Bu proje Johns Hopkins Üniversitesi, Ağ Geçidi Bilim Girişimi ve Qiagen A.Ş. aracılığıyla Provost Ofisi kısmen destek oldu

Giriş: Tek bir bakteri kolonisi, bir gece boyunca inkübe edilir, uygun bir kültür et suyu aşılamak için kullanılır. Bir bakteriyel Topak daha sonra, bir ticari olarak temin edilebilen genomik izolasyon kiti kullanılarak genomik DNA arındırmak için işlenir. Saflaştırılmış genomik DNA 260/280 (nm) oranı örnek protein arındırılmış olduğundan emin olmak için&gt; 1.8 olmalıdır. Pyrosequencing şablon üretimi için gerekli genomik DNA miktarı, 10-20 ng. Şablon A. Amplifikasyon (PyroMark PCR El Kitabı; <a href="http://www.qiagen.com/handbooks" target="_blank">www.qiagen.com / el kitapları</a> 1) PCR reaksiyonu ayarlama Not: Bir astar, 5 &#39;ucunda biotinlenmiş olmalı ve bu şablon hazırlanması için saf HPLC olması önerilir. Biz PCR ve se için PyroMark Testi Tasarım Yazılımı 2.0 tavsiyekısa okuma sıralama için optimize edilmiş sekans Primer tasarımı, ancak, Primer-BLAST ( <a href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome" target="_blank">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome</a> NCBI itibaren) da yapabilirsiniz Primer tasarımı için kullanılabilir. <ol><li> Gerekli tüm çözümleri (Tablo 1&#39;de) çözülme ve her iyice karıştırın. Tablo 1&#39;e göre reaksiyon ayarlayın. Tüm çalışmalar, oda sıcaklığında yapılabilir. </li></ol> Not: PCR Master Mix çoğu durumda tatmin edici sonuçlar verir 1.5 mM, nihai konsantrasyon için MgCl2 içerir. Daha yüksek bir Mg2 + konsantrasyonu gerekli ise, 25 mM MgCl2 kadar 3,5 ul bir reaksiyon eklenebilir. <ol start="2"><li> Iyice hafifçe aşağı yukarı pipetleme ve reaksiyon karışımı karıştırın, daha sonra PCR tüplerine uygun hacimde dağıtım. </li><li> Templat ekleHer bir PCR tüpü E DNA. Biz genomik DNA 10 ng tavsiye ederiz. </li><li> Tablo 2&#39;ye göre termal döngü programlayın. 4 nihai bir tutma ° C kolaylık sağlamak için önerilir. 100 ul mineral yağ ile ısıtılmış bir kapaksız bir termal döngü kullanıyorsanız, bindirme reaksiyonlar. </li><li> Cycler PCR tüpleri yerleştirin ve bisiklet programını başlatın. </li></ol> B. Vakum İş İstasyonu Protokolü Biyotinillenmiş PCR ürünleri hareketsizleştirici <ol><li> Şekil 4&#39;e göre bir ana karışımı olun. </li></ol> Not: pipetleme önce yavaşça homojen bir süspansiyon sağlamak için streptavidin kaplı Sepharose boncuklarının şişe çalkalanır. <ol start="2"><li> Kullanılan PCR ürününün hacmine bağlı olarak, oyuk başına 80 ul toplam hacim vermek için bir PCR plakanın her oyuğuna 60-75 ul ana karışımı dağıtın. </li><li> Her bir kuyunun 5-20 ul biotinlenmiş PCR ürün ekleyin. </li><li> Şerit ca ile kuyu Sealorbital çalkalayıcı kullanılarak, oda sıcaklığına (15-25 ° C) 5-10 dakika süreyle 1.400 rpm&#39;de PCR plaka PS ve ajitasyon. </li></ol> DNA denatürasyonu ve primer sekans ilavesi <ol><li> Tampon tavlama ile 0.3 uM sekanslama primerleri seyreltilir ve bir tepkime levhası, her kuyuya 25 ul dağıtın. Iş istasyonunda plaka yerleştirin. </li><li> Şekil 5, şemasına göre iş istasyonu olukları doldurun. </li><li> Vakum pompası açın ve vakum aracı anahtarı (Şekil 6) için ayarlanmış olduğundan emin olun. Yalak 5 yüksek saflıkta su (Milli-Q 18,2 MW x cm veya eşdeğeri) (Şekil 5) ile filtre probları yıkayın. 12. adımda kullanıma hazır ve taze yüksek saflıkta su ile doldurun çukur. </li><li> Hızlı çalışan, iş istasyonunda boncuk ile PCR plaka yerleştirin. Iki tabak örnekleri yüklenen olduğu gibi aynı yönde olduğundan emin olun. </li><li> ON vakum anahtarı ile, vakum alt20 saniye için ya da her birim aspire edilmiş kadar PCR plakanın gözleri içine aracı. Boncuk vakum aracı (Şekil 7) tarafından Çekilecek. </li><li> Hala ON vakum ile, 20 saniye boyunca% 70 etanol (çukur 1) ile aracı yıkayın veya tüm ses aspire edilinceye kadar. </li><li> ON vakum ile, 20 saniye boyunca denatürasyon solüsyonu (çukur 2) ile aracı yıkayın veya tüm ses aspire edilinceye kadar. </li></ol> Not: Denatürasyon Çözüm bir göz ve cilt tahriş edici sodyum hidroksit içerir. Her zaman laboratuvar önlüğü, eldiven ve koruyucu gözlük takın. <ol start="8"><li> ON vakum ile, 20 saniye boyunca yıkama tamponu (çukur 3) ile aracı yıkayın veya tüm ses aspire edilinceye kadar. </li><li> ON vakum ile tüm sıvı vakum aracı dışarı akmasını sağlamak için, 5 saniye 90 ° ötesinde dikey vakum aracı yükseltmek. Pompa KAPATIN ve reaksiyon plaka ile vakum aracı hizalayın. Içine vakum aracı Altkuyu ve yavaşça kuyu içeren sıralama astar içine boncuk serbest bırakmak için iki yana sallayın. </li><li> Vakum aracı temizlemek için, 10 saniye boyunca yüksek saflıkta su (çukur 4) &#39;te, filtre probları ajitasyon. </li><li> ON vakum açın ve tüm ses aspire edilinceye kadar 20 saniye veya için yüksek saflıkta su (çukur 5) ile aracı yıkayın. </li><li> 5 saniye için 90 ötesinde ° C dikey vakum aracı kaldırın, sonra vakum durur, &quot;Otopark&quot; konumunda saklayın. </li></ol> DNA ipliklerini için dizi astar tavlama <ol><li> Önceden ısıtılmış plaka tutucu reaksiyon plakası yerleştirin. </li><li> 2 dakika 80 bir ısıtma bloğu ° C plaka ısıtın. </li><li> 5 dakika boyunca oda sıcaklığında soğumaya sayaç üzerinde tutucu ve yerden plaka çıkarın. </li></ol> Pyromark S24 Çalışma Not: Güç kablosunu üzerinde bulunan güç düğmesini kullanarak cihazı açın. Startup 1 dakika kadar sürebilir. <ol><li> PyroMark Altın Q24 Reaktifler El Kitabı 2 verilen talimatlara göre bir kartuş doldurun. Cihaz yazılım bir çalışma dosyası kurmak, gerekli hacmi belirlemek ve Araçlar menüsünde Çalıştır Öncesi Bilgi seçmek için </li><li> Cihazda zaten, bu bir çalışma performans sağlamak ve daha sonra kapağı açın. Bunu yapmak için güvensiz olduğunda kapak açıldığında sesli bir ikaz sinyali duyulur. </li><li> Kartuşu girişini açın ve etiket (Şekil 8) öne gelecek şekilde kartuşu takın. Kartuşu doğru (bir çizgi ön görünür olmalıdır) takılı olduğundan emin olun ve kapıyı kapatın. </li><li> Plaka tutma çerçeve açın ve cihazın içindeki örnekleri ile plaka yerleştirin. </li><li> Plaka tutma çerçevesi ve araç kapağını (Şekil 9) kapatın. </li></ol> Bir çalışma başlangıç <ol><li> Çalışma dosyası ile USB stick takıns cihazın ön USB portuna cihaz yazılımı ile yarattı. </li><li> Ana menüdeki &quot;Çalıştır&quot; ı seçin ve &quot;OK&quot; tuşuna basın. </li><li> İstenilen çalıştırma dosyayı seçin ve &quot;Select&quot; tuşuna basın kaydırma okları kullanın. </li></ol> Not: Cihaz tüm önceden basınç ve sıcaklık seviyeleri (bu birkaç dakika sürebilir) ulaşıldığında reaktif dağıtım başlayacak. Bir çalışma sırasında, cihaz ekran gerçek zamanlı olarak seçilen kuyunun pyrogram görüntüler. Diğer kuyuların pyrogram görmek için kaydırma okları kullanın. Bir çalışma Tamamlanıyor <ol><li> Cihazın çalışma bitmiş olduğunu doğrular ve çalışma dosyası USB belleğe kaydedildikten sonra, &quot;Close&quot; tuşuna basın. </li><li> USB stick çıkarın. Çalışma bitmiş önce kaldırıldı, USB stick takın. &quot;Yönetim&quot; ve daha sonra &quot;Kopyala kaydedilmemiş çalışır&quot; seçin. </li><li> Çalıştırmak dosya şimdi açıldı ve enstrüman yazılımı kullanılarak analiz ve karşılaştırılabilirIdentifire yazılımı kullanarak bilinen mikropların bir kütüphaneye. </li></ol>

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> PyroMark PCR Handbook. , (2009).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> PyroMark Q24 User Manual. , (2012).</li><li>Elahi, E., Ronaghi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing:+a+tool+for+DNA+sequencing+analysis.">Pyrosequencing: a tool for DNA sequencing analysis.</a> Methods Mol. Bio. 255, 211-219 (2004).</li><li>Fakhrai-Rad, H., Pourmand, N., Ronaghi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing:+and+accurate+detection+platform+for+single+nucleotide+polymorphisms.">Pyrosequencing: and accurate detection platform for single nucleotide polymorphisms.</a> Hum. Mutat. 19 (5), 479-485 (2002).</li><li>Langaee, T., Ronaghi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+variation+analyses+by+pyrosequencing.">Genetic variation analyses by pyrosequencing.</a> Mutat. Res. 573 (1-2), 96-102 (2005).</li><li>Liu, Z., Lozupone, C., Hamady, M., Bushman, F. D., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+pyrosequencing+reads+suffice+for+accurate+microbial+community+analysis.">Short pyrosequencing reads suffice for accurate microbial community analysis.</a> Nucleic Acids Res. 35 (18), e120 (2007).</li><li>Novais, R. C., Thorstenson, Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+Pyrosequencing+for+microbiology:+From+genes+to+genomes.">The evolution of Pyrosequencing for microbiology: From genes to genomes.</a> J. Microbiol. Methods. 86 (1), 1-7 (2011).</li><li>J, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+pyrosequencing+and+microbial+identification.">Metagenomic pyrosequencing and microbial identification.</a> Clin. Chem. 55 (5), 856-866 (2009).</li><li>Quince, C., Lanzen, A., Curtis, T. P., Davenport, R. J., Hall, N., Head, I. M., Read, L. F., Sloan, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+determination+of+microbial+diversity+from+454+pyrosequencing+data.">Accurate determination of microbial diversity from 454 pyrosequencing data.</a> Nat. Methods. (9), 639-6341 (2009).</li><li>Ronaghi, M., Karamohamed, S., Pettersson, B., Uhlen, M., Nyren, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+DNA+sequencing+using+detection+of+pyrophosphate+release.">Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release.</a> Anal. Biochem. 242, 84-89 (1996).</li><li>King, C., Scott-Horton, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing:+A+simple+method+for+accurate+genotyping.">Pyrosequencing: A simple method for accurate genotyping.</a> J. Vis. Exp. (11), e630 (2008).</li><li>Rothberg, J. W., Heinz, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+semi-conductor+device+that+enabling+non-optical+genome+sequencing.">An integrated semi-conductor device that enabling non-optical genome sequencing.</a> Nature. 475, 348-352 (2011).</li><li>Levene, M. J., Korlach, J., Turner, S. W., Foquet, M., Craighead, H. G., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zero-Mode+Waveguides+for+Single-Molecule+Analysis+at+high+concentrations.">Zero-Mode Waveguides for Single-Molecule Analysis at high concentrations.</a> Science. 299, 682-686 (2003).</li><li>Eid, J., Fehr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+DNA+Sequencing+from+Single+Polymerase+Molecules.">Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules.</a> Science. 323, 133-138 (2009).</li></ol>

Bu makalenin Üretim ve Serbest Giriş Qiagen tarafından desteklenmektedir. Yazarlar Ahmed, Durocher, Jessen ve Vardi Bu makalede kullanılan reaktifler ve aletleri üreten Qiagen Inc çalışanlarıdır.

Birçok yeni nesil dizileme yöntemleri ticari edilmiştir. En yaygın olarak kullanılan yöntemler arasında üç Bu yöntemlerin her biri 3-11 sentez ile sekanslama bağlıdır. Iyon iletken dizi analizi, tek bir molekül gerçek zaman sıralaması ve sentezi (SBS) ile sıralama ama Incorporated nükleotid tespiti için yeni bir platform kullanır. Iyon yarı iletken sıralama içinde, tek bir DNA iplikçik sıralama iplikçik için bir şablon olarak hizmet vermektedir. 12 Polimeraz ve nükleotid sırayla pyrosequencing olarak eklenir. Bir nükleotid artan DNA sarmalı ilave edildiğinde, bir hidrojen iyonu serbest bırakılır. Hidrojen iyonu, bir saha etkili transistörün tabanlı sensör tarafından tespit edilir. Tek bir molekül gerçek zamanlı sıralama sıfır modu dalga kılavuzu (ZMW) bağlıdır. 13 ZMW tek bir polimeraz molekül kuyunun dibinde bağlı küçük bir yapıdır. Bu, bir flore bir şekilde aydınlatılmışkoku molekülü tespit edilebilir. Her nükleotid bir floresan molekül ile etiketlenmiş. Bir floresan etiketli nükleotid dahil olarak, bir detektör nükleotid tanımlar. Aşağıdaki nükleotid eklendiğinde, floresan molekül yarılır. 14 Sentez ile Sequencing (SBS) eşsiz dizilerin kümeleri oluşturulan bu hedef DNA, yükseltmek için benzersiz bir yöntem kullanır. 15 tek sarmallı şablon oluşturulur ve daha sonra tamamlayıcı şeride sentezlenir. Her bir nükleotid, bir flüoresan molekül ile etiketlenir ve her bir baz ilave edildikten sonra ilave edilen baz floresan kaydedilir.

Pyrosequencing &quot;sentez ile dizileme&quot; ilkesine dayanmaktadır nükleik asit dizisi için hızlı ve hassas bir yöntemdir. &quot;Sentez ile sıralama&quot; bir anda tamamlayıcı bükümünü sentezlemek için bir baz tek iplikli DNA şablon kullanılarak yapılan, ve içinde yer alan baz (A, T, G veya C), bir kemilüminesan tespit sinyali tarafından her adımında tespit içerir. Pyrosequencing Reaksiyon DNA şablonu, dNTP (dATP, dGTP, dTTP, dCTP), DNA polimeraz, ATP sulfurylase, lusiferin, lusiferaz ve apyrase içerir. Sentez Reaksiyon dört dNTP ve tek sarmallı biyotinlenmiş şablon DNA&#39;ya DNA polimeraz birinin ilave edilmesi ile başlatılır. DNA polimeraz pirofosfat daha sonra tahliye edilmesini (Şekil 1) ile, şablon üzerine tamamlayıcı dNTP kapsar. ATP sulfurylase orantılı ATP&#39;ye pirofosfat dönüştürür. ATP hangi oxyluciferin için luciferase lusiferaz-aracılı dönüşüm için bir katalizör olarak hareket ederışığı (Şekil 2) üretir. Işığın şiddeti dahil nükleotidlerin sayısı ile orantılıdır ve bir veya daha fazla dNTP (dATP, dTTP, dGTP, dCTP veya) ardışık olarak şablon bükümü (Şekil 3) mevcut olup olmadığını tespit eder. Herhangi bir tüzel kişiliği olmayan dNTP önce sentez reaksiyon devamı için bir sonraki dNTP ilavesi için apyrase tarafından düşer. Tek sarmal kollu DNA şablonundan DNA dizisini tespit edilene kadar bu &quot;sentez ile sekanslama&quot; tepki dört dNTP, her biri sıra ile tekrarlanır. Pyrosequencing reaksiyon bir animasyon görmek için <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50405/50405movie1.mov" target="_blank">filmi görmek için buraya tıklayın</a> .

<table border=1>
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark PCR Master Mix, 2x</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>978703</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CoralLoad Concentrate, 10x</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>978703, 978705</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Q-Solution, 5x</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>978703, 978705</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgCl2, 25 mM</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>978703, 978705</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNase-Free Water</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>129112</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Primers</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>978776 or 978777</td>
 <td>Primers should be purchased from an established oligonucleotide manufacturer (i.e. QIAGEN Pyromark Custom Assays, IDT, etc). Lyophilized primers should be dissolved in TE to provide a stock solution of 100 &mu;M.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pyromark Gold Q24 Reagents</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>970802</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High-purity water (Milli-Q 18.2 M&Omega; x cm or equivalent)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Streptavidin Sepharose High Performance Beads</td>
 <td>GE Healthcare</td>
 <td>17-5113-07</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Annealing Buffer</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>979009</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Denaturation Solution</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>979007</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Wash Buffer</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>979008</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Q24</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>9001514</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Q24 Cartridge</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>979202</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Q96 HS Tip Holder Box</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>979105</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Q24 Vacuum Workstation</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>9001516</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PyroMark Q24 Plate Holder</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>9022273</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Orbital shaker</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>11-675-297</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Heat block</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>11-718Q</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

pyrosequencing for microbial identification and characterization

Pyrosequencing, bakteri türleri tespit bakteri suşları ayrım ve anti-mikrobiyal ajanlara karşı direnç kazandıran genetik mutasyonları tespit etmek için kullanılabilir mikrobiyal genom dizileme kolaylaştıran bir çok yönlü bir tekniktir. Mikrobiyoloji uygulamaları için pyrosequencing avantajları hızlı ve güvenilir yüksek verimli tarama ve mikropların ve mikrobiyal genom mutasyonlarının doğru tanımlama içerir. Pyrosequencing sentezi, reaksiyon sırasında dahil edilen özel bir nükleotid varlığının belirlenmesinde, tamamlayıcı dizi bir seferde tek bir baz sentez ile DNA sekanslama içerir. Reaksiyon dört deoksiribonükleotit (dNTP) arka arkaya ilave edildi ve adi dNTP sentez tepkimesi için bir sonraki dNTP eklenmesinden önce enzimatik olarak bozulmuş olan vardır immobilize tek sarmallı DNA şablonu üzerinde oluşur. Şablonu dahil belirli bir baz Algılama chemilum üretimi ile izlenirinescent sinyalleri. Kemilüminesan sinyalleri üretmek dNTP sırası şablon DNA dizisi belirlenir. Pyrosequencing teknolojinin gerçek zaman sıralaması özelliği tek bir tahlil hızla mikrobiyal tanımlanmasını sağlar. Buna ek olarak, pyrosequencing alet, SNP, nokta mutasyonları, eklemeler, silmeler ve yanı sıra, bazı anti-mikrobiyal direnç oluşabilir çoklu gen kopya miktar protein tipi dahil olmak üzere, bir anti-mikrobiyal ilaç direnci, genetik çeşitlilik, analiz desen.

Yazılımı kullanarak tipik bir pyrosequencing çalışma sonuçları amplikon üretimi için kullanılan ileri ve geri primerler yerini ve korunmuş 16S ribozomal dizisi (Şekil 10) içinde pyrosequencing reaksiyon için kullanılan sıralama astar gösterir. Astar arasındaki aşırı değişken dizisi Yer korunmuş dizileme primeri (5&#39;-TACATGCAAGTCGA) kullanılarak bakteri türlerinin, çok sayıda bakteriyel belirlenmesi için olanak sağlar. bir iç kalite kontrol olarak, DNA dizisi parantez içi değişken bölge doğru DNA bölgesi analiz edilmiştir sağlamak için kontrol edilebilir . Pyrosequencing yazılım bakteri tanımlama için bakteriyel ribozomal dizileri bir iç veritabanı için oluşturulan dizisinin karşılaştırma ve uyum sağlar. Buna ek olarak, bir dizi antibiyotik ilaç direnci kazandıran mutasyonlar belirlemek için analiz edilebilir. Helicob arasında 23S ribozomal genlerdeki mutasyonların Örneğin, analizacter pylori antibiyotik direnci kazandıran iki mutasyon desen (GAA veya AGA) (Şekil 11) göstermektedir. Aynı hastada birden fazla izole analizi aynı zamanda mikrobiyal ilaç direnci salgınların epidemiyolojik araştırmalarda yardımcı olmak için zaman içinde ilaç direncinin ortaya çıkması izlemek için test edilebilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig1.jpg" /> Şekil 1. Biyotinillenmiş PCR ürünü, pirofosfat (PPi) üretimi yol açan DNA polimerazı ile dNTP dahil etmek için bir şablon olarak kullanılır. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/50405/50405fig2.jpg" /> Şekil 2. ATP sulfurylase orantılı yanlısı olduğunu ışık üretir oxyluciferin için luciferase lusiferaz aracılı dönüşüm için bir katalizör olarak ATP. ATP eylemleri pirofosfat dönüştürürATP miktarının orantılı olduğu. Işık pyrogram iz üzerinde zirve olarak kaydedilir ve nükleotid dahil belirtir. Bir sonraki dNTP sentezi devam etmesi için ilave edilmeden önce, adi dNTP apyrase tarafından bozulmuş. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/50405/50405fig3.jpg" /> Şekil 3,. Bir veya daha fazla dNTP (dATP, dTTP, dGTP, dCTP veya) ardışık olarak şablon bükümü üzerine kurulmuştur, oluşturulan ışığın yoğunluğunu gösterir. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/50405/50405fig4.jpg" /> Şekil 4. Biotinlenmiş PCR ürünü hareketsiz ana karışımı hazırlanması için akış şeması. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/50405/50405fig5.jpg" /> ge = &quot;her zaman&quot;&gt; Şekil 5. PCR plaka, PyroMark plaka ve çukur yerleri ile PyroMark iş istasyonu,. <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/50405/50405fig6.jpg" /> 6 Şekil. Pozisyonları ve KAPAT Vakum anahtarı yerler. <img alt="Şekil 7" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig7.jpg" /> Şekil 7. Vakum aracı. Vakum aracı doğru kullanımı. <img alt="Şekil 8," src="/files/ftp_upload/50405/50405fig8.jpg" /> Şekil 8. Kartuş kapısı yerde kartuş ile açıldı. <img alt="Şekil 9," src="/files/ftp_upload/50405/50405fig9.jpg" /> 9 Şekil. Kapı kapalı kartuşu doğru takılı. &quot;Fo: keep-together.within-page =&quot; her zaman &quot;&gt; <img alt="Şekil 10" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig10.jpg" /> 10 Şekil. Tabanlı bakteri tanımlama sonuçlar Pyrosequencing. PCR primerleri, DNA şablonunun korunmuş bölgeler için tasarlanmıştır ve sekanslama primerine amplikon (mavi renkte gösterilmiştir) içinde iyi karakterize edilmiş DNA sekansının tanımlanması hiper-değişken bölgesinin hemen üst tarafından konumlandırılır. <img alt="Şekil 11" src="/files/ftp_upload/50405/50405fig11.jpg"/> 11 Şekil. Pyrosequencing kullanarak Helicobacter pylori antibiyotik ilaç direnci tespit. GAA veya AGA dizileri içeren Helicobacter pylori antibakteriyel direnç görüşmek 23S genlerinde mutasyon analizi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50405/50405fig11large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <table border="1"><tbody><tr> &lt;td&gt; Bileşen </td><td> Reaksiyon başına hacim </td><td> Nihai konsantrasyon </td></tr><tr><td> Pyro PCR Master Mix, 2x </td><td> 12.5 ul </td><td> 1x </td></tr><tr><td> CoralLoad Konsantre, 10x </td><td> 2.5 ul </td><td> 1x </td></tr><tr><td> 25 mM MgCl2 (isteğe bağlı) </td><td> Değişken </td><td> ≥ 1.5 mM </td></tr><tr><td> 5x Q-Çözüm, (isteğe bağlı) </td><td> 5 ul </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Astar A / Astar B </td><td> Değişken / Değişken </td><td> 0.2 μM/0.2 mcM </td></tr><tr><td> RNase içermeyen su </td><td> Değişken </td><td> - </td></tr><tr><td> Toplam Hacim (DNA ekledikten sonra) </td><td> 25 ul </td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 1. PCR reaksiyon karışımının. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> &amp; Nbsp; </td><td></td><td> Ek yorumlar </td></tr><tr><td> İlk PCR aktivasyon aşaması </td><td> 15 dakika </td><td> 95 ° C </td><td> HotStartTaq DNA Polimeraz etkinleştirilir </td></tr><tr><td> 3 adım bisiklet: Denatürasyon </td><td> 30 sn </td><td> 94 ° C </td><td></td></tr><tr><td> Tavlama </td><td> 30 sn </td><td> 60 ° C 56 ° C </td><td> Genomik DNA için Bisülfit dönüştürülür DNA </td></tr><tr><td> Uzatma </td><td> 30 sn </td><td> 72 ° C </td><td></td></tr><tr><td> Döngü Sayısı </td><td> 45 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Son uzatma </td><td> 10 dakika </td><td> 72 ° C </td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 2&#39;de. PCR Döngüsü Özellikleri.

Watch this Scientific Journal Video about Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization at JoVE.com

Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization

Pyrosequencing, bakteri türleri tespit bakteri suşları ayrım ve anti-mikrobiyal ajanlara karşı direnç kazandıran genetik mutasyonları tespit etmek için kullanılabilir mikrobiyal genom dizileme kolaylaştıran bir çok yönlü bir tekniktir. Bu videoda, mikrobiyal amplikon üretimi, amplikon pyrosequencing ve DNA dizi analizi için prosedür gösterilecektir.

Mikrobiyal Tanımlama ve Karakterizasyonu için Pyrosequencing

Pyrosequencing is a versatile technique that facilitates microbial genome sequencing that can be used to identify bacterial species, discriminate ...

pyrosequencing-for-microbial-identification-and-characterization

Research

JoVE Journal

Biology

46.9K Görüntüleme.  Johns Hopkins University. Pyrosequencing, bakteri türleri tespit bakteri suşları ayrım ve anti-mikrobiyal ajanlara karşı direnç kazandıran genetik mutasyonları tespit etmek için kullanılabilir mikrobiyal genom dizileme kolaylaştıran bir çok yönlü bir tekniktir. Bu videoda, mikrobiyal amplikon üretimi, amplikon pyrosequencing ve DNA dizi analizi için prosedür gösterilecektir.

Video: Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization

Microbial Communities in Nature and Laboratory - Interview

Doğa ve Laboratuvar Mikrobiyal Toplulukları - Röportaj

Biyoloji

Biology of Microbial Communities  - Interview

Mikrobiyal Toplulukları Biyoloji - Röportaj

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a tremendous amount of data available comes an explosion of genotyping methods. Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. It also has the ability to identify tri-allelic, indels, short-repeat polymorphisms, along with determining allele percentages for methylation or pooled sample assessment. In addition, there is a standardized control sequence that provides internal quality control. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.


Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.

Pyrosequencing: Doğru Genotiplendirme için Basit Bir Yöntem

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes such as cell adhesion, molecular trafficking, clearance, and signal transduction1-4. In eukaryotes, the most common glycosylation modifications in the secretory pathway are additions at consensus asparagine residues (N-linked); or at serine or threonine residues (O-linked) (Figure 1). Initiation of N-glycan synthesis is highly conserved in eukaryotes, while the end products can vary greatly among different species, tissues, or proteins. Some glycans remain unmodified ("high mannose N-glycans") or are further processed in the Golgi ("complex N-glycans"). Greater diversity is found for O-glycans, which start with a common N-Acetylgalactosamine (GalNAc) residue in animal cells but differ in lower organisms1.
The detailed analysis of the glycosylation of proteins is a field unto itself and requires extensive resources and expertise to execute properly. However a variety of available enzymes that remove sugars (glycosidases) makes possible to have a general idea of the glycosylation status of a protein in a standard laboratory setting. Here we illustrate the use of glycosidases for the analysis of a model glycoprotein: recombinant human chorionic gonadotropin beta (hCG&beta;), which carries two N-glycans and four O-glycans 5. The technique requires only simple instrumentation and typical consumables, and it can be readily adapted to the analysis of multiple glycoprotein samples.
Several enzymes can be used in parallel to study a glycoprotein. PNGase F is able to remove almost all types of N-linked glycans6,7. For O-glycans, there is no available enzyme that can cleave an intact oligosaccharide from the protein backbone. Instead, O-glycans are trimmed by exoglycosidases to a short core, which is then easily removed by O-Glycosidase. The Protein Deglycosylation Mix contains PNGase F, O-Glycosidase, Neuraminidase (sialidase), &beta;1-4 Galactosidase, and &beta;-N-Acetylglucosaminidase. It is used to simultaneously remove N-glycans and some O-glycans8 . Finally, the Deglycosylation Mix was supplemented with a mixture of other exoglycosidases (&alpha;-N-Acetylgalactosaminidase, &alpha;1-2 Fucosidase, &alpha;1-3,6 Galactosidase, and &beta;1-3 Galactosidase ), which help remove otherwise resistant monosaccharides that could be present in certain O-glycans.
SDS-PAGE/Coomasie blue is used to visualize differences in protein migration before and after glycosidase treatment. In addition, a sugar-specific staining method, ProQ Emerald-300, shows diminished signal as glycans are successively removed. This protocol is designed for the analysis of small amounts of glycoprotein (0.5 to 2 &mu;g), although enzymatic deglycosylation can be scaled up to accommodate larger quantities of protein as needed.

Using specific glycosidases to remove sugars from glycoproteins followed by SDS-PAGE is a valuable method to detect glycan modifications on protein samples and is a good choice for initial glycobiology studies. Changes following deglycosylation can be detected as shifts in gel mobility or by staining with glycan sensitive reagents.

Spesifik endo-ve exoglycosidases kullanarak protein glikozilasyon tanımlanması ve karakterizasyonu

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes ...

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated including macromolecular synthesis, metabolism and ultimately, commitment to the cell division cycle. The chemostat, a method of experimentally controlling cell growth rate, provides a powerful means of systematically studying how growth rate impacts cellular processes - including gene expression and metabolism - and the regulatory networks that control the rate of cell growth. When maintained for hundreds of generations chemostats can be used to study adaptive evolution of microbes in environmental conditions that limit cell growth. We describe the principle of chemostat cultures, demonstrate their operation and provide examples of their various applications. Following a period of disuse after their introduction in the middle of the twentieth century, the convergence of genome-scale methodologies with a renewed interest in the regulation of cell growth and the molecular basis of adaptive evolution is stimulating a renaissance in the use of chemostats in biological research.

Cell growth rate is a regulated process and a primary determinant of cell physiology. Continuous culturing using chemostats enables extrinsic control of cell growth rate by nutrient limitation facilitating the study of molecular networks that control cell growth and how those networks evolve to optimize cell growth.

Mikrobiyal Systems Biyoloji Chemostats Kullanımı

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. To enable the non-biased identification of molecules interacting with a specific genomic region of interest, we recently developed the engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) technique. Here, we describe how to use enChIP to isolate specific genomic regions and identify the associated proteins and RNAs. First, a genomic region of interest is tagged with a transcription activator-like (TAL) protein or a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) complex consisting of a catalytically inactive form of Cas9 and a guide RNA. Subsequently, the chromatin is crosslinked and fragmented by sonication. The tagged locus is then immunoprecipitated and the crosslinking is reversed. Finally, the proteins or RNAs that are associated with the isolated chromatin are subjected to mass spectrometric or RNA sequencing analyses, respectively. This approach allows the successful identification of proteins and RNAs associated with a genomic region of interest.

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. This protocol describes procedures to perform engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin imunoprecipitation (enChIP) for identification of proteins and RNAs associated with a specific genomic region.

Belirli Genomik Bölgeler ve enChIP tarafından İlişkili Moleküllerin Tanımlanması İzolasyonu

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Plant Promoter Analysis: Identification and Characterization of Root Nodule Specific Promoter in the Common Bean

The upstream sequences of gene coding sequences are termed as promoter sequences. Studying the expression patterns of promoters are very significant in understanding the gene regulation and spatiotemporal expression patterns of target genes. On the other hand, it is also critical to establish promoter evaluation tools and genetic transformation techniques that are fast, efficient, and reproducible. In this study, we investigated the spatiotemporal expression pattern of the rhizobial symbiosis-specific nodule inception (NIN) promoter of Phaseolus vulgaris in the transgenic hairy roots. Using plant genome databases and analysis tools we identified, isolated, and cloned the P. vulgaris NIN promoter in a transcriptional fusion to the chimeric reporter &#946;-glucuronidase (GUS) GUS-enhanced::GFP. Further, this protocol describes a rapid and versatile system of genetic transformation in the P. vulgaris using Agrobacterium rhizogenes induced hairy roots. This system generates &#8805;2 cm hairy roots at 10 to 12 days after transformation. Next, we assessed the spatiotemporal expression of NIN promoter in Rhizobium inoculated hairy roots at periodic intervals of post-inoculation. Our results depicted by GUS activity show that the NIN promoter was active during the process of nodulation. Together, the present protocol demonstrates how to identify, isolate, clone, and characterize a plant promoter in the common bean hairy roots. Moreover, this protocol is easy to use in non-specialized laboratories.

Promoter expression analyses are crucial to improving the understanding of gene regulation and the spatiotemporal expression of target genes. Herein we present a protocol to identify, isolate, and clone a plant promoter. Further, we describe the characterization of the nodule-specific promoter in the common bean hairy roots.

Bitki organizatörü analizleri: Kimlik ve kök nodül belirli organizatörü ortak fasulye içinde karakterizasyonu

The upstream sequences of gene coding sequences are termed as promoter sequences. Studying the expression patterns of promoters are very significant in ...

Guided Protocol for Fecal Microbial Characterization by 16S rRNA-Amplicon Sequencing

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. Deviations from what is considered a healthy microbiota composition (dysbiosis) may impair vital functions leading to pathologic conditions. Recent and ongoing research efforts have been directed toward the characterization of associations between microbial composition and human health and disease.
Advances in high-throughput sequencing technologies enable characterization of the gut microbial composition. These methods include 16S rRNA-amplicon sequencing and shotgun sequencing. 16S rRNA-amplicon sequencing is used to profile taxonomical composition, while shotgun sequencing provides additional information about gene predictions and functional annotation. An advantage in using a targeted sequencing method of the 16S rRNA gene variable region is its substantially lower cost compared to shotgun sequencing. Sequence differences in the 16S rRNA gene are used as a microbial fingerprint to identify and quantify different taxa within an individual sample.
Major international efforts have enlisted standards for 16S rRNA-amplicon sequencing. However, several studies report a common source of variation caused by batch effect. To minimize this effect, uniformed protocols for sample collection, processing, and sequencing must be implemented. This protocol proposes the integration of broadly used protocols starting from fecal sample collection to data analyses. This protocol includes a column-free, direct-PCR approach that enables simultaneous handling and DNA extraction of large numbers of fecal samples, along with PCR amplification of the V4 region. In addition, the protocol describes the analysis pipeline and provides a script using the latest version of QIIME (QIIME 2 version 2017.7.0 and DADA2). This step-by-step protocol is aimed to guide those interested in initiating the use of 16S rRNA-amplicon sequencing in a robust, reproductive, easy to use, detailed way.

This manuscript describes a detailed standardized protocol of high-throughput 16S rRNA-amplicon sequencing. The protocol introduces an integrated, uniformed, feasible, and inexpensive protocol starting from fecal sample collection through data analyses. This protocol enables analysis of large numbers of samples with rigorous standards and several controls.

16S rRNA Amplicon sıralama tarafından dışkı mikrobiyal karakterizasyonu için rehberli iletişim kuralı

The human intestinal microbiome plays a central role in protecting cells from injury, in processing energy and nutrients, and in promoting immunity. ...

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors (FAPs) and Myogenic Progenitors (MPs) in Skeletal Muscle in the Rat

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in muscle homeostasis, injury, and repair. Current protocols for FAPs identification and isolation use flow cytometry/fluorescence-activated cell sorting (FACS) and studies evaluating their function in vivo to date have been undertaken exclusively in mice. The larger inherent size of the rat allows for a more comprehensive analysis of FAPs in skeletal muscle injury models, especially in severely atrophic muscle or when investigators require substantial tissue mass to conduct multiple downstream assays. The rat additionally provides a larger selection of muscle functional assays that do not require animal sedation or sacrifice, thus minimizing morbidity and animal use by enabling serial assessments. The flow cytometry/FACS protocols optimized for mice are species specific, notably restricted by the characteristics of commercially available antibodies. They have not been optimized for separating FAPs from rat or highly fibrotic muscle. A flow cytometry/FACS protocol for the identification and isolation of FAPs and MPs from both healthy and denervated rat skeletal muscle was developed, relying on the differential expression of surface markers CD31, CD45, Sca-1, and VCAM-1. As rat-specific, flow cytometry-validated primary antibodies are severely limited, in-house conjugation of the antibody targeting Sca-1 was performed. Using this protocol, successful Sca-1 conjugation was confirmed, and flow cytometric identification of FAPs and MPs was validated by cell culture and immunostaining of FACS-isolated FAPs and MPs. Finally, we report a novel FAPs time-course in a prolonged (14 week) rat denervation model. This method provides the investigators the ability to study FAPs in a novel animal model.

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat

This protocol outlines a method to isolate Fibro-adipogenic progenitors (FAPs) and myogenic progenitors (MPs) from rat skeletal muscle. Utilization of the rat in muscle injury models provides increased tissue availability from atrophic muscle for the analysis and a larger repertoire of validated methods to assess muscle strength and gait in free-moving animals.

Sıçandaki İskelet Kasında Fibro-Adipojenik Progenitörlerin (FAP' ler) ve Miyojenik Progenitörlerin (Milletvekilleri) Tanımlanması, İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in ...

In Silico Identification and Characterization of circRNAs During Host-Pathogen Interactions

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs that are formed via back-splicing. These circRNAs are predominantly studied for their roles as regulators of various biological processes. Notably, emerging evidence demonstrates that host circRNAs can be differentially expressed (DE) upon infection with&#160;pathogens (e.g., influenza and coronaviruses), suggesting a role for circRNAs in regulating host innate immune responses. However, investigations on the role of circRNAs during pathogenic infections are limited by the knowledge and skills required to carry out the necessary bioinformatic analysis to identify DE circRNAs from RNA sequencing (RNA-seq) data. Bioinformatics prediction and identification of circRNAs is crucial before any verification, and functional studies using costly and time-consuming wet-lab techniques. To solve this issue, a step-by-step protocol of in silico prediction and characterization of circRNAs using RNA-seq data is provided in this manuscript. The protocol can be divided into four steps: 1) Prediction and quantification of DE circRNAs via the CIRIquant pipeline; 2) Annotation via circBase and characterization of DE circRNAs; 3) CircRNA-miRNA interaction prediction through Circr pipeline; 4) functional enrichment analysis of circRNA parental genes using Gene Ontology (GO) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). This pipeline will be useful in driving future in vitro and in vivo research to further unravel the role of circRNAs in host-pathogen interactions.

In Silico Identification and Characterization of circRNAs During Host-Pathogen Interactions

The protocol submitted here explains the complete in silico pipeline needed to predict and functionally characterize circRNAs from RNA-sequencing transcriptome data studying host-pathogen interactions.

Burada: Silico Konakçı-Patojen Etkileşimleri Sırasında SirkRNA'ların Tanımlanması ve Karakterizasyonu

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs that are formed via back-splicing. These circRNAs are predominantly studied for their roles as ...