Biz tartışma ve yazının eleştirel okuma için Miller laboratuar üyeleri teşekkür ederim. Bu çalışma DLM ve DLM Sağlık ödülü R00 AG030550 National Institutes of Aging için Temel Biyoloji Mükemmellik Nathan Şok Merkezi&#39;nden yeni bir araştırmacı ödül tarafından desteklenmiştir.

1. Çevre Odaları İnşaatı <ol><li> Projenizin kapsamı için gerekli odasının küçük makul ses seçin. Odası (O 2) gaz sızdırmaz malzemeden yapılmış olmalıdır. Pyrex kristalizasyon yemekleri, Anaeropack kutuları veya büyük dökme akrilik kutuları (Ellard Enstrümantasyon), kullanılabilir. Biz 9 50 mm levha 100 x 50 KIMEX kristalizasyon çanak sığabilecek bulduk. Cam levhalar Pyrex kristalizasyon yemekler için kapak olarak kullanılabilir. </li><li> Seçilen odasında bir delik delin ve hortum barb uydurma (Cole Parmer) için Luer plastik bir erkek ile uyum. Parçaları boru bağlantı veya epoksi ile güvence altına alınabilir. Gaz odasının akan ve dışarı için izin kabın karşı tarafta benzer bir bağlantı kurun. Mümkünse, türbülans artırmak için delikler ofset. </li><li> O 2 eş için standart sertifikalı tanımlanan O 2 konsantrasyonları (N 2 ile dengeli) ile sıkıştırılmış gaz tankları edininanoksi koşulları için ntent ya da saf N 2 (&lt;10 ppm O 2). Odalarında oksijen seviyesi kesintiye önlemek için uzun vadeli çalışmalar için otomatik geçiş-over düzenleyiciler kullanın. </li><li> Hipoksiye organizma tepkisi sıcaklığında 15 bağımlı olduğu gösterildi. Bir inkübatörde haznesi yerleştirerek, farklı sıcaklık muhafaza edilebilir. Bir inkübatör içinde Sıcaklıklar dengesiz ve gibi olabilir, bunu sürekli odasının içindeki sıcaklığı ölçmek için bir sıcaklık veri kayıt cihazı yararlanmak için isabetli olmuştur. </li></ol> 2. Çevre Odası Gaz Bağlantı <ol><li> Tüm bağlantıları için, çıt çıt bağlantı veya sıkıştırma parçaları ya bağlanmış sekizde biri-inç dış çaplı tüp kullanmayın. Boru gibi florinlenmiş etilen propilen olarak O 2, (FEP) veya naylon (Cole Parmer) ile sızdırmaz ve reaktif olmalıdır. Tamamlanmış kurulum şematik için, bakınız Şekil 1. </li><li> Com bağlayınBöyle bir kütle akış kontrolörü (Sierra Instruments) veya rotametre (Aalborg) gibi bir akış kontrol cihazı için basılan gaz tankları,. Tanktan giriş basınç akış cihazın aralığı ve hortum barb parçaları içinde olduğundan emin olun. İki kademeli regülatörleri genellikle istenen basınç ayarlı ikinci aşamada, kullanılan [uygun akış hızı seçimi için üç bölüme bakınız] </li><li> (Bkz. Şekil 1) egzoz gazı için ikinci uydurma açık bırakarak çevre bölmesi üzerindeki parçaları biri, sonra içine doğrudan fritli silindirli bir gaz yıkama şişesi kullanılarak saf su ile köpüren tarafından hidrat gazı. Kısa vadeli çalışmalar için, gaz hidrasyon plaka Kuraklığa karşı korur, ancak nem izleme uzun vadeli çalışmalar için gerekli olabilir. </li><li> Dow Corning Vakum Yağ haznesi mühürlemek için kullanılabilir. Haznesinin kapağının üzerine koyun ağırlıkları hava geçirmez bir mühür sağlamak. Sıkı bir mühür ve yeterli akımı onaylamak için, y avuç su küçük bir havuz tutunBizim eldivenli odasında dışarı montaj için el ve kabarcıkları kontrol edin. </li></ol> 3. Debisi Seçimi <ol><li> Karıştırma mükemmel varsayarsak, gaz atmosferi% 90 gaz değişimi odasının hacmi (Fick Kanunu) yerine her zaman vardır. Örneğin, 100 ml / dak &#39;lık bir akış oranı ile bir 100 cc odasında, odacık içinde orijinal ev hava 1 dakika sonra arzu edilen gaz% 90 ile değiştirilir, ve asemptotik% 90 dakikada tarafından tam değişimi yaklaşacak bundan sonra. </li><li> Yüksek debi ve küçük kaplarda daha hızlı istenen oksijen konsantrasyonu ulaşacak. 100 x 50 KIMEX kapları (400 cc), 120 ml / dak akış hızı 10 dakika (3 alışverişi) içinde% 99.9 değişimi ulaşacaktır. Bu akış hızı en oksijen koşulları için uygundur. Bildiğimiz kadarıyla O 2 konsantrasyonunun değişim oranı C. yanıtı nasıl etkilediğini sistematik bir soruşturma olmamıştır elegans. </li></ol><ol><li> Hipoksik koşullarına maruz solucanlar yaygın agar plakalar yüzeyi atlanır. Bunun önlenmesi için, plakalar kenarı etrafında palmitik asit (etanol içinde 10 mg / ml) bir halka yerleştirin. Palmitik asit fiziksel bir bariyer oluşturarak, etanol buharlaşır gibi çözüm çıkacaktır. Palmitik asit engelleri yumurtlama, doğurganlık veya C. ömrü oranı etkilemez elegans 16,17. Sığıntı hipoksik koşullarda daha sık oluşmaz, bu nedenle ek önlemler genellikle gerekli değildir. </li><li><ol><li> Dereceye giremeyen nematod büyüme ortamı (NGM) plakaları 18 alkali çamaşır suyu küçük bir düşüş gravida yetişkin beyazlatma ile senkronize nüfus oluşturun. Standart büyük kesikli hipoklorit beyazlatma protokolleri aksine, bir NGM plakanın yüzeyinde ağartıcı çözeltinin bir düşüş 1-100 hayvanlar alma, sonra ağartıcı çözelti plakası içine emmek için izin <sup&gt; 18. En az 12 saat sonra, canlı OP50 bakteri ile ekildi plakalarına senkronize L1 larva transfer. Alternatif olarak, bir 2-3 saat için plaka üzerinde yumurtlamak için gravida yetişkin karma bir popülasyondan L4 larva eşzamanlı geliştirmek veya almak olacaktır solucanlar bir grup oluşturmak için izin verebilirsiniz. </li><li> Bu canlılık 13 azaltabilir olarak, hipoksi ağartılmış embriyolar maruz bırakmayın. Genç embriyoların (2-4 hücreleri) toplamak için, gravida yetişkin hipoksi sonraki poz için ağız pipeti plaklara taşınmış bir jilet ve embriyo su ile az miktarda kıyılmış edilebilir. </li></ol></li><li> Çevre odasında yüzeyleri. Kontrol hayvanlarına muamele solucanlar aynı sıcaklıkta normoksi (ev hava) içinde tutulmalıdır. Ev havada kaldı örnekleri ve ev havada üzerlerine akan özdeş bir odasında tutulan olanlar arasında hiçbir gözlemlenebilir bir fark yoktur. Gaz akışını başlatmak ve istenilen zaman için pozlama korumak. Rampa yeknesaklık sağlamak için, emin olunmaruz önce gaz yıkama şişe suyu değiştirin. </li><li> Embriyoların test yaşam için, solucanlar oda havasına döndükten sonra 48 saat için geliştirmeye olanak hangi noktada onlar dördüncü dönem larva / gün bir yetişkin olmalıdır. Sağkalım, sansürlemek için izah edilemez bir solucan için Puan. </li><li> , Hipoksiye maruz kalan hayvanlarda görselleştirmek ise 22 mm 2 coverslip üzerine M9 bir damla solucanlara taşıyın ve M9 18% 2 agaroz bir ped üzerine dönüştürmelidir. Gerektiğinde, levamisole (25 mM) ve sodyum azid (10 mM) anestezi olarak kullanılabilir Eğer. Sodyum azid ve levamizol toksisite nedeniyle bazı gözlemler yanıltabilecek ve mantıklı 19 kullanılmalıdır. </li></ol> 5.. Hipoksi maruz kalan Worms (: HIF-1 Batı Analizi için Numune Hazırlama Örneği) Rapid Harvest Birçok hipoksi kaynaklı etkileri hızla yumurta üretimi 12, mitotik epitoplarının fosforilasyon yeniden başlaması da dahil olmak üzere, oda havasında dönmek üzerine iptal edilirembriyogenez 13 ve HIF-1 proteini 9,20 bozulması içinde. Hipoksi maruz kalan hayvanlarda, hızlı izolasyonu bu koşullarda tekrarlanabilir etkiler elde etmek için gereklidir. En az iki dakika bu ayarı ile, hayvanlar hasat edilebilir ve sıvı azot içinde dondurulur. Torpido gözü hipoksi odaları oksijensiz koşullarda numunelerin manipülasyon için izin verirken, anoksi haricindeki koşullar için maliyet ve pratiklik kullanışlılığını sınırlayan. <ol><li> Solucanlar çoğunluğu 18 gebe yetişkin olana kadar 4 10 cm yüksek büyüme (HG) plakalar üzerinde Bristol N2 solucanlar büyür. Bir 01:05 alkalin çamaşır suyu çözeltisi içeren bir 15 ml konik tüp solucanları yıkayın ve solucanlar 5 dakikadan fazla, 9 değil çözülmeye başlayana kadar rotasyon ile inkübe edin. Frenleme ile her yıkama arasında 1500 xg&#39;de aşağı iplik, M9 ile solucanlar üç kez yıkayın. </li><li> Plaka ağartılmış 8 150 mm NGM levhaları üzerine embriyo ve L4 larvaları (22 at Bristol N2 için ~ 48 saat ° C) geliştirmeye olanak sağlar.Çevresel odalarına plakalar taşımak ve hipoksik (1000 ppm, 5000 ppm) ve 4 saat boyunca anoksi (N2) koşullarına maruz bırakmaktadır. Pozlama süreleri deneysel tasarım bağlı olarak değişecektir. Hipoksiye maruz yumurtlama oranı üzerinde hemen bir etkisi olsa da, iki hücreli embriyo maruz 12 16-18 saat sonra ölür. Bu hipoksi odası kurulumu ile, pozlama alt limit denge ulaşmak için gerekli ortamı kur tarafından sınırlanır. </li><li> Etiket biri 1.5 mL mikrofuge&#39;de tüp ve her deneysel örnek için bir 15 ml konik boru. Hipoksi maruz solucanlar hasat sırasında boru tarafı sopa daha olasıdır. Bunu önlemek için, yerine her biri 15 ml konik tüp içinde% 1 sodyum dodesil sülfat (SDS) 100 mcL. SDS aşağı uygulamalar inhibe ise, sığır serum albümini (BSA) yapışmasını engellemek için de kullanılabilir. SDS veya BSA rutin kullanımı belirgin bir fark var gibi görünmüyor. 2x proteini yükleme boya (4% SDS,% 10 2-mercaptoethanol ile 50 ul ekleme1,5 mL mikrofüj tüpe% 30 gliserol (w / v)) içinde bromphenol mavi iz. Hazır sıvı nitrojen bir Dewar var. </li><li> Hipoksi ve kayıttan solucanlar çıkardıktan sonra Zaman adımları. , Hipoksik odasına kapağını çıkarın ve tek bir numune levha alır ve odasına kapatın. 15 ml konik tüp içine dökün sonra bir naylon filtre üzerine solucanlar yıkayın ve distile su kullanın. Frenli 15-20 saniye için 1500 xg&#39;de bir masaüstü santrifüj solucanlar aşağı Spin. </li><li> Solucan pelet bakir bırakarak, tüpten en çıkarmak için bir vakum kullanın. </li><li> Bir pipet kullanarak 1,5 mL mikrofuge&#39;de tüpe 50 uL olarak solucan pelet taşıyın. Sıvı azot tüpü ve batırmayın Seal. </li><li> Tüm örneklerde izole edilmiştir kadar tekrarlayın. Tutarlılığı için ev hava kontrol örnekleri için bu işlemleri takip edin. Numuneler -20 ° C&#39;de saklanabilir </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Hipoksi organizma etkileri görülebileceğiC yetişkinliğe canlılığı inceleyerek elegans (Şekil 2). Vahşi tip Bristol (N2) ve HIF-1 (ia04) delesyon mutantlar tarafından döşenen Embriyolar evi havaya O 2 konsantrasyonları (210,000 ppm O 2) hayatta edilir. HIF-1 embriyoların canlı değildir iken N 2 solucanlar, 5.000 ppm O 2 yetişkinliğe uyum ve hayatta edebiliyoruz. Bu HIF-1 ortamında 10 mevcut oksijen değişen seviyelere adapte için elzem olduğunu gösterir. N2 ne hif-1 hayvanlar Ne 1.000 ppm O 2 maruz yaşayabilir. Hipoksi doğrudan solucanı görselleme bir kesme kapsamı ve berrak kabın (Şekil 3) kullanımı ile mümkündür. Doğrudan kesme kapsamı üzerinde hipoksi haznesi yerleştirerek, organizma reaksiyonları gözlemlemek için hipoksi ile solucanların kaldırmak için gerek yoktur. Kapsamı (Şekil 3 &#39;de olarak floresans illumation takılabilir </strong&gt;), daha da mümkündür hipoksi gözlem türleri uzanan. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4088/4088fig1.jpg" /> Şekil 1.. Gaz akış Hipoksi haznesi. Yönü Örneği oklarla gösterilmiştir. Gaz tanımlandığı O 2 konsantrasyonları (1) ve bir iki aşamalı regülatörü (2) bağlı olan sıkıştırılmış gaz tankları içinde saklanır. Gaz doğru akış hızında üst çıkmadan, akış tüp (3) alt girer. Gaz daha sonra gaz (baloncuklar gözlemleyerek kabarcık balonun doğru bağlantı sağlamak) nemlendirici, kabarcık balonuna (4) akar. Sönmüş gaz daha sonra hipoksiye örnekleri açığa giriş vanası (5) hipoksi odasına geçer. Odasında delinen bir egzoz deliğinden odasına gaz son delikleri. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/4088/4088fig2.jpg" /> Şekil 2. 1.000 ppm O 2, 5,000 ppm O maruz kalan embriyoların Canlılık <sub&gt; 2 ve normoksi (~ 210000 ppm O 2). Embriyolar sürekli akış oksijen odacıklarda 24 saat boyunca, her bir oksijen embriyosu koşullarına maruz bırakıldı. Solucanlar 48 saat yetişkinliğe geliştirmek için izin normoksik koşullar, taşındı ve ardından yetişkinliğe canlılığı skorlandı. n&gt; 50, N = 5. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4088/4088fig3.jpg" /> Şekil 3. C. Görselleştirme mikroskobu ile hipoksi elegans. Worms açıklanan yöntemleri kullanarak hipoksi maruz kalmaktadır. Şeffaf çevre bölmesi (payreks bir kristalizasyon çanak ve cam plakası ile yapılmış) bir diseksiyon kapsamı sahnede doğrudan yerleştirilir. İki kez tüm gaz akışı da dahil olmak üzere bir mikroskop sahnede sadece oda ile, diğer kurmak, gösterilir.

<ol>
	<li>Danovaro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+metazoa+living+in+permanently+anoxic+conditions.">The first metazoa living in permanently anoxic conditions.</a> BMC Biology. 8, 30 (2010).</li><li>Birner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+Hypoxia-inducible+Factor+1+alpha+Is+a+Marker+for+an+Unfavorable+Prognosis+in+Early-Stage+Invasive+Cervical+Cancer.">Overexpression of Hypoxia-inducible Factor 1 alpha Is a Marker for an Unfavorable Prognosis in Early-Stage Invasive Cervical Cancer.</a> Cancer Research. 60, 4693-4696 (2000).</li><li>Harris, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+-+a+key+regulatory+factor+in+tumour+growth.">Hypoxia - a key regulatory factor in tumour growth.</a> Nat. Rev. Cancer. 2, 38-47 (2002).</li><li>Ramirez-Bergeron, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+affects+mesoderm+and+enhances+hemangioblast+specification+during+early+development.">Hypoxia affects mesoderm and enhances hemangioblast specification during early development.</a> Development. 131, 4623-4634 (2004).</li><li>Staff, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wheel-well+Stowaways+Risk+Lethal+Levels+of+Hypoxia+and+Hypothermia.">Wheel-well Stowaways Risk Lethal Levels of Hypoxia and Hypothermia.</a> Human Factors and Aviation. 44, 1-5 (1997).</li><li>Shen, C., Powell-Coffman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Analysis+of+Hypoxia+Signaling+and+Response+in+C.+elegans.">Genetic Analysis of Hypoxia Signaling and Response in C. elegans.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 995, 191-199 (2003).</li><li>Shen, C., Nettleton, D., Jiang, M., Kim, S. K., Powell-Coffman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+the+HIF-1+Hypoxia-inducible+Factor+during+Hypoxia+Response+in+Caenorhabditis+elegans.">Roles of the HIF-1 Hypoxia-inducible Factor during Hypoxia Response in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Biological Chemistry. 280, 20580-20588 (2005).</li><li>Wang, G. L., Jiang, B. H., Rue, E. A., Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-inducible+factor+1+is+a+basic-helix-loop-helix-PAS+heterodimer+regulated+by+cellular+O2+tension.">Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O2 tension.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92, 5510-5514 (1995).</li><li>Epstein, A. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+EGL-9+and+Mammalian+Homologs+Define+a+Family+of+Dioxygenases+that+Regulate+HIF+by+Prolyl+Hydroxylation.">C. elegans EGL-9 and Mammalian Homologs Define a Family of Dioxygenases that Regulate HIF by Prolyl Hydroxylation.</a> Cell. 107, 43-54 (2001).</li><li>Nystul, T. G., Goldmark, J. P., Padilla, P. A., Roth, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suspended+Animation+in+C.+elegans+Requires+the+Spindle+Checkpoint.">Suspended Animation in C. elegans Requires the Spindle Checkpoint.</a> Science. 302, 1038-1041 (2003).</li><li>Gray, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+sensation+and+social+feeding+mediated+by+a+C.+elegans+guanylate+cyclase+homologue.">Oxygen sensation and social feeding mediated by a C. elegans guanylate cyclase homologue.</a> Nature. 430, 317-322 (2004).</li><li>Miller, D. L., Roth, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+Elegans+Are+Protected+from+Lethal+Hypoxia+by+an+Embryonic+Diapause.">C. Elegans Are Protected from Lethal Hypoxia by an Embryonic Diapause.</a> Current Biology. 19, 1233-1237 (2009).</li><li>Padilla, P. A., Nystul, T. G., Zager, R. A., Johnson, A. C. M., Roth, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dephosphorylation+of+Cell+Cycle-regulated+Proteins+Correlates+with+Anoxia-induced+Suspended+Animation+in+Caenorhabditis+elegans.">Dephosphorylation of Cell Cycle-regulated Proteins Correlates with Anoxia-induced Suspended Animation in Caenorhabditis elegans.</a> Molecular Biology of the Cell. 13, 1473-1483 (2002).</li><li>Hu, C. -. J., Wang, L. -. Y., Chodosh, L. A., Keith, B., Simon, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Roles+of+Hypoxia-Inducible+Factor+1{alpha}+(HIF-1{alpha})+and+HIF-2{alpha}+in+Hypoxic+Gene+Regulation.">Differential Roles of Hypoxia-Inducible Factor 1{alpha} (HIF-1{alpha}) and HIF-2{alpha} in Hypoxic Gene Regulation.</a> Molecular and Cellular Biology. 23, 9361-9374 (2003).</li><li>Treinin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIF-1+is+required+for+heat+acclimation+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">HIF-1 is required for heat acclimation in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Physiological Genomics. 14, 17-24 (2003).</li><li>Miller, D. L., Roth, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+sulfide+increases+thermotolerance+and+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans.">Hydrogen sulfide increases thermotolerance and lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> PNAS. 104, 20618-20622 (2007).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li><li>Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+to+the+metabolic+inhibitor+sodium+azide+induces+stress+protein+expression+and+thermotolerance+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Cell Stress Chaperones. 8, 1-7 (2003).</li><li>Salceda, S., Caro, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-inducible+Factor+1&#945;+(HIF-1&#945;)+Protein+Is+Rapidly+Degraded+by+the+Ubiquitin-Proteasome+System+under+Normoxic+Conditions.">Hypoxia-inducible Factor 1&#945; (HIF-1&#945;) Protein Is Rapidly Degraded by the Ubiquitin-Proteasome System under Normoxic Conditions.</a> Journal of Biological Chemistry. 272, 22642-22647 (1997).</li><li>Theilacker, J. C., White, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+of+Gases+in+Air+and+Its+Affect+on+Oxygen+Deficiency+Hazard+Abatement.">Diffusion of Gases in Air and Its Affect on Oxygen Deficiency Hazard Abatement.</a> AIP Conference Proceedings. 823, 305-312 (2006).</li><li>Chua, B., Kao, R. L., Rannels, D. E., Morgan, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+protein+degradation+by+anoxia+and+ischemia+in+perfused+rat+hearts.">Inhibition of protein degradation by anoxia and ischemia in perfused rat hearts.</a> Journal of Biological Chemistry. 254, 6617-6623 (1979).</li><li>Probst, G., Riedinger, H., Martin, P., Engelcke, M., Probst, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Control+of+DNA+Replication+in+Response+to+Hypoxia+and+to+Inhibited+Protein+Synthesis+in+CCRF-CEM+and+HeLa+Cells.">Fast Control of DNA Replication in Response to Hypoxia and to Inhibited Protein Synthesis in CCRF-CEM and HeLa Cells.</a> Biological Chemistry. 380, 1371-1382 (1999).</li><li>Semenza, G. L., Sen, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Oxygen Sensing. 381, (2004).</li><li>Chan, K., Roth, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anoxia-Induced+Suspended+Animation+in+Budding+Yeast+as+an+Experimental+Paradigm+for+Studying+Oxygen-Regulated+Gene+Expression.">Anoxia-Induced Suspended Animation in Budding Yeast as an Experimental Paradigm for Studying Oxygen-Regulated Gene Expression.</a> Eukaryotic Cell. 7, 1795-1808 (2008).</li><li>Nystul, T. G., Roth, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbon+monoxide-induced+suspended+animation+protects+against+hypoxic+damage+in+Caenorhabditis+elegans.">Carbon monoxide-induced suspended animation protects against hypoxic damage in Caenorhabditis elegans.</a> PNAS. 101, 9133-9136 (2004).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu yöntem, laboratuvarda muhafaza edilecek oksijen konsantrasyonları hassas ortamlar için izin veren bir hipoksik ortam oluşturmak için bir strateji sunar. Bu odaların O 2 özel düşük konsantrasyonda organizmalar teşhir ve moleküler ve fizyolojik çıkışları izlemek için basit bir yöntem sağlar. Açıklanan çevre odası laboratuar yerine ticari olarak satın tarafından birleştirilir ve böylece deney ihtiyaçlarına uyacak şekilde değiştirilebilir. Bu yönte...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Boru (FEP ve PTFE) </td><td> Cole Parmer Tygon </td><td> YO-95821-00 (1/8 &quot;HİP) 06605-27 (1/16 x 1/8 &quot;PTFE) &#39;R-3603 </td></tr><tr><td> Sıkıştırma bağlantı parçaları </td><td> Seattle Akışkan Sistemleri </td><td> 06.363-58 (M. bağlayıcı 1/16 &quot;) 06.363-62 (F. bağlayıcı 1/16 &quot;) 06363-60 (M. elemanı 1/8 &quot;) 06363-61 (F. elemanı 1/8 &quot;) </td></tr><tr><td> Akış tüpü </td><td> Aalborg </td><td> PMR3-010.073 (3 çıkış) PMR1-013.520 (1 çıkış) </td></tr><tr><td> Kütle akış kontrolörü </td><td> Sierra Aletleri </td><td> 810S-L-DR-2-OV1-SK1-V1-S1 (Kitle Trak) C100L-DD-2-OV1-SV1-PV2-V1-SO-C10 (Akıllı Trak 2) </td></tr><tr><td> Sıkıştırılmış gaz tankı </td><td> AirGas </td><td> Sipariş üzerine yapılır &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> Hortum barb bağlantı parçaları Plastik erkek Luer </td><td> Cole Parmer </td><td> 45.505-41 (500 serisi 1/16 &quot;) </td></tr><tr><td> Akrilik kutuları Cast </td><td> Ellard Enstrümantasyon </td><td> Sipariş etmek için yapılmış </td></tr><tr><td> Boru bağlantı parçaları (Pirinç veya paslanmaz çelik) </td><td> Seattle Akışkan Sistemleri </td><td> B-402-1 (1/4 &quot;somunu) B-200-3 (1/8 &quot;sendika tee) B-400-seti (1/4 &quot;yüksüklü) B-QM2-B1-200 (QM Vücut QC) B-200-1-2 (1/8 x 1/8 &quot;erkek conn) </td></tr><tr><td> Dow Corning Vakum Gres </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Z273554 </td></tr><tr><td> AnaeroPack kutusu </td><td> Misubishi Gaz Kimya Şirketi </td><td> R684004 (0.4 litre) R685025 (2.5 litre) R685070 (7.0 litre) </td></tr><tr><td> Pyrex gaz yıkama şişesi </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> CLS31770500C (500 mL) CLS31770250C (250 mL) CLS31770125C (125 mL) &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> Palmitik asit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P0500 </td></tr><tr><td> Keçi anti-fare IgG-yaban turpu peroksidaz </td><td> Güney Biyoteknoloji Associates </td><td> 1032-1005 </td></tr><tr><td> SuperSignal Batı Pico Chemiluminsecent Yüzey </td><td> Pierce Chemical </td><td> 34077 </td></tr><tr><td> 100 x 50 cam kristalleşme yemekleri </td><td> Kimax Kimble </td><td> 23000 </td></tr></tbody></table>

creating defined gaseous environments to study the effects of hypoxia on c. elegans

Tüm metazoans tek bilinen istisnası 1, yaşaması için oksijen çok önemlidir. Azalmış O 2 durumunu (hipoksi) hastalığı, normal gelişim ve çevresel koşullarda 2-5 değişikliklerin devletlerin sırasında ortaya çıkabilir. Hipoksiye yanıt olarak katılan hücresel sinyal yollarının anlaşılması inme kansere kadar, çeşitli insan patolojiler için tedavi stratejileri hakkında yeni ipuçları sağlayabilir. Bu amaç, genetik olarak müsait modeli organizmalarda kontrollü hipoksik maruz kalma ile bağlantılı teknik zorluklar göre, en azından kısmen, büyük ölçüde azalmıştır. Nematod Caenorhabditis elegans ideal bir kültür kolaydır ve genetik olarak manipüle olarak, hipoksik yanıt çalışmaları için bir model organizma olarak uygundur. Ayrıca, C. yana karıştırıcı etkisi olmadan belirli hipoksik O 2 konsantrasyonları hücresel yanıtları incelemek mümkündür elegans O 2 (eldeve difüzyon ile diğer gazlar) gibi bir kolaylaştırılmış solunum sistemi 6. karşı. Hipoksiye yanıt olarak dahil olmak üzere bilinen faktörleri C&#39;de muhafaza edilmektedir elegans. Hipoksiye gerçek cevap mevcuttur O 2 spesifik konsantrasyonuna bağlıdır. C. elegans, hipoksi orta maruz hif-1 tarafından büyük ölçüde aracılık ettiği bir transkripsiyonel yanıt verilmesini sağlar, yüksek korunmuş hipoksi-indüklenebilir transkripsiyon faktörü 6-9. C. elegans embriyo O 2 7,10 5,000-20,000 ppm hayatta kalmak için hif-1 gerektirir . Hipoksi &quot;normal O 2 daha az&quot; için genel bir terimdir. Normoksi (normal O 2) de tarif etmek zor olabilir. Biz genellikle normoksi olması 210,000 ppm O 2 oda havası, düşünün. Bununla birlikte, bu gösterilmiş olduğu C. elegans% 5-12 arası O 2 konsantrasyonları (ppm 50,000-120,000 O 2) 11 için davranışsal bir tercihi vardır. Larvae ve yetişkinler, 5.000 ppm O 2 12 hipoksi bağlı diapause önlemek için hif-1 davranır. Ancak, hif-1 O 2 &#39;nin düşük konsantrasyonlarda (anoksi, operasyonel tanım &lt;10 ppm O 2) 13 yanıt olarak bir rol oynamıyor. Anoksi, C. elegans tüm mikroskobik gözlemlenebilir etkinliği 10 sona erdiği asılı animasyon tersinir bir duruma geçer. Farklı koşullarda farklı fizyolojik tepkiler meydana gerçeği O 2 hipoksik konsantrasyonu üzerinde deney kontrolü olmasının önemini vurgulamaktadır. Burada, O 2 tanımlanmış konsantrasyonlarını güvenilir ve tekrarlanabilir hipoksik koşullarda üretmek çevre odalarının yapımı ve uygulanması için bir yöntem sunuyoruz. Sürekli bir akış yöntemi haznesinin hızlı dengeleme sistemi sağlar ve stabilitesini arttırır. Ayrıca, şeffaflık veodalarının erişilebilirlik hipoksiye maruz hayvanların doğrudan görselleştirme için izin verir. Biz daha C. hasat etkili bir yöntem gösterilmektedir elegans örnekleri hızla hipoksi maruz kaldıktan sonra, bu hipoksi 10,14 meydana hızla-ters değişiklikleri birçok gözlemlemek için gereklidir. Bu yöntem, kolayca farklı model sistemler ve gazlar çeşitli dahil bireysel laboratuar ihtiyaçları için değiştirilebilir temel bir temel sağlar.

Watch this Scientific Journal Video about Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans at JoVE.com

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

O tanımlanan konsantrasyonları ile atmosfer oluşturmak için sürekli akış hipoksi odalarına nasıl kullanılacağı Bu kağıdı ayrıntıları<sub&gt; 2</sub&gt; Biyolojik tepkileri anlamak için O azalmış<sub&gt; 2</sub&gt;. Bu sistem kurulumu ve bakımı kolay, ve O geniş bir yelpazede uyacak kadar esnektir<sub&gt; 2</sub&gt; Konsantrasyonları ve model sistemler

Üzerine Hipoksi Etkileri Eğitim için tanımlı Gazlı ortamlar oluşturma<em&gt; C. elegans</em

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, ...

creating-defined-gaseous-environments-to-study-effects-hypoxia-on-c

Research

JoVE Journal

Biology

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

12.0K Görüntüleme.  University of Washington. O tanımlanan konsantrasyonları ile atmosfer oluşturmak için sürekli akış hipoksi odalarına nasıl kullanılacağı Bu kağıdı ayrıntıları 2 Biyolojik tepkileri anlamak için O azalmış 2. Bu sistem kurulumu ve bakımı kolay, ve O geniş bir yelpazede uyacak kadar esnektir 2 Konsantrasyonları ve model sistemler

Video: Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

Kertenkeleler Hareket Hız ve Yön Visual Hassasiyet Test

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Biyoloji

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI Numune Hazırlama: Ultra İnce Tabaka Yöntemi

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Mikroenjeksiyon Kararlı Transgenik C. elegans Üretimi

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale. This complex process requires the coordinated activity of many pre- and post-synaptic proteins to ensure appropriate synaptic connectivity, conduction of electrical signals, targeting and priming of secretory vesicles, calcium sensing, vesicle fusion, localization and function of postsynaptic receptors and finally, recycling mechanisms. As neuroscientists it is our goal to elucidate which proteins function in each of these steps and understand their mechanisms of action. Electrophysiological recordings from synapses provide a quantifiable read out of the underlying electrical events that occur during synaptic transmission. By combining this technique with the powerful array of molecular and genetic tools available to manipulate synaptic proteins in C. elegans, we can analyze the resulting functional changes in synaptic transmission. 
The C. elegans NMJs formed between motor neurons and body wall muscles control locomotion, therefore, mutants with uncoordinated locomotory phenotypes (known as unc s) often perturb synaptic transmission at these synapses 1. Since unc mutants are maintained on a rich supply of a bacterial food source, they remain viable as long as they retain some pharyngeal pumping ability to ingest food. This, together with the fact that C. elegans exist as hermaphrodites, allows them to pass on mutant progeny without the need for elaborate mating behaviors. These attributes, coupled with our recent ability to record from the worms NMJs 2,3,7 make this an excellent model organism in which to address precisely how unc mutants impact neurotransmission. 
The dissection method involves immobilizing adult worms using a cyanoacrylic glue in order to make an incision in the worm cuticle exposing the NMJs. Since C. elegans adults are only 1 mm in length the dissection is performed with the use of a dissecting microscope and requires excellent hand-eye coordination. NMJ recordings are made by whole-cell voltage clamping individual body wall muscle cells and neurotransmitter release can be evoked using a variety of stimulation protocols including electrical stimulation, light-activated channel-rhodopsin-mediated depolarization 4 and hyperosmotic saline, all of which will be briefly described.

Application of electrophysiology to accessible synapses provides a quantifiable measure of synaptic activity, useful in analyzing synaptic mutants. This article describes a dissection method used to expose the neuromuscular junctions (NMJ) of Caenorhabditis elegans (C. elegans) and briefly discusses some of the uses to which this preparation can be applied.

C. Elegans Nöromüsküler Kavşağı Diseksiyon ve kayıt

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale.   This ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

Hi-C: genomların Üç boyutlu Mimari Eğitim Bir Yöntem.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and expression pattern of genes of interest or generation of tandem affinity purification (TAP) tagged versions of specific genes to facilitate their purification. Typically transgenes are generated by placing a promoter upstream of a GFP reporter gene or cDNA of interest, and this often produces a representative expression pattern. However, critical elements of gene regulation, such as control elements in the 3' untranslated region or alternative promoters, could be missed by this approach. Further only a single splice variant can be usually studied by this means. In contrast, the use of worm genomic DNA carried by fosmid DNA clones likely includes most if not all elements involved in gene regulation in vivo which permits the greater ability to capture the genuine expression pattern and timing. To facilitate the generation of transgenes using fosmid DNA, we describe an E. coli based recombineering procedure to insert GFP, a TAP-tag, or other sequences of interest into any location in the gene. The procedure uses the galK gene as the selection marker for both the positive and negative selection steps in recombineering which results in obtaining the desired modification with high efficiency. Further, plasmids containing the galK gene flanked by homology arms to commonly used GFP and TAP fusion genes are available which reduce the cost of oligos by 50% when generating a GFP or TAP fusion protein. These plasmids use the R6K replication origin which precludes the need for extensive PCR product purification. Finally, we also demonstrate a technique to integrate the unc-119 marker on to the fosmid backbone which allows the fosmid to be directly injected or bombarded into worms to generate transgenic animals. This video demonstrates the procedures involved in generating a transgene via recombineering using this method.

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The ability to produce transgenes for Caenorhabditis elegans using genomic DNA carried by fosmids is particularly attractive as all of the native regulatory elements are retained. Described is a simple and robust procedure for the production of transgenes via recombineering with the galK selectable marker.

Üretimi C. elegans Recombineering yoluyla transgenlerin GalK Seçilebilir Marker

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

Içinde Postembryonic Fenotiplerin Belirleme RNAi Tarama C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems including plants, invertebrates and vertebrates. There are various methods to achieve RNAi in vivo4,5. For example, the target gene may be transformed into an RNAi vector, and then either permanently or transiently transformed into cell lines or primary cells to achieve gene knockdown effects; alternatively synthesized double-strand oligonucleotides from specific target genes (RNAi oligos) may be transiently transformed into cell lines or primary cells to silence target genes; or synthesized double-strand RNA molecules may be microinjected into an organism. Since the nematode C. elegans uses bacteria as a food source, feeding the animals with bacteria expressing double-strand RNA against target genes provides a viable strategy6. Here we present an RNAi feeding method to score body size phenotype. Body size in C. elegans is regulated primarily by the TGF- &beta; - like ligand DBL-1, so this assay is appropriate for identification of TGF-&beta; signaling components7. We used different strains including two RNAi hypersensitive strains to repeat the RNAi feeding experiments. Our results showed that rrf-3 strain gave us the best expected RNAi phenotype. The method is easy to perform, reproducible, and easily quantified. Furthermore, our protocol minimizes the use of specialized equipment, so it is suitable for smaller laboratories or those at predominantly undergraduate institutions.

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-&beta; signaling.

Nematod Vücut büyüklüğü Yönetmelik ilgilendim Genler için Ekran RNA-aracılı Girişim Besleme Strateji Kullanımı<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. elegans Kemotaksis Deneyi

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is affected by environmental cues such as osmolarity1 and vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease egg-laying and retain fertilized eggs in their uterus3. However, the effect of different sources of food, especially pathogenic bacteria and particularly Enterococcus faecalis, on egg-laying
	behavior is not well characterized. The egg-in-worm (EIW) assay is a useful tool to quantify the effects of different types of bacteria, in this case E. faecalis, on egg- laying behavior.
	
	EIW assays involve counting the number of eggs retained in the uterus of C. elegans4. The EIW assay involves bleaching staged, gravid adult C. elegans to remove the cuticle and separate the retained eggs from the animal. Prior to bleaching, worms are exposed to bacteria (or any type of environmental cue) for a fixed period of time. After bleaching, one is very easily able to count the number of eggs retained inside the uterus of the worms. In this assay, a quantifiable increase in egg retention after E. faecalis exposure can be easily measured. The EIW assay is a behavioral assay that may be used to screen for potentially pathogenic bacteria or the presence of environmental toxins. In addition, the EIW assay may be a tool to screen for drugs that affect neurotransmitter signaling since egg-laying behavior is modulated by neurotransmitters such as serotonin and acetylcholine5-9.

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

An egg-in-worm (EIW) assay is a useful method to quantify egg-laying behavior. Alterations in egg laying can be a behavioral response of the model organism Caenorhabditis elegans to potentially harmful environmental substances such as those produced by pathogenic bacteria.

Üzerinde Bakterilerin Etkilerinin Ölçme<em&gt; C. Elegans</emBir Yumurta Tutma Testi Kullanma&gt; Davranış

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...