Bu eser Beyin Tümörü Araştırma, Beyin Tümörü Tedavi ve Sağlık Ulusal Enstitüsü (1R21CA141020-01) Preston A. Wells Jr Merkezi Florida Merkezi tarafından desteklenmiştir.

1. Glioblastoma Tek Hücre Süspansiyon hazırlanması <ol><li> Gliomasphere kültür kurulmuş ve daha önce anlatıldığı gibi 2,11,12 neurosphere tahlil (NSA) kullanılarak korunur. </li><li> Gliomaspheres pasajlanmasını için uygun bir zamanda, küre içeren orta boy bir uygun steril doku kültür tüpüne yerleştirilir, silinir, ve oda sıcaklığında 5 dakika için 800 rpm (110 g) santrifüj edilir. </li><li> Yüzer madde ayrılır ve topak küreler% 0.05 tripsin-EDTA, 1 ml içinde tekrar süspanse edilir ve 37 ° C&#39;de 3-5 dakika boyunca bir su banyosunda kuluçkaya bırakılır. </li><li> Soya fasulyesi tripsin inhibitörü eşit bir hacimde daha sonra tripsin aktivitesini durdurmak için kullanılır. </li><li> Hücre süspansiyonu yavaşça homojenlik ve tripsin aktivitesinin tam nötralizasyonu sağlamak için aşağı yukarı pipetle ve. </li><li> Hücre süspansiyonu yine 5 dakika için 800 rpm&#39;de santrifüje tabi tutulur. NeuroCult 1 ml içinde süpernatant kaldırılır ve hücreler yeniden süspanseMGK Bazal Orta. </li><li> Ve tek hücre süspansiyonu 10μl bir hücre sayımı gerçekleştirmek için tripan mavi 90μl ile karıştırılır. </li></ol> 2. Hücre Trace Carboxyfluorescein sukkinimidil ester (KAKE) Yeşil Floresan Boya ile Boyama <ol><li> Lekeli olmak için her 1 milyon hücre için, reaktif boyama 1 ml 5 uM bir nihai konsantrasyon vermek için boyama NeuroCult NSC Bazal Orta 1 ml ila 5 mm hücre izleme CFSE boyası (Molecular Probes, Invitrogen) ve 1 ul ilave edilmesi ile hazırlanır . </li><li> Hücrelerini içeren reaktif boyama homojenliği kadar iyice karıştırılır ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> İnkübasyon sırasında, buz NeuroCult MGK Bazal Orta soğutma çözümü olarak hazırlanmıştır. </li><li> Boyama işlemini sonlandırmak için buz-soğuk su verme çözelti yaklaşık 5-10 hacim CFSE ile yüklenmiş hücrelere ilave edilir. </li><li> Çözelti, daha sonra 5 dakika için 800 rpm&#39;de santrifüje tabi tutulur ve süpernatan atılır. </li><li> At thÖnemli olan, boyanma başarılı olduğunu gösteren bir renk arasında bir parlak yeşil bir renk tonu ile tüpün altına bir hücre peleti orada yer almalıdır. </li><li> Hücreler 5 dk atarak süpernatant için 800 rpm&#39;de santrifüj, taze NeuroCult MGK Bazal Orta 1-2 ml pelet resuspending tarafından yıkanır. Bu işlem üç yıkamadan bir toplam için tekrarlanır. </li><li> Üçüncü yıkamadan sonra, hücreler NeuroCult NSC bazal ortamı ve hücre sayımı yapılır 1 ml içinde tekrar süspanse edilir. </li><li> CFSE lekeli hücreler, daha sonra, uygun bir yoğunluk [50,000 hücre / ml] steril doku kültürü şişeleri içinde kaplanmış ve 37 ° C /% 5 CO2 içeren nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içine yerleştirilir. </li></ol> 3. KAKE Yükleniyor Doğrulama <ol><li> NSA kültür kaplama Hücreler KAKE boyama doğrulamak için bir floresan mikroskop altında izlenebilir. Bu aşamada, bu hücrelerde parlak yeşil renk (Şekil 1) göstermektedir. Dan hücre süspansiyonu Alternatif olarak, bir damlaKAKE boyanan hücrelerin mikroskop lamı üzerine yerleştirilir ve floresan mikroskop altında hücreleri görselleştirmek için bir lamel ile kaplı olabilir. </li><li> Başarılı KAKE etiketleme fazla akım sitometri yöntemiyle onaylanır. Her gruptan gibi birçok 1-5 x 10 5 hücre KAKE boyanma doğrulama için yeterlidir. CFSE hücreleri ve yüksüz bir negatif kontrol hücreler 1 x PBS-ya da 500 ul toplam hacim için NeuroCult NSC bazal medyum içinde yeniden asıldı ve sırasıyla ayrı FACS tüpler içine yerleştirilir yüklendi. </li><li> Flowsitometri ilgili parametreler için cihazın kullanım kılavuzunu talimatlarına göre ayarlanır. KAKE 492 nm ve 517 nm emisyon, maksimum dalga boyu uyarım maksimum vardır. </li><li> İlk olarak, yüksüz kontrol hücreleri çalıştırmak ve edinilen olayları ileri ve yana saçılım (FSC vs SSC) ve histogram araziler kaydedilir ve ana hücre popülasyonunu (Şekil 2A) işlenir. </li><li> Benzer şekilde, CFSE yüklü hücreler aynı parametre kullanılarak analiz edilirler kontrol hücreleri (Şekil 2B) için kullanılır. </li></ol> 4. Yavaş bölünmesi Floresan Aktif Hücre Ayırma (FACS) kullanarak Hücre Nüfus [yani KAKE İstinat] İzolasyonu <ol><li> Bölünmesi üzerine, CFSE şiddetinde azalma ve hGBM hücreleri yeşil floresan yoğunluğu farklı düzeylerde (Şekil 3) sergileyen hücreler oluşan gliomaspheres oluşturmak. Gliomaspheres çapı yaklaşık 150-200 mikron (yaklaşık 5 ila 10 gün hücre hattı büyüme hızına bağlı olarak yazılan KAKE yükleme) bir ortalama boyutu vardığınız zaman küre içeren orta uygun büyüklükte steril doku kültürü yerleştirilir, çıkarılır tüp, ve oda sıcaklığında 5 dakika için 800 rpm&#39;de santrifüjlenmiştir. </li><li> Önceki basamakta anlatılan ve hücrelerin mililitrede 10 7 hücreleri için bir yoğunluğu olan bir hücre süspansiyonu elde etmek için bir hücre sayımı için PBS içerisinde yeniden süspanse edilen bir tek hücre süspansiyonu hazırlanmıştır. </li><li> Kıçtaer PBS uygun bir hacim içinde hücreler resuspending, Propidium iyodür (PI, Sigma, 500 ug / ml), 1 ul / kriteri / akış sitometrisi ile analiz edildiğinde ölü hücreleri çıkarmak için hücre süspansiyonu ml &#39;lik bir konsantrasyonda ilave edilir. </li><li> Tam NeuroCult NSC Medium içeren 1 ml her biri iki adet 15 ml&#39;lik steril doku kültür tüpleri kriteri yavaş bölünen hücreler (CFSE tutucu hücreleri) ve hızla bölünen hücreler (CFSE seyreltilmesi hücreleri) toplamak için kullanılır. </li><li> İlk olarak, boş hücre gruptan hücre süspansiyonu akış sitometresi ile çalıştırılır. </li><li> Hücreleri (olaylar) hücrelerin çoğunluğu akışı arsa dahil edilir, böylece ayarlanır ileri saçılım (FSC) karşı yan dağılım (SSC) ve her iki parametre için gerilim parametreleri esas çizilir. </li><li> Ölü ya da hasarlı hücrelerin dışlamak için, hücreleri DGM karşı PI reaktivite dayalı çizilen ve tek canlı hücre popülasyonu (PI negatif) işlenir edilir. </li><li> Daha sonra, homojen bir hücre popülasyonu f esas alınarak belirlenirorward saçılım (FSC) karşı yan dağılım (SSC). </li><li> Homojen tek canlı hücre popülasyonu sonra logaritmik bir ölçekte belirlenen hücre Frekans karşı KAKE yoğunluğuna dayalı bir histogram çizilir. KAKE lazer yoğunluğu 0 ile 100 arasında negatif sinyal yerleştirmek için ayarlanır. </li><li> Aynı parametreleri ve benzer bir yolluk stratejiyi kullanarak, KAKE etiketli hücreleri akış sitometresinin aracılığıyla çalıştırılır ve (Şekil 4C) incelendi. </li><li> Daha sonra hücreler, ve genel nüfus yavaş bir bölme nüfus (daha hızlı bölünen hücreler) CFSE (sırasıyla CFSE yüksek top% 5 CFSE ile düşük alt% 85), tutma yeteneği temelinde belirlenir. </li><li> Bu farklı hücre popülasyonlarının sonra tam MGK orta 1ml içeren ayrı 15 ml steril doku kültürü tüpler halinde sıralanır. </li><li> Sıralama hücreler daha sonra 5 dakika için 800 rpm&#39;de santrifüjlenir. </li><li> Bir onaylama içinde Yüzer madde ayrılır ve topak yeniden süspansevasatı (izole olaylar ya da topak boyutu sayısına bağlı olarak) ve bir hücre sayımı sürülen uygun hacim gerçekleştirilir. </li><li> Farklı kriteri populasyonlardan Hücreler daha sonra, uygun bir steril doku kültürü şişesi içinde mililitre başına 50.000 hücre de kaplanmış ve seri olarak geçişli veya alt deneylerde kullanılmadan önce, 5-10 gün için, 37 ° C /% 5 CO2 içeren nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içine yerleştirilir. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar Mikroskop (Şekil 1) altında görüntülendi olarak CFSE Yüklemeden sonra bütün hücreler yoğun bir yeşil floresan sunulmuştur. Bu yeşil renkli renk bile çıplak gözle (videoyu görmek) görülebilir. Akım sitometri ile bu hücrelerin incelenmesi de kontrol hücreleri (Şekil 2) ile karşılaştırıldığında oldukça yoğun yeşil floresans gösterir. Neurosphere kültür kaplama KAKE yüklü hücreler üzerine, bu hücreler çoğalmaya başlar ve 5-10 gün içinde 150-200 mikron gliomaspheres oluştururlar. Hücreler, t çoğaldıkça<html> O floresan boya eşit her hücre bölünmesi ile floresans şiddetinin ikiye bölme neden bölünmeler üzerine kızı hücreleri arasında dağıtılır. Glioblastomalar işlevsel olarak heterojen olan ve farklı zaman skalası üzerinde çoğalan hücrelerin oluşmaktadır. Bu protokolde tarif edilen yöntem, sırasıyla, seyreltik CFSE ya da tutma yeteneğini (Şekil 3, aynı zamanda video) sayesinde hızlı ve yavaş bölünen hücreleri tanımlamak ve izole etmek için bir olanak sağlar. Yüksüz hücrelere göre CFSE ile yüklenmiş hücreler elde ayrılmış gliomaspheres akış sitometri analizi çeşitli CFSE tutma özellikleri (Şekil 4) göstermektedir. Hızlı bölünen hücreler (alt% 85) veya yavaş bölünen hücreleri (üst% 5 - KAKE yüksek) neurosphere test koşulları (Şekil 5) kültüre zaman yeteneği oluşturan sergi gliomapshere. Güre 1 &quot;/&gt; Şekil 1. Hemen KAKE boya ile yükledikten sonra Disosiye tümör hücreleri. Hücreler başarılı etiketleme gösteren parlak yeşil renk sergilerler. Orijinal büyütme; 10 x. <img src="/files/ftp_upload/3918/3918fig2.jpg" alt="Şekil 2," /> Şekil 2. Akım sitometri kullanarak KAKE yükleme onay. A) Unloaded hücreleri, B) KAKE yüklenen karşı boş hücrelerde KAKE floresans şiddetinin karşılaştırılması) hücreler ve C yüklenir. Etiketli ve etiketsiz hücreleri arasındaki floresans yoğunluğu büyüklük farkı birkaç emir olduğunu unutmayın. <img src="/files/ftp_upload/3918/3918fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3,. 6 gün sonra kaplama bir CFSE-yüklü hücre türetilmiş bir temsilci gliomasphere. Bazı hücreler çok parlak KAKE boyanması sergilerler. Orijinal büyütme; 63 x. <img src = &quot;/ files/ftp_upload/3918/3918fig4.jpg&quot; alt = &quot;Şekil 4&quot; /&gt; Şekil 4. Örnek flow sitometri araziler / 6 gün KAKE boyandıktan sonra hızlı ve yavaş bölünen hücrelerin izolasyonu için histogramlar. Ölü veya zarar görmüş hücreleri çıkarmak için bir bütün hücre popülasyonunu göstermek için) FSC vs SSC B) SSC vs PI reaktivitesi, C) Geçide FSC vs SSC homojen bir canlı hücre popülasyonu, D) 6 gün negatif kontrol ile karşılaştırıldığında büyük bir floresan yoğunluğu ile kanıtlandığı gibi KAKE etiketleme sonra KAKE istinat hücrelerinin varlığını gösterir. Histogram da KAKE yoğunluğu) zaman. E içindeki KAKE istinat hücreleri (üst% 5) ve KAKE sulandırarak hücreleri (alt% 85) tespit etmek yolluk strateji görüntüleniyor Histogram çürümüş olduğunu gösterir. <img src="/files/ftp_upload/3918/3918fig5.jpg" alt="Şekil 5," /> Elde edilen Şekil 5,. Örnek gliomaspheres <strong&gt; A) hızlı bölünen hücreleri (KAKE düşük) ve B) yavaş bölünen hücreleri (KAKE yüksek). Orijinal büyütme:. Sırasıyla 10x ve ​​20x C) Örnek hücre sayımı pasaj zaman hızlı veya yavaş bölünmesi hücre kaynaklı kültürü elde. P &lt;0.05, t-testi. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3918/3918fig5large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> .

<ol>
	<li>Tian, T., Olson, S., Whitacre, J. M., Harding, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origins+of+cancer+robustness+and+evolvability.">The origins of cancer robustness and evolvability.</a> Integr. Biol. (Camb). 3, 17-30 (2011).</li><li>Deleyrolle, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+label-retaining+tumour-initiating+cells+in+human+glioblastoma.">Evidence for label-retaining tumour-initiating cells in human glioblastoma.</a> Brain. 134 (Pt. 5), 1331-1343 (2011).</li><li>Krishnamurthy, K., Wang, G., Rokhfeld, D., Bieberich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deoxycholate+promotes+survival+of+breast+cancer+cells+by+reducing+the+level+of+pro-apoptotic+ceramide.">Deoxycholate promotes survival of breast cancer cells by reducing the level of pro-apoptotic ceramide.</a> Breast Cancer Res. 10, 106-106 (2008).</li><li>Pece, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+molecular+heterogeneity+of+breast+cancers+correlates+with+their+cancer+stem+cell+content.">Biological and molecular heterogeneity of breast cancers correlates with their cancer stem cell content.</a> Cell. 140, 62-73 (2010).</li><li>Roesch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+temporarily+distinct+subpopulation+of+slow-cycling+melanoma+cells+is+required+for+continuous+tumor+growth.">A temporarily distinct subpopulation of slow-cycling melanoma cells is required for continuous tumor growth.</a> Cell. 141, 583-594 (2010).</li><li>Dembinski, J. L., Krauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+functional+analysis+of+a+slow+cycling+stem+cell-like+subpopulation+in+pancreas+adenocarcinoma.">Characterization and functional analysis of a slow cycling stem cell-like subpopulation in pancreas adenocarcinoma.</a> Clin. Exp. Metastasis. 26, 611-623 (2009).</li><li>Graham, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primitive,+quiescent,+Philadelphia-positive+stem+cells+from+patients+with+chronic+myeloid+leukemia+are+insensitive+to+STI571+in+vitro.">Primitive, quiescent, Philadelphia-positive stem cells from patients with chronic myeloid leukemia are insensitive to STI571 in vitro.</a> Blood. 99, 319-325 (2002).</li><li>Holyoake, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primitive+quiescent+leukemic+cells+from+patients+with+chronic+myeloid+leukemia+spontaneously+initiate+factor-independent+growth+in+vitro+in+association+with+up-regulation+of+expression+of+interleukin-3.">Primitive quiescent leukemic cells from patients with chronic myeloid leukemia spontaneously initiate factor-independent growth in vitro in association with up-regulation of expression of interleukin-3.</a> Blood. 97, 720-728 (2001).</li><li>Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+dyes+for+lymphocyte+migration+and+proliferation+studies.">Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies.</a> Immunol. Cell Biol. 77, 499-508 (1999).</li><li>Lyons, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysing+cell+division+in+vivo+and+in+vitro+using+flow+cytometric+measurement+of+CFSE+dye+dilution.">Analysing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of CFSE dye dilution.</a> J. Immunol. Methods. 243, 147-154 (2000).</li><li>Azari, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Expansion+of+Human+Glioblastoma+Multiforme+Tumor+Cells+Using+the+Neurosphere+Assay.">Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (56), e3633-e3633 (2011).</li><li>Azari, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Expansion+of+the+Adult+Mouse+Neural+Stem+Cells+Using+the+Neurosphere+Assay.">Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (45), e2393-e2393 (2010).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Çalışmalar artan bir sayıda tümör oluşumunu ve tedavi direnç 2-8 katkı kanser hücrelerinin bir yavaş alt bölme bölümünün önemini ortaya koymuştur. Bu nedenle, farklı büyüme oranları ile subpopülasyonunun karşılaştırmak için daha genel olarak hücre ya da bu belirli alt populasyonun çalışma deneysel sağlayan yöntemleri açıklanmaktadır ve standartlaştırmak için çok önemlidir. Hücre bölünmesi onların oranı esas alınarak hücre alt fraksiyonlarının belirlemek ve ya...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Tip </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> NeuroCult MGK Bazal Orta (İnsan) </td><td> Orta </td><td> Hücre Teknolojileri Stem </td><td> 05750 </td></tr><tr><td> NeuroCult MGK Proliferasyon Takviyeler (İnsan) </td><td> Orta takviyesi </td><td> Hücre Teknolojileri Stem </td><td> 05753 </td></tr><tr><td> % 0.05 tripsin-EDTA </td><td> Reaktif </td><td> Gibco </td><td> 25300-062 </td></tr><tr><td> Soya tripsin inhibitörü </td><td> Reaktif </td><td> Sigma </td><td> T6522 </td></tr><tr><td> Penisilin / Streptomisin </td><td> Reaktif </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> T25 şişesi </td><td> Kültür gereçleri </td><td> Nalge Nunc uluslararası </td><td> 136196 </td></tr><tr><td> T80 şişesi </td><td> Kültür gereçleri </td><td> Nalge Nunc uluslararası </td><td> 178905 </td></tr><tr><td> 15 ml tüp </td><td> Kültür gereçleri </td><td> BD Falcon </td><td> 352096 </td></tr><tr><td> 50 ml tüp </td><td> Kültür gereçleri </td><td> BD Falcon </td><td> 352070 </td></tr><tr><td> EGF </td><td> Büyüme faktörü </td><td> Ar-Ge </td><td> 2028-EG </td></tr><tr><td> CellTrace KAKE Hücre Çoğalması Takımı </td><td> Floresan Hücre Bölünmesi Takip Boya </td><td> Moleküler Probları, Invitrogen </td><td> C34554 </td></tr></tbody></table>

identification and isolation of slow-dividing cells in human glioblastoma using carboxy fluorescein succinimidyl ester (cfse)

Tümör heterojenite tümör sağlamlığı destekleyen temel bir özelliği temsil eder ve tedavi stratejilerinin 1 gelişiminde merkezi bir engel koymaktadır. Tümör heterojenliğin sorunu aşmak için, belirli bir hastalığın patolojiler sürücü ve klinik hedefleri temsil tümörün alt popülasyonlarının fenotipik, (epi) genetik ve fonksiyonel belirlenmesi ve tanımlanması sağlayan deneyleri ve araçlar geliştirmek esastır. Bu, şimdi de tümörleri yavaş bisiklet olma fonksiyonel kriterleri pozitif tümör oluşumu beyin, göğüs, cilt de dahil olmak üzere çeşitli kanser yeteneği ile ilişkili olduğu hücre bölünmesi, farklı frekanslarda bulunan hücrelerin alt fraksiyonlar ayrı göstermektedir ve olduğunun tespit edilmesi pankreas yanı sıra lösemi 2-8. Floresan boya carboxyfluorescein süksinimidil ester (CFSE) kan yoluyla in vitro olarak T hücrelerinin bölünmesini frekans izlemek için ve in vivo olarak kullanılmıştırumors ve bu glioblastoma 2,7,8 gibi solid tümörler. CFSE, hücre-geçirgenler floresan olmayan pro-ilaç kararlı amid bağı oluşturmak üzere hücre içi 9 amin grupları ile süksinimidil kısmının reaksiyon yoluyla proteinlere kovalent olarak bağlanarak hücre içinde tutulan bir floresan bileşik, içine hücre içi esterazlar ile dönüştürülür. Floresan boya eşit her hücre bölünmesi ile floresans şiddetinin ikiye bölme neden bölünmeler üzerine kızı hücreleri arasında dağıtılır. Bu bölünme 10 sekiz ila on mermi kadar hücre döngüsü frekans izleme sağlar. KAKE tutma kapasitesi kanseri kök hücre aktivitesi 2 zenginleşmektedir gösterdi yavaş bisiklet subpopülasyonu (üst% 5 boya tutucu hücreleri) belirlemek ve yalıtmak için beyin tümör hücreleri ile birlikte kullanılmıştır. Bu protokol, insan glio kültürü içinde KAKE ile boyanan hücrelerin tekniği ve bireysel nüfus izolasyonu açıklarblastom (GBM)-türetilen akım sitometri 2 kullanarak farklı bölünme fiyatla sahip hücreler. Tekniği tanımlamak ve KAKE etiketleme korumak için onların yeteneği sayesinde hücrelerin beyin tümörü yavaş bisiklet nüfusu izole etmeye hizmet etmiştir.

Watch this Scientific Journal Video about Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester CFSE at JoVE.com

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester CFSE

Bu video protokol hücre bölünmesi sıklığına göre insan glioblastoma hücreleri farklı alt-popülasyonlarının belirlenmesi ve ayrılması için floresan boya carboxyfluorescein sukkinimidil ester (KAKE) uygulamasını gösterir.

Karboksi Flöresein sukkinimidil ester (KAKE) Kullanarak İnsan Glioblastoma Yavaş-bölme Hücreleri Tanımlama ve İzolasyonu

Tumor heterogeneity represents a fundamental feature supporting tumor robustness and presents a central obstacle to the development of therapeutic ...

identification-isolation-slow-dividing-cells-human-glioblastoma-using

Research

JoVE Journal

Medicine

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester (CFSE)

14.0K Görüntüleme.  The University of Florida. Bu video protokol hücre bölünmesi sıklığına göre insan glioblastoma hücreleri farklı alt-popülasyonlarının belirlenmesi ve ayrılması için floresan boya carboxyfluorescein sukkinimidil ester (KAKE) uygulamasını gösterir.

Video: Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester CFSE

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

İnsan Diş Pulp Kök Hücre İzolasyonu, Karakterizasyonu ve Karşılaştırmalı Farklılaşma İki Farklı Yöntemler Kullanılarak Daimi Dişler türetilen

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Tıp

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly isolated from human tissues and serially propagated in immunodeficient mice, typically through antibody labeling of subpopulations of cells and fractionation by flow cytometry. However, the unique clinical features of prostate cancer have considerably limited the study of prostate CSCs from fresh human tumor samples. We recently reported the isolation of prostate CSCs directly from human tissues by virtue of their HLA class I (HLAI)-negative phenotype. Prostate cancer cells are harvested from surgical specimens and mechanically dissociated. A cell suspension is generated and labeled with fluorescently conjugated HLAI and stromal antibodies. Subpopulations of HLAI-negative cells are finally isolated using a flow cytometer. The principal limitation of this protocol is the frequently microscopic and multifocal nature of primary cancer in prostatectomy specimens. Nonetheless, isolated live prostate CSCs are suitable for molecular characterization and functional validation by transplantation in immunodeficient mice.

The isolation of cancer stem cells (CSCs) directly from human tissues is requisite for their biological characterization. This manuscript describes a methodology for the isolation of prostate CSCs from human tissues, while also providing tips on troubleshooting difficult steps.

İnsan Prostat Kanseri Örneklerinden Kanser Kök Hücreleri İzolasyon

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents. 
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

İzolasyon, Kriyoprezervasyon ve Kültür Klinik Uygulamaları İnsan Amniyon Epitel Hücreleri

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity but little is known about their biology. Isolating highly pure human lymphatic endothelial cells (LECs) from diseased and healthy tissue would facilitate studies of the lymphatic endothelium at genetic, molecular and cellular levels. It is anticipated that these investigations may reveal targets for new therapies that may change the clinical management of these conditions. A protocol describing the isolation of human foreskin LECs and lymphatic malformation lymphatic endothelial cells (LM LECs) is presented. To obtain a single cell suspension tissue was minced and enzymatically treated using dispase II and collagenase II. The resulting single cell suspension was then labelled with antibodies to cluster of differentiation (CD) markers CD34, CD31, Vascular Endothelial Growth Factor-3 (VEGFR-3) and PODOPLANIN. Stained viable cells were sorted on a fluorescently activated cell sorter (FACS) to separate the CD34LowCD31PosVEGFR-3PosPODOPLANINPos LM LEC population from other endothelial and non-endothelial cells. The sorted LM LECs were cultured and expanded on fibronectin-coated flasks for further experimental use.

The goal of this protocol is to isolate lymphatic endothelial cells lining human lymphatic malformation cyst-like vessels and foreskins using fluorescence-activated cell sorting (FACS). Subsequent cell culturing and expansion of these cells permits a new level of experimental sophistication for genetic, proteomic, functional and cell differentiation studies.

Çoklu-parametre floresans ile aktive edilen hücre sınıflandırma İnsan lenfatik endotel hücreleri İzolasyonu

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Pankreas Kanseri Yeni Tedavi Stratejileri Geliştirme Hücre Özellikleri Kök incelenmesi

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are time consuming, expensive, and labor intensive. To overcome these obstacles, many research groups have turned to spheroid cultures of cancer cells. While useful, tumor spheroids or aggregates do not replicate cell-matrix interactions as found in vivo. As such, three-dimensional (3D) culture approaches utilizing an extracellular matrix scaffold provide a more realistic model system for investigation. Starting from subcutaneous or intracranial xenografts, tumor tissue is dissociated into a single cell suspension akin to cancer stem cell neurospheres. These cells are then embedded into a human-derived extracellular matrix, 3D human biogel, to generate a large number of microtumors. Interestingly, microtumors can be cultured for about a month with high viability and can be used for drug response testing using standard cytotoxicity assays such as 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and live cell imaging using Calcein-AM. Moreover, they can be analyzed via immunohistochemistry or harvested for molecular profiling, such as array-based high-throughput kinomic profiling, which is detailed here as well. 3D microtumors, thus, represent a versatile high-throughput model system that can more closely replicate in vivo tumor biology than traditional approaches.

Patient-derived xenografts of glioblastoma multiforme can be miniaturized into living microtumors using 3D human biogel culture system. This in vivo-like 3D tumor assay is suitable for drug response testing and molecular profiling, including kinomic analysis.

Kinomic Profil Yöntemi ve İlaç Tepki Testi için 3D İnsan BIOGEL Kültür Sisteminin Kullanılması Microtumors ve Hasta kaynaklı Glioblastom Hücreleri Üretimi

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

İnsan Tümör ksenogratflarının gelen Fare Hücrelerinin tükenmesi Anlamlı Hedef Hücre Alt Analizi geliştirir

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Intranasal Delivery of Therapeutic Stem Cells to Glioblastoma in a Mouse Model

The intrinsic tropism towards brain malignancies renders stem cells as promising carriers of therapeutic agents against malignant tumors. The delivery of therapeutic stem cells via the intranasal route is a recently discovered alternative strategy, with strong potential for clinical translation, due to its non-invasive nature compared to intracranial implantation or delivery via systemic routes. The lack of blood brain barrier further strengthens the therapeutic potential of stem cells undergoing intranasal brain entry. This article summarizes the essential techniques utilized in our studies and outlines the basic principles of intranasal strategy for stem cell delivery using a mouse model of intracranial glioma xenografts. We demonstrate the optimized procedures that generate consistent and reproducible results with specific predetermined experimental parameters and offer guidelines for streamlined work flow that ensure efficient execution and reliable experimental outcome. The article is designed to serve as a baseline for further experimental customization based on hypothesis, stem cell types, or tumor specifics.

Stem cells are promising therapeutic carriers to treat brain tumors due to their intrinsic tumor tropism. Non-invasive intranasal stem cell delivery bypasses the blood brain barrier and demonstrates strong potential for clinical translation. This article summarizes the basic principles of intranasal stem cell delivery in a mouse model of glioma.

Bir Fare Modelinde Tedavi Edici Kök Hücrelerin Glioblastomaya İntranazal Dağıtımı

The intrinsic tropism towards brain malignancies renders stem cells as promising carriers of therapeutic agents against malignant tumors. The delivery of ...

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the development of obesity-associated complications such as type 2 diabetes. To quantitatively and qualitatively investigate the immune cell subsets in human AT deposits, we have developed a flow cytometry approach. The stromal vascular fraction (SVF), containing the immune cells, is isolated from subcutaneous and visceral AT biopsies by collagenase digestion. Adipocytes are removed after centrifugation. The SVF cells are stained for multiple membrane-bound markers selected to differentiate between immune cell subsets and analyzed using flow cytometry. As a result of this approach, pro- and anti-inflammatory macrophage subsets, dendritic cells (DCs), B-cells, CD4+ and CD8+ T-cells, and NK cells can be detected and quantified. This method gives detailed information about immune cells in AT and the amount of each specific subset. Since there are numerous fluorescent antibodies available, our flow cytometry approach can be adjusted to measure various other cellular and intracellular markers of interest.

This article describes a method to analyze immune cell content of adipose tissue by isolation of immune cells from adipose tissue and subsequent analysis using flow cytometry.

Akış Sitometresi kullanarak insan yağ dokusu içinde bağışıklık hücreleri karakterizasyonu

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the ...

Isolation of Primary Human Decidual Cells from the Fetal Membranes of Term Placentae

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized stromal cells and immune cells, are responsible for the secretion of hormonal and inflammatory factors which are critical for successful blastocyst implantation, placental development and play a role in the initiation of labor at term and preterm. Many pregnancy complications can arise from perturbations of a fine balance of different cell populations comprising decidua. Alterations in the proportion of specific decidual cell types may disrupt these crucial processes and increase the risk of developing serious complications of pregnancy, such as embryo implantation failure, intrauterine growth restriction, preeclampsia and preterm labor. The protocol outlined here demonstrates a cost and time effective method for the isolation of primary human decidual cells collected from the fetal membranes of term placentae. By combining enzymatic digestion and gentle mechanical disruption of the decidual tissue, a high yield of decidual cells was obtained with virtually no chorion contamination. Importantly, isolated decidual cells were characterized (stromal cells (55-60%), leukocytes (35%), epithelial (1%) or trophoblast (0.01%) cells) and maintained high viability (80%) which was confirmed by multicolor imaging flow cytometry assay. This protocol is specific to the decidua parietalis and can be adapted to first and second trimester placentae. Once isolated, decidual cells can be used for a multitude of experimental applications aiming to understand the role of different decidual cell sub-populations in pregnancy complications.

This protocol demonstrates a method for the isolation of primary human decidual cells collected from the fetal membranes of term placentae which can be used for a variety of applications (i.e. immunocytochemistry, flow cytometry, etc.) aiming to study the role of different cell populations in pregnancy complications.

Dönem Placentae Fetal membranlar birincil insan Decidual hücre izolasyon

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized ...