Biz uzun süreli tartışmalar ve teknik danışmanlık için U. Heberlein&#39;in ve A. Devineni teşekkür ederiz. Biz de metodunu göstermek konusunda yardım için, A. Benzur, L. Kazaz ve O. Shalom Shohat-Ophir laboratuvar üyelerine teşekkür ederim. Özel takdir laboratuarında sinek sistemlerini kurmak için Eliezer Costi gider. Bu çalışma, İsrail Bilim Vakfı (384/14) ve Marie Curie Kariyer Entegrasyon Hibeler (CIG 631127) tarafından desteklenmiştir.

Not: deneysel tasarım Genel bakış: deneysel tasarım erkek sinekler 4 gün boyunca arka arkaya 3 eğitimlere ödüllendirici ve nonrewarding deneyimlere maruz edildiği kur bastırma 7-9 için uyarlanmış bir protokol içerir. 4 gün - deneyimi fazının sonunda, sineklerin 3 için iki seçenek isteğe etanol tüketimi deneyinde test edilmiştir. Diğer bir deneyde (Tablo 1) başlangıcından önce zamanında yer almalıdır ise protokolü, burada, birden çok deneyde kullanılmak üzere önceden yapılabilir olan farklı hazırlık adımları içerir. 1. Hazırlık Adımları <ol><li> kılcal besleyici sistemini hazırlama <ol><li> 27 G iğne ısıtın ve bir şişeye (Şekil 1) boyunca küçük delik delmek için kullanabilirsiniz. </li><li> Bir jilet kullanarak yarısı (çaprazlama) olarak flakon fiş kesti. Mark squar oluşturarak fiş yüzeyinde dört puan,e şekil kılcal sahipleri içine konumlandırmak için. Fiş (Şekil 1b) üzerinden 4 delik yapmak için bir 18 G iğne kullanın. </li><li> onlar sıkıca adaptörleri olarak hizmet 5 uL cam kılcal tutabilir, böylece mikropipetler kesmek için jilet kullanın. </li><li> Hazırlanan fişlere içine 4 kılcal adaptörleri takın. </li><li> fiş üzerinde 2 etanol-ve iki nonethanol içeren kılcal damarların konumunu işaretleyin. Not: Tüm şişeleri tutarlı kılcal damarların 2 tip pozisyonları tutmak için tavsiye edilir. Büyük delikler şişeleri dışarı sinekler kaçmasına izin olarak, deliklerin büyüklüğüne dikkat edin. Buna ek olarak, fiş kesme sinekler karışık alabilirsiniz bazı küçük, gevşek liflerin oluşturduğu gibi, şişenin takıldığında aşağı dönük tarafı olarak (genellikle kesim tarafında karşısı) fişin yumuşak tarafını kullanılması tavsiye edilir . </li><li> şişeleri ve adaptörleri çok sayıda kılcal besleyici sistemi için kullanılacak hazırlayın (CAFE)Adım 2.3 tarif deneyler. </li></ol></li><li> küçük cam gıda şişeleri hazırlanması <ol><li> Bir gün sinekleri (adım 1.4) toplama önce, mikrosantrifüj tüp rafları 200 cam şişeleri düzenlemek. Eritin (Mısır unu pekmez reçeteye göre Malzeme Tablo) gıda sinek bir mikrodalga kullanarak. cam şişe içine sinek gıda 2 ml dökün (flakon duvarları gıda smear değil deneyin). Gıda sertleşmesine izin verin, ve plastik wrap ile şişeleri örtün. Not: gıda içeren cam şişeler birkaç hafta boyunca 4 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. </li><li> sinek toplama gününde, buzdolabından şişeleri almak ve onları sinekler evine kullanmadan önce oda sıcaklığına gelmesi izin verin. NOT: Gıda şişeler birkaç hafta eski ise, sineklerin gıda ve cam arasında çatlaklar tuzak olabilir gibi gıda hala bozulmamış ve flakon kopuk olmadığından emin olun. </li></ol></li><li> kılcal besleyici tahlil için yapma stok gıda çözümü <ol><li> önHazır Gıda çözeltisi (% 5 sukroz ve% 5 maya özütü) pare, maya ekstresi 5.88 g damıtılmış su, 100 mL sukroz 5.88 g çözülür. NOT: stok çözeltisi kirlenme riski çok yüksektir. Bu nedenle, otoklav önerilir (121 ° C, 30 dak, ve bir kurutma döngüsü olmaksızın) ve alikotları çalışan 850 uL içine kısım Bundan başka, kullanılana kadar 4 ° C &#39;de muhafaza etmektir. Stok çözelti içinde bileşenlerin konsantrasyonu% 5.88 ve sadece adım 2.3 kullanılmadan önce% 15 etanol ya da su (önceden yapılmış gıda çözeltisi 850 uL içinde 150 uL) ilave edildikten sonra% 5 nihai konsantrasyon elde edecek. </li></ol></li><li> Deneysel sinekler Toplama <ol><li> CO 2 takımını kullanarak 200 naif erkek sinekler toplayın. Not: Deneysel bir soru hakkında herhangi bir laboratuvar suşu kullanın. 250 sinekler kolayca eclosion çekme aşamasında sinek beş şişe alınabilir. sinekler toplarken, col dikkat etmenizSon zamanlarda eclosed olan çeneğini sinekler (bakire görünümlü sinekler: kendi karın üzerinde bir mekonyum nokta ile parlak sinekler). Deneyde kullanılmadan önce 4 D - eski Deneysel sinekler 3 gıda ve yaşlı ihtiva eden küçük bir cam şişe içinde, tek başına tutulmalıdır. </li><li> Şişeleri kapatmak için yumuşak fişleri kullanın. NOT: deneyim aşamasında içine ve şişeleri dışarı dişileri eklemek için ağız aspirasyon kullanırken aynı yumuşak fişler eğitim aşaması için çok yararlı olacaktır. </li></ol></li><li> eğitmen sinekler Toplama Not: tüm toplanan sinekler 25 ° C ve% 70 bağıl nemde (RH) 12 saat / 12 saatlik aydınlık / karanlık inkübatör tutulmalıdır. 12 saat / 12 saatlik aydınlık / karanlık döngüsü uygun bir başlangıç ​​zaman değiştirilebilir. <ol><li> Bakire kadın eğitmen sinekler <ol><li> 500 bakire kadın eğitmen WT hisse senedi veya bakire alıcı kadın olarak kullanılmak üzere bir virginator stoktan uçar toplayın. normal boyuttaki gıda şişe başına 25 kişilik gruplar halinde erkek sineklerin tutmak ve tümdeneyde kullanmadan önce 4 d eski - 3 yaş bunları ow. </li></ol></li><li> Evlendirilen kadın eğitmen sinekler <ol><li> Eğitim aşamasında (adım 1.6.1) önce çiftleşme geçmesi WT hisse senedi veya bir virginator stokunun 300 bakire erkek sineklerin toplayın. NOT: Kadın sinekler normal boy gıda şişe başına 10 kadın gruplar halinde tutulur ve 3 yaşlı olan - deneyde kullanılan önce 4 d eski. </li></ol></li><li> Erkek sinekler çiftleşmiş kadın eğitmen uçar oluşturmak için kullanılan <ol><li> 150 erkek sinekler (ille bakire) toplayın. NOT: Sinekler 3 düzenli boy gıda flakon ve yaşlı başına 15 erkek gruplar halinde tutulur - bakire kadın ile eşleştirilmiş önce 4 d eski evlendirilen eğitmen kadın yaratmak için uçar. </li></ol></li></ol></li><li> evlendirilen kadın eğitmen uçar oluşturuluyor <ol><li> 15 erkek bir dişi-conta içine bir erkek içeren flakon saygısız uçar ile çiftleşmiş dişi oluşturmak için eğitici olarak kullanılmak üzere uçar, 10 bakire kadın çifti grupları uçar(adım 2.1) 10 eğitim aşamasından önce 18 saat - flakon 16 içerebilen ve. NOT: Bu normalde antrenmandan önce akşam yer almalıdır. 1.5: erkek arasında 1 oranında tüm kadın evlendirilen olacağını garanti dişi sinekler uçuyor. </li><li> Deney gününde, ağız aspiratör kullanılarak şişeden dışarı erkek aspire erkeklerden çiftleşen dişiler ayırın. Her eğitim gününün başlamasından önce bu hakkı gerçekleştirin. </li></ol></li></ol> 2. Deneysel Adımlar <ol><li> deneyim faz ayarlama <ol><li> inkübatör aydınlık fazın başlangıcında mümkün olduğunca yakın deney başlatın. davranış odasında (bakire ve evlendirilen ikisi) eğitmen kadın yerleştirin. NOT: Bu davranış odasında deney, ya da sessiz ve 25 ° C ve 60 olarak ayarlanmış herhangi bir tenha bir ortam gerçekleştirmek için tavsiye edilir -% 65 RH. % 50&#39;nin üzerinde nem tutulması kur ve çiftleşme davranışları beri, çok önemlis neme duyarlı olduğu bilinen feromon algılama bağlıdır. </li></ol></li><li> ödüllendirici ve nonrewarding deneyimleri erkek sinekler açığa <ol><li> rafın kenarları boyunca şişeleri konumlandırma, mikrosantrifüj rafları tek erkek sinekler içeren cam şişeleri düzenleyin. NOT: Bu düzenleme deneyci kolayca raftan dışarı şişeleri almadan çiftleşmeye geçmesi sinekler çiftleri gözlemlemek için izin verir. </li><li> Ödüllendirici ve nonrewarding çiftleşme deneyimleri geçiren erkekler için ayrı raflar (yani reddetmiş ve evlendirilen) üzerinde uçar (adım 2.2.1 açıklandığı gibi) tek erkek içeren 100 cam şişe 2 grup hazırlayın. </li><li> Aspire eğitmen kadın ve erkek sinekler içeren her flakon ekleyebilirsiniz. 1 saat zamanlayıcı ayarlayın. reddedilen gruptan başlayarak her şişeye birleştirilmiş bir kadın ekleyin. Sonra, evlendirilen edilecek erkeklere hareket ve her şişeye bakire kadın ekleyin. </li><li> yakından çiftleşme karşılaştığında İzlebakire kadın ile etkileşim erkekler ilk bir saat içinde ve daha önce evlendirilen kadın ile etkileşim erkek arkadaşı olmadığını başarıyla dostum emin olmak için. 1 saat boyunca reddedilen kohort izlemek 15 dakika için ikinci bir zamanlayıcı ayarlamak ve erkeklerde her 15 dakikada izlemek için. </li><li> ilk antrenmandan sonuna çiftleşme kadar sona ermedi evlendirilen kohorttan reddedilen çiftleşme başardı kohort ve erkeklerden erkek boşaltın. </li><li> Düzenli sinek gıda şişenin içine önceden evlendirilen kadın eğitmenler dışarı aspire ilk eğitim oturumu bitirmek ve bir sonraki klima oturumu için saklayın. nazikçe evlendirilen erkek grup kadın aspire bu adımı izleyin. </li><li> sinekler 1 saat bekletin. </li><li> iki kere 2.2.7 - Tekrar 2.2.3 adımları. </li><li> adımlarda 2.2.3 eğitim oturumu tekrarlayın - 2.2.8 3 daha d her gün. </li></ol></li><li> Kayıt tüketimi (CAFE) <ol><li> Son Condit sonundag oturumu (dördüncü gün), kılcal besleyici şişeleri içine tek erkek ve grup onları aspire. sinekler eklerken kılcal besleyici şişe kapağı yumuşak bir fişi kullanın ve tüm sinekler takıldıktan sonra hazır kılcal besleyici fişi ile hızlı bir şekilde değiştirin. Grup 6 - koşulu başına en az 8 şişeleri yaratan bir şişenin içine deney gruplarının her birinden 8 sinekler. </li><li> hafifçe tıkacın üstüne 5 mL su eklenerek fişleri ıslatın. su ekleyerek şişeleri içine dökülmesini önlemek için dikkatli olun. her şişeye su eşit miktarda ekleyin. Not: Bu adım kılcal damarların gelen buharlaşmayı azaltmak için yapılır. Bu nedenle, deney boyunca her gün tekrarlanır. bağıl neme bağlı olarak, şu günlerde fişler eklenecek daha az su gerektirebilir. </li><li> % 15 bir son konsantrasyon oluşturmak için hazır gıda alikotları etanol ya da su ilave edilerek iki ayrı gıda çözelti hazırlayın. </li><li> capill doldurmak içiniki gıda çözümleri ile koç, sıvı gıda laboratuar bir film şeridi üzerinde damla 5 uL oluşturmak ve 5 uL işaretine kadar çözüm kılcal doldurmak için izin verir. 5 uL kara leke hattına yakın kılcal, açık ucunu kullandığınızdan emin olun. NOT: - Birlikte 8 kılcal adaptörleri ve kılcal tutmak için bir ekleme olarak bunları kullanmak kerede birden fazla kılcal doldurmak için, 6 bağlamak mümkündür. </li><li> kara leke tam olarak gıda çözümü konumlandırmak için parafin şeridinde hafifçe kılcal dokunun. mineral yağ küçük damlalar halinde her kılcal sonunda daldırma kılcal Seal. Bu aşama yiyecek çözeltisi potansiyel buharlaşmasını en aza indirir. </li><li> kılcal damarların maruz kalan taraf ancak flakon (fiş yüzeyinden 1 mm veya daha az) iç kısmından gözetleme kadar fiş 4 adaptörler / sahipleri ile iki etanol içeren kılcal ve iki nonethanol içeren kılcal yerleştirin. NOT:sinekler normalde fişleri üzerinde oturmak ve beslemek için maruz kılcal aşağı tırmanmaya ıslak fiş yakın kılcal damarların açılmasını tutulması, buharlaşmayı azaltır ve gıdaya kolay erişim sağlar. </li><li> Deneysel sinekler ihtiva şişelere ek olarak, sinekler olmadan sahte şişe hazırlayın. Bu kontrol, doğal buharlaşma değerlendirmek için hizmet vermektedir. NOT: farklılıklar değişken buharlaşma ve tüketim verilerini yanıltıcı yol açabilir olarak, fişleri ile karşılaştırıldığında kılcal açıklığın görece eşit konumlandırma tutmaya çalışın. Deney sırasında yeterli nemi korumak ve ıslak fiş düşük nem ve büyük mesafe olarak, ıslak fiş mümkün olduğunca yakın kılcal açıklıklar pozisyon kontrolsüz buharlaşma hem de sonuç olabilir. </li><li> Bir cetvel kullanarak mm siyah işaret hattına göre kılcal damarların her sıvı göreli konumunu kaydetmek ve bu değerleri yazın. NOT: Çözelti siyah l tam olarak konumlandırılmış iseine, değer sıfıra eşit olmalıdır ve üstünde ya da altında olması durumunda, sırasıyla, pozitif veya negatif değerler olmalıdır. Sıvının ilk seviyeleri son O / N tüketim değerleri referans noktalarını ayarlamak. </li><li> 24 saat süreyle geri inkübatör şişeleri ayarlayın. tüm deney boyunca sabit bir anda kılcal değiştirin. </li><li> şişeleri hafifçe kılcal çıkarın ve siyah markalama hattına göre sıvı seviyesini ölçer. </li><li> Dikkatle sahte şişede sıvı seviyesini kontrol edin. NOT: seviyeleri 2 mm&#39;den daha fazla düştü Eğer buharlaşma yüksek olduğu ve tüketim seviyeleri güvenilir olmadığını, bu gösterir. </li><li> 2 mL su yavaşça fişlerini ıslatın ve adımları 2.3.3 belirtildiği gibi, kılcal damarların bir dizi yeni ekleme - 2.3.10. 24 saat süreyle geri inkübatör şişeleri ayarlayın. </li></ol></li><li> belirlenmesi tercih <ol><li> i nihai seviyesinden çıkararak her kılcal toplam tüketimi hesaplayınbaşlangıç ​​noktasına nitial düzeyi. </li><li> (Etanol içeren kılcal damarların ayrı yani nonethanol kılcal) aynı gıda ile her iki kılcal damarların değerleri birleştirmek. </li><li> etanol içeren kılcal damarların tüketilen miktarın olmayan etanol kılcal damarların tüketilen miktarı çıkarılarak etanol tercihini hesaplamak ve aynı şişenin tüm kılcal damarların toplam tüketim değerleri ile değer bölün. </li><li> Aynı deney grubundaki tüm şişeleri tercih indeksleri ortalama. <img alt="Equation1" src="/files/ftp_upload/54910/54910equation1.jpg" /> NOT: Nonethanol 1 (NE1), Nonethanol 2 (NE2), Etanol 1 (E1), Etanol 2 (E2), Toplam nonethanol (Toplam NE) = NE1 + NE2, toplam etanol (Toplam E) E1 + E2 = Toplam tutar tüketimi (Toplam Sum) = Toplam NE + Toplam E ve Etanol tercihi İndeksi (PI) </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Robinson, G. E., Fernald, R. D., Clayton, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+and+social+behavior.">Genes and social behavior.</a> Science. 322, 896-900 (2008).</li><li>Koob, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurobiological+substrates+for+the+dark+side+of+compulsivity+in+addiction.">Neurobiological substrates for the dark side of compulsivity in addiction.</a> Neuropharmacol. 56, 18-31 (2009).</li><li>Kaun, K. R., Devineni, A. V., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster+as+a+model+to+study+drug+addiction.">Drosophila melanogaster as a model to study drug addiction.</a> Hum Genet. 131, 959-975 (2012).</li><li>Devineni, A. V., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addiction-like+behavior+in+Drosophila.">Addiction-like behavior in Drosophila.</a> Commun Integr Biol. 3, 357-359 (2010).</li><li>Shohat-Ophir, G., Kaun, K. R., Azanchi, R., Mohammed, H., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexual+deprivation+increases+ethanol+intake+in+Drosophila.">Sexual deprivation increases ethanol intake in Drosophila.</a> Science. 335, 1351-1355 (2012).</li><li>Devineni, A. V., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+ethanol+consumption+in+Drosophila+models+features+of+addiction.">Preferential ethanol consumption in Drosophila models features of addiction.</a> Curr Biol : CB. 19, 2126-2132 (2009).</li><li>McBride, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mushroom+body+ablation+impairs+short-term+memory+and+long-term+memory+of+courtship+conditioning+in+Drosophila+melanogaster.">Mushroom body ablation impairs short-term memory and long-term memory of courtship conditioning in Drosophila melanogaster.</a> Neuron. 24, 967-977 (1999).</li><li>Ejima, A., Smith, B. P., Lucas, C., Levine, J. D., Griffith, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+learning+of+pheromonal+cues+modulates+memory+consolidation+in+trainer-specific+associative+courtship+conditioning.">Sequential learning of pheromonal cues modulates memory consolidation in trainer-specific associative courtship conditioning.</a> Curr Biol. 15, 194-206 (2005).</li><li>Ejima, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generalization+of+courtship+learning+in+Drosophila+is+mediated+by+cis-vaccenyl+acetate.">Generalization of courtship learning in Drosophila is mediated by cis-vaccenyl acetate.</a> Curr Biol. 17, 599-605 (2007).</li><li>Keleman, K., Kruttner, S., Alenius, M., Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+of+the+Drosophila+CPEB+protein+Orb2+in+long-term+courtship+memory.">Function of the Drosophila CPEB protein Orb2 in long-term courtship memory.</a> Nat Neurosci. 10, 1587-1593 (2007).</li><li>Kaun, K. R., Azanchi, R., Maung, Z., Hirsh, J., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+model+for+alcohol+reward.">A Drosophila model for alcohol reward.</a> Nat Neurosci. 14, 612-619 (2011).</li><li>Xu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+propensity+for+consuming+ethanol+in+Drosophila+requires+rutabaga+adenylyl+cyclase+expression+within+mushroom+body+neurons.">The propensity for consuming ethanol in Drosophila requires rutabaga adenylyl cyclase expression within mushroom body neurons.</a> Genes Brain Behav. 11, 727-739 (2012).</li><li>Devineni, A. V., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+Drosophila+melanogaster+as+a+model+for+alcohol+research.">The evolution of Drosophila melanogaster as a model for alcohol research.</a> Annu Rev Neurosci. 36, 121-138 (2013).</li><li>Ro, J., Harvanek, Z. M., Pletcher, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FLIC:+high-throughput,+continuous+analysis+of+feeding+behaviors+in+Drosophila.">FLIC: high-throughput, continuous analysis of feeding behaviors in Drosophila.</a> PloS one. 9, 101107 (2014).</li><li>Itskov, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+monitoring+and+quantitative+analysis+of+feeding+behaviour+in+Drosophila.">Automated monitoring and quantitative analysis of feeding behaviour in Drosophila.</a> Nat Commun. 5, 4560 (2014).</li><li>Yapici, N., Cohn, R., Schusterreiter, C., Ruta, V., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Taste+Circuit+that+Regulates+Ingestion+by+Integrating+Food+and+Hunger+Signals.">A Taste Circuit that Regulates Ingestion by Integrating Food and Hunger Signals.</a> Cell. 165, 715-729 (2016).</li><li>Peru, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lasting,+experience-dependent+alcohol+preference+in+Drosophila.">Long-lasting, experience-dependent alcohol preference in Drosophila.</a> Addict Biol. 19, 392-401 (2014).</li><li>Dus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutrient+Sensor+in+the+Brain+Directs+the+Action+of+the+Brain-Gut+Axis+in+Drosophila.">Nutrient Sensor in the Brain Directs the Action of the Brain-Gut Axis in Drosophila.</a> Neuron. 87, 139-151 (2015).</li><li>Anderson, D. J., Adolphs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+framework+for+studying+emotions+across+species.">A framework for studying emotions across species.</a> Cell. 157, 187-200 (2014).</li><li>Gibson, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+responses+to+a+repetitive+visual+threat+stimulus+express+a+persistent+state+of+defensive+arousal+in+Drosophila.">Behavioral responses to a repetitive visual threat stimulus express a persistent state of defensive arousal in Drosophila.</a> Curr Biol. 25, 1401-1415 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Here, we illustrate the details of an integrated approach to measure alterations in reward-seeking behavior, based on previous work described by Devineni et al.6 and Shohat-Ophir et al5. The first section of the protocol uses different types of sexual interactions as the experience input, and the second section uses a two-choice feeding assay to assess the effect of experience on the preference to consume ethanol.
As shown by Devineni et al.<sup...

Deneyim cevaben davranış modifikasyonu hayvanlar ortamında 1 değişikliklere davranışlarını ayarlamak için izin verir. Bu süreçte, hayvanlar dış çevre değişen koşullara kendi iç fizyolojik durumunu entegre ve daha sonra hayatta kalma ve üreme şanslarını artırmak için başka bir yere bir eylem seçin. Ödül sistemleri, yeme ya da içme, ya da yavru 2 cinsel davranış veya bakım gibi uzun vadeli hayatta kalmasını sağlamak o gibi acil hayatta kalma geliştirmek davranışları, takviye bireylerin ve türlerin hayatta kalması için gerekli olan davranışları motive etmek gelişti. Bu tür kötüye ilaçlar gibi yapay bileşikler de doğal ödülleri 2 aracılık birlikte gözle nöral yollarla ödül sistemlerini etkileyebilir. Son yirmi yılda, meyve Molec eğitimi için Drosophila melanogaster gelecek vaat eden bir model olarak kurulmuştur uçmaknitlerin ve davranış 3,4 Etanol etkilerini şekillendirmektedir nöronal mekanizmaları. Daha önce, uyuşturucu ödülleri 5 elde etme motivasyonuna, sinekler peptiderjik nöronların bir alt kümesi (NPF / NPF reseptörü (R) nöronlar) gibi cinsel deneyim olarak bu çift doğal ödülleri belirledik. NPF ifade hem cinsel deneyimlere ve etanol zehirlenmesi olarak ilaç ödülleri, duyarlıdır. NPF sentezleme seviyelerinde değişiklikler yüksek NPF azaltır ve düşük NPF etanol tüketmek tercih arttırır etanol kendi kendine uygulanması 5, değişiklikler dönüştürülür. onlar da azalmış etanol tüketimi ile yansıtılır aktivasyon ile eşleştirilmiş bir koku için güçlü bir tercih görüntüler olarak NPF nöronları aktive sinekler için ödüllendirici. Daha da önemlisi, NPF nöronların aktivasyonu etanol zehirlenme ve bir koku cue arasında pozitif bir ilişki oluşturmak için sinek yeteneği uğratır. NPF / R arasındaki nedensel bağlantıSistem, ödül belleği ve etanol tüketimi bir ödül Devletleri 5 değişikliklerin bir ölçüsü olarak etanol kendini yönetim kullanmak düşündürmektedir. Bu yayında biz ödül devletlerde sinek doğal ödüllendirme sistemi ve tayinine değişiklikleri içine dokunarak için entegre bir yaklaşım göstermektedir. yaklaşım ödül devletler değişiklikler için bir tahmin olarak etanol öz-yönetim değerlendirmek için iki seçenek kılcal besleyici deneyi (CAFE) takip iki ayrı bölümden, doğal ödül ile ilgili deneyimler işlemek için bir eğitim protokolü oluşur. CAFE deney kendine ilaç uygulama için, kemirgen çalışmalarında kullanılan, iki şişe bir seçim tahlillerine benzer ve sinekler 6 bağımlılığı gibi belirli davranış özelliklerini yansıtacak biçimde gösterilmiştir.

<table><tbody><tr><td>Polystyrene 25 x 95 mm Vials</td><td>FlyStuff</td><td>32-109</td><td></td></tr><tr><td>narrow plastic vials flugs</td><td>FlyStuff</td><td>42-102</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Sterile Needle 18 G and 27 G&amp;nbsp;</td><td>can be acquired by any company</td><td></td><td>1.20 X 38 mm (18 G x 1 1/2&quot;) , 0.40 X 13 mm (27 G x 1/2&quot;)</td></tr><tr><td>10 x 75 mm Borosilicate Glass Disposable Culture Tubes</td><td>kimble chase</td><td>73500-1075</td><td></td></tr><tr><td>calibrated pipets 5 &amp;#956;L</td><td>VWR</td><td>53432-706</td><td>color coded white to contain 5 &amp;#956;L</td></tr><tr><td>Mineral Oil&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose, Molecular Biology Grade</td><td>CALBIOCHEM</td><td>573113</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract Powder for microbiology</td><td>can be acquired by any company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>32221</td><td></td></tr><tr><td>standard pipette Tips (micro-pipetts)</td><td>ThermScientific</td><td>T114R-Q</td><td>volume: 0.1 - 20 &amp;#956;L (ultramicro)</td></tr><tr><td>IDENTI-PLUGS (Foam Tube Plugs)</td><td>Jaece</td><td>L800-A</td><td>fits opening 6 - 13 mm</td></tr><tr><td>IDENTI-PLUGS (Foam Tube Plugs)</td><td>Jaece</td><td>L800-D</td><td>fits opening 35 - 45 mm</td></tr><tr><td>virginator fly stock&amp;nbsp;</td><td>bloomington drosophila stock center</td><td>#24638</td><td></td></tr><tr><td>Narrow Vials, Tray Pack (PS)</td><td>Genesee Scientific Corporation</td><td>&amp;nbsp;# 32-109BR</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila Media Recipes and Methods</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/molassesfood.htm</td><td></td></tr><tr><td>propionic acid</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>P5561</td><td></td></tr><tr><td>phosphoric acid</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>W290017</td><td></td></tr><tr><td>Methl 4-Hydroxybenzoate</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>H3647</td><td></td></tr><tr><td>Agar Agar</td><td>can be acquired by any company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>corn meal</td><td>can be acquired by any company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grandma&#039;s molasses</td><td>B&amp;amp;G Foods, Inc</td><td>not indicated</td><td></td></tr><tr><td>instant dry yeast</td><td>can be acquired by any company</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a simple way to measure alterations in reward-seeking behavior using drosophila melanogaster

Biz ödül devletler değişiklikler için bir vekil olarak meyve sinekleri etanol öz-yönetim (Drosophila melanogaster) ölçmek için bir protokol açıklar. Biz, sinek ödüllendirme sistemi içine dokunun doğal ödül ile ilgili deneyimlerini değiştirebilir ve ödül devletlerde değişiklikler için bir tedbir olarak gönüllü etanol tüketimi kullanmak için basit bir yol göstermektedir. yaklaşım iç devlet tecrübesi aracılı değişiklikler rol oynayan nöronlar ve genlerin çalışma ilgili bir araç olarak hizmet vermektedir. protokol iki ayrı bölümden oluşmaktadır: ödüllendirici ve nonrewarding deneyimleri sinekleri açığa ve bir ilaç ödül elde etmek için motivasyon bir önlem olarak gönüllü etanol tüketimi analiz edilmesi. iki kısmına, sırasıyla, bundan başka alt deneyleri için bir ilk adım olarak ya da bağımsız bir, iki seçim beslenme deneyi olarak deneyimi modülasyonu uyarılması için bağımsız olarak kullanılabilir. Protokol karmaşık bir kurulum gerektirmez ve bu nedenle herhangi LABORATOR uygulanabilirTemel sinek kültür araçları ile y.

FPreviously, Devineni ve diğ. meyve sinekleri etanol içeren gıda tüketmek için seçim verildiğinde, onlar yiyecek 6 içeren nonethanol üzerinde etanol içeren gıda için güçlü bir tercih görüntüler gösterdi. Burada gösterilen eğitim protokolü yaşanmadığını naif erkek sineklerin doğuştan etanol tercih tahlil zaman elde edilen bazı temsilcisi sonuçları. Naif Canton S erkek sinekler...

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster at JoVE.com

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

Biz ödüllendirici uyaran ve ödül devletlerde değişiklikler için bir tedbir olarak gönüllü etanol tüketimi ile meyve sinekleri (Drosophila melanogaster) deneyimleri nonrewarding için bir protokol açıklar.

Kullanımı Ödül arayan davranış değişiklikleri Tedbir Basit Yolu<em&gt; Drosophila melanogaster</em

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We ...

a-simple-way-to-measure-alterations-reward-seeking-behavior-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

8.3K Görüntüleme.  Bar-Ilan University.  Biz ödüllendirici uyaran ve ödül devletlerde değişiklikler için bir tedbir olarak gönüllü etanol tüketimi ile meyve sinekleri (Drosophila melanogaster) deneyimleri nonrewarding için bir protokol açıklar. 

Video: A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

Combining Quantitative Food-intake Assays and Forcibly Activating Neurons to Study Appetite in Drosophila

Food consumption is under the tight control of the brain, which integrates the physiological status, palatability, and nutritional contents of the food, and issues commands to start or stop feeding. Deciphering the processes underlying the decision-making of timely and moderate feeding carries major implications in our understanding of physiological and psychological disorders related to feeding control. Simple, quantitative, and robust methods are required to measure the food ingestion of animals after experimental manipulation, such as forcibly increasing the activities of certain target neurons. Here, we introduced dye-labeling-based feeding assays to facilitate the neurogenetic study of feeding control in adult fruit flies. We review available feeding assays, and then describe our methods step-by-step from setup to analysis, which combine thermogenetic and optogenetic manipulation of neurons controlling feeding motivation with dye-labeled food intake assay. We also discuss the advantages and limitations of our methods, compared with other feeding assays, to help readers choose an appropriate assay.

Combining Quantitative Food-intake Assays and Forcibly Activating Neurons to Study Appetite in Drosophila

Quantitative food-intake assays with dyed food provide a robust and high-throughput means to evaluate feeding motivation. Combining the food consumption assay with thermogenetic and optogenetic screens is a powerful approach to investigate the neural circuits underlying appetite in adult Drosophila melanogaster.

Nicel gıda alımı deneyleri birleştirerek ve zorla iştah Drosophila içinde çalışmaya nöronların aktive

Food consumption is under the tight control of the brain, which integrates the physiological status, palatability, and nutritional contents of the food, ...

Davranış

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular disease and various neurological diseases1. We have optimized simple and robust behavioral assays for determining larval locomotion, adult climbing ability (RING assay), and courtship behaviors of Drosophila. These behavioral assays are widely applicable for studying the role of genetic and environmental factors on fly behavior. Larval crawling ability can be reliably used for determining early stage changes in the crawling abilities of Drosophila larvae and also for examining effect of drugs or human disease genes (in transgenic flies) on their locomotion. The larval crawling assay becomes more applicable if expression or abolition of a gene causes lethality in pupal or adult stages, as these flies do not survive to adulthood where they otherwise could be assessed. This basic assay can also be used in conjunction with bright light or stress to examine additional behavioral responses in Drosophila larvae. Courtship behavior has been widely used to investigate genetic basis of sexual behavior, and can also be used to examine activity and coordination, as well as learning and memory. Drosophila courtship behavior involves the exchange of various sensory stimuli including visual, auditory, and chemosensory signals between males and females that lead to a complex series of well characterized motor behaviors culminating in successful copulation. Traditional adult climbing assays (negative geotaxis) are tedious, labor intensive, and time consuming, with significant variation between different trials2-4. The rapid iterative negative geotaxis (RING) assay5 has many advantages over more widely employed protocols, providing a reproducible, sensitive, and high throughput approach to quantify adult locomotor and negative geotaxis behaviors. In the RING assay, several genotypes or drug treatments can be tested simultaneously using large number of animals, with the high-throughput approach making it more amenable for screening experiments.

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster is a genetically and behaviorally tractable model system that has been used to understand the molecular and cellular basis of many important biological processes for over a century 1. Drosophila has been well exploited to gain insights into the genetic basis of fly behavior.

Test için Yöntemler Drosophila Davranış

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular ...

Nörobilim

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video article, we describe an automated assay to measure the effect of hunger or satiety on olfactory dependent food search behavior in the adult fruit fly Drosophila melanogaster. In a light-tight box illuminated by red light that is invisible to fruit flies, a camera linked to custom data acquisition software monitors the position of six flies simultaneously. Each fly is confined to walk in individual arenas containing a food odor at the center. The testing arenas rest on a porous floor that functions to prevent odor accumulation. Latency to locate the odor source, a metric that reflects olfactory sensitivity under different physiological states, is determined by software analysis. Here, we discuss the critical mechanics of running this behavioral paradigm and cover specific issues regarding fly loading, odor contamination, assay temperature, data quality, and statistical analysis.

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

In this video article, we describe an automated assay to measure the effect of hunger or satiety on olfactory dependent food search behavior in the adult fruit fly Drosophila melanogaster.

Toplayıcılık Davranış için Tek-sinek Deneyi<em&gt; Drosophila</em

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video ...

Drosophila'da Şeker Kaynaklı Yiyecek Arama Davranışının Analizi

Tracking Sugar-Elicited Local Searching Behavior in Drosophila

Foraging behavior is essential for the survival of organisms as it enables them to locate and acquire essential food resources. In Drosophila, hunger triggers a distinct search behavior following the consumption of small quantities of a sugar solution. This report presents a simple experimental setup to study sugar-elicited search behavior with the aim of uncovering the underlying mechanisms. Minute quantities of concentrated sugar solution elicit sustained searching behavior in flies. The involvement of path integration in this behavior has been established, as flies utilize their trajectory to return to the sugar location. The most recent findings provide evidence of temporal modulation in the initiation and intensity of the search behavior after sugar intake. We have also used this setup for artificial activation of specific taste-receptor neurons in the pharynx, which elicits the search behavior. The Drosophila neurogenetic toolkit offers a diverse array of tools and techniques that can be combined with the sugar-elicited search behavior paradigm to study the neural and genetic mechanisms underlying foraging. Understanding the neural basis of hunger-driven searching behavior in flies contributes to the field of neurobiology as a whole, offering insights into the regulatory mechanisms that govern feeding behaviors not only in other organisms but also in humans.

Yazar Spotlight: Yiyecek Arama ve İletişimde Türler Arası İçgörüler Yoluyla Davranışsal Yolları Keşfetmek

This protocol describes a behavioral assay for recording sugar-elicited search behavior using Drosophila melanogaster. The assay can be utilized to study feeding and foraging-related behaviors, as well as the underlying neuronal mechanisms.

Drosophila'da Şeker Kaynaklı Yerel Arama Davranışının İzlenmesi

Foraging behavior is essential for the survival of organisms as it enables them to locate and acquire essential food resources. In Drosophila, hunger ...

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. When selecting sites to deposit their eggs, female flies are capable of ranking the relative attractiveness of their options and choosing the &#34;greater of two goods.&#34; However, most egg-laying preference assays are not practical if one wants to take a systematic genetic screening approach to search for the circuit basis underlying this simple decision-making process, as they are population-based and laborious to set up. To increase the throughput of studying of egg-laying preferences of single females, we developed custom chambers that each can simultaneously assay egg-laying preferences of up to thirty individual flies as well as a protocol that ensures each female has a high egg-laying rate (so that their preference is readily discernable and more convincing). Our approach is simple to execute and produces very consistent results. Additionally, these chambers can be equipped with different attachments to allow video recording the egg-laying animals and to deliver light for optogenetics studies. This article provides the blueprints for fabricating these chambers and the procedure for preparing the flies to be assayed in these chambers.

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

This protocol describes a high throughput assay for testing egg-laying preferences of Drosophila melanogaster at single-animal resolution. This assay provides a simple, efficient, and scalable platform to identify genes and circuit components that control a simple decision-making process.

Yüksek Verimli Testi Bireyin Yumurta Yumurtlayan Tercihler incelemek için<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. ...

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of the right type and quantity of food therefore has a major influence on quality of life. Research on feeding behavior focuses on the underlying processes that ensure actual feeding and unravels the role of factors regulating internal energy homeostasis and the neuronal bases of decision-making. The model organism Drosophila melanogaster, with its great variety of genetically traceable tools for labeling and manipulating single neurons, allows mapping of neuronal networks and identification of molecular signaling cascades involved in the regulation of food intake. This report demonstrates the CApillary FEeder assay (CAFE) and shows how to measure food intake in a group of flies for time spans ranging from hours to days. This easy-to-use assay consists of glass capillaries filled with liquid food that flies can freely access and feed on. Food consumption in the assay is accurately determined using simple measurement tools. Herein we describe step-by-step the method from setup to successful execution of the CAFE assay, and provide practical examples to analyze the food intake of a group of flies under controlled conditions. The reader is guided through possible limitations of the assay, and advantages and disadvantages of the method compared to other feeding assays in D. melanogaster are evaluated.

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

The CApillary FEeder (CAFE) assay is a simple, budget-friendly, highly reliable method for investigating mechanisms underlying food intake. Used with the highly versatile genetic model organism Drosophila melanogaster, it provides a powerful means of gaining new insights into regulatory mechanisms of food intake.

Kılcal Besleyici Testi Gıda Alımını içinde Tedbirler<em&gt; Drosophila melanogaster</em

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of ...

Measuring and Altering Mating Drive in Male Drosophila melanogaster

Despite decades of investigation, the neuronal and molecular bases of motivational states remain mysterious. We have recently developed a novel, reductionist, and scalable system for in-depth investigation of motivation using the mating drive of male Drosophila&#160;melanogaster (Drosophila), the methods for which we detail here. The behavioral paradigm centers on the finding that male mating drive decreases alongside fertility over the course of repeated copulations and recovers over ~3 d. In this system, the powerful neurogenetic tools available in the fly converge with the genetic accessibility and putative wiring diagram available for sexual behavior. This convergence allows rapid isolation and interrogation of small neuronal populations with specific motivational functions. Here we detail the design and execution of the satiety assay that is used to measure and alter courtship motivation in the male fly. Using this assay, we also demonstrate that low male mating drive can be overcome by stimulating dopaminergic neurons. The satiety assay is simple, affordable, and robust to influences of genetic background. We expect the satiety assay to generate many new insights into the neurobiology of motivational states.

Measuring and Altering Mating Drive in Male Drosophila melanogaster

This article describes a behavioral assay that uses male mating drive in Drosophila melanogaster to study motivation. Using this method, researchers can utilize advanced fly neurogenetic techniques to uncover the genetic, molecular, and cellular mechanisms that underlie this motivation.

Ölçme ve Male Değiştirme Çiftleşme Sürücü<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Despite decades of investigation, the neuronal and molecular bases of motivational states remain mysterious. We have recently developed a novel, ...

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an oil-coated graduated cylinder; landing height provided a measure of flight performance by assessing how far flies will fall before producing enough thrust to make contact with the wall of the cylinder. Here we describe an updated version of the flight tester with four major improvements. First, we added a &#34;drop tube&#34; to ensure that all flies enter the flight cylinder at a similar velocity between trials, eliminating variability between users. Second, we replaced the oil coating with removable plastic sheets coated in Tangle-Trap, an adhesive designed to capture live insects. Third, we use a longer cylinder to enable more accurate discrimination of flight ability. Fourth we use a digital camera and imaging software to automate the scoring of flight performance. These improvements allow for the rapid, quantitative assessment of flight behavior, useful for large datasets and large-scale genetic screens.

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Here we describe a method for rapid and accurate measurement of flight performance in Drosophila, enabling high-throughput screening.

Uçuş Performans Doğru ve hızlı ölçüm için geliştirilmiş Yöntemi<em&gt; Drosophila</em

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an ...

Kullanımı Ödül arayan davranış değişiklikleri Tedbir Basit Yolu

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Nicel gıda alımı deneyleri birleştirerek ve zorla iştah Drosophila içinde çalışmaya nöronların aktive

Test için Yöntemler Drosophila Davranış

Toplayıcılık Davranış için Tek-sinek Deneyi

Drosophila'da Şeker Kaynaklı Yerel Arama Davranışının İzlenmesi

Drosophila'da Şeker Kaynaklı Yerel Arama Davranışının İzlenmesi

Drosophila'da Şeker Kaynaklı Yerel Arama Davranışının İzlenmesi

Yüksek Verimli Testi Bireyin Yumurta Yumurtlayan Tercihler incelemek için

Kılcal Besleyici Testi Gıda Alımını içinde Tedbirler

Ölçme ve Male Değiştirme Çiftleşme Sürücü

Uçuş Performans Doğru ve hızlı ölçüm için geliştirilmiş Yöntemi