Bu çalışma Kanser Araştırma Ontario Enstitüsü (OICR), Terry Fox Vakfı ve Nörolojik Cerrahlar Amerikan Derneği tarafından finanse edildi.

1. Beyin Tümörü Doku Kültürü <ol><li> 37 ° C su banyosuna 15 yapay BOS ml (aCSF-bkz. Tablo 1) ve yere 200 ul çözülmüş Liberase (Roche Applied Science) ekleyin. Liberase TM ana doku örneklerinin yanı sıra kültür tumorspheres birbirinden ayırmak için kullanılan proteolitik enzim bir karışımıdır. Tripsin-EDTA aksine, Liberase yöntem yüzey antijeni CD133 korur. Yaklaşık 0.5 cm 3 Doku örneği için, biz Liberase 200 ul kullanın. Doku küçük ise, biz 100 ul kullanın. </li><li> Oda sıcaklığına amonyum klorür çözeltisi (kök hücre teknolojileri) getirin. Amonyum Klorür çözeltisi yavaşça diğer hücreler üzerinde en az etkisi olan kırmızı kan hücreleri lysis oluşumunu. Bir sabitleştirici içermez. </li><li> Steril biyolojik güvenlik kabini içinde, kapalı Pipeti sonra, doku durulama numune kabı, girdap aCSF 5 ml ekleyin. Bu adım, kırmızı kan hücreleri (RBC) kaldırmak için yardımcı olur. </li><li> Steril bir 100 mm Petri di beyin tümör dokusu aktarınsh. </li><li> Ince makas veya neşter ve forseps kullanma, bulamaç kıvamına doku ayrıştırılacaktır. </li><li> Liberase ile önceden ısıtılmış aCSF içeren tüp içine 10 ml normal pipet veya forseps ve transfer parçaları kullanarak örnek toplayın. </li><li> Inkübatör-çalkalayıcı (30 rpm) üzerine yerleştirin ve 37 ayarlı ° C, 15 dk. </li><li> Bir 50 ml Falcon tüp içine 70 mikron hücre süzgecinden doku lizat filtreleyin. </li><li> 5 dakika boyunca 280 xg&#39;de süzüntü aşağı spin. </li><li> Dikkatli süpernatantı çıkan hücre pelet boyutu ve rengi değerlendirilmesi: pembe veya kırmızı granül kırmızı kan hücrelerinin artan numaraları gösterir. </li><li> 1 ml PBS içinde yeniden süspanse pelet. </li><li> Topak boyutunu ve kırmızı hücre kirlenme esas amonyum klorid solüsyonu (4-12 ml), uygun bir miktarda ekleyin (amonyum klorit çözeltisi çok yumuşak olan ve fazla miktarda kırmızı hücre dışındaki hücreler için zararlı değildir). </li><li> 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Spin hücreleri5 dakika boyunca 280 xg&#39;de aşağı. </li><li> Steril PBS içinde 10 ml bir kere yıkayın. </li><li> 5 ml MGK tam orta (Tablo 2) ve ultra-düşük bağlama 60 mm doku kültürü plaka (Corning) transfer süspanse edin. Biz hidrofilik ve nötr hücre eki-aracılı farklılaşma en aza indirmek için, ücret vardır kovalent bağlı hidrojel yüzeyler ile ultra-düşük bağlama kültürü tabak kullanın. </li></ol> Kültüründe ilk gün için, ortamı değiştirmek gerekmez: medya rengi hafif sarı olduğunda kontör sadece gerektiği kadar 1-2 ml medya ile, daha sonra kültür ve değişim ortamı gözlemlemek devam ediyor. 2. Akış sitometrisi için Tumorsphere Ayrışma <ol><li> Mikroskop altında tumorspheres Değerlendirin: küre boyutu&gt; 100 mikron ise büyük küreler merkezinde nekrotik olabileceğinden, dissosiyasyon tavsiye edilir. </li><li> 15 ml konik tüp kültürü aktarın. </li><li> 2-3 ml steril P ekleBS iyice plakası durulayın ve konik tüp eklemek. </li><li> 5 dakika boyunca 280 xg&#39;de santrifüjleyin. </li><li> 1 süpernatant ve tekrar süspansiyon Kaldır - 2 ml steril PBS. </li><li> 10 ul Liberase ekleyin. </li><li> 3 dakika boyunca 37 ° C su banyosunda inkübe edin. Birden kümeleri görüldü eğer süspansiyon çıkarın ve görsel değerlendirmek, 1.000 ul pipet kullanarak yavaşça çiğnemek. </li><li> Topaklanma devam ederse, ek bir 1-2 dakikalık inkübasyonun devam. </li><li> 5 ml steril PBS eklenerek ve 5 dakika boyunca 280 x g santrifüj ile hücreler yıkanır. </li><li> 500-1000 ul steril PBS +2 mM EDTA süpernatant ve tekrar süspansiyon çıkarın. </li><li> Hücre sayısı ve tripan mavisi kullanarak canlılığı değerlendirin. </li><li> PBS +2 mM EDTA 1 milyon / ml hücre sayısını ayarlayın. </li></ol> 3. Yüzey Boyama <ol><li> 12x75 mm akım tüpleri test başına 1x10 6 / ml hücre süspansiyonu 100 ul aktarın. </li><li> Antikorların uygun miktarda ekleyin. Eşleştirilmiş İzotip kontrol her biri için kullanılması gerekenantikor (bkz. Tablo 3). </li><li> Buz üzerinde 30 dakika süreyle inkübe edin. </li><li> Her akış tüpüne 2 ml PBS +2 mM EDTA ekleyin. </li><li> 4 dk, süzün ve leke için 200 xg&#39;de santrifüjleyin. </li><li> 300 ul PBS +2 mM EDTA süspanse pelet. </li><li> Her bir tüpe 10 ul 7AAD canlılığı boya ekleyin ve buz üzerinde en az 15 dakika inkübe edilir. </li><li> Flow sitometri ile analiz edin. </li></ol> 4. Akım Sitometri Toplama ve Analizi Akış veri toplama ve analiz özellikleri aracı bağlıdır. Örnek negatif örnekleri çalıştırın ve cihaz ayarlarını İleri (boyut) ve Side (taneciklik) dağılım için kurulmuştur. Bu dağılım deseni son kullanıcı enkaz dahil, örnekteki tüm hücreleri görüntülemenize olanak sağlar. Bir bölge, genellikle ilgi hücrelerin yaklaşık çizilir. (Şekil 4a) Ayarlar ardından af ilk on yıl içinde olumsuz hücreleri yerleştirmek için gerekli tüm floresans dedektörler için kurulanluorescence yoğunluk arsa. Birden fazla boya veya florokrom kullanıldığında, tek lekeli kontroller renk kompanzasyon değerleri (floresans emisyon müdahale çıkarma) kurmak için çalıştırılması gerekir. Kullanılır ve ölü hücreler (Şekil 4b) dışlamak için çizilmiş bir ikinci bölge - canlı hücreler, örneğin 7-AAD (uyarma 488/emission 655 7-Amino-aktinomisin D) gibi bir canlılığı boya çalışırken. Bu bölgelerin her ikisinde örneklerin herhangi daha fazla analiz için uygulanır. 5. Kendini yenileme Assay Büyük klonal küre büyüme tarafından kolaylaştırılır anahtarı testi kendini yenileme kapasitesi, sınırlayıcı seyreltme testin in vitro testtir. Tumorspheres disosiye ve kuyu başına tek bir hücreye dilüsyonlarda aşağı dağıtılır, ve kültür 7 gün içinde izleyen kürenin oluşum oranı hesaplanır. 7. gün, her hücre kaplama yoğunluk için küreler (F 0) içermeyen kuyuların yüzdesi hesaplanır ve çizilirkuyu başına hücre (x) sayısına karşılık. Her da en az bir tumorsphere oluşturmak için gereken hücre sayısı çizgi 0.37 seviyesini (C = 0 e-x) kestiği nokta tespit edilir. Hücrelerin bir Poisson dağılımı, bu hesaplama (% 37 kesişir) bütün hücre popülasyonu (Şekil 5) clonogenic kök hücrelerin frekansı yansıtır, böylece kuyu başına bir hücrenin seyreltme ile F = 0 0.37 karşılık gelir. 6. Tek Hücre RT-PCR Farklı topluluklarda Tek hücreleri AmpliGrid slayt (Beckman Coulter kedi # AG480F) üzerinde tepki sitelerinde Beckman Coulter MoFlo XDP göre sıralanır. Tek hücreli RT-PCR üreticinin spesifikasyonlarına göre AmpliGrid Tek Bir Adım RT-PCR sistemi (Beckman Coulter kedi # OAX04515) kullanılarak yapılır. Kısaca, tek bir hücre, bir kayar AmpliGrid her bir reaksiyon yeri yatırılır, her biri bir tek hücre varlığıReaksiyon sitesi mikroskop ile onaylamıştır. Ters transkripsiyon (RT) ele geçirilmesini örnek önlemek için sıralama hemen sonra gerçekleştirilir. RT master miks kiti talimatlarına (Tablo 4) göre, taze hazırlanır. Bu reaksiyon başına 25 uM rasgele primerlerin (Promega) ve 0.03 ul kullanılır; ana karışımı 1 ul her bir reaksiyon yeri merkezine eklenir. Bu, hemen sızdırmaz çözeltisi (Beckman Coulter, cat # OAX04503) 5 ul ile kaplanır. Bir AmpliSpeed ​​slayt cycler (Beckman Coulter, cat # OAX04101) kullanılarak, slaytlar 25 ° inkübe edilir 10 dakika, 42 ° C&#39;de 10 dakika, ve 55 ° C de 45 dakika süre ile. Ters transkripsiyon, DNase / RNase içermeyen su ile 3 ul her bir reaksiyon yeri ilave edilir ve bütün karışım, bir PCR tüp (1 tüp / sitesi) aktarıldıktan sonra. 8 ul qPCR ana karışımı (5 ul SYBR Yeşil (Quanta), 1 ul su, 10 uM ileri ve ters primerler karışımı 1 ul) ve ayrıca 2 ve: bir PCR plaka, 10 ul bir reaksiyon hacmi kantitatif PCR için kullanılmıştırMu; RT karışımın l. Gerçek-zaman ölçümü için, numuneler aşağıdaki program kullanan bir BioRad döngü cihazı üzerinde çalışır: 60 saniye için 60 saniye, 72 ° C, 30 sn için 95 ° C&#39;de 10 dakika, 95 ° C&#39;de 45 döngü, 60 ° C&#39;de, ardından 72 ile 10 dakika ° C ve erime eğrisi analizi. Ct değerleri, Opticon izleyicisi 3 (BioRad) kullanılarak tayin edilmiştir. Üç genler temizlik gen olarak GAPDH dahil, hücre başına değerlendirilebilir. Gen ekspresyonu 2-ΔCt göre GAPDH ifade normalize edilir. Biyolojik teknik çoğaltır eksikliği telafi etmek için çoğaltır gibi aynı çeşit, aynı nüfusunun en az bir düzine tek bir hücre kullanılabilir. 7. Temsilcisi Sonuçlar Şekil 1 GBM ile temsili bir hastanın Manyetik Rezonans Görüntüleme (MRG) gösterir. Beyin tümörü örnekleri Hamilton Sağlık Bilimleri / McMaster Sağlık S olarak onaylanmış, ameliyattan hemen sonra hasta rıza elde edilirciences Araştırma Etik Kurulu. Her örnek bir kısmı rutin klinik tanı nöropatolog verilir. Şekil 2 &#39;de gösterildiği gibi geri kalan örnek işlenir. Şekil 3 &#39;de gösterildiği gibi bir kere büyüme faktörleri, şekil tumorspheres ile birlikte sinir kök hücre ortamı içinde kaplanmış tümör hücreleri,. Tümör hücreleri sinir kök hücre yüzey işaretleyicileri CD133 ve CD15 ile işaretlenmiş ve Şekil 4&#39;te gösterildiği gibi akış sitometrisi ile analiz edilmiştir. Örneğin, CD15 + / CD133 için farklı topluluklarda Tek hücreleri +, CD15 + / CD133-, CD15-/CD133 +, CD15-/CD133- ardından 96 kuyucuğu (Şekil 5a) içine veya AmpliGrid slaytlar (Şekil 6a) halinde sıralanır. 96 plaka, kendini yenileme kapasitesi (örn. CD133 + hücreleri), (Şekil 5b) sahip tek hücreli, incu takiben (Şekil 5c) tumorspheres oluşabilirbation. Bir kendini yenileme grafiği kuyu başına oluşan kürelerin sayısını sayarak (5d Şekil) çizilebilir. Tek hücre Ampligrid slayt (Şekil 6a) reaksiyon yeri ayrılmıştır. Tek hücrelerden çıkartılan RNA ters Advalytix AmpliSpeed ​​(Şekil 6b) kullanılarak transkribe edilebilir. Elde edilen cDNA Gerçek zamanlı RT-PCR (Şekil 6c) gerçekleştirmek için kullanılır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4111/4111fig1.jpg" /> Şekil 1. Bir hasta GBM manyetik rezonans görüntüleme (MRG). Başağrısı bir ay uzun bir geçmişi ve kusma, uyuşukluk ve görme bulanıklığı bir haftada geçmişi olan bir 16 yaşındaki kızın beyin MRI taraması. Aksiyel FLAIR sekansı büyük bi-hemisferik (&quot;kelebek&quot;) GBM gösterir. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/4111/4111fig2.jpg" /> Şekil 2. Beyin tümörü işleme. Beyin tümörü örnekleri obta vardırameliyattan hemen sonra hasta rıza dan ined. Bunlar (a) gösterildiği gibi, mekanik olarak ayrılmış olan ve 15 dk (b) için 37 ° C&#39;da bir 30 rpm sallanan kuluçka makinesi içinde inkübe edilerek Liberase ile aCSF daha sonra enzimatik olarak ayrılmış bulunmaktadır. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4111/4111fig3.jpg" /> Şekil 3,. BTIC nüfus kültür tumorspheres oluştururlar. Büyüme faktörleri ile tam nöral kök hücre medya kaplama Disosiye beyin tümör hücrelerine tumorspheres oluştururlar. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/4111/4111fig4.jpg" /> Şekil 4. BTIC nüfus flow sitometrik analizi. (A) Vadeli yan dağılım özelliklerini karşılık (b) canlılığı boya 7-AAD ile leke Hücreler analizi hariç tutulur enkaz dahil tüm hücreleri bir görüntü sağlar. (C) istatistiksel kadranın pozisyon (d) Tümör hücre yüzey ma ile boyanmış uygun İzotip kontrol kullanılarak belirlenirrkers CD15-PE ve CD133-APC. (D) Moflo XDP hücre sıralayıcı. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4111/4111fig4large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/4111/4111fig5.jpg" /> Şekil 5,. BTICs seyreltme analizi Limit kendi kendini yenileme kapasitesini ortaya koymaktadır. (A) değişik dilüsyonları Hücreleri kuyu başına (b) tek bir hücreye MGK 200 ul içeren 96 kuyu halinde sıralanır. (C) 7 günlük bir kuluçka döneminden sonra, bir tumorsphere oluşur. İkincil tumorspheres morfolojisi primer tumorspheres bu aynıdır. (D) ortalama x-kesim değeri için de en az bir tane tumorsphere oluşturmak için gereken hücrelerin sayısını göstermek için her bir tümör alt tipi için analiz sınırlayıcı seyreltme hesaplanabilir. <img alt="Şekil 6" src="/files/ftp_upload/4111/4111fig6.jpg" /> Şekil 6. Tek BTIC hücre gen ekspresyon analizimümkünse tek hücre RT-PCR teknolojisi kullanıyor. (a) BTIC popülasyondan Tek hücreler AmpliGrid Slaytlarınıza sıralanabilir. (B) cDNA sentez Advalytix AmpliSpeed ​​kullanılarak AmpliGrid slaytlar üzerinde tek hücreler üzerinde gerçekleştirilir. (C) Gerçek zaman PCR Kantitatif tek BTIC hücrelerden sentezlenen cDNA üzerinde gerçekleştirilir. <table border="1"><tbody><tr><td> 2M NaCl </td><td> 62 ml </td></tr><tr><td> 1M KCl </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> 1M MgCl2 </td><td> 3.2 mL </td></tr><tr><td> 155 mM NaHCO 3 </td><td> 169 ml </td></tr><tr><td> 1M Glikoz </td><td> 10 mL </td></tr><tr><td> 108 mM CaCl2 </td><td> 0,9256 ml </td></tr><tr><td> Purelab Ultra H 2 0 </td><td> 749,84 mL </td></tr></tbody></table> Tablo 1 yapay serebrospinal akışkan (aCSF) -. 1.000 ml. <table border="1"><tbody><tr><td> Stok bazal ortam </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> 01:01 DMEM: F12 </td><td> 480 ml </td></tr><tr><td> N2 takviyesi </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> 1M Hepes </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Glikoz </td><td> 3.0 g </td></tr><tr><td> N-asetilsistein (60 ug / ml) </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> Nöral hayatta kalma faktörü-1 (NSF-1) </td><td> 10 mL </td></tr></tbody></table> Tablo 2. Nöral kök hücre ortam. MGK tam medya (Kullanmadan önce taze yapılmış): MGK bazal ortam + 20 ng / ml EGF (epidermal büyüme faktörü) + 20 ng / ml bFGF (temel fibroblast büyüme faktörü) + 10 ng / ml LIF (lösemi inhibitör faktör) * + 10 ml / ul antibiyotik-antimikotik * Lösemi inhibitör faktörü (LIF): Millipore dan Bu reaktif bir interlökin 6 sınıf sitokin, bir pr içerirkök hücre kültürlerinin uzun vadeli bakım teşvik kök hücrelerin spontan farklılaşma bastırır otein. <table border="1"><tbody><tr><td> Antikorlar </td><td> Tedarikçi / CAT # </td><td> ul / test (100 ul) </td></tr><tr><td> CD133 / 2 APC (293C3) </td><td> Miltenyi Biotec/130-090-854 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> IgG2b APC (İzotip kontrolü) </td><td> Miltenyi Biotec/130-092-217 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> CD15PE </td><td> Beckman Coulter/IM1954U </td><td> 5 </td></tr><tr><td> IgG2a PE (İzotip kontrolü) </td><td> Beckman Coulter/A09141 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> 7AAD </td><td> Beckman Coulter/A07704 </td><td> 10 </td></tr></tbody></table> Tablo 3. Akış antikorlar. <table border="1"><tbody><tr><td> Bileşen </td><td> Hacim (1 reaksiyon) </td><td> Hacim (48 reaksiyon) </td></tr><tr><td> Tek Hücre RT reaksiyonu Tampon 2x </td><td> 0.50 ul </td><td> 30.0 ul </td></tr><tr><td> RNaz İnhibitör (10 U / ul) </td><td> 0.02 ul </td><td> 1.2 ul </td></tr><tr><td> 5X Tek Hücre RT artırıcı </td><td> 0.15 ul </td><td> 9.00 ul </td></tr><tr><td> Tek Hücre RT Enzim Mix </td><td> 0.04 ul </td><td> 2.4 ul </td></tr><tr><td> Advablue (OAX04227) </td><td> Ul 0.1 </td><td> 6.00 ul </td></tr><tr><td> Nükleaz ücretsiz su </td><td> 1 ul makyaj </td><td> 60 ul makyaj </td></tr></tbody></table> Tablo 4. Tek Hücre RTPCR (kedi # OAX04515) RT master miks bileşimi.

<ol>
	<li>Ohgaki, H., Kleihues, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+and+etiology+of+gliomas.">Epidemiology and etiology of gliomas.</a> Acta Neuropathol. 109, 93 (2005).</li><li>Huse, J. T., Holland, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+brain+cancer:+advances+in+the+molecular+pathology+of+malignant+glioma.">Targeting brain cancer: advances in the molecular pathology of malignant glioma.</a> 10, 319 (2010).</li><li>Wechsler-Reya, R., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+biology+of+brain+tumors.">The developmental biology of brain tumors.</a> Annu. Rev. Neurosci. 24, 385 (2001).</li><li>Singh, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+cancer+stem+cell+in+human+brain+tumors.">Identification of a cancer stem cell in human brain tumors.</a> Cancer Res. 63, 5821 (2003).</li><li>Singh, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+brain+tumour+initiating+cells.">Identification of human brain tumour initiating cells.</a> Nature. 432, 396 (2004).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+and+population+analyses+demonstrate+that+an+EGF-responsive+mammalian+embryonic+CNS+precursor+is+a+stem+cell.">Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell.</a> Dev. Biol. 175, 1 (1996).</li><li>Tropepe, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+neural+stem+cells+proliferate+in+response+to+EGF+and+FGF+in+the+developing+mouse+telencephalon.">Distinct neural stem cells proliferate in response to EGF and FGF in the developing mouse telencephalon.</a> Dev. Biol. 208, 166 (1999).</li><li>Yin, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AC133,+a+novel+marker+for+human+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">AC133, a novel marker for human hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Blood. 90, 5002 (1997).</li><li>Yu, Y., Flint, A., Dvorin, E. L., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AC133-2,+a+novel+isoform+of+human+AC133+stem+cell+antigen.">AC133-2, a novel isoform of human AC133 stem cell antigen.</a> J. Biol. Chem. 277, 20711 (2002).</li><li>Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells,+cancer,+and+cancer+stem+cells.">Stem cells, cancer, and cancer stem cells.</a> Nature. 414, 105 (2001).</li><li>Al-Hajj, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification+of+tumorigenic+breast+cancer+cells.">Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 3983 (2003).</li><li>Bonnet, D., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+acute+myeloid+leukemia+is+organized+as+a+hierarchy+that+originates+from+a+primitive+hematopoietic+cell.">Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell.</a> Nat. Med. 3, 730 (1997).</li><li>Matsui, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+clonogenic+multiple+myeloma+cells.">Characterization of clonogenic multiple myeloma cells.</a> Blood. 103, 2332 (2004).</li><li>Bao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cancer+stem+cells+through+L1CAM+suppresses+glioma+growth.">Targeting cancer stem cells through L1CAM suppresses glioma growth.</a> Cancer Res. 68, 6043 (2008).</li><li>Bao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma+stem+cells+promote+radioresistance+by+preferential+activation+of+the+DNA+damage+response.">Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response.</a> Nature. 444, 756 (2006).</li><li>Bao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-like+glioma+cells+promote+tumor+angiogenesis+through+vascular+endothelial+growth+factor.">Stem cell-like glioma cells promote tumor angiogenesis through vascular endothelial growth factor.</a> Cancer Res. 66, 7843 (2006).</li><li>Beier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temozolomide+preferentially+depletes+cancer+stem+cells+in+glioblastoma.">Temozolomide preferentially depletes cancer stem cells in glioblastoma.</a> Cancer Res. 68, 5706 (2008).</li><li>Piccirillo, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+pools+of+cancer+stem-like+cells+coexist+within+human+glioblastomas+and+display+different+tumorigenicity+and+independent+genomic+evolution.">Distinct pools of cancer stem-like cells coexist within human glioblastomas and display different tumorigenicity and independent genomic evolution.</a> Oncogene. 28, 1807 (2009).</li><li>Piccirillo, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=morphogenetic+proteins+inhibit+the+tumorigenic+potential+of+human+brain+tumour-initiating+cells.">morphogenetic proteins inhibit the tumorigenic potential of human brain tumour-initiating cells.</a> Nature. 444, 761 (2006).</li><li>Rich, J. N., Bao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotherapy+and+cancer+stem+cells.">Chemotherapy and cancer stem cells.</a> Cell Stem Cell. 1, 353 (2007).</li><li>Lapidot, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell+initiating+human+acute+myeloid+leukaemia+after+transplantation+into+SCID+mice.">A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice.</a> Nature. 367, 645 (1994).</li><li>Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells,+cancer,+and+cancer+stem+cells.">Stem cells, cancer, and cancer stem cells.</a> Nature. 414, 105 (2001).</li><li>Fuchs, E., Segre, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells:+a+new+lease+on+life.">Stem cells: a new lease on life.</a> Cell. 100, 143 (2000).</li><li>Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells:+units+of+development,+units+of+regeneration,+and+units+in+evolution.">Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution.</a> Cell. 100, 157 (2000).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707 (1992).</li><li>Reynolds, B. A., Tetzlaff, W., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multipotent+EGF-responsive+striatal+embryonic+progenitor+cell+produces+neurons+and+astrocytes.">A multipotent EGF-responsive striatal embryonic progenitor cell produces neurons and astrocytes.</a> J. Neurosci. 12, 4565 (1992).</li><li>Hulett, H. R., Bonner, W. A., Barrett, J., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+sorting:+automated+separation+of+mammalian+cells+as+a+function+of+intracellular+fluorescence.">Cell sorting: automated separation of mammalian cells as a function of intracellular fluorescence.</a> Science. 166, 747 (1969).</li><li>Kohler, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+cultures+of+fused+cells+secreting+antibody+of+predefined+specificity.">Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.</a> Nature. 256, 495 (1975).</li><li>Barrett, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+does+not+predict+tumor+growth+potential+in+mouse+models+of+high-grade+glioma.">Self-renewal does not predict tumor growth potential in mouse models of high-grade glioma.</a> Cancer Cell. 21, 11 (2012).</li><li>Venugopal, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmi1+marks+intermediate+precursors+during+differentiation+of+human+brain+tumor+initiating+cells.">Bmi1 marks intermediate precursors during differentiation of human brain tumor initiating cells.</a> Stem Cell Res. 8, 141 (2012).</li><li>Gerlinger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumor+heterogeneity+and+branched+evolution+revealed+by+multiregion+sequencing.">Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing.</a> N. Engl. J. Med. 366, 883 (2012).</li><li>Gilbertson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medulloblastoma:+signalling+a+change+in+treatment.">Medulloblastoma: signalling a change in treatment.</a> Lancet. Oncol. 5, 209 (2004).</li><li>Zhu, Y., Parada, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+and+genetic+basis+of+neurological+tumours.">The molecular and genetic basis of neurological tumours.</a> Nat. Rev. Cancer. 2, 616 (2002).</li><li>Maher, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+glioma:+genetics+and+biology+of+a+grave+matter.">Malignant glioma: genetics and biology of a grave matter.</a> Genes Dev. 15, 1311 (2001).</li><li>Blake, W. J., KAErn, M., Cantor, C. R., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+in+eukaryotic+gene+expression.">Noise in eukaryotic gene expression.</a> Nature. 422, 633 (2003).</li><li>Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+gene+expression+in+a+single+cell.">Stochastic gene expression in a single cell.</a> Science. 297, 1183 (2002).</li><li>Maheshri, N., O'Shea, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Living+with+noisy+genes:+how+cells+function+reliably+with+inherent+variability+in+gene+expression.">Living with noisy genes: how cells function reliably with inherent variability in gene expression.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36, 413 (2007).</li><li>Raj, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+mRNA+synthesis+in+mammalian+cells.">Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells.</a> PLoS Biol. 4, e309 (2006).</li><li>Ross, I. L., Browne, C. M., Hume, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+of+individual+genes+in+eukaryotic+cells+occurs+randomly+and+infrequently.">Transcription of individual genes in eukaryotic cells occurs randomly and infrequently.</a> Immunol. Cell Biol. 72, 177 (1994).</li><li>Kubista, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+real-time+polymerase+chain+reaction.">The real-time polymerase chain reaction.</a> Mol. Aspects Med. 27, 95 (2006).</li><li>Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+mRNA+using+real-time+RT-PCR.">Quantification of mRNA using real-time RT-PCR.</a> Nat. Protoc. 1, 1559 (2006).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Lösemi 21 çalışmasına dayalı kanser kök hücresi hipotezine 10, meme kanseri 11 ve beyin kanseri 4,5, tümör hücrelerinin yalnızca görece küçük bir kısmını adlandırılan kanser kök hücreleri, yoğun çoğalmaya başlar ve kendini bir yeteneğe sahip olduğunu göstermektedir -yenilemek. Tümör hücrelerinin çoğu prolifere ve tümörün fenotipik imzası haline hücrelere farklılaşırlar olarak kendini yenileme yeteneğini kaybeder. Tümör muhafaza ede...

Beyin tümörleri insanlarda bilinen en agresif ve heterojen kanserler arasındadır. Onların erken tespiti ve teşhisi, modern nöro-görüntüleme teknolojisi tarafından kolaylaştırılmış olmasına rağmen, biz yine de özellikle diffüz, invaziv olanları veya beyinde derin yerleşimli olanlar için, birçok beyin tümörleri için tedavi edici tedaviler yoksundur. Beyin tümörleri çok agresif ve çoğu zaman çaresiz doğası nedeniyle çocuklarda kanser ölümlerinin önde gelen nedenlerindendir. Glioblastoma (GBM), erişkinlerde en sık rastlanan primer beyin tümörü olan eşit ölümcül prognozu 1 için korkulan en saldırgan insan kanserleri, biridir. Bu son derece malign astrositik tümör (WHO grade 4) genellikle yetişkinlerin hemisferlerin oluşur ve aynı zamanda küçük çocuklar ve bebeklerde oluşabilir. Onun büyüme hızlı ve infiltratif ve tanı patolojik özellikleri, nükleer pleomorfizm, mikrovasküler proliferasyon ve nekroz 2,3 bulunmaktadır. Adul içints yeni teşhis GBM birlikte ortanca sağkalım nadiren tüm tedavilerin genellikle yoksul cevapları, 12 ay 1 ötesine uzanır. Biz somatik kök hücre ve kanser hücreleri tarafından paylaşılan birçok fonksiyonel ve genetik benzerlikler bulunmaktadır kaydetti ve normal beyin gelişimini düzenleyen moleküler yollar genellikle kanser düzensiz olduğunu. Beyin tümörlerinin çalışma kök hücre biyolojisi paradigmalar uygularken, biz prospektif belirlemek ve proliferasyon, kendini yenileme kök hücre özelliklerini sergiledi insan GBMs bir hücre subpopülasyonu arındırmak için ilk araştırmacılardan olan, ve in vitro 4 ve farklılaşma İn vivo 5. Biz aslında çok pediatrik ve yetişkin beyin tümörleri için in vitro 6,7 normal nöral kök hücreler (NSC&#39;lerde) karakterize etmek için kullanılan kültür koşulları ve testleri uygulanır ve CD133 8 nöral progenitör hücre yüzey işaretleyici için sıralama hücre tarafından bu kök-benzeri hücreler için zenginleştirilmiş ,9. CD133 + beyin tümörü fraksiyonu NOD-SCID fare beyinlerinde 5,10 CD133-fraksiyonu daha tümör gelişimini çok daha yüksek frekanslı vardı hücrelerini içeriyordu. Bu resmen kök hücre özellikleri ile beyin tümör hücrelerinin sadece nadir alt, tümör-başlatıcı adı &quot;beyin tümör hücrelerinin başlatılması&quot; onlara kazanç veya &quot;BTICs&quot; olduklarını belirlediler. BTICs ve roman tanımlama birçok solid tümör için temel olarak kanser kök hücre hipotezi 10-13 için güçlü bir destek vererek, insan beyninin tümörogenez sağlayan yeni anlayışlar içine, ve daha etkin kanser tedavilerinin 14-20 için yeni bir hücresel hedef kurar. Tümör toplu öldürme odaklı tümör büyümeye devam sağlayan nadir kök benzeri fraksiyonu kaçırabileceği Tedaviler. Kanser kök hücre öldürme odaklanan beyin tümörleri olan hastalar için daha iyi tedavi ve prognoz verebileceğini Tedaviler. BTIC nüfus incelemek için, bizim cultu rafine varÖzellikle kök hücre özelliklerine sahip İnsan beyin tümörleri içinde hücre popülasyonları için seçmek için protokolleri yeniden. Serum serbest, nöral kök orta bir farklılaşmamış kök hücre devletin bakım sağlar, hücre (MGK) ve temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF), epidermal büyüme faktörü (EGF) ve lösemi inhibitör faktör ilavesi (LIF) sağlar çok güçlü, kendini sürekli yenileyen ve genişletilebilir insan tumorspheres yayılması. Burada, birincil beyin tümörleri ve BTIC popülasyonlar için zenginleştirmek MGK orta kültür onları işlemeye dahil yöntemleri açıklanmaktadır. Bizim deneysel model sistemi bu hücreleri sadece minimal kök altında kültüre gerçeğini vurgulamak için &quot;BTIC hasta izolatları&quot; çağrısında bulundular kök hücre popülasyonlarının için seçmek için hücre koşulları. gibi CD133 ve CD15 ve akım sitometri analizi gibi temel kök hücre belirteçleri için BTIC popülasyonlarının sonraki immunolabelling de açıklanmıştır. Biz o zaman sınırlayıcı seyreltme analizini tartışır,Hangi BTICs ve kendini yenileme potansiyeli okuyan yardımcı olur. Nihayet, biz AmpliGrid Slaytlarınıza tek hücre sıralama ve tek hücre RT-PCR yaparak bu nadir hücrelerin gen ekspresyon analizi keşfedebilirsiniz. Bu teknikler ayrıca bu tür medulloblastom, ependimoma, pediatrik gliomları gibi diğer beyin tümörleri için de geçerlidir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> 01:01 DMEM: F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 11320-082 </td></tr><tr><td> N2 takviyesi </td><td> Invitrogen </td><td> 17502-048 </td></tr><tr><td> 1M Hepes </td><td> Wisent </td><td> 330-050-EL </td></tr><tr><td> Glikoz </td><td> Invitrogen </td><td> 15023-021 </td></tr><tr><td> N-asetilsistein </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A9165-25g </td></tr><tr><td> Nöral hayatta kalma faktörü -1 (NSF-1) </td><td> Lonza Clonetics </td><td> CC-4323 </td></tr><tr><td> Epidermal büyüme faktörü (EGF) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> E9644 </td></tr><tr><td> Temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0261 </td></tr><tr><td> Lösemi inhibitör faktörü (LIF) </td><td> Millipore </td><td> LIF1010 </td></tr><tr><td> Mikotik / Antibiyotik </td><td> Wisent </td><td> 450-115-EL </td></tr><tr><td> Liberase TM </td><td> Roche </td><td> 05 401 119 001 </td></tr><tr><td> Amonyum klorür çözeltisi </td><td> Hücre Teknolojileri Stem </td><td> 07850 </td></tr></tbody></table>

processing of primary brain tumor tissue for stem cell assays and flow sorting

Beyin tümörlerinin tipik olarak sinir soy belirteçler, çeşitli ifade morfolojik olarak farklı hücre oluşmaktadır. Stem hücre özellikleri ile tümör hücrelerinin sadece nispeten küçük bir kısmı olarak adlandırıldı, beyin tümörü başlatıcı hücreleri (BTICs), çoklu soyların birlikte ayırmak kendini yenilemek ve in vivo olarak tümör başlatmak için bir yeteneğine sahiptirler. Biz aslında insan beyninin çeşitli tümörlerde normal nöral kök hücreler (NSC&#39;lerde) için kullanılır ve bu kültürü yöntemi özellikle kök benzeri popülasyonları için seçtiği bulundu kültür koşulları uygulanır. Serum serbest orta (MGK) bir farklılaşmamış kök hücre devletin bakım için izin verir, ve bFGF ve EGF ilave çoklu güçlü, kendini sürekli yenileyen yayılması ve genişletilebilir tumorspheres sağlar. İlave her tümörün BTIC nüfusu karakterize etmek için, flow sitometri ile hücre yüzey belirteçleri değerlendirmek. Biz de daha spesifik karakterize ilgi popülasyonları sıralayabilirsiniztirme. Kendini yenileme deneyleri 96 kuyucuğu ayrılır tek BTICs gerçekleştirilir; 37 inkübasyon sonrasında tumorspheres oluşumu ° C kök veya progenitör hücre varlığını gösterir. Belirli bir nüfus Çoklu hücre sayıları, aynı zamanda kendini yenileme kapasitesini analiz etmek için, seyreltme analizi sınırlandırılması için farklı kuyularda sıralanabilir. Biz de tek hücre RT-PCR kullanarak belirli bir hücre popülasyonu içindeki diferansiyel gen ekspresyonu çalışabiliriz. Aşağıdaki protokoller BTIC popülasyonları gibi tumorspheres ayrışma için zenginleştirmek için primer insan örnekleri ayrışma ve kültürleme için işlemler açıklanmaktadır. Ayrıca akım sitometri analizi veya sıralama, kendini yenileme deneyleri ve tek hücreli RT-PCR için boyama için protokoller dahildir.

Watch this Scientific Journal Video about Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting at JoVE.com

Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

Beyin tümörü başlatan hücreler (BTICs), heterojen bir tümör sahip kök hücre özellikleri içinde nadir hücrelerinin tanımlanması insan beyin tümörü patogenezinde sağlayan yeni anlayışlar içine. Biz BTICs için zenginleştirmek özgü kültür koşullarının rafine var ve biz rutin daha bu popülasyonların zenginleştirmek için flow sitometri kullanın. Tek hücre RT-PCR ile kendini yenileme analizleri ve transkript analiz sonra bu izole hücreler üzerinde de yapılabilir.

Sıralama Kök Hücre Tahliller ve Akış Primer Beyin Tümörü Doku İşleme

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction ...

processing-primary-brain-tumor-tissue-for-stem-cell-assays-flow

Research

JoVE Journal

Medicine

17.9K Görüntüleme.  McMaster University. Beyin tümörü başlatan hücreler (BTICs), heterojen bir tümör sahip kök hücre özellikleri içinde nadir hücrelerinin tanımlanması insan beyin tümörü patogenezinde sağlayan yeni anlayışlar içine. Biz BTICs için zenginleştirmek özgü kültür koşullarının rafine var ve biz rutin daha bu popülasyonların zenginleştirmek için flow sitometri kullanın. Tek hücre RT-PCR ile kendini yenileme analizleri ve transkript analiz sonra bu izole hücreler üz...

Video: Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells (MDSC) from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting (AutoMACS)

MDSC are a heterogeneous population of immature macrophages, dendritic cells and granulocytes that accumulate in lymphoid organs in pathological conditions including parasitic infection, inflammation, traumatic stress, graft-versus-host disease, diabetes and cancer1-7. In mice, MDSC express Mac-1 (CD11b) and Gr-1 (Ly6G and Ly6C) surface antigens7. It is important to note that MDSC are well studied in various tumor-bearing hosts where they are significantly expanded and suppress anti-tumor immune responses compared to na&iuml;ve counterparts7-10. However, depending on the pathological condition, there are different subpopulations of MDSC with distinct mechanisms and targets of suppression11,12. Therefore, effective methods to isolate viable MDSC populations are important in elucidating their different molecular mechanisms of suppression in vitro and in vivo.
Recently, the Ghansah group has reported the expansion of MDSC in a murine pancreatic cancer model. Our tumor-bearing MDSC display a loss of homeostasis and increased suppressive function compared to na&iuml;ve MDSC 13. MDSC percentages are significantly less in lymphoid compartments of na&iuml;ve vs. tumor-bearing mice. This is a major caveat, which often hinders accurate comparative analyses of these MDSC. Therefore, enriching Gr-1+ leukocytes from na&iuml;ve mice prior to Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) enhances purity, viability and significantly reduces sort time. However, enrichment of Gr-1+ leukocytes from tumor-bearing mice is optional as these are in abundance for quick FACS sorting. Therefore, in this protocol, we describe a highly efficient method of immunophenotyping MDSC and enriching Gr-1+ leukocytes from spleens of na&iuml;ve mice for sorting MDSC in a timely manner. Immunocompetent C57BL/6 mice are inoculated with murine Panc02 cells subcutaneously whereas na&iuml;ve mice receive 1XPBS. Approximately 30 days post inoculation; spleens are harvested and processed into single-cell suspensions using a cell dissociation sieve. Splenocytes are then Red Blood Cell (RBC) lysed and an aliquot of these leukocytes are stained using fluorochrome-conjugated antibodies against Mac-1 and Gr-1 to immunophenotype MDSC percentages using Flow Cytometry. In a parallel experiment, whole leukocytes from na&iuml;ve mice are stained with fluorescent-conjugated Gr-1 antibodies, incubated with PE-MicroBeads and positively selected using an automated Magnetic Activated Cell Sorting (autoMACS) Pro Separator. Next, an aliquot of Gr-1+ leukocytes are stained with Mac-1 antibodies to identify the increase in MDSC percentages using Flow Cytometry. Now, these Gr1+ enriched leukocytes are ready for FACS sorting of MDSC to be used in comparative analyses (na&iuml;ve vs. tumor- bearing) in in vivo and in vitro assays.

Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells MDSC from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting AutoMACS

This is a rapid and comprehensive method of immunophenotyping Myeloid Derived Suppressor Cells (MDSC) and enriching Gr-1+ leukocytes from mouse spleens. This method uses flow cytometry and AutoMACS Cell Sorting to enrich for viable Gr-1+ leukocytes prior to FACS sorting of MDSC for use in vivo and in vitro assays.

Akım Sitometri ve Otomatik Manyetik Aktif Hücre Sıralama (AutoMACS) kullanarak Naive ve Pankreas Tümör taşıyan fareler ile myeloid türevi bastırıcı hücreler (MDSC) hazırlanması

MDSC are a heterogeneous population of immature macrophages, dendritic cells and granulocytes that accumulate in lymphoid organs in pathological ...

Tıp

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events in cardiac myocytes such as proliferation and apoptosis require an accurate identification of cardiac myocyte nuclei to analyze cellular renewal in homeostasis and in pathological conditions2. Here, we provide a method to isolate cardiomyocyte nuclei from post mortem tissue by density sedimentation and immunolabeling with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) and subsequent flow cytometry sorting. This strategy allows a high throughput analysis and isolation with the advantage of working equally well on fresh tissue and frozen archival material. This makes it possible to study material already collected in biobanks. This technique is applicable and tested in a wide range of species and suitable for multiple downstream applications such as carbon-14 dating3, cell-cycle analysis4, visualization of thymidine analogues (e.g. BrdU and IdU)4, transcriptome and epigenetic analysis.

Cardiac nuclei are isolated via density sedimentation and immunolabeled with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) to identify and sort cardiomyocyte nuclei by flow cytometry.

Post-mortem Doku gelen kardiyomiyosit Çekirdeklerin İzolasyonu

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

İnsan Diş Pulp Kök Hücre İzolasyonu, Karakterizasyonu ve Karşılaştırmalı Farklılaşma İki Farklı Yöntemler Kullanılarak Daimi Dişler türetilen

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

Hasta Türetilen Hücre Kültürü ve CD133 İzolasyonu<sup&gt; +</supMelanom dan&gt; sağlayan olası Kanser Kök Hücreleri

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

Yeni Bir Yüksek çözünürlüklü<em&gt; In vivo</emTümör Büyüme ve Tedavi için İntrakranial Yapıların Dinamik Tepki Eğitim&gt; Görüntüleme Tekniği

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the presence of circulating tumor cells (CTCs). These rare cells have been demonstrated to be of clinical significance in metastatic breast, prostate, and colorectal cancers. The current gold standard in clinical CTC detection and enumeration is the FDA-cleared CellSearch system (CSS). This manuscript outlines the standard protocol utilized by this platform as well as two&#160;additional adapted protocols that describe the detailed process of user-defined marker optimization for protein characterization of patient CTCs and a comparable protocol for CTC capture in very low volumes of blood, using standard CSS reagents, for studying in vivo preclinical mouse models of metastasis. In addition, differences in CTC quality between healthy donor blood spiked with cells from tissue culture versus patient blood samples are highlighted. Finally, several commonly discrepant items that can lead to CTC misclassification errors are outlined. Taken together, these protocols will provide a useful resource for users of this platform interested in preclinical and clinical research pertaining to metastasis and CTCs.

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Circulating tumor cells (CTCs) are prognostic in several metastatic cancers. This manuscript describes the gold standard CellSearch system (CSS) CTC enumeration platform and highlights common misclassification errors. In addition, two&#160;adapted protocols are described for user-defined marker characterization of CTCs and CTC enumeration in preclinical mouse models of metastasis using this technology.

Klinik ve Klinik Öncesi Araştırma Uygulamaları Tümör Hücre (CTC) Tahliller Sirkülasyon semiautomated adaptasyon

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

Evaluation of Stem Cell Properties in Human Ovarian Carcinoma Cells Using Multi and Single Cell-based Spheres Assays

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem cells&#8221; (CSCs) responsible for tumor initiation, maintenance and relapse following conventional chemotherapies. Identification of ovarian CSCs is therefore an important goal. A commonly used method to assess CSC potential in vitro is the spheres assay in which cells are plated under non-adherent culture conditions in serum-free medium supplemented with growth factors and sphere formation is scored after a few days. Here, we review currently available protocols for human ovarian cancer spheres assays and perform a side-by-side analysis between commonly used multi cell-based assays and a more accurate system based on single cell plating. Our results indicate that both multi cell-based as well as single cell-based spheres assays can be used to investigate sphere formation in vitro. The more laborious and expensive single cell-based assays are more suitable for functional assessment of individual cells and lead to overall more accurate results while multi cell-based assays can be strongly influenced by the density of plated cells and require titration experiments upfront. Methylcellulose supplementation to multi cell-based assays can be effectively used to reduce mechanical artifacts.

In vitro spheres assays are commonly used to identify cancer stem cells. Here we compare single with multi cell-based spheres assays. The more laborious single cell-based assays or methylcellulose supplementation give more accurate results while multi cell-based assays performed in liquid medium can be highly influenced by cell density.

Çoklu ve tek hücre bazlı küreler tahliller kullanılarak, insan yumurtalık karsinoma hücrelerinde Kök Hücre Özelliklerinin Değerlendirilmesi

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem ...

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered genotypes now possess the ability to invade and survive in other tissues. In this protocol, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. The cells isolated from this procedure are then available for gene profiling experiments. For successful metastasis, these cells must be able to intravasate, survive in circulation, extravasate to distant organs, and survive in that new organ system. The lungs are the typical target of breast cancer metastasis. A set of genes have been discovered that mediates the selectivity of metastasis to the lung. Here we describe a method of studying lung metastasis from a genetically engineered mouse model.. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts (MEFs) from the mouse embryo is included. MEF cells from the same animal type provide a clue of non-cancer cell gene expression. Together, these techniques are useful in studying mouse mammary tumorigenesis, its associated signaling mechanisms and pathways of the abnormalities in embryos.

The goal of this protocol is to study breast tumorigenesis. With this technique, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. A lung extraction protocol is included for studying lung metastasis. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts from the mouse embryo is included.

Primer Tümör ve Akciğer Metastazı Eğitim için MEF Hücre İzolasyonu

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by astrocytes, pericytes and brain endothelial cells (BECs). Here, we detail methods to assess BBB coverage using single cultures of immortalized human BECs, single cultures of primary mouse BECs, and a humanized triple culture model (BECs, astrocytes and pericytes) of the BBB. To highlight the applicability of the assays to disease states, we describe the effect of oligomeric amyloid-&#946; (oA&#946;), which is an important contributor to Alzheimer&#39;s disease (AD) progression, on BBB coverage. Further, we utilize the epidermal growth factor (EGF) to illuminate the drug screening potential of the techniques. Our results show that single and triple cultured BECs form meshwork-like structures under basal conditions, and that oA&#946; disrupts this cell meshwork formation and degenerates the preformed mesh structures, but EGF blocks this disruption. Thus, the techniques described are important for dissecting fundamental and disease-relevant processes that modulate BBB coverage.

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Maintaining blood-brain barrier coverage is key for the homeostasis of the central nervous system. This protocol describes in vitro techniques to delineate the fundamental and pathological processes that modulate blood-brain barrier coverage.

Kan-beyin Bariyeri Mesh Benzeri Gemi Oluşumu ve Kesintisini Değerlendiren İn Vitro Tahliller

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

Sampling Strategies and Processing of Biobank Tissue Samples from Porcine Biomedical Models

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of genetically modified pig models, and the often-limited number of available animals of these models, establishment of (biobank) collections of adequately processed tissue samples suited for a broad spectrum of subsequent analyses methods, including analyses not specified at the time point of sampling, represent meaningful approaches to take full advantage of the translational value of the model. With respect to the peculiarities of porcine anatomy, comprehensive guidelines have recently been established for standardized generation of representative, high-quality samples from different porcine organs and tissues. These guidelines are essential prerequisites for the reproducibility of results and their comparability between different studies and investigators. The recording of basic data, such as organ weights and volumes, the determination of the sampling locations and of the numbers of tissue samples to be generated, as well as their orientation, size, processing and trimming directions, are relevant factors determining the generalizability and usability of the specimen for molecular, qualitative, and quantitative morphological analyses. Here, an illustrative, practical, step-by-step demonstration of the most important techniques for generation of representative, multi-purpose biobank specimen from porcine tissues is presented. The methods described here include determination of organ/tissue volumes and densities, the application of a volume-weighted systematic random sampling procedure for parenchymal organs by point-counting, determination of the extent of tissue shrinkage related to histological embedding of samples, and generation of randomly oriented samples for quantitative stereological analyses, such as isotropic uniform random (IUR) sections generated by the &#34;Orientator&#34; and &#34;Isector&#34; methods, and vertical uniform random (VUR) sections.

The practical application and performance of methods for generation of representative tissue samples of porcine animal models for a broad spectrum of downstream analyses in biobank projects are demonstrated, including volumetry, systematic random sampling, and differential processing of tissue samples for qualitative and quantitative morphologic and molecular analyses types.

Örnekleme stratejileri ve Biobank doku örnekleri domuz Biyomedikal modellerinden işlenmesi

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of ...