Bu araştırma NIH / NIAAA (AA11852 ve AA007471) hibe tarafından desteklenmiştir.

1. Stereotaksik Cerrahi <ol><li> Tüm prosedürler Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için NIH Kılavuzu izleyin ve Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır. </li><li> Bir stereotaksik aparat kullanarak, Long-Evans izofluran ile anestezi fareler, faiz beyin bölgesi üzerinde bir 21-gauge kanül (daha sonra microdilaysis prob yerleştirme için) (Plastik biri, Roanoke, VA) ile implante edilir ve bir ip iyi ele cıvata kafa sahne (mikrodiyaliz cihazları desteklemek için kullanılan) içine inşa edilmiştir. </li><li> Ameliyat sırasında ve sonrasında dikkatle sıçanlarda izleyin. Tüm hayvanlar ameliyat sonrası bakım ve iyileşme en az bir hafta alır ve aşağıdaki işlemleri başlamadan önce sağlıklı olduğundan emin olun. Stereotaksik cerrahi yöntemin Jüpiter Video kullanılabilir. 1 </li></ol> 2. Edimsel Eğitim <ol><li> Ameliyat sonrası iyileşme bir hafta sonra, hayvanların% 10 sakkaroz eriyik için kolu basın için eğitilmişlerdirn lickometer, geri çekilebilir kolu, ve sipper tüp (daha önce Howard ve ark., 2009&#39;da tarif edildiği gibi) ile donatılmış bir Med Associates operant bölmesinin (MedAssociates, Inc, Vermont, ABD). MedAssociates 2 Software tüm tasarlamak için kullanılmıştır edimsel programları (MedAssociates, Inc, Vermont, USA). </li><li> Bir kere, sakaroz için yanıt etanol kademeli birden içme oturumları çözeltisine eklenir sırasında uygun bir eğitim programı üzerinde sıçanlar başlamak için eğitilmiştir. </li><li> Örneğin, bizim laboratuvar anda etanol% 10 etanol /% 10 sakaroz içme çözeltisi sonuçlanan çözüm içine soluk bir 8 günlük bir eğitim programı kullanmaktadır. Kontrol hayvanlarına sadece% 10 sakkaroz veya içme çözüm alırsınız. Kullanılmak için operant programı belli tür yaygın olarak değişebilir, fakat mikro-diyaliz numune için aşağıda tarif edilen genel prosedürler yine de gerçekleştirilebilir. 3 </li></ol> 3. Ön mikrodiyaliz Prosedürleri: Bağ <ol&gt; <li> Geçen eğitim oturumu (bizim örneğimizde bu 7. eğitim oturumu) için ikinci bir gece önce, hayvanların baş sahnede tether cıvata takılır tether bahar alışmışsındır. Bahar hayvan kafesi içinde serbestçe hareket böylece bir halka standı ve kelepçeler ile kafesi yanında askıya mikrodiyaliz döner ve karşı denge kol, bağlanır. Gergin hayvanlar tethering onları set-up alıştırmak için, ad libitum gıda ve su ile evlerinde kafeste, edimsel odasında gece geçirmek. </li><li> Ertesi gün, sıçan davranışsal görevleri yerine getirirken halata hissi hayvan alıştırmak için, bir yerde ip ile edimsel programını tamamlar. Edimsel odasının tavanının ortasına yukarıdaki halata ve döner askıya izin üstüne yakın edimsel odasının duvarına bağlanıyor aparatı monte edin. Tüm bu ses zayıflatma odasına yerleştirilir. After oturumu microdiaysis prob yerleştirilmesi beklemek edimsel odasında onun ev kafesine sıçan dönün. </li></ol> 4. Ön mikrodiyaliz Prosedürleri: sıçan gün için davranışsal eğitim tamamlandıktan sonra mikrodiyaliz prob, mikrodiyaliz deneyinin bir gün önce eklenir <ol><li> Gergin ise, izofluran ile sıçan uyutmak ve kılavuz kanül gelen obturator kaldırmak mikrodiyaliz deneyden önce gün, sıçan sonra edimsel oturumu tamamlandı. Yavaşça (5 ~ üzerinde dak) faiz beyin bölgeye kranial kılavuz kanül aracılığıyla yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) ile perfüze bir mikrodiyaliz prob, takın. Biz laboratuvar inşa probları ve Doyon ve ark., 2003 ve Pettit ve Adalet, 1991&#39;den sonra modellenmiş mikrodiyaliz yordamları kullanın. 3, 4 </li><li> Hayvan Yukarıdaki prob giriş ve çıkış hatları askıya önce tartışılan tethering aparatı kullanın. </li><li> P çevirinrobe debisi 0.2 ul / dak aşağı. Bir kez daha, sıçan edimsel odasında gece geçirir. </li></ol> 5. Mikrodivaliz Prosedürler: numuneleri ayrılmış iştahlı ve consummatory evreleri ile öz-yönetim oturumu sırasında <ol><li> Deney başlamadan en az 2 saat önce, çalışma akış oranına prob kadar açmak. Biz 1.0 veya 2.0 ul / beyin bölgesine bağlı olarak min kullanabilirsiniz. Sonda akış oranı tutarlı olduğunu kontrol edin, ve zaman içinde hacim ölçmek için bir Hamilton şırıngası kullanılarak grubu akış oranının en az% 90 olmalıdır. </li><li> Diyaliz örnekleri (5 veya 7 dakika) sırasında ve edimsel seanstan sonra, önce alınır. Numune aralığı beyin bölgesinde bağlıdır, nörotransmiter analiz edilen, analit konsantrasyonunun ve analiz için kullanılacak analitik kimya ekipman duyarlılık diyaliz. Davranışsal aşamaları aşağıdaki gibidir: <ol><li> Baseline: Denemenin başında,hayvanın evi kafesi (4 örnek) diyaliz örnekleri toplamak. </li><li> Transferi: evde kafes temel örnekleri toplandıktan sonra, edimsel odasına sıçan aktarın. Tethered sıçan Transferi aşırı dikkat mikrodiyaliz akışkan transfer hattı karışık hale gelir ve sıçan sakin kalmasını etmediğinden emin olmak için gereklidir. Eğer ilk beklemek örnek taban / transferi örneği değiştirmek gibi hemen transferinden sonra, edimsel programını etkinleştirin. </li><li> Bekle: sıçan odası (beyin bölgeye göre 3-4 numune) içine uzatmak için kolu bekler gibi örnekleri toplamak için devam edin. </li><li> Alkol: kolu sunulmuştur ve basıldıktan sonra, içme çözeltisi (% 10 sucrose/10% etanol veya% 10 sukroz), bir şişe yaklaşık 20 dakika (3-4 numunelerde) sıçan için uygun hale getirilir. </li><li> Post-içecek: içecek süresinden sonra, şişe geri çeker, ama fare kalır in yaklaşık 20 dakika (3-4 numune) için edimsel odası. </li></ol></li></ol> 6. Mikrodivaliz Prosedürler: etanol analiz için numune hazırlanması mikrodiyaliz <ol><li> , Etanol konsantrasyonu açısından değerlendirilmiştir sonra hayvanlara daha önce iki numune etil alkol çözeltisi, ve tüm örnekler kendi kendilerine uygulamaktadır. Pipet ya da 2 ml&#39;lik cam şişe içine ilgi örnek bir 1 ya da 2 ul alikot. Sonra bir hava geçirmez septum (9 mm Kırmızı Poly Vida Kapağı, PTFE / Sil Bölme, Agilent Technologies) ile flakon mühür. Etanol analiz kısım (1 ya da 2 ul) ve hacim toplam örnek hacminin, ve herhangi bir ek analizler için gerekli numune hacmine bağlıdır. </li><li> Örnekleri daha sonra nörokimyasal analiz için kullanılacak ise, uygun etanol tayini için tablet pipetleme sonra numune saklamak. </li><li> Örneğin, bizim laboratuvar dopamin için örnekleri inceliyor. Bunu gerçekleştirmek için, deney sırasında kuru buz örnekleri yerve daha sonra, deney sonra -80 ° C de örnekleri saklayın. Biz, 2.0 ul / nucleus accumbens yerleştirilen problar için dak &#39;lık bir akış oranı ile bir araya toplanan numune 5 dakika etanol analiz için 2 ul hacimde kullanılır. Bu elektrokimyasal algılama ile yüksek performanslı sıvı kromatografisi ile dopamin sonra analiz için kalan en az 7 ul sağlar. </li><li> Çok daha düşük konsantrasyonlarda hücre dışı dopamin sahip prefrontal korteks, alınan numuneler için, 1.0 ul / dak &#39;lık bir akış oranı kullanılarak bir min 7-numune alınmıştır etanol analizi için 1 ul alikot kullanır. </li></ol> 7. Post-mikrodiyaliz prosedürleri <ol><li> Mikrodiyaliz Deneyin tamamlanmasından sonra, sıçan uyutmak ve prob çıkarın. Hayvan hemen ötenazi değilse, tıkayıcı değiştirin. Deneme üç gün içinde beyin toplayın. Aksi takdirde, sonda yolu görüntüleme mümkün olmayabilir. </li><li> Beyin i kaldırılması gerekironaylanmış hayvan kullanımını protokolleri n uygun. Biz tuzlu tuzlu ve sonra formalin ile kardiyak perfüzyon ardından sodyum pentobarbital (150 mg / kg, ip) dozda kullanın. Kesit önce en az 12 saat boyunca bir formalin-tuzlu su çözeltisine daldırın beyin. </li><li> Koronal bölümünde 100 mikron dilimler halinde beyin. Cresyl mor dilimleri Leke ve doğru prob yerleştirme için inceleyin. 5, 6 </li></ol> 8. Etanol konsantrasyonu için numune analizi <ol><li> Toplanan örnekler yanı sıra harici standartlar (0,3125-20 mM etanol) alev iyonizasyon algılama sistemi ile gaz kromatografisi üzerinde çalıştırılır. Bu sistem, bir alev iyonizasyon detektörü ile bir Varian CP 3800 gaz kromatografı oluşur, bir Bruker (Varian) 8400 tepe boşluğunun, otomatik örnekleyici ° C, ve bir HP Innowax kılcal sütun (30 mx 0.53 mm x 1.0 um kalınlığındaki film,), 50 ile ısıtıldı mobil faz olarak helyum. </li><li> Kromatogramlar kromatografl ile birlikte kaydedilir ve analiz edilirBöyle burada özellikle ele alınacak Varian Yıldız Kromatografi Workstation yazılımı olarak aphy yazılımı. </li><li> Etanol analizi için sistem hazırlamak için, bir çevrimli su banyosu kullanılarak Otosampler plaka ısı ve iki ek gaz tankları (hava ve hidrojen, helyum daima balmumu sütun korumak için çalışan sol) açın. </li><li> Septum, basınç gaz tankı, hem de Eğer fiber septum ve bunlar, uygun olduğunda (lif-500 enjeksiyonlar değiştirilebilir, böylece kullanılmış olan kez sayısı sayısı tutmak, böylece olcam numune sayısını kaydedin -100 delikler). </li><li> Örnekleri (Tablo 2 program parametreleri) çalıştırmak için sistemi hazırlar start-up yöntemi başlatın. O &quot;hazır&quot; olduğunu bildirmek için sistem için bekleyin. </li><li> 20 dakika herhangi o emmiş kirlenmektedir desorb için yüksek bir sıcaklığa tabi tutarak analiz için numune elyaf hazırlar, &quot;yanma&quot; başlatma hareketsiz iken. </li><li> Standartlarına göre yapılırKimyasal bir çeker ocak içinde bir balon jojeye ile 100 mL &#39;lik bir son hacim su ile% 95 etanol ve 238 ul seyreltmek. Bu, bir 40 mM etanol çözeltisi oluşturur. Biz 20, 10 oluşturmak için bir 1:1 seri seyreltme, 5, 2.5, 1.25, 0.625, 0.3125 mM standartları kullanıyor. Standart her bir konsantrasyonu için, diyaliz örnekler alınacak aynı birimde tablet kullanılır. 2 ml bir cam şişe içine tablet pipet, ve daha sonra bir hava geçirmez septum ile şişe sızdırmaz. </li><li> Tüm sıvı kısım buharlaştırılır kadar tüm örnekler etanol otomatik numune alıcı içinde ısıtılır. Biz yaklaşık 30 dakika bizim örnekleri ısıtmak. </li><li> Bu bölümde bizim gaz kromatografisi ile kullandığınız Yıldız Workstation yazılımı anlatılmaktadır. Başka yazılım kullanılabilir, ancak aşağıda açıklaması uygulanabilir olmayabilir. </li><li> Örnekleri çalıştırmak için, örnek hangi Otosampler yuvasında olduğu belirterek örnek bir liste oluşturmak ve örnek kaç kez delinmiş olmalıdır. Seçtiğiniz kat rota veri dosyaları emin oluner. Ardından, örnekleri için tercih edilen yöntemi seçin ve çalışma başlar. Biz Tablo 2&#39;de belirtildiği çalışan parametrelerini kullanın. </li><li> Bizim diyalizat etanol programı 3 dakika boyunca örnek emer ve 1 dakika boyunca, balmumu sütuna besleyen helyum akışı içine desorbs. Ancak, programların belirli ihtiyaçlarınızı karşılamak için yazılmış olabilir. </li><li> Sonra balmumu sütunda ayrı ve örnek bileşenleri alev iyonizasyon dedektörü ile nereye örneğin etanol, yanma ve serbest iyonlar gibi bileşikler içeren karbon. Dedektörün anot gelen voltaj ile dönüştürülmüş ve (Şekil 1) aşağıda gösterildiği gibi kromatogramları ile sonuçlanan kayıtlı olduğu, bir akım yaratmak için artan bir katot elektron akım elde edilir. Voltaj değişim time.7 karşısında detektör içinden geçen karbon miktarı ile orantılıdır </li><li> Sistem numune çalışması bittikten sonra, her tepe entegrasyonu kontrol etmek gerekir. Yıldız Workstation yazılımı için,araç çubuğunda mavi tepe simgesine tıklayın. Her pikin renk üzerine tıklayın ve taban ayarlamak için okları sürükleyin. Piklerinin sonraki grup üzerine geçmeden önce her pik yeniden entegre. Pik analiz yazılımı herhangi bir genel kromatografisi yazılımı olabilir. </li><li> Yıldız Workstation yazılımı için, araç çubuğunda toplu rapor simgesine tıklayın. Sizin belirttiğiniz klasördeki örnek raporları yazdırmak için toplu rapora her örnek sürükleyin. Raporlama yazılımı en yaygın kromatografisi yazılım sistemleri ile özelleştirilebilir. </li><li> Raporlar seçtiğiniz bilgileri göstermek için programlanmış olabilir. Şu anda pik yüksekliği kullanabilirsiniz, ancak raporları da pik alanı kullanmak için programlanmış olabilir. </li><li> Sistemi kapatmak için kapatma yöntemi (parametreler Tablo 2&#39;de belirtildiği gibi) başlatmak, su banyosu kapatın ve kolon fırını sıcaklığı 30 ° C&#39;ye ulaştığında, hidrojen ve hava tankları kapatın </li></ol> 9. Etanol Veri <ol><li> Pik yüksekliği olarak çizilirbilinen her dış standart etanol konsantrasyonunun bir fonksiyonu (Şekil 2A). Her diyalizat örneği tarafından verilen pik yüksekliği gelen etanol konsantrasyonu hesaplamak için bu noktaları tarafından verilen lineer işlevini kullanın. </li><li> Saat boyunca diyaliz etanol konsantrasyonu grafiğini çizerek, bizim davranış oturum sırasında ilgi beyin bölgesi içinde etanol seviyesinin kalıp görebilir. (Şekil 2B) aşağıda gösterilen örnek veriler, kendi kendine uygulama oturum sırasında zaman karşısında diyaliz etanol konsantrasyonu olarak gösterilir. </li></ol> 10. Genel Bakım: Fiber her 500 delikler ve septum değiştirilmesi gerektiğini her 100 delikler Lif değiştirmek için <ol><li> Gaz kromatografisi tuş takımı Menü düğmesine basın, seçim 8400, enter tuşuna basın; değişim şırınga seçin, Enter tuşuna basın. Otosampler izin kendini konumlandırmak olacaktır lif (SPME Fiber Meclisi, 75 mikron Carboxen-PDMS, Supelco Analitik, Bellefonte, PA) kaldırılacak. </li><li> Fiber kaplama kapağını açın. Kontra somunu, ve elyaf montaj kaldırılması için izin vermek için hareket mandalı. Lif takımını çıkarın. Sökün sonra montaj fiber tutar ve somun lif sökün. </li><li> Yenisi ile eski lif değiştirin ve fiber montaj yenilemek. , Otomatik örnekleyici derleme değiştirin tekrar kilitlemeli ve yerine montajı vidalama. İşiniz bittiğinde, tuş takımındaki &quot;değiştirmek done&quot; tuşuna basın ve otomatik örnekleyici kullanımı için kendisini hazır olacak. </li></ol> Septum değiştirmek için <ol><li> Birincisi, sökün sonra septum (Hi-Temp 0,450 Dia. Jenerik Şartlanmış Bölme, Varian) kapsayan kapağı ve eski septum çıkarın. Uydurma aşağı Seat yeni septum. Kapağı tekrar vidalayın ve anahtarı ile sıkın. Lif septumun delinmiş ilk kez kırmak olmaz, böylece Ardından, delinme septumun bir enjeksiyon iğnesi kullanın. </li></ol&gt; 11. Temsilcisi Sonuçlar Şekil 1, etanol standartların konsantrasyonu için üç ve etanol kendi kendine uygulama oturum sonunda bir araya toplanan diyalizat sıçan numune için örnek kromatogramları göstermektedir. Etanol zirveleri, nispeten simetrik olması tutarlı tutma süreleri var ve gürültü oranı&gt; 10 için bir sinyal olmalıdır. Bu kriterlere uyulmaması sistem bakım gerektirir anlamına gelir. Kalite kromatografisi ve düzgün hazırlanmış standartlar doğrusal bir standart eğri (R2 ≥ 0.99; Şekil 2A) üretmek etanol toplanan diyalizat örneklerinin etanol konsantrasyonu hesaplamak için kullanılan öz idare kendi öz-yönetim oturumu sırasında (Şekil 2B) fazla hayvan . <img src="/files/ftp_upload/4142/4142fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> 1. Örnek kromatogramları Şekil. Etanol standart ya da numune diyalizat bir mikrolitrelik bir gaz c içine yüklendişişeye hromatograph ve metin içinde anlatıldığı gibi analiz edilmiştir. 2.5, 5.0 ve 10 mM etanol standartları elde edilen tepe noktalarının A) Kaplama. B) Tepe kendi kontrolünde etanol olan bir sıçan bir diyalizat örneği oluşturulur. <img src="/files/ftp_upload/4142/4142fig2.jpg" alt="Şekil 2," /> Şekil 2,. Şekil 1&#39;de gösterilen örnek deney grafiksel sonuçlanır. A) Etanol standart eğri. Bir etanol kendinden-yönetim oturumu boyunca diyalizat etanol konsantrasyonu B) Zaman kursu. <table border="1"><tbody><tr><td> Donanım </td><td> Parametre </td><td> Start-up ayarı </td><td> Ayarı Koşu </td><td> Dinlenme ayarı </td></tr><tr><td colspan="5"> 8400 Bruker (Varian) Autosampler </td></tr><tr><td></td><td> Enjeksiyon modu </td><td> SPME </td><td> SPME </td><td> n / a </td></tr> &lt;tr&gt; <td></td><td> Solvent nüfuz derinliği </td><td> 0% </td><td> % 20 </td><td> n / a </td></tr><tr><td></td><td> Örnek penetrasyon derinliği </td><td> % 20 </td><td> % 20 </td><td> n / a </td></tr><tr><td></td><td> Emme zamanı </td><td> 0.01 dk </td><td> 3 dk </td><td> n / a </td></tr><tr><td></td><td> Desorpsiyon zamanı </td><td> 19 dk </td><td> 1 dakika </td><td> n / a </td></tr><tr><td></td><td> Modu çözücü kaynağı temizleyin </td><td> Ben </td><td> Ben </td><td> n / a </td></tr><tr><td></td><td> Temiz modu adsorpsiyon ve desorpsiyon zamanı </td><td> 0.01 dk </td><td> 0.01 dk </td><td> n / a </td></tr><tr><td></td><td> Su banyosu (Otosampler ısıtır) * </td><td> 50 ° C </td><td> 50 ° C </td><td> Kapalı </td></tr><tr><td colspan="5"> CP-3800 Varian Gaz Kromatografi </td></tr><tr><td> Enjektör Fırın </td&gt; <td> Fırın gücü </td><td> Üzerinde </td><td> Üzerinde </td><td> Üzerinde </td></tr><tr><td></td><td> Fırın sıcaklığı </td><td> 250 ° C </td><td> 220 ° C </td><td> 30 ° C </td></tr><tr><td> Kolon Fırını </td><td> Stabilizasyon süresi </td><td> 0.10 dk </td><td> 0.10 dk </td><td> 0.10min </td></tr><tr><td></td><td> Sıcaklık </td><td> 65 ° C </td><td> 65 ° C </td><td> 30 ° C </td></tr><tr><td> Sütun </td><td> Mobil faz akış hızı </td><td> 8.5 ml / dak </td><td> 8.5 ml / dak </td><td> n / a </td></tr><tr><td></td><td> Sütun basmalı </td><td> ~ 6 psi </td><td> ~ 6 psi </td><td> ≥ 0.1 psi </td></tr><tr><td> FID dedektörü </td><td> Fırın gücü </td><td> Üzerinde </td><td> Üzerinde </td><td> Üzerinde </td></tr><tr><td></td><td> Sıcaklık </td><td> 220 ° C </td><td> 220 ° C </td><td> 120 ° C </td></tr&gt; <tr><td></td><td> Elektronik </td><td> Üzerinde </td><td> Üzerinde </td><td> Kapalı </td></tr><tr><td></td><td> Zaman sabiti </td><td> Hızlı </td><td> Hızlı </td><td> Hızlı </td></tr><tr><td></td><td> Menzil </td><td> 11 </td><td> 11 </td><td> 11 </td></tr><tr><td></td><td> Autozero </td><td> Evet </td><td> Evet </td><td> Evet </td></tr></tbody></table> Alev iyonizasyon algılama sistemi parametreleri Tablo 2. Gaz kromatograf. Bu tablo hazırlamak için kullanılan üç program için parametreler (start-up ayarları), run (ayarlar çalıştıran) gösterir ve sistemi korumak değil kullanmak (istirahat ayarları) iken.

<ol>
	<li>Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survivable+stereotaxic+surgery+in+rodents.">Survivable stereotaxic surgery in rodents.</a> J. Vis. Exp. (20), e880 (2008).</li><li>Howard, E. C., Schier, C. J., Wetzel, J. S., Gonzales, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dopamine+response+in+the+nucleus+accumbens+core-shell+border+differs+from+that+in+the+core+and+shell+during+operant+ethanol+self-administration.">The dopamine response in the nucleus accumbens core-shell border differs from that in the core and shell during operant ethanol self-administration.</a> Alcohol Clin. Exp. Res. 33, 1355-1365 (2009).</li><li>Doyon, W. M., York, J. L., Diaz, L. M., Samson, H. H., Czachowski, C. L., Gonzales, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+activity+in+the+nucleus+accumbens+during+consummatory+phases+of+oral+ethanol+self-administration.">Dopamine activity in the nucleus accumbens during consummatory phases of oral ethanol self-administration.</a> Alcohol Clin. Exp. Res. 27, 1573-1582 (2003).</li><li>Pettit, H. O., Justice, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+dose+on+cocaine+self-administration+behavior+and+dopamine+levels+in+the+nucleus+accumbens.">Effect of dose on cocaine self-administration behavior and dopamine levels in the nucleus accumbens.</a> Brain Res. 539, 94-102 (1991).</li><li>Paxinos, G., Kus, L., Ashwell, K. W. S., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chemoarchitectonic Atlas of The Rat Forebrain. , (1998).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1986).</li><li>Skoog, D. A., Holler, F. J., Nieman, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Instrumental Analysis. , (1998).</li><li>Doyon, W. M., Anders, S. K., Ramachandra, V. S., Czachowski, C. L., Gonzales, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+operant+self-administration+of+10%+ethanol+plus+10%+sucrose+on+dopamine+and+ethanol+concentrations+in+the+nucleus+accumbens.">Effect of operant self-administration of 10% ethanol plus 10% sucrose on dopamine and ethanol concentrations in the nucleus accumbens.</a> J Neurochem. 93, 1469-1481 (2005).</li><li>Carrillo, J., Gonzales, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+exposure+to+voluntary+ethanol+self-administration+produces+adaptations+in+ethanol+consumption+and+accumbal+dopamine+signaling.">A single exposure to voluntary ethanol self-administration produces adaptations in ethanol consumption and accumbal dopamine signaling.</a> Alcohol. 45, 559-5566 (2011).</li><li>Howard, E. C., Schier, C. J., Wetzel, J. S., Duvauchelle, C. L., Gonzales, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+shell+of+the+nucleus+accumbens+has+a+higher+dopamine+response+compared+with+the+core+after+non-contingent+intravenous+ethanol+administration.">The shell of the nucleus accumbens has a higher dopamine response compared with the core after non-contingent intravenous ethanol administration.</a> Neuroscience. 154, 1042-1053 (2008).</li><li>Robinson, D. L., Lara, J. A., Brunner, L. J., Gonzales, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Ethanol+Concentrations+in+the+Extracellular+Fluid+of+the+Rat+Brain.">Quantification of Ethanol Concentrations in the Extracellular Fluid of the Rat Brain.</a> J. Neurochem. 75, 1685-1693 (2000).</li><li>Gonzales, R. A., McNabb, J., Yim, H. J., Ripley, T., Bungay, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Microdialysis+of+Ethanol+in+Rat+Striatum.">Quantitative Microdialysis of Ethanol in Rat Striatum.</a> Alcohol Clin. Exp. Res. 22, 858-867 (1998).</li></ol>

Bu makale Med Associates, Inc tarafından finanse edilmiştir

Uygulamalar ve sınırlamalar İlaç öz-yönetim modeli uyuşturucu bağımlılığı kemirgenler kullanılır. Bu şekilde modellenmiştir kötüye Birçok ilaç, ilaç merkezi bölme doğrudan teslim edildiği, intravenöz olarak tatbik edilebilmektedir. Bu bir öz-yönetim oturumu üzerinden dozunun yakından takip edebilmeleri sağlanmaktadır. Etanol sözlü genellikle kendi kontrolünde olduğundan, emilim ve metabolizmaları bireysel farklılıklar nedeniyle ilaç düzeylerini izlemek için çok daha zordur. Ilgi beyin bölgesinden örnek mikrodiyaliz kullanarak, biz sadece bölgede ulaşan etanol desen izlememiz mümkün değildir, ama biz de aynı anda her öz-yönetim aşamasında zamanla aynı bölgede nörotransmitter değişiklikleri takip edebiliyoruz. Beyin nörokimyasal değişiklikler ve ilaç kaynaklı tepkiler ilaç kötüye kullanımı ve bağımlılığı ile ilişkilidir, bu yüzden aynı anda mea yeteneğiBelirli kendinden-yönetim aşamalarında emin nörokimyasal ve ilaç konsantrasyonları çok güçlü ve benzersiz bir araç sağlar. Davranışı ile analitlerin diyalizat konsantrasyonları arasında ilişki için akılda tutulması gereken bir konu mikrodiyaliz tesisat fiziksel özellikleridir. Özellikle, toplama tüpüne mikrodiyaliz prob lümeni aktarılacak sıvısı için gereken süreyi önemli olduğunu, ve daha kısa sürelerde daha iyi. Süresi 90 saniyedir böylece bizim laboratuvar, biz probları inşa. Bu koşullar kullanılarak, diyalizat etanol konsantrasyonu arttıkça içecek ve sonrası içecek süreler boyunca azalır etanol tüketimi, başlangıcındaki bir accumbal dopamin artış olduğunu bulduk. 2,3,8,9 Bu deneyler , farmakolojik çalışmalardan elde edilen veriler ile kombine edildiğinde, bize ch etanol ve öz-yönetim ilişkili çevresel ipuçlarının kesinlikle farmakolojik etkilerini ayrıştırmak için izinnörotransmitter konsantrasyonlarda anges. Bu, kombine davranış-mikrodiyaliz teknikleri bu özel uygulaması, laboratuar mevcut araştırma alanları için uygun olduğunu belirtmek gerekir. Biz senkron kendi kendine uygulama davranışları için bu önlemler ilgili olabilir, böylece, aynı bölgede nörotransmitter değişiklikleri modeline göre beyin ulaşan etanol geçici olarak ortaya değerlendirmek için tasarlanmıştır. Türetilmiş diyalizat etanol konsantrasyonları vivo prob kurtarma için düzeltilmiş ve beyin etanol doku konsantrasyonu sadece bir kısmını temsil ediyor değil. Etanol kantitatif mikrodiyaliz gerekirse, sonda içine diffüze hücre dışı alanından ki etanol çıkarma fraksiyonu deneysel olarak tespit edilmelidir. Yöntemleri ve daha fazla tartışma için bizim laboratuvardan önceki yayınların bakın. 10,11,12 Bu protokol gaz ch kullanımını gösterir rağmenMikrodiyaliz numunelerin tepe boşluğu etanol katı faz mikro ile birlikte romatography, mikrodiyaliz örneğin etanol oranı analizi için diğer yöntemler de kullanılabilir. Ancak, alternatif yöntemlerin bazı dezavantajları muzdarip olabilir. Örneğin, daha az hassas analitik yöntemlerin Burada gösterilen 5-7 dk daha örnekleme kat daha gerektiren daha büyük bir örnek hacmi gerekebilir. Burada tartışılan sistemin tipi şişe üst kısmında yerleştirilmiş elyaf için emme izin vererek, mühürlü örnek şişesine içinde buhar fazı içinde etanol konsantre bir katı faz mikro kullanır. Bu, tipik olarak buhar, 50-100 mikrolitre enjekte edilmesini sağlar doğrudan tepe boşluğunun, örnekleme ile karşılaştırıldığında, tespit limiti geliştirir. Tepe boşluğunun, yöntemin diğer bir önemli avantajı analiz için enjekte edilen örnek, son derece temiz ve tuzları serbest olmasıdır. Mikrodiyaliz sıvı numune direkt enjeksiyonu aynı zamanda daha yüksek bir sensit ile birlikte kullanılabilirivity, ancak bu enjekte tuzları temizleme için gerekli düzenli bakım nedeniyle zaman aşağı fazla enstrüman gerektirir. Sorun giderme ve diğer notlar <ol><li> Denemeniz başlamadan önce, mikrodiyaliz set-up düzgün çalışıp çalışmadığını kontrol etmek ve herhangi bir sorun sorun-ateş kendinize bol zaman verin. Sizinle dışarı atlamaya hazır ACSF ile perfüze, set-up ekstra olduğunu göstermektedir bir çok edimsel oturumları her gün belirli bir saatte meydana eğilimi gibi, kendinizi zaman kazanmak için set-up arızalı. </li><li> Mikrodiyaliz probları, prob olarak beyine doku kesme tarafından üretilen doku hasarı en aza indirmek için, yaklaşık 5 dakikalık bir süre boyunca takılı olduğundan emin olun. </li><li> Operant odasına sıçan aktarırken, ikinci bir kişi operant programı init böylece transfer hattı (mikrodiyaliz kurulum parçası) Dolaşmasını vermez, böylece destek, ve faydalı olacaktırzamanında iated. </li><li> Eğer uygun sıcaklığa ulaşması için zaman Otosampler su banyosu bol vermek emin olun. Bizim sistemimiz genellikle iki saat 50 ° C&#39;ye ulaşması gerekir Ayrıca, örneklerin tam örnekleri analiz etmeden önce buharlaşmış olduğunu temin ederim. Biz genellikle görsel olarak bu örnek analiz başlamadan önce meydana geldiğini onaylayın. </li><li> Standart iyi analitik kimya uygulamaları takip edilmelidir. Bunlar arasında, ancak kişiler, ekipman ve prosedürler doğrulama, bunlarla sınırlı değildir. Kısacası, biz aşağıdaki yönergeleri istihdam: Bireysel kullanıcılar birden fazla gün boyunca standart konsantrasyonları ve doğrusal standart eğrileri (R2 ≥ 0.99) için tekrarlanabilir pik yükseklik değerleri oluşturmak için yeteneğini göstermelidir. GC-FID sisteminin düzgün çalıştığını doğrulamak için, standartlar herhangi bir diyalizat örneklerinde enjekte edilmeden önce analiz her zaman olmalıdır. Oluşturulan standart eğri bir R2 ≥ 0,99 olmalıdır. </li><li> Kullandığımız ekipman çoğu2010 yılında Agilent Technologies tarafından satın alındı ​​Varian, Inc aracılığıyla satın alınmıştır. Şu anda, Bruker Scientific Instruments Varian laboratuvar gaz kromatografi cihazları iş elde. Gelecekte alımları için, ya şirketinize danışın. </li><li> İşbu Protokol sıçanlar ile edimsel davranış gösterir, ancak izleyici davranışlarının daha bozulması küçük fare modeli ile meydana gelme olasılığı olduğunu farkında olmalıdır. Farkında olmak başka konu medial prefrontal korteks veya nükleus akumbens burada gösterilenden daha büyük derecede edimsel davranış bozabilir dışında beyin bölgeleri içine bir mikrodiyaliz prob yerleştirme uygulaması olduğunu. Yakından prob yerleşimi nedeniyle hasar davranış ciddi değişiklikler yaratır olmadığını belirlemek için çok sayıda davranış parametrelerini incelemek önemlidir. </li></ol>

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> % 95 Etanol </td><td> AAPER Alkol ve Chemical Co, Shelbyville, KY </td><td> E190, 111000190 </td></tr><tr><td> Ultra Saf Sakaroz </td><td> MP Biomedicals, LLC, Solon, OH </td><td> 821721 </td></tr><tr><td> Ultra Yüksek Saflıkta Helyum </td><td> Hava Gazı </td><td> HE UHP300 </td></tr><tr><td> Hava </td><td> Hava Gazı </td><td> AIZ300 </td></tr><tr><td> Hidrojen </td><td> Hava Gazı </td><td> AIZ300 </td></tr><tr><td> GC 2 ml şişe </td><td> Agilent </td><td> # 8010-0015 </td></tr><tr><td> PTFE / silikon septa ile GC flakon kapaklar </td><td> Agilent </td><td> # 8010-0084 </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Özgül reaktifler

microdialysis of ethanol during operant ethanol self-administration and ethanol determination by gas chromatography

Operant kendi kendine uygulama yöntemleri yaygın etanol de dahil olmak üzere pek çok ilaç kötüye kullanımı, ve davranışsal ve farmakolojik etkilerini incelemek için kullanılmıştır. Bununla birlikte, tipik olarak, etil alkol kötüye birçok başka ilaçlar gibi intravenöz göre, oral olarak kendini yönetilir. Oral ilaçların farmakokinetiği intravenöz ilaçlar daha karmaşıktır. Etanol farmakolojik ve davranışsal etkileri arasındaki ilişkiyi anlama içme esnasında ve sonrasında beyne ulaşmasını etanol zaman ders bilgi gerektirdiğinden, biz zamanla beyin diyalizat etanol konsantrasyonları izlemek için alev iyonizasyon dedektörü ile in vivo mikrodiyaliz ve gaz kromatografisi kullanın. Kombine mikrodiyaliz-davranışsal deneyler çeşitli teknikler kullanılmasını gerektirebilir. Öz-yönetim ve neu çok sayıda test etmek için adapte edilebilir Bu makalede, stereotaksik cerrahi, davranışsal eğitim ve mikrodiyaliz,rochemical merkezli hipotez, sadece örnek toplama ve diyalizat etanol analizi sonraki aşamalara nasıl ilişkili olduğunu göstermek için dahil edilmiştir. Etanol çalışmalar için özel olan alev iyonizasyon dedektörü, gaz kromatografisi yoluyla etanol konsantrasyonu analiz Diyalizat ayrıntılı olarak tarif edilmektedir. Bu yöntemler ile üretilen verileri kendi kendine uygulama işlemi sırasında beyin ulaşan etanol modeli sergileyen ve aynı diyalizat örneklerin nörokimyasal analizi ile eşleştirilmiş zaman, sonuçlar etanol farmakolojik ve davranışsal etkileri ile ilgili yapılmasına olanak tanır.

Watch this Scientific Journal Video about Microdialysis of Ethanol During Operant Ethanol Self-administration and Ethanol Determination by Gas Chromatography at JoVE.com

Microdialysis of Ethanol During Operant Ethanol Self-administration and Ethanol Determination by Gas Chromatography

Operant etanol sırasında sıçanların beyinlerinde etanol konsantrasyonu zaman ders belirlemek için bir yöntem olup kendi kendine uygulama tarif edilmektedir. , Oluşturulan küçük miktarlar için gerekli hassasiyete sahiptir çünkü alev iyonizasyon dedektörü ile Gaz kromatografisi, diyalizat örnekleri etanol ölçmek için kullanılır.

Gaz kromatografisi ile operant etanol kendi kendine uygulama ve etanol belirleme sırasında etanol mikrodivaliz

Operant self-administration methods are commonly used to study the behavioral and pharmacological effects of many drugs of abuse, including ethanol.  ...

microdialysis-ethanol-during-operant-ethanol-self-administration

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.4K Görüntüleme.  The University of Texas at Austin. Operant etanol sırasında sıçanların beyinlerinde etanol konsantrasyonu zaman ders belirlemek için bir yöntem olup kendi kendine uygulama tarif edilmektedir. , Oluşturulan küçük miktarlar için gerekli hassasiyete sahiptir çünkü alev iyonizasyon dedektörü ile Gaz kromatografisi, diyalizat örnekleri etanol ölçmek için kullanılır.

Video: Microdialysis of Ethanol During Operant Ethanol Self-administration and Ethanol Determination by Gas Chromatography

Assessment of Ultrasonic Vocalizations During Drug Self-administration in Rats

Drug self-administration procedures are commonly used to study behavioral and neurochemical changes associated with human drug abuse, addiction and relapse. Various types of behavioral activity are commonly utilized as measures of drug motivation in animals. However, a crucial component of drug abuse relapse in abstinent cocaine users is "drug craving", which is difficult to model in animals, as it often occurs in the absence of overt behaviors. Yet, it is possible that a class of ultrasonic vocalizations (USVs) in rats may be a useful marker for affective responses to drug administration, drug anticipation and even drug craving. Rats vocalize in ultrasonic frequencies that serve as a communicatory function and express subjective emotional states. Several studies have shown that different call frequency ranges are associated with negative and positive emotional states. For instance, high frequency calls ("50-kHz") are associated with positive affect, whereas low frequency calls ("22-kHz") represent a negative emotional state. This article describes a procedure to assess rat USVs associated with daily cocaine self-administration. For this procedure, we utilized standard single-lever operant chambers housed within sound-attenuating boxes for cocaine self-administration sessions and utilized ultrasonic microphones, multi-channel recording hardware and specialized software programs to detect and analyze USVs. USVs measurements reflect emotionality of rats before, during and after drug availability and can be correlated with commonly assessed drug self-administration behavioral data such lever responses, inter-response intervals and locomotor activity. Since USVs can be assessed during intervals prior to drug availability (e.g., anticipatory USVs) and during drug extinction trials, changes in affect associated with drug anticipation and drug abstinence can also be determined. In addition, determining USV changes over the course of short- and long-term drug exposure can provide a more detailed interpretation of drug exposure effects on affective functioning.

Drug self-administration and ultrasonic vocalizations (USV) are used as behavioral assessments in animal research, but rarely in combination. The purpose of this article is to describe the advantages of recording USVs during drug self-administration procedures to assess affective responses to drug experience.

Sıçanlar İlaç Öz-yönetim sırasında Ultrasonik seslenmelere Değerlendirilmesi

Drug self-administration procedures are commonly used to study behavioral and neurochemical changes associated with human drug abuse, addiction and ...

Nörobilim

Operant Sensation Seeking in the Mouse

Operant methods are powerful behavioral tools for the study of motivated behavior. These 'self-administration' methods have been used extensively in drug addiction research due to their high construct validity. Operant studies provide researchers a tool for preclinical investigation of several aspects of the addiction process. For example, mechanisms of acute reinforcement (both drug and non-drug) can be tested using pharmacological or genetic tools to determine the ability of a molecular target to influence self-administration behavior1-6. Additionally, drug or food seeking behaviors can be studied in the absence of the primary reinforcer, and the ability of pharmacological compounds to disrupt this process is a preclinical model for discovery of molecular targets and compounds that may be useful for the treatment of addiction3,7-9. One problem with performing intravenous drug self-administration studies in the mouse is the technical difficulty of maintaining catheter patency. Attrition rates in these experiments are high and can reach 40% or higher10-15. Another general problem with drug self-administration is discerning which pharmacologically-induced effects of the reinforcer produce specific behaviors. For example, measurement of the reinforcing and neurological effects of psychostimulants can be confounded by their psychomotor effects. Operant methods using food reinforcement can avoid these pitfalls, although their utility in studying drug addiction is limited by the fact that some manipulations that alter drug self-administration have a minimal impact on food self-administration. For example, mesolimbic dopamine lesion or knockout of the D1 dopamine receptor reduce cocaine self-administration without having a significant impact on food self-administration 12,16. 
Sensory stimuli have been described for their ability to support operant responding as primary reinforcers (i.e. not conditioned reinforcers)17-22. Auditory and visual stimuli are self-administered by several species18,21,23, although surprisingly little is known about the neural mechanisms underlying this reinforcement. The operant sensation seeking (OSS) model is a robust model for obtaining sensory self-administration in the mouse, allowing the study of neural mechanisms important in sensory reinforcement24. An additional advantage of OSS is the ability to screen mutant mice for differences in operant behavior that may be relevant to addiction. We have reported that dopamine D1 receptor knockout mice, previously shown to be deficient in psychostimulant self-administration, also fail to acquire OSS24. This is a unique finding in that these mice are capable of learning an operant task when food is used as a reinforcer. While operant studies using food reinforcement can be useful in the study of general motivated behavior and the mechanisms underlying food reinforcement, as mentioned above, these studies are limited in their application to studying molecular mechanisms of drug addiction. Thus, there may be similar neural substrates mediating sensory and psychostimulant reinforcement that are distinct from food reinforcement, which would make OSS a particularly attractive model for the study of drug addiction processes. The degree of overlap between other molecular targets of OSS and drug reinforcers is unclear, but is a topic that we are currently pursuing. While some aspects of addiction such as resistance to extinction may be observed with OSS, we have found that escalation 25 is not observed in this model24. Interestingly, escalation of intake and some other aspects of addiction are observed with self-administration of sucrose26. Thus, when non-drug operant procedures are desired to study addiction-related processes, food or sensory reinforcers can be chosen to best fit the particular question being asked. 
In conclusion, both food self-administration and OSS in the mouse have the advantage of not requiring an intravenous catheter, which allows a higher throughput means to study the effects of pharmacological or genetic manipulation of neural targets involved in motivation. While operant testing using food as a reinforcer is particularly useful in the study of the regulation of food intake, OSS is particularly apt for studying reinforcement mechanisms of sensory stimuli and may have broad applicability to novelty seeking and addiction.

In this protocol we describe a method of operant learning using sensory stimuli as a reinforcer in the mouse. It requires no prior training or food restriction, and it allows the study of motivated behavior without the use of a pharmacological or natural reinforcer such as food.

Fare Aradığınız Edimsel Sensation

Operant methods are powerful behavioral tools for the study of motivated behavior.  These 'self-administration' methods have been used extensively in drug ...

A Simple Way to Measure Ethanol Sensitivity in Flies

Low doses of ethanol cause flies to become hyperactive, while high doses are sedating. The sensitivity to ethanol-induced sedation of a given fly strain is correlated with that strain s ethanol preference, and therefore sedation is a highly relevant measure to study the genetics of alcohol responses and drinking. We demonstrate a simple way to expose flies to ethanol and measure its intoxicating effects. The assay we describe can determine acute sensitivity, as well as ethanol tolerance induced by repeat exposure. It does not require a technically involved setup, and can therefore be applied in any laboratory with basic fly culture tools.

A simple assay to measure the sedating effects of ethanol on Drosophila flies, based on the loss of righting reflex, is described.

Sinekler Etanol Hassasiyet Tedbir Basit Yolu

Low doses of ethanol cause flies to become hyperactive, while high doses are sedating. The sensitivity to ethanol-induced sedation of a given fly strain ...

Methods for Intravenous Self Administration in a Mouse Model

Animal models have been developed to study the reinforcing effects of drugs, including the intravenous self-administration (IVSA) paradigm. The advantages of using an IVSA paradigm to study the reinforcing properties of drugs of abuse such as cocaine include the fact that the drug is self-administered instead of experimenter-administered, the schedule of reinforcement can be altered, and accurate measurement of the quantities of drug consumed as well as the timing and pattern of IV injections can be obtained. Furthermore, the intravenous route of administration avoids potential confounds related to first pass metabolism or taste, and produces rapid increases in blood and brain drug levels. As outlined in this video, intravenous self-administration can be obtained without prior food restriction or prior drug training following careful catheter placement during surgery and meticulous daily catheter flushing and maintenance. Experimental procedures outlined in this paper include a description of animal housing and acclimation methods, operant training using sweetened milk solutions, and catheter implantation surgery.

The intravenous self-administration (IVSA) paradigm is considered to be the gold standard in examining the reinforcing properties of drugs of abuse in rodents. This manuscript outlines the experimental procedures and surgical techniques necessary to obtain reliable IVSA data. In particular, meticulous catheter implantation and maintenance are highlighted.

Bir Fare Modelinde İntravenöz Öz Yönetim Yöntemleri

Animal models have been developed to study the reinforcing effects of drugs, including the intravenous self-administration (IVSA) paradigm. The advantages ...

Identification of Olfactory Volatiles using Gas Chromatography-Multi-unit Recordings (GCMR) in the Insect Antennal Lobe

All organisms inhabit a world full of sensory stimuli that determine their behavioral and physiological response to their environment. Olfaction is especially important in insects, which use their olfactory systems to respond to, and discriminate amongst, complex odor stimuli. These odors elicit behaviors that mediate processes such as reproduction and habitat selection1-3. Additionally, chemical sensing by insects mediates behaviors that are highly significant for agriculture and human health, including pollination4-6, herbivory of food crops7, and transmission of disease8,9. Identification of olfactory signals and their role in insect behavior is thus important for understanding both ecological processes and human food resources and well-being.
	To date, the identification of volatiles that drive insect behavior has been difficult and often tedious. Current techniques include gas chromatography-coupled electroantennogram recording (GC-EAG), and gas chromatography-coupled single sensillum recordings (GC-SSR)10-12. These techniques proved to be vital in the identification of bioactive compounds. We have developed a method that uses gas chromatography coupled to multi-channel electrophysiological recordings (termed 'GCMR') from neurons in the antennal lobe (AL; the insect's primary olfactory center)13,14. This state-of-the-art technique allows us to probe how odor information is represented in the insect brain. Moreover, because neural responses to odors at this level of olfactory processing are highly sensitive owing to the degree of convergence of the antenna's receptor neurons into AL neurons, AL recordings will allow the detection of active constituents of natural odors efficiently and with high sensitivity. Here we describe GCMR and give an example of its use.
	Several general steps are involved in the detection of bioactive volatiles and insect response. Volatiles first need to be collected from sources of interest (in this example we use flowers from the genus Mimulus (Phyrmaceae)) and characterized as needed using standard GC-MS techniques14-16. Insects are prepared for study using minimal dissection, after which a recording electrode is inserted into the antennal lobe and multi-channel neural recording begins. Post-processing of the neural data then reveals which particular odorants cause significant neural responses by the insect nervous system.
	Although the example we present here is specific to pollination studies, GCMR can be expanded to a wide range of study organisms and volatile sources. For instance, this method can be used in the identification of odorants attracting or repelling vector insects and crop pests. Moreover, GCMR can also be used to identify attractants for beneficial insects, such as pollinators. The technique may be expanded to non-insect subjects as well.

Identification of Olfactory Volatiles using Gas Chromatography-Multi-unit Recordings GCMR in the Insect Antennal Lobe

Olfactory cues mediate many different behaviors in insects, and are often complex mixtures comprised of tens to hundreds of volatile compounds. Using gas chromatography with multi-channel recording in the insect antennal lobe, we describe a method for the identification of bioactive compounds.

Böcek antennal Lob Gaz Kromatografisi-Multi-ünite Recordings (GCMR) kullanarak Olfaktör Uçuculuk tanımlanması

All  organisms inhabit a world full of sensory stimuli that determine their  behavioral and physiological response to their environment. Olfaction is ...

Hippocampal Insulin Microinjection and In vivo Microdialysis During Spatial Memory Testing

Glucose metabolism is a useful marker for local neural activity, forming the basis of methods such as 2-deoxyglucose and functional magnetic resonance imaging. However, use of such methods in animal models requires anesthesia and hence both alters the brain state and prevents behavioral measures. An alternative method is the use of in vivo microdialysis to take continuous measurement of brain extracellular fluid concentrations of glucose, lactate, and related metabolites in awake, unrestrained animals. This technique is especially useful when combined with tasks designed to rely on specific brain regions and/or acute pharmacological manipulation; for example, hippocampal measurements during a spatial working memory task (spontaneous alternation) show a dip in extracellular glucose and rise in lactate that are suggestive of enhanced glycolysis1-3,4-5, and intrahippocampal insulin administration both improves memory and increases hippocampal glycolysis6. Substances such as insulin can be delivered to the hippocampus via the same microdialysis probe used to measure metabolites. The use of spontaneous alternation as a measure of hippocampal function is designed to avoid any confound from stressful motivators (e.g. footshock), restraint, or rewards (e.g. food), all of which can alter both task performance and metabolism; this task also provides a measure of motor activity that permits control for nonspecific effects of treatment. Combined, these methods permit direct measurement of the neurochemical and metabolic variables regulating behavior.

Hippocampal Insulin Microinjection and In vivo Microdialysis During Spatial Memory Testing

Modulation of hippocampally-dependent spatial working memory by direct intrahippocampal microinjection, accompanied and followed by in vivo microdialysis for metabolites in conscious, behaving animals.

Hipokampal İnsülin Mikroenjeksiyon ve<em&gt; In vivo</emMekansal Bellek Test sırasında&gt; mikrodivaliz

Glucose metabolism is a useful marker for local neural activity, forming the basis of methods such as 2-deoxyglucose and functional magnetic resonance ...

An Inexpensive, Scalable Behavioral Assay for Measuring Ethanol Sedation Sensitivity and Rapid Tolerance in Drosophila

Alcohol use disorder (AUD) is a serious health challenge. Despite a large hereditary component to AUD, few genes have been unambiguously implicated in their etiology. The fruit fly, Drosophila melanogaster, is a powerful model for exploring molecular-genetic mechanisms underlying alcohol-related behaviors and therefore holds great promise for identifying and understanding the function of genes that influence AUD. The use of the Drosophila model for these types of studies depends on the availability of assays that reliably measure behavioral responses to ethanol. This report describes an assay suitable for assessing ethanol sensitivity and rapid tolerance in flies. Ethanol sensitivity measured in this assay is influenced by the volume and concentration of ethanol used, a variety of previously reported genetic manipulations, and also the length of time the flies are housed without food immediately prior to testing. In contrast, ethanol sensitivity measured in this assay is not affected by the vigor of fly handling, sex of the flies, and supplementation of growth medium with antibiotics or live yeast. Three different methods for quantitating ethanol sensitivity are described, all leading to essentially indistinguishable ethanol sensitivity results. The scalable nature of this assay, combined with its overall simplicity to set-up and relatively low expense, make it suitable for small and large scale genetic analysis of ethanol sensitivity and rapid tolerance in Drosophila.

An Inexpensive, Scalable Behavioral Assay for Measuring Ethanol Sedation Sensitivity and Rapid Tolerance in Drosophila

Straightforward assays for measuring ethanol sensitivity and rapid tolerance in Drosophila facilitate the use of this model organism for investigating these important ethanol-related behaviors. Here, a relatively simple, scalable assay for measuring ethanol sensitivity and rapid tolerance in flies is described.

Etanol sedasyon Hassasiyet ve hızlı Hoşgörü Ölçüm Ucuz bir, Ölçeklenebilir Davranış Deneyi<em&gt; Drosophila</em

Alcohol use disorder (AUD) is a serious health challenge. Despite a large hereditary component to AUD, few genes have been unambiguously implicated in ...

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the development of more effective treatments is the relative lack of understanding of the molecular underpinnings of the effects of ethanol on behavior. The nematode, Caenorhabditis elegans (C.&#160;elegans), provides a useful model in which to generate and test hypotheses about the molecular effects of ethanol. Here, we describe an assay that has been developed and used to examine the roles of particular genes and environmental factors in behavioral responses to ethanol, in which locomotion is the behavioral output. Ethanol dose-dependently causes an acute depression of crawling on an agar surface. The effects are dynamic; animals exposed to a high concentration demonstrate an initial strong depression of crawling, referred to here as initial sensitivity, and then partially recover locomotion speed despite the continued presence of the drug. This ethanol-induced behavioral plasticity is referred to here as the development of acute functional tolerance. This assay has been used to demonstrate that these two phenotypes are distinct and genetically separable. The straightforward locomotion assay described here is suitable for examining the effects of both genetic and environmental manipulations on these acute behavioral responses to ethanol in C.&#160;elegans.

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

C. elegans is a useful model for studying the effects of ethanol on behavior. We present a behavioral assay that quantifies the effects of ethanol on the locomotion speed of crawling worms; both initial sensitivity and the development of acute functional tolerance to ethanol can be measured with this assay.

Locomotion Speed ​​Etanol Etkilerinin Ölçülmesi için bir Testi<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the ...

Custom-made Microdialysis Probe Design

Microdialysis is a commonly used technique in neuroscience research. Therefore commercial probes are in great demand to monitor physiological, pharmacological and pathological changes in cerebrospinal fluid. Unfortunately, commercial probes are expensive for research groups in public institutions. In this work, a probe assembly is explained in detail to build a reliable, concentric, custom-made microdialysis probe for less than $10. The microdialysis probe consists of a polysulfone membrane with a molecular cut-off of 30 kDa. Probe in vitro recoveries of substances with different molecular weight (in the range of 100-1,600 Da) and different physicochemical properties are compared. The probe yields an in vitro recovery of approximately 20% for the small compounds glucose, lactate, acetylcholine and ATP. In vitro recoveries for neuropeptides with a molecular weight between 1,000-1,600 Da amount to 2-6%. Thus, while the higher molecular weight of the neuropeptides lowered in vitro recovery values, dialysis of compounds in the lower range (up to 500 Da) of molecular weights has no great impact on the in vitro recovery rate. The present method allows utilization of a dialysis membrane with other cut-off value and membrane material. Therefore, this custom-made probe assembly has the advantage of sufficient flexibility to dialyze substances in a broad molecular weight range. Here, we introduce a microdialysis probe with an exchange length of 2 mm, which is applicable for microdialysis in mouse and rat brain regions. However, dimensions of the probe can easily be adapted for larger exchange lengths to be used in larger animals.

Microdialysis is a commonly used technique in neuroscience research. Therefore commercial probes are in great demand.In this work a probe assembly is explained in detail to build a reliable, concentric, custom-made microdialysis probe for less than $10.

Ismarlama Mikrodiyaliz Probe Tasarım

Microdialysis is a commonly used technique in neuroscience research. Therefore commercial probes are in great demand to monitor physiological, ...

Assessment of Dopaminergic Homeostasis in Mice by Use of High-performance Liquid Chromatography Analysis and Synaptosomal Dopamine Uptake

Dopamine (DA) is a modulatory neurotransmitter controlling motor activity, reward processes and cognitive function. Impairment of dopaminergic (DAergic) neurotransmission is strongly associated with several central nervous system-associated diseases such as Parkinson&#39;s disease, attention-deficit-hyperactivity disorder and drug addiction1,2,3,4. Delineating disease mechanisms involving DA imbalance is critically dependent on animal models to mimic aspects of the diseases, and thus protocols that assess specific parts of the DA homeostasis are important to provide novel insights and possible therapeutic targets for these diseases.
Here, we present two useful experimental protocols that when combined provide a functional read-out of the DAergic system in mice. Biochemical and functional parameters on DA homeostasis are obtained through assessment of DA levels and dopamine transporter (DAT) functionality5. When investigating the DA system, the ability to reliably measure endogenous levels of DA from adult brain is essential. Therefore, we present how to perform high-performance liquid chromatography (HPLC) on brain tissue from mice to determine levels of DA. We perform the experiment on tissue from dorsal striatum (dStr) and nucleus accumbens (NAc), but the method is also suitable for other DA-innervated brain areas.
DAT is essential for reuptake of DA into the presynaptic terminal, thereby controlling the temporal and spatial activity of released DA. Knowing the levels and functionality of DAT in the striatum is of major importance when assessing DA homeostasis. Here, we provide a protocol that allows to simultaneously deduce information on surface levels and function using a synaptosomal6 DA uptake assay.
Current methods combined with standard immunoblotting protocols provide the researcher with relevant tools to characterize the DAergic system.

Synaptosomal dopamine uptake and high-performance liquid chromatography analysis represent experimental tools to investigate dopamine homeostasis in mice by assessing the function of the dopamine transporter and levels of dopamine in striatal tissue, respectively. Here we present protocols to measure dopamine tissue content and assess the functionality of the dopamine transporter.

Dopaminerjik Homeostasis farelerde yüksek performanslı sıvı Kromatografi analizi ve Synaptosomal dopamin alımı kullanımı tarafından değerlendirilmesi

Dopamine (DA) is a modulatory neurotransmitter controlling motor activity, reward processes and cognitive function. Impairment of dopaminergic (DAergic) ...