkatle toprak yüzeyi üzerinde örneklenir.</li>
</ol>2. onay alg
Not: Aşağıdaki öğeler gereklidir: bir büyüteç veya taşınabilir mikroskop ve 60 mm çanak gözlem için.
<ol><li>Tek kullanımlık pipet ise yosun örnek varlığını doğrulamak için örnek doğrudan gözlemlemek için Büyüteç kullanın. Not: Yaklaşık büyük hücreler kolayca 400-1000 µm (Örneğin, Closterium ehrenbergii) uzunluğunda olabilir gözlenen bu yöntemi kullanarak.</li>
	<li>Yosun taşınabilir mikroskop altında onaylamak için bir plastik laboratuvar tabağına su örneği dökün.<ol>
<li>Üst yarısı iç kısmı (yaklaşık 3 mL) örnek koymak (kapak) 60 mm Petri dish, sonra alt yarısında, üst kapak iç kısmı karşı karşıya onun alt kısmı ile yer. Not: Bu yöntem örnek hareket etmesini tutar ve gözlem kolaylaştırır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. yalıtım için cam kapiller pipet Pasteur pipet üzerinden hazırlanması
Not: işlemi başlamadan önce aşağıdaki öğeler gereklidir: Pasteur Pipetler, bir raf Pasteur Pipetler, eldiven, bir lastik ampul, bir ruh lamba, metanol ruhu lamba, bir çakmak, forseps, çöp kutusu, camlar için için için steril ve temiz oda veya laminar akış hood (gerekirse).
<ol><li>Bir alkol brülör tutuşturmak.<ol>
<li>İnce cam kapiller pipet yalıtım için üretmek için alev değil titreşen emin olun. Alev keskinleştirmek ve Pasteur pipet ucu, eritin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Isı Steril cam Pasteur pipet forseps kullanarak el ile ve ipucu yan tarafında kauçuk ampul desteklenir, alev üzerinde.</li>
	<li>Pasteur pipet alev kapalı almak ve o streç.<ol>
<li>Cam eritme, hızlı bir şekilde Pasteur pipet alev kaldırmak ve sonra çekin. Not: Bu deneyde, Pasteur pipet 15-20 cm. tarafından Make emin alev kapatın çekerek sırasında olan pipet uzatıldı.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cam kapiller pipet ucu için uygun uzunlukta kesin. Selam bölümü en iyi olduğu için için belgili tanımlık uç idealdir. Not: Bu çalışmada, bir cam kapiller pipet ucu 5-10 cm ile hazırlanmıştır.<ol>
<li>Kılcal erime sonra atmak ve alev koymak onaylamak emin olun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cam kapiller pipet yayımlanan kabarcıklar açılış belgili tanımlık uç boyutunu gösterir. İzole edilmesi için hücre için doğru boyutu seçin. Kabarcıklar yaklaşık 1 mm Closterium türler, yalıtım ile 10-20 µm hücre genişlikleri için uygun.</li>
</ol>4. tek hücreli yalıtım cam kapiller pipet tarafından
Not: Başlamadan önce aşağıdaki öğeleri ihtiyaç vardır: bir ters ışık mikroskobu, watch gözlük, bir plastik tabak ve steril dişli test CA Orta (Tablo 1) içeren veya CA orta7şartına tüpleri.
<ol><li>Bir kaç saat gözlük (22 mm çapında ve 1 mm derinlik), her içeren 1 mL steril CA orta hazırlayın.</li>
	<li>Hedef hücre alanında toplanan su örneği üzerinden ayırma.<ol>
<li>Hedef hücreleri içeren plastik tabak içine su örneği (yaklaşık 30-40 mL) dökün.</li>
		<li>Örnek bir ters ışık mikroskobu altında Plastik tabak kesilmediğini gözleyerek, cam kapiller pipet kullanarak tek hücreleri seçin.</li>
		<li>Hücre hücre aspirasyon kılcal eylem tarafından kolaylaştırmak için yakın cam kapiller pipet getir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hücreleri 1 mL steril CA Orta (Şekil 1a) içeren bir izleme cam içine aktarın.</li>
	<li>Tekrar bir yeni cam kapiller pipet steril CA ortamdan kullanarak hücreleri almak ve steril CA Orta (Şekil 1b) içeren bir ikinci izle cam için transfer. Not: Bu işlem tek bir hücre spot plaka (Şekil 1 c) izole kadar yinelenir.</li>
	<li>Yeni bir cam kapiller pipet kullanarak tek hücre kadar almak ve sonunda CA orta veya şartına CA Orta (Şekil 1 d) 14 mL içeren bir test tüpünde aktarın. Örnek bir 16-h ışık: 8 altında 23 ° C'de kuluçkaya-h karanlık döngüsü 2 hafta boyunca. Not: hücre bölünmesi4kolaylaştırmak için klimalı ortamda çevresini hücre büyümesini salgılanan, bilinmeyen factor(s) hücre çoğalması için eklenmiştir. Klonal bir kültür kurulmuşsa, kültür orta4şartına CA orta hazırlayın. Kültür başarılı olursa yeşile döndürür.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Wickett, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylotranscriptomic+analysis+of+the+origin+and+early+diversification+of+land+plants.">Phylotranscriptomic analysis of the origin and early diversification of land plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, E4859-E4868 (2014).</li><li>Delwiche, C. F., Cooper, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolutionary+origin+of+a+terrestrial+flora.">The evolutionary origin of a terrestrial flora.</a> Current Biology. 25, R899-R910 (2015).</li><li>Daste, P., Neuville, D., Victor-Baptiste, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+procedure+for+obtaining+clonal+isolation+of+diatoms.">A simple procedure for obtaining clonal isolation of diatoms.</a> British Journal of Psychology. 18, 1-3 (1983).</li><li>Pringsheim, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pure Cultures of Algae: Their Preparation and Maintenance. , 119 (1946).</li><li>Sieracki, M., Poulton, N., Crosbie, N., Andersen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+isolation+techniques+for+microalgae.">Automated isolation techniques for microalgae.</a> Algal Culturing Techniques: Automated isolation techniques for microalgae. , 101-116 (2005).</li><li>Andersen, R. A., Kawachi, M., Andersen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traditional+microalgae+isolation+techniques.">Traditional microalgae isolation techniques.</a> Algal Culturing Techniques: Traditional micro algae isolation techniques. , 83-100 (2005).</li><li>Abe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+nuclear+transformation+of+the+Closterium+peracerosum-strigosum-littorale+complex.">Stable nuclear transformation of the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex.</a> Plant and Cell physiology. 52, 1676-1685 (2011).</li><li>Tsuchikane, Y., Tsuchiya, M., Kokubun, Y., Abe, J., Sekimoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugation+processes+of+Penium+margaritaceum+(Zygnemophyceae,+Charophyta).">Conjugation processes of Penium margaritaceum (Zygnemophyceae, Charophyta).</a> Phycological Research. 59, 74-82 (2011).</li><li>Kanda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-based+knockouts+reveal+that+CpRLP1+is+a+negative+regulator+of+the+sex+pheromone+PR-IP+in+the+Closterium+peracerosum-strigosum-littorale+complex.">CRISPR/Cas9-based knockouts reveal that CpRLP1 is a negative regulator of the sex pheromone PR-IP in the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex.</a> Scientific Reports. 7, 17873 (2017).</li><li>Ichimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mating+types+and+reproductive+isolation+in+Closterium-ehrenbergii+Meneghini.">Mating types and reproductive isolation in Closterium-ehrenbergii Meneghini.</a> Botanical Magazine-Tokyo. 94, 325-334 (1981).</li><li>Sekimoto, H., Satoh, S., Fujii, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+physiological+properties+of+a+protein+inducing+protoplast+release+during+conjugation+in+the+Closterium+peracerosum-strigosum-littorale+complex.">Biochemical and physiological properties of a protein inducing protoplast release during conjugation in the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex.</a> Planta. 182, 348-354 (1990).</li><li>Ichimura, T., Watanabe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Closterium+calosporum+complex+from+the+Ryukyu+Islands-Variation+and+taxonomical+problems.">The Closterium calosporum complex from the Ryukyu Islands-Variation and taxonomical problems.</a> Memoirs of the National Science Museum. 7, (1974).</li><li>Provasoli, L., Pintner, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+media+for+fresh-water+algae:+problems+and+suggestions+.">Artificial media for fresh-water algae: problems and suggestions .</a> The Ecology of Algae, a symposium held at the Pymatuning Laboratory of Field Biology on June 18 and 19, 1959. , 84-96 (1960).</li><li>Provasoli, L., Tryon, C. A., Hartmann, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Media++&amp;+prospects+for+the+cultivation+of+marine+algae.">Media &amp; prospects for the cultivation of marine algae.</a> Proceedings of U. S.-Japan Conference in Hakone, Japan. , 63-75 (1968).</li><li>Guillard, R. R. L., Andersen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+methods+for+microalgae.">Purification methods for microalgae.</a> Algal Culturing Techniques: Purification methods for microalgae. , 117-132 (2005).</li></ol>

Mevcut yöntemini kullanarak, Closterium sp. 9 klonal kültür suşları %60 başarı oranı temsil eden su örneği (Inba1), izole 15 hücrelerden kuruldu. Tür kimliği gelecekte morfolojik gözlem yanı sıra moleküler filogenetik Analizi8gibi DNA analizleri yapılacaktır.
Mevcut yönteminde su örneği tazelik için başarı oranı önemlidir. Su örnekleri hücrelerden en kısa zamanda alan koleksiyonu sonra ayırmak daha iyidir. Her ne kadar Closterium türlerinin (Örneğin, C. ehrenbergii, C. peracerosum-strigosum-littorale karmaşık) hücreleri su örnek için 7 d 4-8 ° C'de depolayarak korunabilir, yalıtım hücrelerin arzu edilir Rezervasyonun yapıldığı gün toplama ya da öbür gün. Yani çamaşır Tekrarlamaların sayısını artırmayı hedef hücreleri dışında herhangi bir kirletici kaldırmak önemlidir (Örneğin, > 3 x) kültürlerin bir kirlenme mikroorganizmaların toprak ve hücreleri tarafından engel olabilir.
Bu tekniğin bir sınırlama kültür bu protokol (CA veya şartına CA orta) için kullanılan ortam her zaman tüm conjugating algler için uygun değildir. Bazı durumlarda, başka bir ortam, aynı zamanda farklı ışık ve sıcaklık koşullarında kullanmayı düşünün gerekebilir. Ayrıca, bu bir kültür bir tek hücreden büyüdü olup olmadığını kanıtlaması zor olduğundan, doğru bir şekilde sadece 1 hücre hücreleri bir test tüpünde aktarırken almak gereklidir. Bu nedenle, Transfer bir yeni cam kapiller pipet ile her zaman yapılmalıdır.
Klonal bir kültür yöntemi yıkama Bu pipet ile kurulması bir klasik/standart yöntemdir ve bir çalışma için istediğiniz hücreleri izole etmek için kullanmak için en güvenilir yöntemdir. Birçok çalışmalar8,9,10,11 kullanılan yosun conjugating klonal kültürleri mevcut yöntemini kullanarak kuruldu. Conjugating yosun klonal bir kültür olmadan analiz etmek zordur. Ayrıca, son yıllarda de novo tüm genom dizileri (MinION nanopore sequencer kullanarakÖrneğin,) elde etmek kolay oldu ve klonal kültürler oluşturma de novo sıralama daha da kolaylaştıracaktır. Başka bir deyişle, bu yöntem ilk adım gelecekte onların biyolojik çeşitliliğin daha iyi anlamak için bu alg eğitim olur.
Bir kararlı kültür yük oluşturmak için doğru protokolü içinde kritik belirli adımları gerçekleştirmek gereklidir. Sadece tek bir hücreye geçişini izin vermek için en uygun bir diyafram ile cam kapiller pipet hazırlanması en önemli adımdır. Cam kapiller pipet diyafram faiz hücre küçük eksen uzunluğundan daha biraz daha fazla olması gerekir. Optimum cam kapiller pipet tek bir hücre kılcal eylem tarafından Aspire. Ancak, diyafram çapı çok büyükse, kılcal da olmayan yaşam kirletici maddeler veya bile (bir) diğer organism(s), hedef hücre ek olarak çizecektir.
Bir cam kapiller pipet optimum bir diyafram ile elde etmek için aşağıdaki noktaları unutmayın. İlk olarak, alev ayağı cam kapiller pipet Isıtma dar olması gerekir. Ardından, Pasteur pipet çekerek zaman o alev kaldırılması gerekir; Aksi takdirde, Pasteur pipet diyafram çökecek.
Ekipman ve kapsayıcılar bu protokol için gösterilen temel ve değiştirilebilir. Örneğin, çok iyi plakaları izle gözlük bir kuyu ile yerine kullanarak, hücre çamaşır daha verimli hale getirilebilir. Buna ek olarak, konteyner benzer diğerleri için yedek olabilir. Tek bir hücre kültür ortamına son aşamada aktararak, klonal bir kültür kurulabilir.
Steril bir kap hazırlama ve bir mahallede çalışma axenic (kirlenmemiş) suşlar kuracak. Kontaminasyonu önlemek için daha--dan 3 x ile taze aliquots çamaşır adımı yinelemek gereklidir. Bazen bakteriler de antibiyotik15ekleyerek sterilize.
Bu yöntem desmid üzerinde (Zygnematales) yalıtım odaklı, ancak cam kapiller pipet diyafram boyutunu değiştirerek, bu farklı ölçekli plankton yalıtım için uygulanabilir.

Algler (Zygnematales düzenin) conjugating, olarak da bilinen conjugatophytes, işgal arazi bitkiler1,2hemen atalarının en yakın yaşayan akrabası olarak anahtar bir filogenetik konumu. Klonal kültürleri oluşturulmuş: yosun taksonomik, fizyolojik ve genetik çalışmalar çok çeşitli için son yıl içinde açmıştır. Doğal bir alandan mikroorganizmaların yalıtım teknikleri uzun geleneği3,4var. Son yıllarda, otomatik yalıtım teknikleri kullanarak akış sitometresi de5kurdu. Klonal bir kültür kurulması için tek bir hücre elde etmek için kullanılan en yaygın yöntemdir cam kapiller pipet6kullanarak tek hücreli yalıtım. Bu geleneksel yöntem beceri ve hassas bir deneysel protokol gerektirir.
Bu makalede, biz yosun örnekleme alanı örnekleri ve Closterium türler gibi conjugating tek hücreli alg klonal kültürler kurulması bir cam kapiller pipet kullanarak göstermek. Bitkisel hücreleri içeren su örneği bir alan sitesinden (Örneğin, bir göl, gölet veya çeltik alan) toplanır. Hücreler bir cam kapiller pipet kullanarak su örneği izole ve sonra yıkanır. Hücreleri azot takıma Orta (CA orta) içeren bir test tüpünde bir 16-h ışık: 8 altında 24 ° C'de kültürlü-s karanlık rejimi. Bu yöntem klonal kültürler oluşturmak için diğer mikroalg yalıtmak için uygundur.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sampling</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plankton net</td>
			<td>RIGO, Japan</td>
			<td>N-NO380T</td>
			<td>Mesh size: 32 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable microscope (e.g., Nature Scope FABRE)</td>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td>JAN: 4960759 206725</td>
			<td>Magnification: 20&#215;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loupe (e.g., Peak 1985 Steinheil System Magnifier)</td>
			<td>Tohkai Sangyo Co. Ltd., Japan</td>
			<td>1985-20</td>
			<td>Magnification: 20&#215;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spuit</td>
			<td>EIKEN CHEMICAL CO. LTD. Japan</td>
			<td>Sterile spuit No.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Tube (50 mL centrifuge tubes with screw caps)</td>
			<td>Labcon, USA</td>
			<td>3181-345-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle (100 mL Polycarbonate bottle)</td>
			<td>AS ONE Corporation, Japan</td>
			<td>1-7403-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm dish</td>
			<td>Asahi glass Co. Ltd., Japan</td>
			<td>1010-060</td>
			<td>&#160;For observation of algae.&#160; 60 mm/non-treated dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparation of a micropipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes (cotton plugged 9&#8221; Pasteur Pipettes)</td>
			<td>Fisher Scientific, USA</td>
			<td>13-678-8B</td>
			<td>7 &#215; 225 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber bulb (SPOID SILICONE, 1 cc)</td>
			<td>AS ONE Corporation, Japan</td>
			<td>5-5669-01</td>
			<td>10 &#215; 40 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless forceps</td>
			<td>AS ONE Corporation, Japan</td>
			<td>PT-09</td>
			<td>110 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-cell isolation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Watch glass (Blood reaction board)</td>
			<td>Sekiya Rika Co., Ltd, Japan</td>
			<td>F14-155-030</td>
			<td>to rinse cells during isolation. 22 mm diameter and 1 mm depth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Threaded test tubes&#160;</td>
			<td>Fujimotorika, Co., Ltd, Japan</td>
			<td>XX142</td>
			<td>18 &#216; &#215; 170 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted light microscope</td>
			<td>Olympus, Tokyo, Japan</td>
			<td>CKX41N</td>
			<td>for isolation of algae.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic dish</td>
			<td>Asahi glass Co. Ltd., Japan</td>
			<td>SH90-15E&#160;</td>
			<td>&#160;90 &#215; 15 mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment of a clonal culture of unicellular conjugating algae

Mikroalg kullanmak için klonal kültürleri fizyolojisi, genetik, Taksonomi ve Mikrobiyoloji gibi çeşitli konularda çalışmaları kurmak için önemlidir. Böylece, klonal kültürler kurmak için teknikleri geliştirmek son derece önemlidir. Bu makalede, biz conjugating alga klonal kültürleri kurulması göstermek. Su örnekleri tarladan toplanır. Daha sonra medyada yer ve klonal bir kültür oluşturmak için uygun koşullar altında yetiştirilen bir cam kapiller pipet, kullanarak izole hücrelerdir.

50 mL su örneği (Inba1) bir örnekleme noktasından Gölü INBA numa toplanmıştır (pH 8.1, 24,7 ° C; 35 ° 44′30. 2″N 140 ° 12′08. 2″E), Sakura-shi, Chiba, Japonya, 25 Haziran 2016. Su örneği 4-8 ° C'de depolanan Koleksiyon, bir örnek Closterium sp., ertesi günü bitkisel hücreleri içeren su örneği izole edildi. Bitkisel hücrelerin on beş özdeş morfoloji (Inba1-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -13, -14 ve -15) alınan örneğin izole edildi ve yöntemi yıkama pipet kullanarak yıkadım. On beş izole tek hücreleri bağımsız test şartına CA orta 15 mL içeren tüplerde kültürlü. Kuluçka 2 hafta sonra hücre çoğalması 9 test tüplerde gözlendi [Inba1-1, -3, -4, -5 (Şekil 2a), -6, -9, -10, -12 (Şekil 2b) ve -13; Tablo 2]. Dokuz klonal kültürler Inba1 örnek yalıtır (Şekil 3) kuruldu.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57761/57761fig1.jpg"> Resim 1 : Tek hücreli yalıtım akışının. (bir) Transfer tek hedef yosun hücre özgün su örneği steril ortamda ilk izle cam. (b, c) Hücreyi tekrar yıkamak için sonraki izle cam aktarmak. Hiçbir diğer hücreleri/kirletici hedef Orta olana bu yordamı yinelenmelidir; üç saat gözlük şemada burada örnek olarak gösterilir. (d) son olarak, yıkanmış hücre büyüme için uygun orta tüp bebek transfer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57761/57761fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57761/57761fig2v2.jpg"> Resim 2 : Bitkisel hücrelerin fotoğraflarını Closterium SP. (bir) Inba1-5 ve (b) Inba1-12 burada gösterilir. Ölçek çubuğu 50 µm. = <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57761/57761fig2v2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57761/57761fig3.jpg"> Şekil 3 : Inba1 örnek klonal bir kültürden kurulması. 2 hafta boyunca kültürlü test tüpleri altından çekildi. Yıldız işareti hücre çoğalması gösterir. Ölçek çubuğu 2 cm. = <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57761/57761fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Ortam adı</td>
			<td>Başvuru</td>
			<td colspan="2">Yorumlar</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="13">CA</td>
			<td rowspan="13">Ichimura ve Watanabe12
</td>
			<td>CA (NO3)2·4H2O</td>
			<td>2 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>KNO3
</td>
			<td>10 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>NH4NO3
</td>
			<td>5 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>Β-Na2glycerophosphate·5H2O</td>
			<td>3 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgSO4·7H2O</td>
			<td>2 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>B12 vitamini</td>
			<td>0,01 μg</td>
		</tr>
<tr>
<td>Biotin</td>
			<td>0,01 μg</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tiamin HCl</td>
			<td>1 μg</td>
		</tr>
<tr>
<td>PIV metaller</td>
			<td>0.1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fe (EDTA; olarak 1:1 molar)</td>
			<td>0.1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>40 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">100 mL yapmak için su ekleyin</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">pH 7.2 için NaOH ile ayarlamak</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="7">P IV metaller</td>
			<td rowspan="7">13 Provasoli ve Pintner
</td>
			<td>Na2EDTA·2H2O</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>FeCl3·6H2O</td>
			<td>19,6 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>MnCl2· 4H2O</td>
			<td>3.6 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>ZnCl2*</td>
			<td>1,04 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>CoCl2·6H2O</td>
			<td>0.4 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>Na2MoO4·2H2O</td>
			<td>0,25 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">100 mL yapmak için su ekleyin</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Fe (EDTA; olarak 1:1 molar)</td>
			<td rowspan="3">Provasoli14
</td>
			<td>Fe (NH4)2(yani4)2·6H2O,</td>
			<td>70,2 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>Na2EDTA·2H2O,</td>
			<td>66 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">100 mL yapmak için su ekleyin</td>
		</tr>
<tr>
<td>Klimalı CA orta</td>
			<td>Abe vd.7
</td>
			<td colspan="2">Taze CA orta hücrelerde 14-20 gün kuluçkaya. Kültürlü orta nitel filtre kağıdı kullanarak filtreleme tarafından toplamak ve ısıyla (15dk için 121 ° C) tarafından filtre uygulanmış orta sterilize.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">* İçinde imkan sağlayacaktır, 1,04 mg ZnCl2 2.2 mg ZnSO4·7H2O. tarafından değiştirilir</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Formülasyonları Bu çalışmada kullanılan medya.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Su örneği</td>
			<td>Hücrenin adını</td>
			<td>Sonra kültür durumu</td>
			<td>Soy adı</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="15">Inba1</td>
			<td>-1</td>
			<td>Hücreleri hızla</td>
			<td>Inba1-1</td>
		</tr>
<tr>
<td>-2</td>
			<td>Değişmedi</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>-3</td>
			<td>Hücreleri hızla</td>
			<td>inba1-3</td>
		</tr>
<tr>
<td>-4</td>
			<td>Hücreleri hızla</td>
			<td>inba1-4</td>
		</tr>
<tr>
<td>-5</td>
			<td>Hücreleri hızla</td>
			<td>inba1-5</td>
		</tr>
<tr>
<td>-6</td>
			<td>Hücreleri hızla</td>
			<td>inba1-6</td>
		</tr>
<tr>
<td>-7</td>
			<td>Değişmedi</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>-8</td>
			<td>Değişmedi</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>-9</td>
			<td>Hücreleri hızla</td>
			<td>inba1-9</td>
		</tr>
<tr>
<td>-10</td>
			<td>Hücreleri hızla</td>
			<td>inba1-10</td>
		</tr>
<tr>
<td>-11</td>
			<td>Değişmedi</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>-12</td>
			<td>Hücreleri hızla</td>
			<td>inba1-12</td>
		</tr>
<tr>
<td>-13</td>
			<td>Hücreleri hızla</td>
			<td>inba1-13</td>
		</tr>
<tr>
<td>-14</td>
			<td>Değişmedi</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>-15</td>
			<td>Değişmedi</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2: Yalıtım deneme Özeti.

Watch this Scientific Journal Video about Establishment of a Clonal Culture of Unicellular Conjugating Algae at JoVE.com

Establishment of a Clonal Culture of Unicellular Conjugating Algae

Tek hücreli alg Conjugating klonal bir kültür kurulması

Bu makalede, biz klonal bir doğal alanı sitesinden toplanan tek hücreli conjugating yosun türlerin kültürleri kurulması göstermek.

It is essential to establish clonal cultures of microalgae for use in studies of various topics, such as physiology, genetics, taxonomy, and microbiology. ...

establishment-of-a-clonal-culture-of-unicellular-conjugating-algae

Research

JoVE Journal

Biology

13.1K Görüntüleme.  Japan Women's University. Bu makalede, biz klonal bir doğal alanı sitesinden toplanan tek hücreli conjugating yosun türlerin kültürleri kurulması göstermek.

Video: Establishment of a Clonal Culture of Unicellular Conjugating Algae

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Erken Civciv Embriyolar ex vivo (Kültür) Kültür Yöntemi

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Biyoloji

Isolation of CD133+ Liver Stem Cells for Clonal Expansion

Liver stem cell, or oval cells, proliferate during chronic liver injury, and are proposed to differentiate into both hepatocytes and cholangiocytes. In addition, liver stem cells are hypothesized to be the precursors for a subset of liver cancer, Hepatocellular carcinoma. One of the primary challenges to stem cell work in any solid organ like the liver is the isolation of a rare population of cells for detailed analysis. For example, the vast majority of cells in the liver are hepatocytes (parenchymal fraction), which are significantly larger than non-parenchymal cells. By enriching the specific cellular compartments of the liver (i.e. parenchymal and non-parenchymal fractions), and selecting for CD45 negative cells, we are able to enrich the starting population of stem cells by over 600-fold.The proceduresdetailed in this report allow for a relatively rare population of cells from a solid organ to be sorted efficiently. This process can be utilized to isolateliver stem cells from normal murine liver as well as chronic liver injury models, which demonstrate increased liver stem cell proliferation. This method has clear advantages over standard immunohistochemistry of frozen or formalin fixed liver as functional studies using live cells can be performed after initial co-localization experiments. To accomplish the procedure outlined in this report, a working relationship with a research based flow-cytometry core is strongly encouraged as the details of FACS isolation are highly dependent on specialized instrumentation and a strong working knowledge of basic flow-cytometry procedures. The specific goal of this process is to isolate a population of liver stem cells that can be clonally expanded in vitro.

Here we describe the isolation of CD133 expressing liver stem cells and cancer stem cells from whole murine liver, a process that requires tissue digestion, cell enrichment, and flow cytometry isolation. We include methods for advanced single cell isolation and clonal expansion.

Klonal Genişleme CD133 + Karaciğer Kök Hücre İzolasyonu

Liver stem cell, or oval cells, proliferate during chronic liver injury, and are proposed to differentiate into both hepatocytes and cholangiocytes. In ...

Scale-Up of Mammalian Cell Culture using a New Multilayered Flask

A growing number of cell-based applications require large numbers of cells. Usage of single layer T-flasks, that are adequate during small-scale expansion, may become cumbersome, laborious and time-consuming when large numbers of cells are required. To address this need, the performance of a new multi-layered cell culture vessel to facilitate easy scale up of cells from single layered T-flasks will be discussed. The flasks tested are available in 3- and 5-layer format and enable culture and complete recovery of three and five times the number of cells respectively, compared to T-175 flasks. A key feature of the BD Multi-Flask is a mix/equilibration port that allows rapid in-vessel mixing as well as uniform distribution of cells and reagents within and 
between layers of each vessel and consistently produce cells that can be cultured in an environment that is congruent to T-175 flasks.
The design of these Multi-Flasks also allows for convenient pipette access for adding reagents and cells directly into the flasks as well as efficient recovery of valuable cells and reagents and reduces risk of contamination due to pouring. For applications where pouring is preferred over pipetting, the design allows for minimal residual liquid retention so as to reduce wastage of valuable cells and reagents.

Cells play an instrumental and increasing role in research, and the discovery and development of new therapeutics. With this increasing need for greater number of cells we need more efficient and effective ways for growing and harvesting attachment dependent cells. A Multilayered flask with the right features can serve this purpose.

Yeni çok katmanlı bir balon kullanarak Memeli Hücre Kültürü Ölçeği-Up

A growing number of cell-based applications require large numbers of cells. Usage of single layer T-flasks, that are adequate during small-scale ...

Establishment of Microbial Eukaryotic Enrichment Cultures from a Chemically Stratified Antarctic Lake and Assessment of Carbon Fixation Potential

Lake Bonney is one of numerous permanently ice-covered lakes located in the McMurdo Dry Valleys, Antarctica. The perennial ice cover maintains a chemically stratified water column and unlike other inland bodies of water, largely prevents external input of carbon and nutrients from streams. Biota are exposed to numerous environmental stresses, including year-round severe nutrient deficiency, low temperatures, extreme shade, hypersalinity, and 24-hour darkness during the winter 1. These extreme environmental conditions limit the biota in Lake Bonney almost exclusively to microorganisms 2.
Single-celled microbial eukaryotes (called "protists") are important players in global biogeochemical cycling 3 and play important ecological roles in the cycling of carbon in the dry valley lakes, occupying both primary and tertiary roles in the aquatic food web. In the dry valley aquatic food web, protists that fix inorganic carbon (autotrophy) are the major producers of organic carbon for organotrophic organisms 4, 2. Phagotrophic or heterotrophic protists capable of ingesting bacteria and smaller protists act as the top predators in the food web 5. Last, an unknown proportion of the protist population is capable of combined mixotrophic metabolism 6, 7. Mixotrophy in protists involves the ability to combine photosynthetic capability with phagotrophic ingestion of prey microorganisms. This form of mixotrophy differs from mixotrophic metabolism in bacterial species, which generally involves uptake dissolved carbon molecules. There are currently very few protist isolates from permanently ice-capped polar lakes, and studies of protist diversity and ecology in this extreme environment have been limited 8, 4, 9, 10, 5. A better understanding of protist metabolic versatility in the simple dry valley lake food web will aid in the development of models for the role of protists in the global carbon cycle.
We employed an enrichment culture approach to isolate potentially phototrophic and mixotrophic protists from Lake Bonney. Sampling depths in the water column were chosen based on the location of primary production maxima and protist phylogenetic diversity 4, 11, as well as variability in major abiotic factors affecting protist trophic modes: shallow sampling depths are limited for major nutrients, while deeper sampling depths are limited by light availability. In addition, lake water samples were supplemented with multiple types of growth media to promote the growth of a variety of phototrophic organisms.
RubisCO catalyzes the rate limiting step in the Calvin Benson Bassham (CBB) cycle, the major pathway by which autotrophic organisms fix inorganic carbon and provide organic carbon for higher trophic levels in aquatic and terrestrial food webs 12. In this study, we applied a radioisotope assay modified for filtered samples 13 to monitor maximum carboxylase activity as a proxy for carbon fixation potential and metabolic versatility in the Lake Bonney enrichment cultures.

Microbial eukaryotes are both a source of photosynthetically-derived carbon and top predatory species in permanently ice-covered Antarctic lakes. This report describes an enrichment culture approach to isolate metabolically versatile microbial eukaryotes from the Antarctic lake, Lake Bonney, and assesses inorganic carbon fixation potential using a radioisotope assay for Ribulose-1,5-bisphophate carboxylase oxygenase (RubisCO) activity.

Karbon Fiksasyon Potansiyel bir Kimyasal Tabakalı Antarktika Gölü ve Ölçme Mikrobiyal Ökaryotik Zenginleştirme Kültürlerinin Kurulması

Lake Bonney is one of numerous permanently ice-covered lakes located in the McMurdo Dry Valleys, Antarctica. The perennial ice cover maintains a ...

The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental biologist. For many organs it is difficult to access developing tissue to allow monitoring during ex vivo culture. The slice culture method allows access to tissue so that morphogenetic movements can be followed and specific cell populations can be targeted for manipulation or lineage tracing.
In this paper we describe a method of slice culture that has been very successful for culture of tooth germs in a range of species. The method provides excellent access to the tooth germs, which develop at a similar rate to that observed in vivo, surrounded by the other jaw tissues. This allows tissue interactions between the tooth and surrounding tissue to be monitored. Although this paper concentrates on tooth germs, the same protocol can be applied to follow development of a number of other organs, such as salivary glands, Meckel&#39;s cartilage, nasal glands, tongue, and ear.

Here we detail a method to culture tooth germs in mandible slices using a tissue chopper. This method allows unique access to the tooth during development, providing excellent opportunity for manipulation and lineage tracing, not available using more traditional culture methods.

Eksplantasyon Kültüründe Diş mikropların Geliştirme takiben için Dilim Kültür Yöntemi

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental ...

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls and carotenoids. In vivo, these proteins are folded with pigments to form complexes which are inserted in the thylakoid membrane of the chloroplast. The high similarity in the chemical and physical properties of the members of the family, together with the fact that they can easily lose pigments during isolation, makes their purification in a native state challenging. An alternative approach to obtain homogeneous preparations of LHCs was developed by Plumley and Schmidt in 19871, who showed that it was possible to reconstitute these complexes in vitro starting from purified pigments and unfolded apoproteins, resulting in complexes with properties very similar to that of native complexes. This opened the way to the use of bacterial expressed recombinant proteins for in vitro reconstitution. The reconstitution method is powerful for various reasons: (1) pure preparations of individual complexes can be obtained, (2) pigment composition can be controlled to assess their contribution to structure and function, (3) recombinant proteins can be mutated to study the functional role of the individual residues (e.g., pigment binding sites) or protein domain (e.g., protein-protein interaction, folding). This method has been optimized in several laboratories and applied to most of the light-harvesting complexes. The protocol described here details the method of reconstituting light-harvesting complexes in vitro currently used in our laboratory, and examples describing applications of the method are provided.

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

This protocol details the reconstitution of light-harvesting complexes in vitro. These integral membrane proteins coordinate chlorophylls and carotenoids and are responsible for harvesting light in higher plants and green algae.

Bitkiler ve Yeşil Alg Işık hasat Kompleksleri İn Vitro Sulandırma içinde

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the role of acidic extracellular pH in tumor aggressiveness and its underlying mechanism has not been extensively studied compared to hypoxic or nutrient starvation conditions. In addition, a well-defined culture method to mimic the acidic extracellular tumor microenvironment has not been fully reported.
Here we present a simple in vitro culture method to maintain acidic extracellular pH using reduced bicarbonate and increased lactate or HCl concentrations in the culture medium. The medium pH was sustained for at least 24 h and gradually decreased by 72 h following culture of PANC-1 and AsPC-1 pancreatic cancer cells. Three distinct acidic media conditions in this study highly upregulated pH-responsive genes such as MSMO1, INSIG1, and IDI1 compared to hypoxia or nutrient starvation. The upregulation of these genes can be used as a marker of acidic pH. These simple techniques are beneficial to elucidate underlying mechanisms of tumor malignancy under acidic tumor microenvironment. Therefore, our extracellular acidic pH culture system enables discovery of cellular acidic pH responses not only in cancer cells but also in primary cells, such as renal tubular cells, in relation to the other acidic disorders including, diabetic ketoacidosis, lactic acidosis, renal tubular acidosis, and respiratory acidosis.

The acidic tumor microenvironment plays critical roles in tumor progression. To assess the effects of acidic extracellular pH on cancer cells in vitro, we established simple acidic culture systems.

Bir hücre dışı asidik pH kültür sistemi kurulması

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches (Periplaneta americana)

Gnotobiotic animals are a powerful tool for the study of controls on microbiome structure and function. Presented here is a protocol for the establishment and maintenance of gnotobiotic American cockroaches (Periplaneta americana). This approach includes built-in sterility checks for ongoing quality control. Gnotobiotic insects are defined here as cockroaches that still contain their vertically transmitted endosymbiont (Blattabacterium) but lack other microbes that normally reside on their surface and in their digestive tract. For this protocol, egg cases (oothecae) are removed from a (nonsterile) stock colony and surface sterilized. Once collected and sterilized, the oothecae are incubated at 30 &#176;C for approximately 4&#8722;6 weeks on brain-heart infusion (BHI) agar until they hatch or are removed due to contamination. Hatched nymphs are transferred to an Erlenmeyer flask containing a BHI floor, sterile water, and sterile rat food. To ensure that the nymphs are not housing microbes that are unable to grow on BHI in the given conditions, an additional quality control measure uses restriction fragment-length polymorphism (RFLP) to test for nonendosymbiotic microbes. Gnotobiotic nymphs generated using this approach can be inoculated with simple or complex microbial communities and used as a tool in gut microbiome studies.

Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches Periplaneta americana

This protocol is used in establishing and maintaining gnotobiotic American cockroaches (Periplaneta americana) by surface sterilizing the egg cases (oothecae) prior to hatching. These gnotobiotic insects contain their vertically transmitted Blattabacterium endosymbionts but have axenic guts.

Gnotobiyotik Amerikan Hamamböceklerinin Kurulması ve Bakımı (Periplaneta americana)

Gnotobiotic animals are a powerful tool for the study of controls on microbiome structure and function. Presented here is a protocol for the establishment ...

Bovine Ovarian Cortex Tissue Culture

Follicle development from the primordial to antral stage is a dynamic process within the ovarian cortex, which includes endocrine and paracrine factors from somatic cells and cumulus cell-oocyte communication. Little is known about the ovarian microenvironment and how the cytokines and steroids produced in the surrounding milieu affect follicle progression or arrest. In vitro culture of ovarian cortex enables follicles to develop in a normalized environment that remains supported by adjacent stroma. Our objective was to determine the effect of nutritional Stair-Step diet on the ovarian microenvironment (follicle development, steroid, and cytokine production) through in vitro culture of bovine ovarian cortex. To accomplish this, ovarian cortical pieces were removed from heifers undergoing two different nutritionally developed schemes prior to puberty: Control (traditional nutrition development) and Stair-Step (feeding and restriction during development) that were cut into approximately 0.5-1 mm3 pieces. These pieces were subsequently passed through a series of washes and positioned on a tissue culture insert that is set into a well containing Waymouth&#39;s culture medium. Ovarian cortex was cultured for 7 days with daily culture media changes. Histological sectioning was performed to determine follicle stage changes before and after the culture to determine effects of nutrition and impact of culture without additional treatment. Cortex culture medium was pooled over days to measure steroids, steroid metabolites, and cytokines. There were tendencies for increased steroid hormones in ovarian microenvironment that allowed for follicle progression in the Stair-Step versus Control ovarian cortex cultures. The ovarian cortex culture technique allows for a better understanding of the ovarian microenvironment, and how alterations in endocrine secretion may affect follicle progression and growth from both in vivo and in vitro treatments. This culture method may also prove beneficial for testing potential therapeutics that may improve follicle progression in women to promote fertility.

In vitro culture of bovine ovarian cortex and the effect of nutritional Stair-step diet on ovarian microenvironment is presented. Ovarian cortex pieces were cultured for seven days and steroids, cytokines, and follicle stages were evaluated. The Stair-Step diet treatment had increased steroidogenesis resulting in follicle progression in culture.

Sığır Yumurtalık Korteks Doku Kültürü

Follicle development from the primordial to antral stage is a dynamic process within the ovarian cortex, which includes endocrine and paracrine factors ...

Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids

The liver is the largest organ in mammals. It plays an important role in glucose storage, protein secretion, metabolism and detoxification. As the executor for most of the liver functions, primary hepatocytes have limited proliferating capacity. This requires the establishment of ex vivo hepatocyte expansion models for liver physiological and pathological research. Here, we isolated murine hepatocytes by two steps of collagenase perfusion and established a 3D organoid culture as the 'mini-liver' to recapitulate cell-cell interactions and physical functions. The organoids consist of heterogeneous cell populations including progenitors and mature hepatocytes. We introduce the process in detailed to isolate and culture the murine hepatocytes or fetal hepatocyte to form organoids within 2-3 weeks and show how to passage them by mechanically pipetting up and down. In addition, we will also introduce how to digest the organoids into single cells for lentivirus infection of shRNA/ectopic construction, siRNA transfection and CRISPR-Cas9 engineering. The organoids can be used for drug screens, disease modelling, and basic liver research by modeling liver biology and pathobiology.

A long-term ex vitro 3D organoid culture system was established from mouse hepatocytes. These organoids can be passaged and genetically manipulated by lentivirus infection of shRNA/ectopic construction, siRNA transfection and CRISPR-Cas9 engineering.