Gelen ve federal fonların, NCI ve Calidris Tedavi arasındaki işbirliği araştırma Anlaşma,, OT için Amerikan Kanser Derneği hibe IRG 97-152-17 Bu çalışma kısmen NIH, Ulusal Kanser Enstitüsü, Kanser Araştırma Merkezi İntramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir sözleşme HHSN26120080001E altında Ulusal Kanser Enstitüsü, NIH,.

1. Hücre lizatının hazırlanması Bu protokol, bir GFP kaynaşık proteini ifade yapışık hücreler için tasarlanmıştır. Gerekli hücre sayısı protein ifade seviyesine bağlı olarak, gibi düşük bir çok 20 x 10 6 hücre 6 10 olarak değişebilir. Örneğin, HEK hücreleri eksprese GFP-STAT3 lizat 1 mL lizis tamponu ile% 70 yakın konfluent 10 T75 şişeleri içinde yetiştirilen hücreler muamele etmek suretiyle hazırlandı. Bununla birlikte, bu lizat MST deney için optimum seviyede floresan sağlamak üzere 150-kat sulandırılmış gerekiyordu. Hücre parçalama protokolü araştırılmaktadır özellikleri ve proteinin hücre içi lokalizasyonu kuvvetle bağlıdır. Deterjan kullanarak, çünkü protein istikrarsızlık istenmeyen ise, sonikasyon aşağıda açıklanan, en iyi seçenek olabilir. Farklı katkı maddeleri protein modifikasyonu reaksiyonları önlemek için lizis tamponu ilave edilebilir: EDTA fosforilasyon engeller, sodyum vanadat, böylece tirozin protein fosfatazlar inhibefenoksimetilpenisilin florür Ser / Thr fosfatazların bir inhibitörüdür. <ol><li> Lizis tamponu hazırlayın. Kolay elde sitoplazmik proteinler için aşağıdaki bileşime iyi çalışır: 25 mM Tris HCI, pH 8.0, ve proteaz inhibitörü kokteyl, 2 mM AEBSF, 0.3 uM aprotinin, 130 uM Bestatin, oluşan 100 kat (Sigma-Aldrich P2714, seyreltilmiş 1 mM EDTA, 14 uM E-64, 1 uM löpeptin). Alternatif olarak, daha az çözünür proteinler için, bir proteaz inhibitörleri kokteyli ve denatüre edici olmayan deterjan ile ticari RIPA tampon kullanabilir. Buz üzerinde tampon tutun. </li><li> Buz gibi soğuk PBS T75 şişesi başına tampon 10 ml kullanarak kısa bir süre hücreleri yıkayın. 5 dakika buz üzerinde hücre tutmak kadar veya hücreler şişeden ayırma başlar. Gerekirse ayırmak için hücre kazıyıcı ile hücreleri kazıyın. </li><li> 10 ml buz gibi soğuk PBS ile önceden soğutulmuş bir 14 ml&#39;lik yuvarlak tabanlı bir santrifüj tüpüne transfer süspansiyon hücreleri. </li><li> 4 de 400-600 x g&#39;de santrifüj ile topak hücrelere ° C 5 dakika. Ben bu noktada birkaç matara hücreleri birleştirinf gerekli. </li><li> Buz gibi soğuk lizis tamponu 200 ul PBS süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet kaldırmak, bir ön süspansiyon aktarılması 1.5 ml Eppendorf tüp soğutulmuş. </li><li> Yerel aşırı ısınma en aza indirmek için buz üzerinde hücreleri tutun. Önceden soğutulmuş ucu 2-3 mm ile% 30 genlikte sonication 3x 10 sn bakliyat, hücreleri lyse. Yüzeyinin altında ucu frothing en aza indirmek için tutun. Bunun yerine 30 dakika boyunca buz üzerinde deterjan içeren tampon ve inkübe kullanılıyorsa bu adımı sayın. </li><li> Fizyolojik tuz konsantrasyonu (100 mM NaCI) 5 M NaCI kullanılarak gerektiğinde içeren Lizat çözeltisi düzeltin. </li><li> 10 dakika boyunca 4 ° C&#39;de 26,000 x g&#39;de santrifüj ile lizatları toplayın. </li><li> Optimum seyreltme lizat (aşağıda Bölüm 3, açıklandığı gibi) ve bir titrasyon (önceden seyreltilmiş lizat tipik olarak yaklaşık 300 ul) için gerekli lizat miktarını belirler. </li><li> Inceleme altındaki bir protein (-80 ° C, bir çok durumda) için uygun bir sıcaklıkta kısım lizat ve saklayın. </li> &lt;/ Ol&gt; 2. MST Tampon seçimi ve hazırlanması <ol><li> Protein-ligand etkileşimleri tampon şartlarına bağlı olduğu için, MST, tampon bileşimi, belirli bir sistemin özelliklerine bağlı olarak seçilir. Bu, en az iki farklı tampon test etmek için genel olarak avantajlıdır. </li><li> 2 5x MST tamponlar hazırlayın. Ve Tris HCI (250 mM Tris HCI, pH 7.4, 750 mM NaCI, 50 HEPES (, 25 mM MgCl2,, 500 mM NaCI,% 0.25 NP-40, 250 mM HEPES, pH 7.4): Bu iki bileşimler ile iyi deneyimleri mM MgCl2,% 0.05 Tween-20). BSA ilavesi (son bağlayıcı karışım 5%) plastik tüpler ve cam kılcal proteinlerin yapışmasını önlemeye yardımcı olabilir. NaN3 (0.5 mm) de mikroorganizmaların büyümesini engellemek için dahil edilebilir. </li></ol> 3. Optimal Lizat Seyreltme Belirlenmesi <ol><li> Dalga boyu ile LED uyarma kaynağı seçin λ MST cihaz üzerinde = 470 nm. </li><li> Ce ile kılcal Yük2 seyreltilmiş ve MST tamponu ile 10x ayıklamak edeceğiz. </li><li> MST aletin Kontrol Yazılımı &quot;Kılcal bul&quot; işlemi gerçekleştirin. Sulandırılmış lizatında uygun floresan aralığı 400 ila 1500 floresans birimleri olup. </li></ol> 4. Optimal Ligand Konsantrasyon aralığı belirlenmesi <ol><li> Ligandın en yüksek konsantrasyon beklenen ayrışma sabiti en az 20x daha yüksek olmalıdır. </li><li> Düşük ligand konsantrasyonunun floresan protein molar konsantrasyonundan daha düşük olmalıdır. </li></ol> Ligand konsantrasyon aralığı tahmini için NanoTemper Teknolojileri Konsantrasyon Bulucu aracı bakın. 5. Hücre lisatı ve ligand çözeltiler hazırlanması <ol><li> Buz üzerinde 0.5 ml LoBind santrifüj tüpleri gerekli bir dizi (genellikle 10-16) ile bir tüp raf yerleştirin. Her bir tüpün alt MST tampon pipetle 25 ul. Birinci küvet ligand stok solüsyonu 25 ul ekleE (# 1, ligandı en yüksek konsantrasyon) ve tüp dinlenme kullanarak ligandın iki kat seri seyreltme gerçekleştirin. Buz üzerinde ligand örnekleri ile raf tutun. </li><li> Çözülme hücre buz üzerinde yavaşça lizat. </li><li> Bağlama reaksiyonlarında floresan hedef proteinin optimum seviyesini sağlamak için MST tampon maddesi ile hücre lizatı seyreltin. Nihai protein konsantrasyonu tahmin Kd veya daha düşük yakın olmalıdır. Bu nihai çözüm floresan sayıları gerekli olan sayı elde etmek için ayarlanmalıdır. Lizat GFP-STAT3 konsantrasyonunun belirlenmesi için, alet floresein bir yardımı ile kalibre edildi. Lizattaki GFP molar konsantrasyonu sırasıyla floresein ve EGFP kuantum verimleri, 0.85 ve 0.61 oranı ile tespit edildi. 15 </li></ol> 6. Mikro Termoforosis Bağlama Çalışmaları <ol><li> MST cihaz üzerinde λ = 470 nm ile LED uyarma kaynağını seçin. </li><li> T yerleştirin 0.5 ml LoBind tüplerligand seri seyreltme örnekleri ile tüpler karşısında ube raf. Dikkatle Her tüpün alt hücre lizatı 15 ul ekle. Örnek kaybını önlemek için tüp duvarları dokunmamaya gayret edin. </li><li> Hücre lizatı ile ilgili tüp en yüksek konsantrasyonu (# 1) # 1 ile ligandın Örnek 15 ul ekle. İyice karıştırın ve bir pipet değiştirin. Ligand içermelidir sonuncusu hariç tüplerin geri kalanı ile bu adımı tekrar edin. </li><li> Son tüp MST tampon 15 ul ekleyin ve iyice karıştırın. </li><li> Tüp # 1 bağlayıcı karışımı ile yaklaşık 2/3 ilk kılcal doldurun, bu merkeze doğru çözüm taşımak için eğin, ve (tepsi açılış en yakın konumu) pozisyon # 1 kılcal tepsiye kılcal yerleştirin . Geri kalanı kılcal ile bu adımı yineleyin. Kılcal biter uzun deneyler için balmumu ile takılabilir. </li><li> MST araç içindeki tepsi yerleştirin ve cihazın kapağını kapatın. </li><li> &quot;Kılcal Bul&quot; gerçekleştirkomutu alet kılcal damarların tam pozisyon bulmak ve örneklerin floresan ölçmek izin. </li><li> Floresan sinyal yoğunluğuna göre, 400-1,500 birimleri aralığı haline getirmek için LED güç (% 10-100 itibaren) ayarlayın. </li><li> Termoforosis deney gerçekleştirmek için &quot;Başlat&quot; düğmesini tıklayın. Birden fazla kızılötesi lazer güç belirli bir sistem için optimal sıcaklık gradyanı bulmak için deney için seçilebilir. Ölçümlerin tekrarlanabilirliği sağlamak için kılcal damarların aynı seti 2-3 çalışır veri toplamak. Bu 16 kılcal damarların bir set çalıştırmak için 10-12 dakika sürer. </li></ol> 7. Mikro Termoforosis Veri Analizi <ol><li> Analiz yazılımını açın. </li><li> Proje klasörü yükleyin. Ortaya Bilgi Çalıştır Görüntüleyici seçtiğiniz belirli bir IR lazer güç thermophoretic eğrileri toplanan. Bu IR lazer gücü gibi çeşitli koşullar altında toplanan tüm thermophoretic izleri açma bir seçenek vardır, s LEDOver, sıcaklık, konsantrasyon, vb. az bir kez ve daha sonra onlara ve kapatarak analiz için herhangi bir eğrileri seçerek (deney adı tıklayın). </li><li> Değerlendirme Puan grafik penceresinde, T-atlama ile Termoforosis veya Termoforosis seçin. Mavi ve kırmızı çizgiler doğru konumda olduğundan emin olun. Standart sapma ile ortalama puan alma, seçme &quot;Ortalama Kullanım&quot; veya ayrı çalışan için &quot;ayırt çalışır&quot;. </li><li> Bir ayrışma sabit uygun arsa, etiketli molekül konsantrasyonu değeri (bir uyum pencere menüsündeki &quot;konsantrasyon&quot; kare kontrol) girin ve düzeltmek, &quot;Ortalama Kullanım&quot; seçin ve eğri uygun. Standart sapma ile K D değeri ayrı bir bilgi pop-up penceresi görünür. Tepesi yöntemi kullanarak bir uyum çizmek için, Hill yöntemi &quot;ortalama&quot; seçin ve sonra eğri uygun. Standart sapma ile EC 50 benzerlik değeri, bu durumda gösterilmiştir. Zaman doygunluk K D veya Tepesi &quot;sınır&quot; özelliği de kullanılabilirBir bağlı durumda ulaşmış değildir. </li><li> Bir metin dosyasına ortalama uyum verileri kaydetmek ve Excel&#39;e aktarmak. </li><li> Arsa F normu (normalleştirilmiş floresan), mesafe kadar taşınmış normuna (farklı deney karşılaştırılırsa normalleştirilmiş floresan fark), ya da bir kısmı, etiketsiz (titre) molekül konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak (bakınız, aşağıdaki formül) bağlanmıştır. </li></ol> Fraksiyon (karmaşık bir molekül fraksiyonu) = (Therm, (C)-serbest) / (ilişkili-bağlı olmayan), termal (C) konsantrasyonu C ölçülen Termoforosis olduğu, Bound bağlanmamış (moleküller olduğunda ilişkisiz bir durum için olan Termoforosis bir karmaşık) ve bağlı tamamen bağlı devlet için Termoforosis olduğunu.

<ol>
	<li>Lea, W. A., Simeonov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+polarization+assays+in+small+molecule+screening.">Fluorescence polarization assays in small molecule screening.</a> Expert. Opin. Drug Discov. 6, 17-32 (2011).</li><li>Willander, M., Al-Hilli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+biomolecules+using+surface+plasmons.">Analysis of biomolecules using surface plasmons.</a> Methods Mol. Biol. 544, 201-229 (2009).</li><li>Hulme, E. C., Trevethick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+binding+assays+at+equilibrium:+validation+and+interpretation.">Ligand binding assays at equilibrium: validation and interpretation.</a> Br. J. Pharmacol. 161, 1219-1237 (2010).</li><li>Ghai, R., Falconer, R. J., Collins, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+isothermal+titration+calorimetry+in+pure+and+applied+research--survey+of+the+literature+from+2010.">Applications of isothermal titration calorimetry in pure and applied research--survey of the literature from 2010.</a> J. Mol. Recognit. 25, 32-52 (2012).</li><li>Vuignier, K., Schappler, J., Veuthey, J. L., Carrupt, P. A., Martel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-protein+binding:+a+critical+review+of+analytical+tools.">Drug-protein binding: a critical review of analytical tools.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. , 398-3953 (2010).</li><li>Lebowitz, J., Lewis, M. S., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+analytical+ultracentrifugation+in+protein+science:+a+tutorial+review.">Modern analytical ultracentrifugation in protein science: a tutorial review.</a> Protein Sci. 11, 2067-2079 (2002).</li><li>Duhr, S., Braun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+molecules+move+along+a+temperature+gradient.">Why molecules move along a temperature gradient.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 19678-19682 (2006).</li><li>Zillner, K., Jerabek-Willemsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+thermophoresis+as+a+sensitive+method+to+quantify+protein:+nucleic+acid+interactions+in+solution.">Microscale thermophoresis as a sensitive method to quantify protein: nucleic acid interactions in solution.</a> Methods Mol. Biol. 815, 241-252 (2012).</li><li>Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-binding+assays+in+biological+liquids+using+microscale+thermophoresis.">Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis.</a> Nat. Commun. 1, 100 (2010).</li><li>Stark, G. R., Darnell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+JAK-STAT+pathway+at+twenty.">The JAK-STAT pathway at twenty.</a> Immunity. 36, 503-514 (2012).</li><li>Ehret, G. B., Reichenbach, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+binding+specificity+of+different+STAT+proteins.+Comparison+of+in+vitro+specificity+with+natural+target+sites.">DNA binding specificity of different STAT proteins. Comparison of in vitro specificity with natural target sites.</a> J. Biol. Chem. 276, 6675-6688 (2001).</li><li>Yang, J., Stark, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+unphosphorylated+STATs+in+signaling.">Roles of unphosphorylated STATs in signaling.</a> Cell Res. 18, 443-451 (2008).</li><li>Timofeeva, O. A., Chasovskikh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+unphosphorylated+STAT3+transcription+factor+binding+to+DNA.">Mechanisms of unphosphorylated STAT3 transcription factor binding to DNA.</a> J. Biol. Chem. 287, 14192-14200 (2012).</li><li>Timofeeva, O. A., Tarasova, N. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT3+suppresses+transcription+of+proapoptotic+genes+in+cancer+cells+with+the+involvement+of+its+N-terminal+domain.">STAT3 suppresses transcription of proapoptotic genes in cancer cells with the involvement of its N-terminal domain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2013).</li><li>Patterson, G., Day, R. N., Piston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+spectra.">Fluorescent protein spectra.</a> J. Cell Sci. 114, 837-838 (2001).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim. Bu yayının içeriği mutlaka Sağlık ve İnsan Hizmetleri Departmanı görüş ve politikalarını yansıtmamaktadır, ne de ticari isimler, ticari ürünler, veya kuruluşların söz ABD Hükümeti tarafından onaylandığı anlamına gelmez.

Protein ekspresyonu ve saflaştırılması, ancak, en güncel olarak kullanılan yöntem ile etkileşimleri &quot;Kd belirlenmesi için gerekli olan bir zahmetli ve pahalı bir adımdır. MST uygulanması önemli ölçüde etkileşimlerinin kantitatif karakterizasyonu basitleştirilmesi ve hızlandırılması böylece protein saflaştırma kaçınarak sağlar. Bu tür bir zar proteinleri ve transkripsiyon faktörleri olarak zor olan açıklama ve saflaştırmak proteinler durumunda, özellikle önemli bir ava...

Moleküller arası etkileşim yakınlık nicel karakterizasyonu biyomedikal araştırma birçok alanda önemlidir. Bağlama sabiti (Kd) ayrılma sadece ilaç keşfi değil, aynı zamanda gerekli olan herhangi bir biyolojik sistem herhangi bir ikili etkileşim karakterizasyonu önemli bir parametredir. Bu immunoprecipitation ve maya iki hibrit ekran gibi protein-protein etkileşimleri tespiti için kullanılan biyokimyasal yöntemler, yakınlık bu özel kompleks in vivo olarak verilen koşullar altında olup olmadığını tanımlar iken nasıl sıkı bu etkileşimler vardır bize haber yok. Ilaç keşfi işlemde, bağlanma tahlili geliştirilmesi gerekli ve sıklıkla en çok zaman tüketen aşamalar biridir. K D belirlenmesi En sık kullanılan yöntemler floresan polarizasyon, 1 yüzey plazmon rezonans (SPR) teknolojisi, 2 radyo-bağlama, 3 izotermal titrasyon kalorimetre, 4 equilibri dahilum diyaliz (ED), 5 ultrafiltrasyon (UF), 5 ve ultra-santrifüj (UC). 6 bunların tüm hedef saflaştırılmış proteinin önemli miktarlarda gerektirir. Mikro Termoforosis (MST) bir mikroskobik sıcaklık degrade moleküllerin yönelik hareketi algılayan hızla gelişen bir yöntemdir. Sıcaklık eğimi boyunca hareket göreli bir değişiklik biyomoleküllerin sonucu hidrasyon kabuk herhangi bir değişiklik. 7 MST bağlanma afiniteleri belirlemek için kullanılan ve bir hedef proteine ​​floresan ile etiketlenmiş proteinleri, ya da floresan ligandlarına ligand incelemek için uygulanmıştır. 8, 9 MST bir yüzeye immobilizasyon ihtiyacı (immobilizasyon-ücretsiz teknolojisi) doğrudan çözüm etkileşimleri ölçümü sağlar. Değişikliğin boyutunu önemli ölçüde sistemden sisteme farklı olmasına rağmen, pratik olarak herhangi bir bağlayıcı, MST sinyali bir değişiklik eşlik eder. MST tarafından molekülün hareket tespiti için, floresan gerekirnt. Yöntemin bu büyük sınırlama bir avantaj dönüştürülebilir. Bir protein herhangi bir sistem, bir GFP füzyon olarak ifade edilirse, bu tek flüoresan molekül olacak ve böylece hücre lizatı veya hücre içermeyen ekspresyon sisteminden izole edilmeden incelenebilir. Az eserler ile bağlama koşulları için izin hücre lizatları üretimi önemli bir sorundur. Burada birçok Çözünür ve zar proteinleri için kullanılabilir hücre lizatı hazırlanması ve MST deney bir protokol açıklamaktadır. STAT proteinleri hücre dışı sinyallere yanıt olarak tirosin fosforilasyon ile aktif hale sitoplazmik transkripsiyon faktörleri gizli olan ve bağışıklık, hematopoiez, iltihaplanma, ve gelişme. Memelilerde 10 de dahil olmak üzere birçok biyolojik proseslerde yer alan, STAT etti STAT 1, 2, 3, 4 oluşmaktadır , 5A, 5B ve 6. Bütün aktif STAT aynı DNA sekansına bağlamak için bilinen, bu nedenle GAZ motifi olarak adlandırılan, IFN-gama sekansı aktifleştirildi. Bununla birlikte, transcriFarklı STAT bir ptional etkileri çok farklıdır. 11. birçok patolojik süreçler ve 17.000 yayınlar üzerinde verimli yoğun çalışmalar karışmakla rağmen, farklı DNA dizileri ile STAT etkileşimleri K D belirlenmemiştir. GAZ motifinin varyantlarına farklı durum arasında sadece göreli afinite karakterize edilmiştir. Protein ekspresyonu ve saflaştırılması, 11 güçlükler istatistik &#39;DNA bağlama seçicilik karakterizasyonu en önemli engeller vardır. Çalışmaların çoğunluğu Tyr-fosforile transkripsiyon faktörü için eş anlamlı hale geldi &quot;aktif&quot; STAT, transkripsiyon düzenlenmesi olmayan fosforile STAT (U-STAT) rolü rolü odaklanmış olmasına rağmen hızla ortaya çıkmaktadır. 12. Ancak, bu mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır, ve U-STAT aslında DNA bağlamak ya da diğer transkripsiyon faktörleri ile etkileşim yoluyla hareket kesin değildi vardır. Yakın zamanda U-STAT3 DNA istif bağlamak göstermiştirdaha yüksek afinite ile GAZ motifleri farklı ces. 13 bulgu bu önemli proteinin biyolojik fonksiyonları anlayışımızı için önemli etkileri vardır. Biz GAZ için STAT3 göreceli yakınlık belirlemek için mikro Termoforosis uygulanan ve AT-zengin oligonükleotid S +100 (Şekil 4) var. Hemen hemen aynı protokol farklı bir STAT3 ligandı bir lipopeptid inhibitör bağlanma için Kd tayini için kullanılmıştır. 14, negatif bir kontrol olarak kullanılmıştır ilgili bir transkripsiyon faktörü, GFP STAT1 bağlanma Resim böylece etkileşim seçiciliği teyit saptanabilir. 14

<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 <td>Name of the Reagent/material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RIPA buffer</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>20-188</td>
 <td>Other manufacturer's buffers work as well</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protease inhibitors cocktail</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P2714</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>G008</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115 Capillary Tray</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>T001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115 Standard Treated Capillaries</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>K002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NT Control software</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>2.0.2.29</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NT Analysis software</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>1.4.27</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Table-top refrigerated centrifuge</td>
 <td>Eppendorf </td>
 <td>5417R</td>
 <td>Other microtube refrigerated centrifuges</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protein LoBind Tube 0.5 ml</td>
 <td>Eppendorf </td>
 <td>22431064</td>
 <td></td>
 </tr>
	 </tbody>
 </table>

protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis

Protein etkileşimleri kantitatif karakterizasyonu özellikle yaşam bilimleri, ilaç keşfi hemen her alanında gereklidir. K D tayin mevcut yöntemlerin çoğu zaman alıcı ve pahalı olabilir nesil olan ilgi protein, saflaştırılmış erişim gerektirir. Bu hücre lizatlarından hedef proteinin arıtılmadan mikro Termoforosis (MST) ile bağlanma afinitesinin belirlenmesine olanak sağlayan bir protokol geliştirmiştir. Yöntem, denatüre edici olmayan koşullar altında GFP kaynaşık protein ve hücre lisisinin aşırı içerir. STAT3-GFP yönteminin uygulanması geçici olarak ilk kez farklı dizileri ile oligonükleotidler için en iyi incelenmiş olan transkripsiyon faktörünün afinitesini belirlemek için izin HEK293 hücrelerinde ifade edilmiştir. Protokol basittir ve küçük moleküller, peptidler, DNA, RNA ile protein etkileşimleri çalışmak için uygulama çeşitli olabilir, ve proteins.

Oligonükleotidler için bağlayıcı olmayan fosforile STAT3 protein afinitesi ölçülmesi. STAT3-GFP eksprese eden HEK293 hücreleri DNA bağlama deneyi için floresan etiketli STAT3 kaynağı olarak kullanılmıştır. Hücre lizatları RIPA tamponu (20x10 6 hücre / ml) kullanılarak hazırlandı. Bağlama çalışmaları için, lizatları bağlanma reaksiyonu (20 nM) &#39;de floresan protein en uygun düzeyde sağlamak için MST DNA bağlayıcı tampon maddesi ...

Watch this Scientific Journal Video about Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis at JoVE.com

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Mikro Termoforosis (MST) yaygın olarak hücre lizatlarından hedef proteinin arıtılmadan bağlanma afinitesinin belirlenmesinde kullanılabilir. Protokol, GFP-kaynaşık proteini, denatüre edici olmayan koşullar hücre parçalama ve ligand arasında değişen konsantrasyonlarda varlığında MST sinyalinin tespiti arasında aşırı içerir.

Mikro Termoforosis tarafından Bağlama Affinity belirlenmesi Protein Saflaştırma-ücretsiz Yöntemi

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

protein-purification-free-method-binding-affinity-determination

Research

JoVE Journal

Biology

30.3K Görüntüleme.  National Cancer Institute. Mikro Termoforosis (MST) yaygın olarak hücre lizatlarından hedef proteinin arıtılmadan bağlanma afinitesinin belirlenmesinde kullanılabilir. Protokol, GFP-kaynaşık proteini, denatüre edici olmayan koşullar hücre parçalama ve ligand arasında değişen konsantrasyonlarda varlığında MST sinyalinin tespiti arasında aşırı içerir.

Video: Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often used for protein analysis. The Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spectrophotometer solves this issue with an innovative sample retention system that holds microvolume samples between two measurement surfaces using the surface tension properties of liquids, enabling the quantification of samples in volumes as low as 0.5-2 &mu;L. The elimination of cuvettes or capillaries allows real time changes in path length, which reduces the measurement time while greatly increasing the dynamic range of protein concentrations that can be measured. The need for dilutions is also eliminated, and preparations for sample quantification are relatively easy as the measurement surfaces can be simply wiped with laboratory wipe. This video article presents modifications to traditional protein concentration determination methods for quantification of microvolume amounts of protein using A280 absorbance readings or the BCA colorimetric assay.

Microvolume samples are quantified by a spectrophotometer system that uses natural surface tension to retain samples without the use of cuvettes or capillaries. The dynamic range of protein concentrations and speed by which they can be measured are greatly increased with this method.

NanoDrop 2000c Spektrofotometre kullanılarak Microvolume Protein Konsantrasyonu Tayini

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

Biyoloji

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), a plant cysteine protease, by real-time label-free analysis using Biacore X100. Several cystatin B variants with point mutations in areas of interaction with papain, are produced. For each cystatin B variant we determine its specific binding concentration using calibration-free concentration analysis (CFCA) and compare the values obtained with total protein concentration as determined by A280. After that, the kinetics of each cystatin B variant binding to papain is measured using single-cycle kinetics (SCK). We show that one of the four cystatin B variants we examine is only partially active for binding. This partial activity, revealed by CFCA, translates to a significant difference in the association rate constant (ka) and affinity (KD), compared to the values calculated using total protein concentration. Using CFCA in combination with kinetic analysis in a structure-function study contributes to obtaining reliable results, and helps to make the right interpretation of the interaction mechanism.

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

We apply label-free protein interaction analysis using Biacore X100 for structure-function analysis of the binding of several cystatin B mutants to papain through kinetic characterization. Calibration-free concentration analysis (CFCA) measures the concentration of protein with retained binding activity without the need for a standard curve. We show that confirmation of concentrations using CFCA increases the reliability of the kinetic analysis and that kinetic constants can reliably be determined even if the activity of a recombinant protein is reduced.

Kinetik ve Yapı-fonksiyon Analiz Affinity belirlenmesi Doğru Protein Konsantrasyonu Önemi

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude stringent methods for the isolation and identification of protein networks around a protein of interest. The use of chemical crosslinkers allows the selective stabilization of labile interactions, thus bypassing biochemical limitations for purification. Here we present a protocol amenable for cells in culture that uses a homobifunctional crosslinker with a spacer arm of 12 &Aring;, dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP is cleaved by reduction of a disulphide bond present in the molecule. Cross-linking combined with immunoaffinity chromatography of proteins of interest with magnetic beads allows the isolation of protein complexes that otherwise would not withstand purification. This protocol is compatible with regular western blot techniques and it can be scaled up for protein identification by mass spectrometry1.
Stephanie A. Zlatic and Pearl V. Ryder contributed equally to this work.

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The cell permeable crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizes transient and labile interactions in vivo, which allows their isolation using stringent protein complex purification techniques. Here we present a technique for crosslinking cells grown in culture followed by isolation of protein complexes by immunoprecipitation.

Dayanıksız Multi-protein Kompleksleri izolasyonu In vivo Kontrollü Hücresel Çapraz Bağlama ve immuno-manyetik Afinite Kromatografisi

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ribonucleoprotein complexes (miRNPs) that are often expressed in a cell-type dependently. To understand how the interplay of these RNA-binding factors affects the regulation of individual transcripts, high resolution maps of in vivo protein-RNA interactions are necessary1.
A combination of genetic, biochemical and computational approaches are typically applied to identify RNA-RBP or RNA-RNP interactions. Microarray profiling of RNAs associated with immunopurified RBPs (RIP-Chip)2 defines targets at a transcriptome level, but its application is limited to the characterization of kinetically stable interactions and only in rare cases3,4 allows to identify the RBP recognition element (RRE) within the long target RNA. More direct RBP target site information is obtained by combining in vivo UV crosslinking5,6 with immunoprecipitation7-9 followed by the isolation of crosslinked RNA segments and cDNA sequencing (CLIP)10. CLIP was used to identify targets of a number of RBPs11-17. However, CLIP is limited by the low efficiency of UV 254 nm RNA-protein crosslinking, and the location of the crosslink is not readily identifiable within the sequenced crosslinked fragments, making it difficult to separate UV-crosslinked target RNA segments from background non-crosslinked RNA fragments also present in the sample.
We developed a powerful cell-based crosslinking approach to determine at high resolution and transcriptome-wide the binding sites of cellular RBPs and miRNPs that we term PAR-CliP (Photoactivatable-Ribonucleoside-Enhanced Crosslinking and Immunoprecipitation) (see Fig. 1A for an outline of the method). The method relies on the incorporation of photoreactive ribonucleoside analogs, such as 4-thiouridine (4-SU) and 6-thioguanosine (6-SG) into nascent RNA transcripts by living cells. Irradiation of the cells by UV light of 365 nm induces efficient crosslinking of photoreactive nucleoside-labeled cellular RNAs to interacting RBPs. Immunoprecipitation of the RBP of interest is followed by isolation of the crosslinked and coimmunoprecipitated RNA. The isolated RNA is converted into a cDNA library and deep sequenced using Solexa technology. One characteristic feature of cDNA libraries prepared by PAR-CliP is that the precise position of crosslinking can be identified by mutations residing in the sequenced cDNA. When using 4-SU, crosslinked sequences thymidine to cytidine transition, whereas using 6-SG results in guanosine to adenosine mutations. The presence of the mutations in crosslinked sequences makes it possible to separate them from the background of sequences derived from abundant cellular RNAs.
Application of the method to a number of diverse RNA binding proteins was reported in Hafner et al.18

RNA transcripts are subject to extensive posttranscriptional regulation that is mediated by a multitude of trans-acting RNA-binding proteins (RBPs). Here we present a generalizable method to identify precisely and on a transcriptome-wide scale the RNA binding sites of RBPs.

PAR-Klip - RNA Cilt Proteinler Transcriptome geniş Cilt Siteleri Belirlemek Amacıyla Bir Yöntem

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification procedures. As an alternative, lipids can be coated on flat surfaces as used for lipid ELISA and Plasmon resonance spectroscopy. However, surface coating lipids do not form microdomain structures, which may be important for the lipid binding properties. Further, these methods do not allow for the purification of larger amounts of proteins binding to their target lipids.
 To overcome these limitations of testing lipid protein interaction and to purify lipid binding proteins we developed a novel method termed lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic-activated cell sorting (LIMACS). In this method, lipid vesicles are prepared with the target lipid and phosphatidylserine as the anchor lipid for Annexin V MACS. Phosphatidylserine is a ubiquitous cell membrane phospholipid that shows high affinity to the protein Annexin V. Using magnetic beads conjugated to Annexin V the phosphatidylserine-containing lipid vesicles will bind to the magnetic beads. When the lipid vesicles are incubated with a cell lysate the protein binding to the target lipid will also be bound to the beads and can be co-purified using MACS. This method can also be used to test if recombinant proteins reconstitute a protein complex binding to the target lipid. 
 We have used this method to show the interaction of atypical PKC (aPKC) with the sphingolipid ceramide and to co-purify prostate apoptosis response 4 (PAR-4), a protein binding to ceramide-associated aPKC. We have also used this method for the reconstitution of a ceramide-associated complex of recombinant aPKC with the cell polarity-related proteins Par6 and Cdc42. Since lipid vesicles can be prepared with a variety of sphingo- or phospholipids, LIMACS offers a versatile test for lipid-protein interaction in a lipid environment that resembles closely that of the cell membrane. Additional lipid protein complexes can be identified using proteomics analysis of lipid binding protein co-purified with the lipid vesicles.

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

To test the interaction of a protein with its target lipid we used MACS and Annexin V-conjugated magnetic beads and lipid vesicles synthesized from the target lipid and Annexin V-binding phosphatidylserine. Proteins bound to the target lipid are co-purified and analyzed after elution from the beads.

Manyetik Aktif Hücre Ayırma (LIMACS) kullanarak Lipid veziküllü aracılı Afinite Kromatografisi: Protein-lipit Etkileşim Analiz Roman Yöntemi

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a demand for general methods that do not require target protein specific optimization1 . To achieve this, purification tags that genetically can be fused to the gene of interest are commonly used2 . The most widely used affinity handle is the hexa-histidine tag, which is suitable for purification under both native and denaturing conditions3 . The metabolic burden for producing the tag is low, but it does not provide as high specificity as competing affinity chromatography based strategies1,2.
Here, a bispecific purification tag with two different binding sites on a 46 amino acid, small protein domain has been developed. The albumin-binding domain is derived from Streptococcal protein G and has a strong inherent affinity to human serum albumin (HSA). Eleven surface-exposed amino acids, not involved in albumin-binding4 , were genetically randomized to produce a combinatorial library. The protein library with the novel randomly arranged binding surface (Figure 1) was expressed on phage particles to facilitate selection of binders by phage display technology. Through several rounds of biopanning against a dimeric Z-domain derived from Staphylococcal protein A5, a small, bispecific molecule with affinity for both HSA and the novel target was identified6 .
The novel protein domain, referred to as ABDz1, was evaluated as a purification tag for a selection of target proteins with different molecular weight, solubility and isoelectric point. Three target proteins were expressed in Escherishia coli with the novel tag fused to their N-termini and thereafter affinity purified. Initial purification on either a column with immobilized HSA or Z-domain resulted in relatively pure products. Two-step affinity purification with the bispecific tag resulted in substantial improvement of protein purity. Chromatographic media with the Z-domain immobilized, for example MabSelect SuRe, are readily available for purification of antibodies and HSA can easily be chemically coupled to media to provide the second matrix.
This method is especially advantageous when there is a high demand on purity of the recovered target protein. The bifunctionality of the tag allows two different chromatographic steps to be used while the metabolic burden on the expression host is limited due to the small size of the tag. It provides a competitive alternative to so called combinatorial tagging where multiple tags are used in combination1,7.

A novel and highly efficient two-step affinity chromatography protocol has been developed and is described in detail. The method is based on a small purification tag with two inherent affinities and is applicable to a wide range of target proteins with different properties.

Küçük Bispecific Affinity Tag Kolaylaştırılmış Ortogonal Protein Saflaştırma

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

Tandem Affinity Arıtma kullanarak Protein etkileşim Ortaklar belirlenmesi

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs. Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and specific carrier of vitamin A in the blood. Here we describe an optimized technique to produce and purify holo-RBP and two real-time monitoring techniques to study the transport of vitamin A by the high-affinity RBP receptor STRA6. The first technique makes it possible to produce a large quantity of high quality holo-RBP (100%-loaded with retinol) for vitamin A transport assays. High quality RBP is essential for functional assays because misfolded RBP releases vitamin A readily and bacterial contamination in RBP preparation can cause artifacts. Real-time monitoring techniques like electrophysiology have made critical contributions to the studies of membrane transport. The RBP receptor-mediated retinol transport has not been analyzed in real time until recently. The second technique described here is the real-time analysis of STRA6-catalyzed retinol release or loading. The third technique is real-time analysis of STRA6-catalyzed retinol transport from holo-RBP to cellular retinol binding protein I (CRBP-I). These techniques provide high sensitivity and resolution in revealing RBP receptor's vitamin A uptake mechanism.

Here we describe an optimized technique to produce high-quality vitamin A/RBP complex and two real-time monitoring techniques to study vitamin A transport by STRA6, the RBP receptor.

Plazma Retinol Bağlayıcı Protein Membran Reseptör tarafından Retinol Ulaştırma Gerçek zamanlı Analizleri

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Using recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules is an efficient means to discover interactions. The technique has largely been used to discover protein-protein interactions but the bait molecule to be challenged need not be restricted to proteins. The protocol presented here has been optimized to allow a modest number of baits to be screened in replicates to maximize the identification of independent clones presenting the same protein. This permits greater confidence that interacting proteins identified are legitimate interactors of the bait molecule. Monitoring the phage titer after each affinity selection round provides information on how the affinity selection is progressing as well as on the efficacy of negative controls. One means of titering the phage, and how and what to prepare in advance to allow this process to progress as efficiently as possible, is presented. Attributes of amplicons retrieved following isolation of independent plaque are highlighted that can be used to ascertain how well the affinity selection has progressed. Trouble shooting techniques to minimize false positives or to bypass persistently recovered phage are explained. Means of reducing viral contamination flare up are discussed.

Phage display is a powerful technique to capture proteins or protein moieties that interact with an immobilized molecule of interest. Once a decision of the type of phage cDNA library to create and screen has been made, the protocol described here permits efficient affinity selection leading to identification of interactors.

Rekombinant Protein Yemler Kullanarak Phage Ekran ve Affinity seçimi için Protokol

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay

Biomarkers are becoming increasingly more important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing myocardial infarction (MI) is largely driven by detecting cardiac-specific proteins in patients' serum or plasma as an indicator of myocardial injury. Having recently shown that cardiac myosin binding protein-C (cMyBP-C) is detectable in the serum after MI, we have proposed it as a potential biomarker for MI. Biomarkers are typically detected by traditional sandwich enzyme-linked immunosorbent assays. However, this technique requires a large sample volume, has a small dynamic range, and can measure only one protein at a time.	
Here we show a multiplex immunoassay in which three cardiac proteins can be measured simultaneously with high sensitivity. Measuring cMyBP-C in uniplex or together with creatine kinase MB and cardiac troponin I showed comparable sensitivity. This technique uses the Meso Scale Discovery (MSD) method of multiplexing in a 96-well plate combined with electrochemiluminescence for detection. While only small sample volumes are required, high sensitivity and a large dynamic range are achieved. Using this technique, we measured cMyBP-C, creatine kinase MB, and cardiac troponin I levels in serum samples from 16 subjects with MI and compared the results with 16 control subjects. We were able to detect all three markers in these samples and found all three biomarkers to be increased after MI. This technique is, therefore, suitable for the sensitive detection of cardiac biomarkers in serum samples.

Measuring biomarkers in complex biological samples is increasingly guiding clinical decision-making. We describe a highly sensitive method to simultaneously measure cardiac myosin binding protein-C, creatine kinase MB, and cardiac troponin I in serum samples from subjects with myocardial infarction and healthy control subjects.

Elektrokemiluminesan immunoassay Serum Kardiyak Miyozin Bağlayıcı Protein-C belirlenmesi için hassas ve özel miktar tayini yöntemi

Biomarkers are becoming increasingly more  important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing  myocardial infarction (MI) is ...