Düsseldorf Üniversitesi Tıp Fakültesi Forschungskommission bir hibe ile desteklenen CKVB için; Bu çalışma CK ve JPH, DFG (GRK1033 Ko 1679/3-1) için NÖRON-Eranet keşfet (BMBF 01EW1003) tarafından finanse edildi.

1. Aggresome Donör Hücre Hazırlanması: Monomerik Kırmızı Floresan Protein (MRFP) veya Gelişmiş Yeşil floresan proteini (eGFP) etiketli İnsan Tam Boy (FL) DISC1 transfeksiyonu <ol><li> Tohum 1.5 x 10 6/10 cm çanak insan nöroblastom NLF (NSG, Philadelphia Çocuk Hastanesi, Philadelphia) on 10 cm yemekleri hücreleri ve gecede büyümek. NLF hücreleri% 10 ile takviye edilmiş RPMI-1640 ortamı içinde kültürlenmiştir FBS, penisilin / Strepomycin, L-Glutamin. Ertesi gün hücreler,% 70-80 konfluense olmalıdır. </li><li> Geçici olarak 15 ug plasmid DNA ile Metafectene transfeksiyon reaktifi (Biontex, Martinsried, Almanya) ile her biri 10 cm tabak transfekte. Kısaca, 10 cm tabak için, 15 ug plazmid DNA ve 30 ul Metafectene, 750 ul Opti-MEM ile karıştırılmış ve 20 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edildi. 5 yemekleri pcDNA3.1 MRFP / eGFP-plazmid ile yalnız eGFP etiketli insan (FL) DISC1 ve 5 yemekleri ile transfekte edildi. </li></ol> 2. AggresomeTransfekte Donör Hücrelerden Arındırma Burada açıklanan protokol beyin dokusunda 13 ve büyük agrega ve aggresomes 14 yalıtmak için bir protokol Lewy-Oluşumu arındırmak için bir yöntem bir kombinasyonudur. Zaten mevcut olan yöntemler deterjan kullanımı, hücre-invaziv deneylerde uygulama için deterjan içermeyen protein izolasyon dayandığı için kritik önem taşır. <ol><li> Transfeksiyondan 48 saat sonra, eGFP ve mRFP/eGFP-DISC1 ifade izlemek ve flöresanlı bir mikroskop (Şekil 1) altında aggresomes oluşumu teyit. </li><li> 1X Proteaz önleyici kokteyl eklemek (Roche, Indianapolis, IN) ile bir Precellys24 homojenizör (Bertin teknolojiler, Fransa) kullanılarak hücrelerin bozmak, PBS pH 7.4, 400 ul PBS ile her bir kazıma ile yıkayın hücrelerini. Kısaca, bir 2 ml parçalama tüp 1 ml hücre süspansiyonu ekleyin ve 10 seramik boncuklar ilave edin. 3 x 60 sn darbeleri ile hücrelerin parçalayıcı. Sürecin mekanik kuvvet olabilir37 Yukarıdaki örnek içindeki sıcaklık artışı ° C nedenle bakım lizis işleminden sonra buz üzerinde örnek chill alınmalıdır. </li><li> Buz üzerinde soğutulur ve 37 hücreleri, 60 dakika boyunca 10 mM MgCl2, 40 U / ml DNase A ve inkübe ° C ekleyin </li><li> % 80 çözeltileri,% 50, PBS, pH 7.4 (10 ml her biri) içinde% 20 sakaroz (w / v) hazırlayın. </li><li> En az% 50,% 20, ardından 2 ml% 80 sakaroz ile başlayarak, bir 15 ml tüp içinde şahin sakaroz eğim hazırlayın. Yavaş degrade dökün ve zaten döktü katmanları rahatsız etmemek için dikkatli olun. 4 at Katman 1000 xg&#39;de 15 dakika degrade ve santrifüj üstüne sindirilmiş lizat ° C. </li><li> Dikkatlice PBS pH 7.4 5 ciltlik bir pipet ve karışımı ile% 50-80 sakkaroz katmanı arasındaki interfaz toplamak. 4 ° C&#39;de 1000 x g&#39;de 15 dakika boyunca santrifüje Iki ek kat çamaşır tekrarlayın. Bu interfaz yılında aggresomes floresan ve UV ışık altında bir mikroskop gözlenebilir. </li><li> Süpernatantı atın ve250-500 ul PBS pH 7.4 içinde pelet tekrar süspansiyon. Bu topak saflaştırılmış aggresomes (Şekil 2) içerir. </li></ol> 3. MRFP/eGFP-DISC1 Aggresomes ile Alıcı SH-SY5Y Hücreleri Tedavisi <ol><li> Tohum 5 x 10 4 alıcı SH-SY5Y insan nöroblastom hücrelerinde yapısal bir 24 de plakanın her steril cam lameller üzerine GFP-DISC1 (598-854) ifade. SH-SY5Y hücre Penisilin / Streptomisin, non-esansiyel amino asitler (NEAA) ve% 10 FBS ile takviye DMEM/F-12 ortamında kültüre edilir. </li><li> 24 saat sonra, her bir kuyunun 10 ul ekleyin ve 48-72 saat süreyle inkübe edin. </li><li> PBS pH 7.4 ile 3 x hücreler yıkanır ve 5 dakika için% 0.04 &#39;Tripan Mavisi ile hücre dışı floresan gidermek. </li><li> Buz üzerinde 10 dakika süreyle PBS pH 7.4 &#39;de% 4 PFA ile hücreleri saptamak, DAPI montaj orta (Invitrogen, ABD) ile Altın uzattığı steril H 2 O ile bir kez yıkayın ve cam slaytlar lamelleri monte edin. </li><li> / Alımını onaylaZ-yığın görüntülerde alıcı hücreler tarafından eksprese işe proteinleri ile kolokalizasyon tarafından dışarıdan uygulanan aggresomes işgali. </li></ol> Ancak, eksojen protein alımını / işgali aslında konak hücrenin protein alımı ile paralel olarak tespit edilemeyebilir. Bizim örneğimizde MRFP etiketli DISC1 aggresomes işe çözünebilir GFP etiketli DISC1 (598-854) konak hücre (bkz. Şekil 3) tarafından ifade edilmiş protein. Resimleri bir Zeiss LSM 510 konfokal-veya Zeiss Axiovision Apotome2 Mikroskop alınmıştır. 4. Rekombinant DISC1 Üretimi (598-785) Bir önceki yayında biz öz-örgütlenme alanlarının varlığına dayalı öz-etkileşim için çeşitli DISC1 protein parçalarının yeteneği analiz. Tüm protein arasında insan DISC1 (598-785) (Şekil 4) güçlü multimerization eğilimi 4 görüntülenen test parçaladı. Bu nedenle, insan DISC1 (598-785) (Resim pET15b içine klonlandıvagen, Madison, Wisconsin) olarak ifade E. 6-histidin etiketi bir N-terminal içeren, coli BL21-(lDE3) Rosetta (Novagen, ABD), ve 4 açıklandığı gibi 8 mol / l üre denatüre edici koşullar altında saflaştınldı. Kısaca, protokol aşağıda verilmiştir. <ol><li> BL21-(IDE3) Rosetta E. coli bir OD 600 5mM 5 mM-arginin-HCl, MgSO4, 100 ug / ml carbencillin, 35 ug / ml kloramfenikol içeren yukarı 2 x 500 ml 2YT içinde büyütülmüştür: 0.6-0.8 ve DISC1 (598-785) ifade endüklenmiştir 1 mM IPTG ile. </li><li> DISC1 (598-785) 37 ° C &#39;de 4 saat boyunca ifade edildi ifade santrifüjleme ile hasat bakteriler tarafından sona erdirildi. </li><li> Bakteri pelet, 50 ml TE tamponu (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 5 mM EDTA) artı 2 mM PMSF,% 1 TX-100, 250 ug / ml lizozim, 20 mM MgCl2 ve 400 U/50 ml içinde tekrar süspanse eridiği sağlamak için DNase I, reaksiyon hafif karıştırma ile oda sıcaklığında 30 dakika süre ile inkübe edildi. </li><li> Β-mercapt 10 mM ekleBaşka bir 30 dakika boyunca oethanol (ME) ve 500 mM NaCI ve inkübe. </li><li> 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca 20.000 g&#39;de bakteri inklüzyon gövdelerinin aşağı Spin </li><li> Yeniden süspanse pelet 50 mM Tris, pH 8.0, 5 mM imidazol, 500 mM NaCl, 8 M üre, 10 mM β-ME ve 4, 30 dakika boyunca 20.000 g&#39;de sentrifüjleme ile artıkları kaldırmak ° C ihtiva eden 50 ml tampon içinde ekstraksiyon </li><li> Ekstraksiyon tamponu ile Ni-NTA agaroz matrisi yıkayın. Oda sıcaklığında 2 saat süreyle Ni-NTA matris ile yeniden süspansiyon haline getirilmiş precleared protein ekstresi inkübe edin. </li><li> 12 mM imidazol içeren ekstraksiyon tamponu ile Ni-NTA matrisi yıkayın. </li><li> 50 mM Tris, 500 mM NaCl, 300 mM imidazol, 8 M üre, 1 mM PMSF, 5 mM EDTA ve β-ME 10 mM ihtiva eden 15 ml elüsyon tamponu ile yavaş yavaş protein Zehir. </li><li> Β-ME 10 mM PBS, pH 7.4 ile adım adım protein Dialyze. </li></ol> 1 L bakteriyel başlangıç ​​kültürü kaynaktan rekombinant DISC1 (598-785) prot 50 mg&#39;a kadar izole etmek mümkündürein. α-sinüklein refolding Için, α-sinüklein, rekombinant protein 500 mg (Sigma-Aldrich, USA) ile deneyler 1 mg / ml &#39;lik bir konsantrasyonda PBS içinde çözüldü. Oligomerler elde etmek için, refolding 37 gece boyunca gerçekleştirildi ° C gibi daha önceki bir yayında 10 tanımlanmıştır. 5. DyLight594 ile Rekombinant DISC1 (598-785) Etiketleme <ol><li> Önceki sonraki etiketleme süreci, DISC1 (598-785) proteini β-ME kurtulmuş oldu. Bu nedenle, protein 1:2,000 bir seyreltme PBS pH 7,4-3 kez diyaliz edilir. </li><li> Etiket 1 üreticinin talimatlarına göre DyLight 594 maleimid (Thermo Scientific, USA) mg DISC1 (598-785). Kısaca, PBS pH 7.4 içinde 1 mg / ml protein çözülür ve serbest tiyol gruplarının geri kazanmak için 5 mM TCEP ekleyin. Oda sıcaklığında 2 saat süreyle inkübe etmek ve reaksiyon DMF boya çözünmüş 20 ul ekle. </li><li> PBS pH protein 3 x Dialyze2 1:2000 oranında 7.4 her biri HR. </li></ol> İlave etiketli protein saflık artırmak için bir His 6-etiketli bir Ni-NTA sütunu gerçekleştirilir üzerinde afiniteyle saflaştırılması bazlı. <ol start="4"><li> 10 ml PBS pH 7.4 ile 1 ml Ni-NTA matris (Qiagen, Almanya) yıkayın. </li><li> Sütun etiketli, diyalizlenmiş protein uygulayın ve yavaşça sütunu üzerinde çalışmasına izin. </li><li> 3 x 20 ml PBS, pH 7.4 ile yıkanır protein </li><li> Eluat hacmini azaltmak için Ni-NTA sütun üzerindeki renkli bant izlerken PBS pH 7.4, 500 mM imidazol damla damla ile protein Zehir. </li><li> 2 saat için her bir 1:2000 seyreltme bir 10 mM NAPI pH 7.4 ile arındırıldı ve 3 x Dialyze. </li><li> Eluat, sıvı azot içinde 5 x 100 ul örnekleri ve ek dondurucuda kısım filtreler.İnteger steril 0.45 mikron şırınga kullanın. Her bir 100 ul alikot içinde 1 ug / ml - protein olarak toplam miktarı 0.5 olmalıdır. </li></ol> isteğe concentrtirme adım <ol start="10"><li> Stereotaktik sıçan enjeksiyonlar için, proteinin bir hız-vac (Eppendorf Concentrator 5301) 10 kat konsantre edildi. Nihai tampon durum 100 mM NAPI idi. </li></ol> α-sinüklein Etiketleme Rekombinant α-sinüklein bir etiketleme ve arıtma (Ni-NTA sütunu) DISC1 (598-785) ile paralel olarak yapılmıştır. Toplam başlangıç ​​malzemesi 500 mg yerine DISC1 (598-785) için 1 mg idi. 6. Etiketli Rekombinant DISC1 (598-785) Protein Alıcı SH-SY5Y Hücreleri Tedavisi <ol><li> Tohum 5x10 4 alıcı SH-SY5Y insan nöroblastom hücrelerinde yapısal bir 24 de plakanın her steril cam lameller üzerine GFP-DISC1 (598-854) ifade. </li><li> 5-10 ug / ml &#39;lik bir konsantrasyonda, hücre kültür ortamına etiketli protein ekleyin ve 48-72 saat boyunca inkübe edilir. </li><li> PBS pH 7.4 ile 3 x hücreler yıkanır ve ektraksiyonu gidermek5 dakika için% 0.04 &#39;Tripan Mavisi ile ellular floresan. </li><li> Buz üzerinde 10 dakika süreyle PBS pH 7.4 &#39;de% 4 PFA ile hücreleri saptamak, DAPI montaj orta (Invitrogen, ABD) ile Altın uzattığı steril H 2 O ile bir kez yıkayın ve cam slaytlar lamelleri monte edin. </li><li> Lazer konfokal mikroskobu ile üretilen Z-yığın görüntülerde alıcı hücreler tarafından eksprese işe proteinleri ile kolokalizasyon tarafından rekombinant protein uygulanan eksojen alımı / işgali onaylayın. Ancak, endojen protein alımı esasen konak hücrenin protein işgali ile paralel olarak tespit edilemeyebilir, Z-yığın görüntüleri hala protein invaziv onaylayabilirsiniz. </li></ol> Bizim örneğimizde rec de. DISC1 (598-785) * en azından kısmen acemi içinde çözünür DISC1 (598-854) konak hücre (Şekil 5A bakınız) tarafından ifade edilmiş protein GFP-etiketli. Rekombinant α-sinüklein işgali ama hiçbir işe için (Şekil 5B) gösterilmiştir. Resimler çekildibir Zeiss LSM 510 konfokal-ya da bir Zeiss mikroskobu Axiovision Apotome2. Konsantre bir enjeksiyon ile bile hayvanın perfüzyon sonra tespit edilebilir enjeksiyon yeri etrafında protein yayılmasında Mpfc sonuçlara DISC1 (598-785) * işaretli (2.5 ug / ul arasında yaklaşık 4 ul), Bir rodamin filterset ile PBS pH 7.4 &#39;de% 4 PFA. Bizim örneğimizde DISC1 (598-785) nöron ayrı bir numara tarafından alınır ve Z-yığın görüntüleme (Şekil 6) ile izlenebilir. Genel olarak, burada kullanılan olanlardan daha sonra diğer proteinlerin enjeksiyon ister istemez hücre istilası yol açmaz. Işgali olayı protein niteliği üzerinde esasen bağlıdır, yine temiz bir arıtma daha fazla analiz için bir ön koşuldur. 7. Temsilcisi Sonuçlar NLF hücrelerinden rekombinant FL DISC1-eGFP saflaştırılmış oluşan Aggresomes alıcı SH-SY5Y ce işgaldüşük verimlilik de lls (yaklaşık% 0.3 5) olarak konfokal mikroskobu (Şekil 3) ile ko tarafından görülebilir. Önceden bildirildiği gibi, DISC1 (598-785) ifade ve E. arınmış coli multimerler 4 pozitif kontrol (Şekil 5B) olarak paralel olarak kullanıldığı α-sinüklein ile benzer yaklaşık olarak% 20 5 (Şekil 5A) ve bir verimle eşit olarak hücre-invaziv oluşturmuştur. Etiketli rekombinant DISC1 (598-785) ifade ve E. arınmış multimerik proteini stereotaksi bir sıçan prefrontal korteks (; Pum, Bader, Huston, Korth, yayınlanmamış Şekil 6) enjekte edildiğinde coli da hücre-invaziv in vivo nöron oldu. <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. NLF nöroblastom hücrelerinde geçici FP-DISC1 (kırmızı) ifade. Kırmızı floresan aggresomes dete olabilir,hücre içindeki cted. <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig2.jpg" alt="Şekil 2," /> Şekil 2. Bir sükroz degrade arıtma sonrası DISC1 aggresomes MRFP etiketli saflaştırılmış. <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. Istila aggresomes Floresan resmi. MRFP etiketli flDISC1 aggresomes SH-SY5Y nöroblastom hücreleri ile saflaştırılmış ve inkübe edildi eksprese çözünebilir GFP etiketli DISC1 (598-854). Etiketli aggresomes bir tutulum bir Lazer Tarama mikroskobu (Zeiss LSM 510) Z-yığın görüntüleme ile izlenir. <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig4.jpg" alt="Şekil 4," /> Şekil 4. Rec SEC-profili. S704 ve C704 tek nükleotid polimorfizmleri (SNP) içeren DISC1 (598-785). Her iki değişken sıralanmıştır oligomerizasyonun bir bozulma ve yüksek moleküler ağırlıklı mult oluşumunu göstermekimers (kırmızı ok). Bu resim Leliveld ark yayın., Biyokimya 2009 değiştirilir. <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig5.jpg" alt="Şekil 5," /> Şekil 5. Invaziv DyLight-etiketli rekombinant DISC1 (598-785) Floresan Z-yığın resim. Çözünür GFP-DISC1 (598-854) ifade eden SH-SY5Y nöroblastoma hücre etiketli ile inkübe edildi, 5 ug / ml &#39;lik bir konsantrasyonda yeniden birleştirici protein. (A) Kırmızı agrega rec işgali gösterir. DISC1 (598-785) protein ve sarı noktalar agrega içine çözünür GFP-DISC1 (598-854) bir işe göstermektedir. (B) Rekombinant α-sinüklein (kırmızı) yaklaşık% 20 oranında bir sıklık ile işe alım olmadan hücreleri işgal etti. <a href="/files/ftp_upload/4132/4132fig5large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig6.jpg" alt="Şekil 6" /> Şekil 6. Immünofloresan resmienjekte etiketli, rekombinant DISC1 (598-785) proteini. Z-yığın görüntüleme rec varlığını teyit eder. Nöronal çekirdeklerin (Neun, yeşil) karşı bir antikor ile boyandı sıçan kortikal nöronlarda DISC1 (598-785) proteini.

<ol>
	<li>Millar, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+two+novel+genes+by+a+translocation+co-segregating+with+schizophrenia.">Disruption of two novel genes by a translocation co-segregating with schizophrenia.</a> Hum. Mol. Genet. 9, 1415-1423 (2000).</li><li>St Clair, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+within+a+family+of+a+balanced+autosomal+translocation+with+major+mental+illness.">Association within a family of a balanced autosomal translocation with major mental illness.</a> Lancet. 336, 13-16 (1990).</li><li>Leliveld, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insolubility+of+disrupted-in-schizophrenia+1+disrupts+oligomer-dependent+interactions+with+nuclear+distribution+element+1+and+is+associated+with+sporadic+mental+disease.">Insolubility of disrupted-in-schizophrenia 1 disrupts oligomer-dependent interactions with nuclear distribution element 1 and is associated with sporadic mental disease.</a> J. Neurosci. 28, 3839-3845 (2008).</li><li>Leliveld, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomer+assembly+of+the+C-terminal+DISC1+domain+(640-854)+is+controlled+by+self-association+motifs+and+disease-associated+polymorphism+S704C.">Oligomer assembly of the C-terminal DISC1 domain (640-854) is controlled by self-association motifs and disease-associated polymorphism S704C.</a> Biochemistry. 48, 7746-7755 (2009).</li><li>Ottis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergence+of+two+independent+mental+disease+genes+on+the+protein+level:+recruitment+of+dysbindin+to+cell-invasive+disrupted-in-schizophrenia+1+aggresomes.">Convergence of two independent mental disease genes on the protein level: recruitment of dysbindin to cell-invasive disrupted-in-schizophrenia 1 aggresomes.</a> Biol. Psychiatry. 70, 604-610 (2011).</li><li>Meyer-Luehmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+induction+of+cerebral+beta-amyloidogenesis+is+governed+by+agent+and+host.">Exogenous induction of cerebral beta-amyloidogenesis is governed by agent and host.</a> Science. 313, 1781-1784 (2006).</li><li>Frost, B., Jacks, R. L., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+tau+misfolding+from+the+outside+to+the+inside+of+a+cell.">Propagation of tau misfolding from the outside to the inside of a cell.</a> J. Biol. Chem. 284, 12845-12852 (2009).</li><li>Frost, B., Ollesch, J., Wille, H., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+diversity+of+wild-type+Tau+fibrils+specified+by+templated+conformation+change.">Conformational diversity of wild-type Tau fibrils specified by templated conformation change.</a> J. Biol. Chem. 284, 3546-3551 (2009).</li><li>Clavaguera, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+and+spreading+of+tauopathy+in+transgenic+mouse+brain.">Transmission and spreading of tauopathy in transgenic mouse brain.</a> Nat. Cell Biol. 11, 909-913 (2009).</li><li>Desplats, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inclusion+formation+and+neuronal+cell+death+through+neuron-to-neuron+transmission+of+alpha-synuclein.">Inclusion formation and neuronal cell death through neuron-to-neuron transmission of alpha-synuclein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 13010-13015 (2009).</li><li>Ren, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+penetration+and+persistent+infection+of+mammalian+cells+by+polyglutamine+aggregates.">Cytoplasmic penetration and persistent infection of mammalian cells by polyglutamine aggregates.</a> Nat. Cell Biol. 11, 219-225 (2009).</li><li>Munch, C., O'Brien, J., Bertolotti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion-like+propagation+of+mutant+superoxide+dismutase-1+misfolding+in+neuronal+cells.">Prion-like propagation of mutant superoxide dismutase-1 misfolding in neuronal cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 3548-3553 (2011).</li><li>Iwatsubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+Lewy+bodies+from+the+brains+of+patients+with+diffuse+Lewy+body+disease.">Purification and characterization of Lewy bodies from the brains of patients with diffuse Lewy body disease.</a> Am. J. Pathol. 148, 1517-1529 (1996).</li><li>Meriin, A. B., Wang, Y., Sherman, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+aggresomes+and+other+large+aggregates.">Isolation of aggresomes and other large aggregates.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, 1-9 (2010).</li><li>Korth, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DISCopathies:+brain+disorders+related+to+dysfunctional+DISC1.">DISCopathies: brain disorders related to dysfunctional DISC1.</a> Rev. Neurosci. 20, 321-330 (2009).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu çalışmada, bir transfekte edilmiş nöroblastoma hücre çizgisi, bunların hazırlanması ve bir rekombinant protein DISC1 tür etiketleme ve in vitro ve in vivo olarak alıcı hücrelerin hücre istilası deneylerde uygulama mRFP/eGFP-DISC1 aggresomes saflaştırılması açıklanmıştır. Yerli mRFP/eGFP-DISC1 aggresomes arıtılması Lewy cismi benzeri yapılar ve büyük agrega 13, 14 yalıtmak için protokoller geliştirildi, fakat deterjan kullanımını önlemek için ve oluşabilecek hücre invazyonu yanlış pozitif riskini en aza indirmek için güncellenmiştir deterjan kolaylaştırılmış membran penetrasyonu nedeniyle. Bir olası gelecek iyileşme daha fazla aggresomes tamamen ayrı kalan membranları ve hücre iskeleti ile sonikasyon ile aggresomes saflığını arttırmak için de olabilir. Artan genel saflık olarak, büyük aggresomes ma için kaydedilen toplam işgal olayların sayısınıy 5 artırılacak. Önerdiğimiz 3 fazlı sukroz sınırlı tanımı diğer protein türlerinden aggresomes için yeterli olup olmadığı test edilmelidir, bu anlamda protokol burada özetlenen bireysel optimizasyon için bir başlangıç ​​noktası olarak kabul edilmelidir. Saflaştırılmış aggresomes sakkaroz izleri önemli ölçüde genel verimi azaltmak etmedi ortadan kaldırmak için bizim eller, ek yıkama adımları (deterjansız) oldukça sağlam olduğunu kanıtladı. Önceki bir yayında bu DISC1 bir oligomer montaj C-terminali 4 (Şekil 4) farklı multimerization etki bağlı olduğunu tanımlanmıştır. Biz, E., rekombinant çözünür ifade için bu parça seçtik coli ve sonraki ve Ni-NTA saflaştırılması. Onun multimerization izlemek ve α-sinüklein gibi tarif hücre-invaziv proteini ile hücre invazivlik karşılaştırmak için, biz floresan boya DyLight594 ile DISC1 (598-785) etiketli ve kıyaslaeşit olarak etiketlenmiş α-sinüklein bu ile hücre-invaziv. Rekombinant DISC1 parçasının hücre-invaziv ölçüde doğal, tam uzunlukta DISC1 aggresomes, muhtemelen daha küçük boyutlu ve daha yüksek bir saflık derecesi ile karşılaştırıldığında çıkarıldı. Yine, saflıkta hücre-invaziv belirleyici bir rol oynadığı görülmektedir. Bizim örneğimizde invaziv aggresomes Birleştirilerek bir çözünür, yani hücre dağınık şeklinde ifade edildi hedef hücre hattı çözünür homolog protein işe. Bu Z-yığın görüntüleme yoluyla alıcı hücre sınırı içinde invaziv aggresomes ve rekombinant proteinlerin ko sağlar beri alıcı hücre hattı bir floresan proteini (örneğin GFP veya TÇ) ifadesi bir avantajdır. Hücre-invaziv DISC1 aggresomes ve multimerik parçaları ifade ve E. arınmış coli DISC1, DI ilgili bir proteinin konformasyon hastalıkların tanımlayıcı bir özelliği olabilirSC1opathies 15. Çekim Trouble: Sukroz gradient saflaştırma sonrasında Düşük aggresome verim: Bu protokol tanıtılan sukroz gradient eGFP/mRFP-DISC1 (FL) aggresomes ile iyi çalışır. Diğer proteinlerden oluşan Aggresomes değişken boyutlarda olabilir, bu nedenle sakaroz konsantrasyonları diğer kullanıcılar tarafından optimize edilmesi gerekmektedir. Rekombinant protein Yetersiz saflaştırılması: Rekombinant protein arıtma işlemi herhangi bir bakteri kirletici maddeler de protokol sonraki adımda etiketlenir. Bulaşmayı önlemek için, SDS-PAGE ile protein çalıştırın ve rekombinant proteini Coomassie-Blue ile boyanarak saf, en az% 95 olduğunu onaylayın. Yüksek kalite ve verimi sağlamak için, her bir ayrı protokol protein için optimize edilmelidir. Düşük etiketleme efRekombinant proteinlerin ficiency: Serbest SH grupları içeren herhangi bir kontaminasyondan proteinin etkili etiketleme azalacaktır. Bu nedenle, kapsamlı diyaliz ve Ni-NTA bazlı saflaştırma zorunludur.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif ismi </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11875-093 </td><td> Orta konak hücre hattı bağlıdır. En uygun alıcı hücre çizgisi kullanıcı tarafından belirlenmelidir. </td></tr><tr><td> DMEM/F-12 </td><td> Invitrogen </td><td> 11320-033 </td><td> Orta alıcı hücre hattı bağlıdır. En uygun alıcı hücre çizgisi kullanıcı tarafından belirlenmelidir. </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-250 </td><td></td></tr><tr><td> Metafectene </td><td> Biontex </td><td> T020-1.0 </td><td> Diğer transfeksiyon reaktifleri de işe yarayabilir ama bizim protokolü ile test edilmiştir. </td></tr><tr><td> Ni-NTA agaroz </td><td> Qiagen </td><td> 30210 &lt;/ Td&gt; <td> Deneyler Qiagen gelen Ni_NTA agaroz ile yapıldı, diğer tedarikçiler de çalışmak gerekir. </td></tr><tr><td> DNaz I </td><td> Roche </td><td> 04716728001 </td><td> Aggresomes arınma sürecinde RNaz ücretsiz DNaz için gerek yoktur. </td></tr><tr><td> Sakaroz </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S0389 </td><td></td></tr><tr><td> Opti-MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31985-062 </td><td> Serum içermeyen aracı madde olarak iyi çalışır </td></tr><tr><td> Penisilin / Streptomisin </td><td> Invitrogen </td><td> 15140122 </td><td> SH-SY5Y ve NLF orta Ek </td></tr><tr><td> Non-esansiyel amino-asitler (NEAA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M7145 </td><td> SH-SY5Y orta Ek </td></tr><tr><td> Tripan Mavi 0.4% </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8154 </td><td> Toksik reaktifi </td></tr><tr><td> DyLight 594 Maleimide </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> 46608 </td><td> Stabil tiyoeter bağları oluşturmak için sistein reaktif boya azalır. Ayrıca diğer renkler mevcuttur. </td></tr><tr><td> DAPI ile Altın uzatmak </td><td> Invitrogen </td><td> P36935 </td><td> Bu antifade sıvı mountant elimizde üstün sonuçlar verdi. </td></tr><tr><td> Proteaz İnhibitör Kokteyl </td><td> Roche </td><td> 11873580001 </td><td> 100X çözüm için 500 ul H 2 O 1 masa çözülür. </td></tr><tr><td> Sentetik bir-sinüklein </td><td> Sigma </td><td> S7820 </td><td> Refold metin olarak tanımlanmıştır. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Belirli reaktiflerin Tablo. </td></tr><tr><td> Precellys 24 </td><td> Bertin Teknolojileri </td><td> 03119.200.RD000 </td><td> Biz diğer mekanik homojen test değilBunun dışındaki nizers. Diğer deterjan ücretsiz homojenleştirme metodu yanı işe yarayabilir, ancak bu protokol için test edilmemiştir. </td></tr><tr><td> 5301 Yoğunlaştırıcı (Speedvac) </td><td> Eppendorf </td><td> 5301 000.210 </td><td> Protein konsantre olmak varsa Sadece gerekli. </td></tr><tr><td> LSM 510 ve Axiovision Apotome2 </td><td> Zeiss </td><td> Üreticilerin katalog bak </td><td> Hem mikroskoplar Z-yığın görüntüleme gerçekleştirmek için yeteneği barındırırlar. Bu işgal olaylar katı ve ciddi bir değerlendirme için bir ön koşuldur. </td></tr><tr><td> Hücre kültürü plastik malzemeden </td><td> Nunc </td><td> 10 cm yemekler # 172958, 24-kuyucuğu # 142475 </td><td> Farklı plastik malzemenin kullanımı, rekombinant protein ya da aggresomes ve plastik yüzeylerin etkileşim etkileyebilir. Biz burada açıklanan dışındaki malzemelerin test etmedim. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Özel malzeme ve ekipman Tablo. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> Numara </td><td> Tampon adı </td><td> içerik </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> 1. </td><td> Bakteriyel büyüme ortamının </td><td> 16 g / l Bacto Tripton, MgSO4 5mM 10 g / l Bacto maya özü, 5 g / l NaCI, 5 mM-arginin-HCl, 100 ug / ml carbencillin, 35 ug / ml kloramfenikol </td><td> OD 600 bakteriler büyümek: 0.6-0.8 1 mM IPTG ile ifade neden. </td></tr><tr><td> 2. </td><td> Bakteriyel tabanda tampon </td><td> 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 5 mM EDTA, 2 mM PMSF,% 1 TX-100, 250 ug / ml lizozim, 20 mM MgCl2 ve 400 ml DNase I U/50 </td><td> Ove 1 L bakteriyel pelet Resupend50 ml tampon içinde yeniden süspanse rnight kültürü. </td></tr><tr><td> 3. </td><td> Protein ekstraksiyon tamponu </td><td> 50 mM Tris pH 8.0, 5 mM imidazol, 500 mM NaCl, 8 M üre, 10 mM B-ME </td><td></td></tr><tr><td> 4. </td><td> Ni-NTA sütunu yıkama tamponu </td><td> 50 mM Tris pH 8.0, 5 mM imidazol, 500 mM NaCl, 8 M üre, 10 mM B-ME, 12 mM imidazol </td><td> 12 mM imidazol ile Modifiye ekstraksiyon tampon eklendi. </td></tr><tr><td> 5. </td><td> Ni-NTA sütunu elüsyon tampon </td><td> 50 mM Tris, 500 mM NaCl, 300 mM imidazol, 8 M üre, 1 mM PMSF, 5 mM EDTA ve 10 mM B-ME </td><td> Işlem tampon maddesi daha sonra diyaliz edilir, 10 mM B-ME, içerir. </td></tr><tr><td> 6. </td><td> PBS </td><td> 8 g / l NaCl, 0.2 g / l KCI, 1.44 g / l Na 2 HPO 4, 0.24 g / l KH 2 PO 4, pH 7.4 &#39;e ayarlamak </td><td></td></tr><tr><td>7. </td><td> Tampon Etiketleme </td><td> PBS 5 mM TCEP içeren </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Tarifleri Tablo. </td></tr></tbody></table></td></tr></tbody></table>

generation, purification, and characterization of cell-invasive disc1 protein species

Protein toplama Alzheimer hastalığı (Aβ, tau) nörodejeneratif hastalıklarda, örneğin, gibi kronik ve dejeneratif beyin koşulların bir genel ayırt edici olarak görülen, Parkinson Hastalığı (α-sinüklein), Huntington hastalığı (poliglutamin, huntingtin), ve diğerleri. Protein agregasyonu rahatsız proteostasis sonucu oluştuğu düşünülmektedir, doğan ve katlanan proteinlerin yıkımı arasındaki dengesizlik yani. Not, aynı protein ailesel formları arasında ender türevleri mutant bu hastalıklar dağınık formlar toplanmış bulunur. Şizofreni birçok durumda kalıcı ve geri dönüşümsüz bilişsel açığı ile birlikte gider kronik ilerleyici beyin hastalığıdır. Aday gen yaklaşımı, biz bozulması-in-şizofreni 1 (DISC1), kronik ruhsal hastalığı 1, 2 bağlantı ile bir İskoç aile klonlanmış bir genin, brai çözünmez büyüklükler bulunamadı araştırdıkn şizofreni 3 sporadik olgular. SMRI CC kullanarak, CMD ile vakaların yaklaşık% 20&#39;sinde belirlendi ancak biyokimyasal fraksiyonasyonu sonrası nörodejeneratif hastalıklar ile değil normal kontrollerde veya hasta sarkosyl çözülmeyen DISC1 immünreaktivitesi. In vitro sonraki çalışmalar DISC1, toplama eğilimi hastalığı ile ilişkili polimorfizmi S704C 4 etkilendiğini ortaya koydu ve in vitro üretilen DISC1 aggresomes Aβ 6 için gösterilen olmuştu ne benzer 5, tau 7-9, α hücre-invaziv olduğu -sinüklein 10, poliglutamin 11 veya SOD1 agregalar 12. Bu bulgular bize CMD olguların en azından bir alt kümesi, toplanan DISC1 olan proteinin konformasyon bozuklukları olabileceğini teklif istenir. İşte biz memeli hücrelerinde DISC1 aggresomes oluşturmak nasıl açıklar, bir sukroz degrade onları arındırmak ve hücre-invaziv Studi için bunları kullanmakes. Benzer şekilde, biz sadece bir multimerik C-terminal DISC1 fragmanı, etiket üretmek ve hücre invaziv çalışmalar için arınmak anlatılmaktadır. DISC1 yeniden birleştirici multimerler kullanılarak bir benzer bir şekilde etiketlenmiş sentetik α-sinüklein fragmanı için olduğu gibi benzer hücre invaziv elde edin. Ayrıca stereotaktik alıcı hayvanların beyin içine enjekte edildiğinde bu fragman, in vivo alınır olduğunu göstermektedir.

Watch this Scientific Journal Video about Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species at JoVE.com

Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species

Hücre kültüründen hücre içi, sitoplazmik tam uzunluklu protein DISC1 aggresomes ve bir etiketlenmiş, multimerik DISC1 rekombinant protein parçasının üretimi, saflaştırılması ve hücre istilası<em&gt; E. coli</em&gt; Tarif edilmektedir. Hücre invazivlik hücre kültürü ve nöronlar için alıcı hücreler için gösterilir<em&gt; In vivo</em&gt; Stereotaktik beyin inokülasyon sonrası.

Hücre-invaziv DISC1 Protein Türlerinin Üretimi, Saflaştırılması, ve Karakterizasyonu

Protein aggregation is seen as a general hallmark of chronic, degenerative brain conditions like, for example, in the neurodegenerative diseases ...

generation-purification-characterization-cell-invasive-disc1-protein

Research

JoVE Journal

Biology

13.6K Görüntüleme.  Medical School Düsseldorf, Germany. Hücre kültüründen hücre içi, sitoplazmik tam uzunluklu protein DISC1 aggresomes ve bir etiketlenmiş, multimerik DISC1 rekombinant protein parçasının üretimi, saflaştırılması ve hücre istilası E. coli Tarif edilmektedir. Hücre invazivlik hücre kültürü ve nöronlar için alıcı hücreler için gösterilir In vivo Stereotaktik beyin inokülasyon sonrası.

Video: Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Organik Solvent ve Asetik Asit olmadan Jeller Coomassie G-250 ile Proteinlerin Boyama

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Biyoloji

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is believed to aid their search for suitable environments (1). This capability is conferred by the magnetosome, a subcellular organelle that consists of a linear-chain assembly of lipid vesicles each able to biomineralize and enclose a ~50-nm crystal of magnetite or greigite. A principle component of the magnetosome that was shown to be required for the formation of functional vesicles is MamA. MamA is a highly abundant magnetosome-associated protein which is one of the most characterized magnetosome-associated proteins in vivo (2-6). This article focuses on the purification of MamA, which despite being studied in vivo, no clear functional or structural details have been identified for it. Bioinformatics analysis suggested that MamA is a tetra-tricopeptide repeat (TPR) containing protein. TPR is a structural motif found as such or forming part of a bigger fold in a wide range of proteins, it serves as a template for protein-protein interactions and mediates multi-protein complexes (7). TPRs are involved in many crucial tasks in eukaryotic cell organelle processes and many bacterial pathways (8-14). In order to understand MamA, a unique TPR containing protein, highly purified protein is required as a first step. In this article, we present the purification protocol for a stable MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

Purification of the &lt;em&gt;M. magneticum&lt;/em&gt; Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&amp;Delta;41

MamA is a unique Magnetosome associated protein which was shown to be involved in magnetosome activation. Here we present the purification protocol of MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

Saflaştırılması M. magneticum Deformasyon AMB-1 Magnetosome İlişkili Protein MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using noninvasive sampling techniques to investigate population genetics and demography of wild populations1. This approach has proven to be especially useful when dealing with rare or elusive species2. While a number of these methods have been developed to sample hair, feces and other biological material from carnivores and medium-sized mammals, they have largely remained untested in elusive small mammals. In this video, we present a novel, inexpensive and noninvasive hair snare targeted at an elusive small mammal, the American pika (Ochotona princeps). We describe the general set-up of the hair snare, which consists of strips of packing tape arranged in a web-like fashion and placed along travelling routes in the pikas&#x2019; habitat. We illustrate the efficiency of the snare at collecting a large quantity of hair that can then be collected and brought back to the lab. We then demonstrate the use of the DNA IQ system (Promega) to isolate DNA and showcase the utility of this method to amplify commonly used molecular markers including nuclear microsatellites, amplified fragment length polymorphisms (AFLPs), mitochondrial sequences (800bp) as well as a molecular sexing marker. Overall, we demonstrate the utility of this novel noninvasive hair snare as a sampling technique for wildlife population biologists. We anticipate that this approach will be applicable to a variety of small mammals, opening up areas of investigation within natural populations, while minimizing impact to study organisms.

We present a noninvasive sampling approach to efficiently collect hair samples from elusive small mammals, as shown for the American pika. We demonstrate the utility of this method by extracting DNA from sampled hair and amplifying several types of molecular markers commonly used in studies of wildlife ecology and conservation.

Elusive Küçük Memeliler Yüksek Kalite DNA Edinme Noninvaziv Saç Örnekleme Tekniği

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key selective advantages. First, renaturation of disordered aggregates by Hsp104 empowers yeast survival after various protein-misfolding stresses, including heat shock3,5,11,12. Second, remodeling of cross-beta amyloid fibrils by Hsp104 enables yeast to exploit myriad prions (infectious amyloids) as a reservoir of beneficial and heritable phenotypic variation13-22. Remarkably, Hsp104 directly remodels preamyloid oligomers and amyloid fibrils, including those comprised of the yeast prion proteins Sup35 and Ure223-30. This amyloid-remodeling functionality is a specialized facet of yeast Hsp104. The E. coli orthologue, ClpB, fails to remodel preamyloid oligomers or amyloid fibrils26,31,32.
Hsp104 orthologues are found in all kingdoms of life except, perplexingly, animals. Indeed, whether animal cells possess any enzymatic system that couples protein disaggregation to renaturation (rather than degradation) remains unknown33-35. Thus, we and others have proposed that Hsp104 might be developed as a therapeutic agent for various neurodegenerative diseases connected with the misfolding of specific proteins into toxic preamyloid oligomers and amyloid fibrils4,7,23,36-38. There are no treatments that directly target the aggregated species associated with these diseases. Yet, Hsp104 dissolves toxic oligomers and amyloid fibrils composed of alpha-synuclein, which are connected with Parkinson's Disease23 as well as amyloid forms of PrP39. Importantly, Hsp104 reduces protein aggregation and ameliorates neurodegeneration in rodent models of Parkinson's Disease23 and Huntington's disease38. Ideally, to optimize therapy and minimize side effects, Hsp104 would be engineered and potentiated to selectively remodel specific aggregates central to the disease in question4,7. However, the limited structural and mechanistic understanding of how Hsp104 disaggregates such a diverse repertoire of aggregated structures and unrelated proteins frustrates these endeavors30,40-42.
To understand the structure and mechanism of Hsp104, it is essential to study the pure protein and reconstitute its disaggregase activity with minimal components. Hsp104 is a 102kDa protein with a pI of ~5.3, which hexamerizes in the presence of ADP or ATP, or at high protein concentrations in the absence of nucleotide43-46. Here, we describe an optimized protocol for the purification of highly active, stable Hsp104 from E. coli. The use of E. coli allows simplified large-scale production and our method can be performed quickly and reliably for numerous Hsp104 variants. Our protocol increases Hsp104 purity and simplifies His6-tag removal compared to a previous purification method from E. coli47. Moreover, our protocol is more facile and convenient than two more recent protocols26,48.

Here, we describe a protocol for the purification of highly active Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation. This scheme exploits a His6-tagged construct for affinity purification from E. coli followed by anion-exchange chromatography, His6-tag removal with TEV protease, and size-exclusion chromatography.

Hsp104 saflaştırılması, Protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

Tandem Affinity Arıtma kullanarak Protein etkileşim Ortaklar belirlenmesi

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes such as cell adhesion, molecular trafficking, clearance, and signal transduction1-4. In eukaryotes, the most common glycosylation modifications in the secretory pathway are additions at consensus asparagine residues (N-linked); or at serine or threonine residues (O-linked) (Figure 1). Initiation of N-glycan synthesis is highly conserved in eukaryotes, while the end products can vary greatly among different species, tissues, or proteins. Some glycans remain unmodified ("high mannose N-glycans") or are further processed in the Golgi ("complex N-glycans"). Greater diversity is found for O-glycans, which start with a common N-Acetylgalactosamine (GalNAc) residue in animal cells but differ in lower organisms1.
The detailed analysis of the glycosylation of proteins is a field unto itself and requires extensive resources and expertise to execute properly. However a variety of available enzymes that remove sugars (glycosidases) makes possible to have a general idea of the glycosylation status of a protein in a standard laboratory setting. Here we illustrate the use of glycosidases for the analysis of a model glycoprotein: recombinant human chorionic gonadotropin beta (hCG&beta;), which carries two N-glycans and four O-glycans 5. The technique requires only simple instrumentation and typical consumables, and it can be readily adapted to the analysis of multiple glycoprotein samples.
Several enzymes can be used in parallel to study a glycoprotein. PNGase F is able to remove almost all types of N-linked glycans6,7. For O-glycans, there is no available enzyme that can cleave an intact oligosaccharide from the protein backbone. Instead, O-glycans are trimmed by exoglycosidases to a short core, which is then easily removed by O-Glycosidase. The Protein Deglycosylation Mix contains PNGase F, O-Glycosidase, Neuraminidase (sialidase), &beta;1-4 Galactosidase, and &beta;-N-Acetylglucosaminidase. It is used to simultaneously remove N-glycans and some O-glycans8 . Finally, the Deglycosylation Mix was supplemented with a mixture of other exoglycosidases (&alpha;-N-Acetylgalactosaminidase, &alpha;1-2 Fucosidase, &alpha;1-3,6 Galactosidase, and &beta;1-3 Galactosidase ), which help remove otherwise resistant monosaccharides that could be present in certain O-glycans.
SDS-PAGE/Coomasie blue is used to visualize differences in protein migration before and after glycosidase treatment. In addition, a sugar-specific staining method, ProQ Emerald-300, shows diminished signal as glycans are successively removed. This protocol is designed for the analysis of small amounts of glycoprotein (0.5 to 2 &mu;g), although enzymatic deglycosylation can be scaled up to accommodate larger quantities of protein as needed.

Using specific glycosidases to remove sugars from glycoproteins followed by SDS-PAGE is a valuable method to detect glycan modifications on protein samples and is a good choice for initial glycobiology studies. Changes following deglycosylation can be detected as shifts in gel mobility or by staining with glycan sensitive reagents.

Spesifik endo-ve exoglycosidases kullanarak protein glikozilasyon tanımlanması ve karakterizasyonu

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

Yılında Kistik Fibrozis Transmembran İletkenlik Regülatörü Protein İfadesi ve Arıtma Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

Mikro Termoforosis tarafından Bağlama Affinity belirlenmesi Protein Saflaştırma-ücretsiz Yöntemi

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or eliminated either catalytically or spontaneously. Due to the short life spans of most ROS and the diversity of their sources and subcellular localizations, a complete picture can be obtained only by careful measurements using a combination of protocols. Here, we present a set of three different protocols using OxyBurst Green (OBG)-coated beads, or dihydroethidium (DHE) and Amplex UltraRed (AUR), to monitor qualitatively and quantitatively various ROS in professional phagocytes such as Dictyostelium. We optimised the beads coating procedures and used OBG-coated beads and live microscopy to dynamically visualize intraphagosomal ROS generation at the single cell level. We identified lipopolysaccharide (LPS) from E. coli as a potent stimulator for ROS generation in Dictyostelium. In addition, we developed real time, medium-throughput assays using DHE and AUR to quantitatively measure intracellular superoxide and extracellular H2O2 production, respectively.

We adapted a set of protocols for the measurement of reactive oxygen species (ROS) that can be applied in various amoeba and mammalian cellular models for qualitative and quantitative studies.

Tespit, görselleştirme ve bir amip Model Sistemde reaktif oksijen türlerinin Üretimi nicelleştirilmesini

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. However, the use of biochemical screens aimed at extending the knowledge gained from genetic analysis was explored only recently. Here we describe a method to purify the protein complex that associates with any protein of interest from adult fly heads. This method takes advantage of the Drosophila GAL4/UAS system to express a bait protein fused with a Tandem Affinity Purification (TAP) tag in fly neurons in vivo, and then implements two rounds of purification using a TAP procedure similar to the one originally established in yeast1 to purify the interacting protein complex. At the end of this procedure, a mixture of multiple protein complexes is obtained whose molecular identities can be determined by mass spectrometry. Validation of the candidate proteins will benefit from the resource and ease of performing loss-of-function studies in flies. Similar approaches can be applied to other fly tissues. We believe that the combination of genetic manipulations and this proteomic approach in the fly model system holds tremendous potential for tackling fundamental problems in the field of neurobiology and beyond.

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Drosophila is famous for its powerful genetic manipulation, but not for its suitability of in-depth biochemical analysis. Here we present a TAP-based procedure to identify interacting partners of any protein of interest from the fly brain. This procedure can potentially lead to new avenues of research.

Protein-protein etkileşimi belirlenmesi<em&gt; Drosophila</emTandem Affinity Arıtma tarafından&gt; Adult Başlar (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...