Yazarlar resimli sanatsal yardım için Vanderbilt Üniversitesi Tıp Merkezi ve Melissa A. Musser az Akım Sitometri Paylaşılan Kaynak destek için hücre bölünme yöntemleri ve Kevin Weller, David Flaherty ve Brittany Matlock önerileri için Catherine Alford teşekkür etmek istiyorum. Biz Dr teşekkür ederim. Nöronal progenitörlerin izolasyon uygulanması konusunda tavsiye için Jack Mosher ve Sean Morrison. VMC Akım Sitometri Paylaşılan Kaynak Vanderbilt Ingram Kanser Merkezi (P30 CA68485) ve Vanderbilt Sindirim Hastalıkları Araştırma Merkezi (P30 DK058404) tarafından desteklenmektedir. Bu çalışma Sağlık hibe DK064251, DK086594 ve DK070219 ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından finanse tarafından desteklenmiştir.

1. Ortam hazırlanması (Tüm adımları doku kültürü davlumbaz yapılır) <ol><li> Aşağıdaki Kombine: 44 ml L-15 Orta, 0.5 ml 100X penisilin / streptomisin (P / S), 0.5 ml 100 mg / ml sığır serumu albümini (BSA), 0.5 ml HEPES 1M, 5 ml Doku Kültürü dereceli su. Eklemeden önce iyice BSA ve P / S karıştırmak için emin olun. Bu hacim kadar çözülmesi için beş farklı doku tiplerine uygun olmalıdır. Bu ortam, doku enzimatik ayrışma sonra kullanım için su verme çözümler hazırlamak için Adım 3,4 kullanılacaktır. </li><li> 0.22 mikron Polyethersulfone (PES) filtresi olsa Filtre Medya. </li><li> 1X Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) ve 1X Fosfat hazırlayın doku kültürü dereceli su kullanarak 10X Hisse Senetleri (PBS) Tamponlu Salin. 0.22 mikron PES filtre süzülür. Bu reaktiflerin büyük miktarları vaktinden önce hazırlanmış ve 4 ° C&#39;de saklandı, gerektiğinde, bir doku kültüründe davlumbaz daha küçük hacimli aliquoting edilebilir. </li><li> 1X HBSS, (birden fazla 15 ml konik tüpler doldurunEğer alt diseksiyon planı dokuların sayısı) buz üzerinde tüpleri tutarak eşit tüplerinin sayısı. </li></ol> 2. Diseksiyon <ol><li> 60 veya 100 mm petri içeren buz 1X PBS içine kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesi onaylanan protokoller ve transfer rahim uyarınca hamile fare zamanlanmış Euthanize. </li><li> Rahim embriyo çıkarın ve buz 1X PBS dekapitasyon yoluyla euthanize. Floresan aydınlatma altında bireysel Ekran, pozitif transgenik ve yabani tip (WT) nontransgenic havuzları bölünerek. Diseksiyon boyunca buz 1X PBS içinde embriyo tutun. </li><li> Bir mikroskop altında, ürogenital sistem alt-teşrih. Ince forseps ile ön ayaklardan düzeyde yer embriyo tutun. Sonra briskly aşağı ve dorsal vücut duvarı ile iç organları çekerek diyaframın düzeyinde forseps ekleyerek genital tüberkül için karaciğerden organlar aşağı doğru çıkarın. </li><li> Ek bir alt-dokuya tahliluzaklıkta çevreleyen doku (Şekil 1) faiz. Buz 1X HBSS içeren 15 ml konik tüp içine her biri ayrı ayrı alt disseke doku tipi yerleştirin. Havuz her bir doku tipi birlikte embriyo fenotipe göre (yani tüm GFP + fetal barsak örnekleri tek bir 15 ml&#39;lik konik tüp içinde birleştirilir). </li><li> Buna paralel olarak, akım sitometri de tazminat kontrolleri için kullanmak wild-tip embriyoların karşılaştırılabilir dokuları diseke. </li></ol> 3. Subdissected Dokuların Çözülme <ol><li> Pelet 5 dakika boyunca 210 bağıl santrifüj kuvveti (RCF), 4 ° C&#39;de santrifüje edilerek alt-dokuya disseke. Santrifüj sonrasında, mümkün olduğunca çok HBSS kapalı olarak aspire. </li><li> Doku tiplerinin çapraz bulaşmayı önlemek için her bir numune arasında pipet uçları değiştirmek için emin olmak, Accumax (Yenilikçi Cell Technologies, Inc) içinde doku pelletini. Accumax katma miktarı dokusunun büyük veya daha küçük tutarlar için ölçeklendirilebilir. Tipik olarak 1 için-5 Fetal barsak örnekleri, Accumax 1 ml kullanılacak ama büyük doku havuzu daha büyük bir hacmi ayrışma elde etmek isteyecektir. </li><li> 37 ° izole olan doku (örneğin 13.5 DPC bağırsağın 20 dakika, 15.5 DPC bağırsak 35 dk) aşamasına bağlı olarak 20-45 dakika C su banyosu. Icine koyun tüpler Halfway ayrışma zamanı olsa, elle su banyosu (ya da herhangi bir katı yüzeyi) tarafına karşı tüpü vurmak suretiyle ve (bir eski moda bir cıvalı termometre aşağı sallamak olur gibi) tüp &quot;Flicking&quot; ile doku ayrılıyoruz. Ayrışma süresi sonunda daha örnek ayırmak için prosedür birden çok kez aşağı sallamak tekrarlayın. Daha kırılgan örnekleri için, aşağı titremesinin vigorousness azaltmak ve ayrışma yerine uygun bir düzeyde sağlamak için Adım 3.5 sırasında triturasyonun pipet kullanın. DPC 14.5 ve 15.5 DPC LUT için tipik ayrışma kez sırasıyla 35 ve 45 dakika vardır. </li><li> Doku Accumax içinde kuluçkaya edilirken, Quenching yüzden makyajEtkin çözüm olarak adlandırılan Quench ve 1:5 Quench. Söndürmesinden 6 ml L-15 Ortam için 45 ul 5 mg / ml Dnaz i katarak yapılır. Quench 01:05 30 ml L-15 Media ila 45 ul 5 mg / ml Dnaz i katarak yapılır. </li><li> Ayrışmanın sonunda, buz üzerine 15 ml tüpler hareket ve hemen her tüpe 1 ml Quench ekleyin. Doku (Şekil 2) neredeyse tamamen ayrışmış kadar her numune yukarı ve aşağı öğütmek. Hareketsiz çözeltide doku mevcut bazı küçük parçalar olacaktır. Tamamen homojen örnek ulaşılması kolay ulaşılabilir ne de kötü hücre canlılığı ile sonuçlanabilir olarak istenen bir şey. </li><li> Protokol kalanı için mümkün olduğu kadar buz üzerinde örnek tutun. Quench veya örneklerin çapraz bulaşmayı önlemek için 01:05 Quench kadar pipetleme zaman taze bir pipet kullandığınızdan emin olun. </li></ol> 4. Hücre Süspansiyon Filtreleme <ol><li> % 70 etanole batırılmış edilmiştir forseps kullanarak üzerinde 38 mikron naylon örgü membranın kare, 3 cm (Sefar Amerika) koyunYeni bir 15 ml konik tüp ağız. Dar delik ipuçlarını kullanarak membran merkezi haline pipetleme tarafından mesh Filtre hücreleri. Membran filtre ederken doymuş hale gelirse, çıkarmak bir kimwipe olan tüpün ağız kuruması ve hücre süspansiyonu kalanı filtre naylon elekten yeni bir parçası kullanılır. Tüm hücrelerin filtre ettikten sonra, tüp yıkayın ve kalan hücrelerin filtre 1:5 Quench 1 ml kullanın. </li><li> Süzme tamamlanıncaya ya da tıkanmış bir membran değiştirirken, örgü iki rulo ve hücrelerin herhangi bir asılı damlacıkları kaldırmak için tüpün üstünde membran silmek için forseps kullanabilir. </li><li> 210rcf santrifüj ile pelet hücre süspansiyonu, 5 dakika süreyle 4 ° C. 1 ml Quench 1:5 süpernatan ve Pastör pipetiyle pelet kapalı aspire. </li><li> 5 ml polistiren tüpler içine naylon gözlü bir Filtre hücre süspansiyonu. 1 ml ile 15 ml tüp yıkayın 1:5 ve filtre kalan hücreler yakalamak için Quench. </li></ol> 5.. FACS için Örnekler hazırlanması <ol&gt; <li> Sıralama ve tazminat kontroller için aynı doku kullanıyorsanız, 1/10 th tazminat kontrolleri için kullanılacak yeni bir 5 ml polistiren tüp için örnek hacminin 1 / 20. transfer. Iki porsiyon halinde yaban-tip doku örneği böler. Ikinci yarı 7-Aminoactinomycin D (7-AAD, bir &quot;canlılığı lekesi&quot; olarak kullanılan canlı hücreler dahil bir floresan intercalator) sahip olacak iken bir kısmı (7-AAD sadece buna eklendi (Sadece WT) vahşi tip renksiz edilecektir ). Bunlar tek tek kontrol akışı sıralayıcı de ayrık florofor emisyon arasında bir spektral örtüşme tazminat sağlamak için gereklidir. Örneğin, EGFP gibi tek bir flüoresan raportör için, gerekli kontroller şunlardır: sadece boyanmamış WT hücreleri ve sadece 7-AAD (Şekil 3) ile boyanmış bir tüp EGFP. </li><li> 5 dk için 210rcf azından Quench 1:05 ve santrifüj, 4 ° C ile hücre süspansiyonu içeren bütün 5 ml&#39;lik tüplere doldurulur. Sıvı yaklaşık 200 ul bırakarak, süpernatan aspiretüpünde. </li><li> Quench 1:5 7-AAD 1:1000 sulandırınız. 7-AAD sadece kompanzasyon kontrolü ve sıralanmasını örnekleri 7-AAD boyama seyreltme ekleyin. Sadece EGFP veya WT sadece tazminat kontrolleri 7-tipi AAD katmayın. Hacmi elde edilen hücre peleti başlangıç ​​materyali ve boyuttaki miktarına bağlı olarak değişir eklenecek 7-AAD. 7-AAD uygun tüplere eklendikten sonra, örnekler sıralanabilir hazırız. <table border="1"><tbody><tr><td> Doku </td><td> Örnek Pool Boyut </td><td> Cilt tüp * eklenecek 7-AAD </td></tr><tr><td> 15.5 DPC Bağırsaklar </td><td> 1-5 </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td> 15.5 DPC LUT </td><td> 1-5 </td><td> 150 ul </td></tr></tbody></table> Medya aspirasyon olduğundan Tablo 1. Farklı doku ayrışarak her tüp * nihai toplam miktarın ilave 7-AAD miktarı 50-100 ul arasında değişen bir miktar değişecektir biryaklaşık proses n ve pellet önlemek için gerçekleştirilir. Nihai çözelti hacmi hücre işleme en aza indirecek şekilde ölçülen değildir. </li><li> 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri için 0.75 ml TRIzol-LS ekleyerek RNA izolasyonu için hücreleri yakalamak için toplama tüpleri hazırlayın. </li><li> Daha önce açıklandığı gibi in vitro kültür için hücrelerin yerine RNA izolasyonu toplamak, doğrudan 6 sıra doku kültürü plaklarda kendini yenileme ortamı içine tür hücreler, fibronektin kaplı ve medya ile dolu olursa. 2,6,7 </li></ol> 6. Akım Sitometri <ol><li> Akış sitometresi, geri kirlenmesini önlemek için her bir numune arasında temizlemek için emin olmak, ilk tazminat kontrolleri değerlendirmek. Sıralama için gerilim / kapıları ayarlamak için tazminat örneklerin profilleri kullanın. İstenen dokuda pozitif hücrelerin sınırlayıcı sayıda mevcut ise, farklı bir doku floresans yoğunluğunu ve hücre boyutuna sürece telafisi ayarlar oluşturmak için de kullanılabilir dikkatörnekleri arasında karşılaştırılabilir. </li><li> 7-AAD boya sürebilir ve lekesiz denetimleri (Şekil 4) GFP floresans göreli yüksek yoğunluklu sergileyen hücreleri toplamak ölü hücreleri önlemek için tazminat parametreleri ve kapıları ayarlayın. </li><li> Her mikrosantrifüj tüpüne maksimum 25.000 hücreleri sıralayın. Sıralama geniş çaplı nozul ve nöronal progenitör canlılığını korumak için düşük akış hızı (örneğin, 17psi, 100 mikron meme, 3000 olayları / sn) ile mümkün olan en düşük basınçta yapılmalıdır. Türlü EGFP + hücreler izole etmek için biz EGFP muhabiri heyecanlandırmak için bir 488nm 20mW lazer kullanarak BD Biosciences FACSAriaII bizim izolasyonlar gerçekleştirin. </li><li> Örneklerinde yüksek hücre konsantrasyonlarına içeriyorsa, o daha 7-AAD sıralarken yüksek yakalama verimi sağlamak üzere lekeyi 1:1000 kullanarak hücre süspansiyonu sulandırmak için tavsiye edilir. </li><li> Hemen sıralama sonrasında TRIzol-LS yakalanan hücrelerin Girdap Her bir tüp. </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar Akış sıralama için bir hücre süspansiyonları üretmek için Doku ayrışma yeterli enzimatik sindirimi ve düşük hücre canlılığı neden olabilir kaçınarak aşırı sindirim arasında hassas bir denge olduğunu. Doku ayrışma arzu edilen seviyede bir örnek, Şekil 2 &#39;de gösterilmiştir. Uygun bir şekilde sindirilir dokuda alt disseke organların el öğütme parçaları hala net bir şekilde ortaya çıkmadan (Şekil 2b, 2f). Enzimatik zaman ya da enzimin çok yüksek bir konsantrasyonda çok uzun bir süre boyunca tedavi edilmektedir dokularda, elde edilen süspansiyonun, doku herhangi bir rezidüel büyük parçaları (Şekil 2b, 2H) yoksundur. Filtreleme Uygun ayrışma ve manuel tipik olarak% 90 daha canlı hücreler sergilemek ve EGFP ifade yüksek düzeyde (Şekil 4) göstermek akım sitometri de sıralama profilleri üretmek. Bu yöntemle elde edilen hücre popülasyonlarının iyi göstermekcanlılığı ve EGFP yakalama + nöronal ataları için gating ile gen ekspresyon sonraki kültür veya analiz için yakalanabilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4188/4188fig1.jpg" /> Şekil 1. Fetal fare LUT olarak TH-EGFP + nöronal progenitörlerin Dağılımı. 15.5 DPC de Tüm-mount ürogenital sistem floresan aydınlatma (b) kapsamında belirlenen TH-EGFP transgen ifadesi ile etiketlenmiş EGFP + hücrelerinin dağılımı karşılaştırıldığında (a) aydınlık alan aydınlatma altında ventral izlendi. TH-EGFP ifade adrenaller (a) ve mediale yer çölyak ganglion (cg) mevcuttur. Pelvik ganglion (pg), mesane duvarında (bla) ve üretradan (u) transgen ifadeden floresans 15.5 DPC TH-EGFP alt disseke mesane sergileyen Yanal (c) görünümü. Dorsal görünümünde (d) EGFP + hücreleri dorsal anterior üretrada belirgindir. Diğer etiketler: böbrekler (k), testis (t), mesane (bla) ve genital tüberkül (gt). <imgalt = &quot;Şekil 2&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/4188/4188fig2.jpg&quot; /&gt; Şekil 2,. 15 fetal DPC LUT (a) ve bağırsak (e) &#39;aydınlık görüntüler, sırasıyla, ayrışma İnkübasyon sonunda, ayrışma inkübasyon periyodu boyunca yarım görüntülenmiştir önce manuel bozulması sonra parçalama (b, f), (c, g), ve bir örnek için (d, s) aşırı ayrışmış olmuştur. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4188/4188fig3.jpg" /> Şekil 3. Şematik titiz FACS yolluk parametreleri kurmak için gerekli tazminat kontrol göstermektedir. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/4188/4188fig4.jpg" /> Şekil 4. Akışı tür profilleri Temsilcisi görüntü 14.5 DPC (a) ve 15.5 DPC (b). Siyah nüfusun ölü öne ve yana yayılım dayalı tek hücreler oluşur tarafından etiketlenmiştir7-AAD floresans. Gri nüfusu 7-AAD dışlanmış ve böylece yaşayabilir olan öne ve yana yayılım dayalı tekli hücreler oluşur. Yeşil kapılı nüfus kutulu &quot;GFP +&quot; alanı ile gösterilir ve 7-AAD (canlı) hariç ve EGFP floresans sergilemek sahip tek hücre oluşur.

<ol>
	<li>Gong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+expression+atlas+of+the+central+nervous+system+based+on+bacterial+artificial+chromosomes.">A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes.</a> Nature. 425, 917-925 (2003).</li><li>Morrison, S. J., White, P. M., Zock, C., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification,+isolation+by+flow+cytometry,+and+in+vivo+self-renewal+of+multipotent+mammalian+neural+crest+stem+cells.">Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells.</a> Cell. 96, 737-749 (1999).</li><li>Kruger, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+stem+cells+persist+in+the+adult+gut+but+undergo+changes+in+self-renewal,+neuronal+subtype+potential,+and+factor+responsiveness.">Neural crest stem cells persist in the adult gut but undergo changes in self-renewal, neuronal subtype potential, and factor responsiveness.</a> Neuron. 35, 657-669 (2002).</li><li>Bixby, S., Kruger, G. M., Mosher, J. T., Joseph, N. M., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-intrinsic+differences+between+stem+cells+from+different+regions+of+the+peripheral+nervous+system+regulate+the+generation+of+neural+diversity.">Cell-intrinsic differences between stem cells from different regions of the peripheral nervous system regulate the generation of neural diversity.</a> Neuron. 35, 643-656 (2002).</li><li>Walters, L. C., Cantrell, V. A., Weller, K. P., Mosher, J. T., Southard-Smith, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+background+impacts+developmental+potential+of+enteric+neural+crest-derived+progenitors+in+the+Sox10Dom+model+of+Hirschsprung+disease.">Genetic background impacts developmental potential of enteric neural crest-derived progenitors in the Sox10Dom model of Hirschsprung disease.</a> Human Molecular Genetics. , (2010).</li><li>Corpening, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+live+imaging+of+enteric+progenitors+based+on+Sox10-Histone2BVenus+transgene+expression.">Isolation and live imaging of enteric progenitors based on Sox10-Histone2BVenus transgene expression.</a> Genesis. 49, 599-618 (2011).</li><li>Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Isolation of fetal rat neural crest stem cells (NCSC) from gut and sciatic nerve. , (2012).</li><li>Skarnes, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conditional+knockout+resource+for+the+genome-wide+study+of+mouse+gene+function.">A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function.</a> Nature. 474, 337-342 (2011).</li><li>Harding, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GUDMAP+database--an+online+resource+for+genitourinary+research.">The GUDMAP database--an online resource for genitourinary research.</a> Development. 138, 2845-2853 (2011).</li><li>Joseph, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+glia+are+multipotent+in+culture+but+primarily+form+glia+in+the+adult+rodent+gut.">Enteric glia are multipotent in culture but primarily form glia in the adult rodent gut.</a> J. Clin. Invest. 121, 3398-3411 (2011).</li><li>Newgreen, D. F., Murphy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+cell+outgrowth+cultures+and+the+analysis+of+cell+migration.">Neural crest cell outgrowth cultures and the analysis of cell migration.</a> Methods Mol. Biol. 137, 201-211 (2000).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Floresan gazetecilere ifade Fare muhabiri hatları fare genetik topluluk 1,8,9 birden fazla çabalarıyla yaygın olarak kullanılabilir hale gelmektedir. Bunun sonucu olarak Burada gösterilen çözünme yöntemi yaygın fetal veya yetişkin dokular ya gelen nörotransmiter veya reseptör salgılanma modellerini dayalı kesikli nöronal alt tiplerinin izolasyon için uygulanabilir. Bir flüoresan raportör transgen ifade göre bu yöntem optimize edilmiş olmakla birlikte, aynı zamanda hücrenin canlı imm?...

The authors middle initials were omitted from the publication of <a href="http://www.jove.com/video/4188">An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice</a>.

Erratum: An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Satıcı </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Accumax </td><td> Sigma (mfr: Yenilikçi Hücre Teknolojileri) </td><td> A7089-100ML </td><td> 1 ml hacme donmuş Mağaza </td></tr><tr><td> DNase I </td><td> Sigma </td><td> D-4527 </td><td> Depolanan -20 ° C 1xHBSS 5 mg / ml, (Quench Kullanılan, 1:5 Quench) </td></tr><tr><td> 10X PBS pH 7.4 </td><td> Gibco </td><td> 70011-044 </td><td> Sonra steril filtre doku kültürü dereceli su ile 1x Makyaj </td></tr><tr><td> 10X HBSS w / o Ca ya da Mg </td><td> Gibco </td><td> 14185-052 </td><td> Sonra steril filtre doku kültürü dereceli su ile 1x Makyaj </td></tr><tr><td> Leibovitz L-15 orta </td><td> Gibco </td><td> 21083027 </td><td></td></tr><tr><td> 100X penisilin / streptomisin </td><td> Gibco </td><td>15140-133 </td><td> Mağaza -20 ° C&#39;de bölünüp </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma </td><td> A3912-100G </td><td> -20 ° C&#39;de su içinde 100 mg / ml &#39;de bölünüp depolamak </td></tr><tr><td> Biowhittaker 1M% 0.85 NaCl HEPES </td><td> Lonza </td><td> 17-737E </td><td></td></tr><tr><td> 38 mikron NITEX Naylon Mesh Membran </td><td> Sefar Amerika </td><td> 3-38/22 </td><td> ~ 3 cm&#39;lik kareler halinde kesin. UV doku kültürü kaputu sterilize etmek için gece boyunca tedavi. </td></tr><tr><td> 7-AAD </td><td> Invitrogen </td><td> A1310 </td><td> 1 mg / ml </td></tr><tr><td> TRIzol LS </td><td> Invitrogen </td><td> 10296-028 </td><td></td></tr><tr><td> 5 ml polistiren tüpler </td><td> Şahin </td><td> 352058 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml&#39;lik tüplere konik </td><td> Corning </td><td> 430790 </td><td></td></tr><tr><td> Güzel Kesme Forseps </td><td> Güzel Bilim Aletleri </td><td> 11251-30 </td><td> Dumont # 5 forcep, Dumoxel, standart ucu 0.1x0.06mm </td></tr><tr><td> Kaşık Kesme </td><td> Güzel Bilim Aletleri </td><td> 10370-18 </td><td></td></tr></tbody></table>

an optimized procedure for fluorescence-activated cell sorting (facs) isolation of autonomic neural progenitors from visceral organs of fetal mice

Geliştirme nöral krest (NC) sırasında kaynaklı nöronal ataları bağırsak ve alt üriner sistem gibi iç organlarda otonomik gangliyonlar oluşturmak için nöral tüp uzağa göç. Lazer yakalama mikro diseksiyon gibi yöntemleri kullanarak ayrık nüfusların izolasyon zordur bu nedenle gelişimi sırasında ve olgun dokularda hem bu hücreler sıklıkla yaygın doku boyunca dağılmış bulunmaktadır. Onlar ancak Tirozin hidroksilaz (TH) gibi nöron spesifik genlerin düzenleyici bölgelerden sürülen floresan gazetecilere ifadesi doğrudan görüntülenebilmekte. Biz canlı TH yüksek verim + bağırsak ve bölünmeler ve floresan aktive hücre sıralama (FACS) dayalı alt üriner sistem (LUT) dahil fetal fare viseral dokular, gelen nöronal ataları için optimize edilmiş bir metodu tanımlar. Pe geni katekolaminlerin üretimi için hız sınırlama enzimi kodlayan. Enterik nöronal progenitörlerin TH dur ifade etmeye başlayacakfetal intestinal 1 ve TH onların göç ing de yetişkin pelvik ganglion nöronlar 2-4 bir alt kümesi mevcuttur. Bu soy ve bu LUT diğer yönlerine nöronlar ve bunların izolasyon dağılımının ilk görünümü tarif edilmemiştir. TH ifade Nöronal ataları transgen yapı Tg (Th-EGFP) DJ76Gsat/Mmnc 1 taşıyan farelerde EGFP ifade ile kolayca görüntülenebilmekte. Biz 0.5 DPC olarak fiş algılama sabah tayin, 15.5 gün sonrası cinsel birleşme (DPC) de gelişmekte LUT olarak TH dağıtım + hücreler belgelemek için fetal farelerde bu transgen ifade görüntülendi ve gözlenen coalescing nöronal ataları bir alt pelvik ganglion ekspres EGFP. LUT TH + nöronal ataları izole etmek için, başlangıçta fetal fare bağırsak 2-6 nöral krest kök hücreleri arındırmak için kullanılan yöntemlerin optimize edilmiş. Dayanılmıştır NC-türetilmiş nüfus izole önce çabalarıAkım sitometri için hücre süspansiyonları elde etmek kollajenaz ve tripsin bir kokteyl ile sindirim. Elimizdeki bu yöntemler nispeten düşük canlılığı ile LUT gelen hücre süspansiyonları üretti. Fetal LUT dokularda nöronal progenitörlerin zaten düşük insidansı göz önüne alındığında, son ayrışmaktadır hücre sağkalım artış olacağı gibi ayrışma yöntemleri optimize etmek için yola çıktı. Bizi aşağı analiz için yeterli nöronal progenitörlerin sonraki verimleri ile sürekli daha fazla yaşama (toplam hücrelerinin&gt;% 70) elde etmek için izin düşük basınçta sıralama bu nazik Accumax DİSOSİASYON (Yenilikçi Cell Technologies, Inc), otomatik filtreleme, ve akış belirlenir. Bu tarif yöntemi genel olarak fetal veya yetişkin için mürin dokular ya gelen nöronal popülasyonlarının çeşitli izole etmek için uygulanabilir.

Watch this Scientific Journal Video about An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting FACS Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice at JoVE.com

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting FACS Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

Fetal fare dokulardan nöral krest kaynaklı nöronal ataları arındırmak için optimize edilmiş bir prosedür anlatılmıştır. Bu yöntem, floresan ile aktive olan hücre sıralama (FACS) tarafından ayrı nüfus yalıtmak için floresan muhabiri allellerinin ifade yararlanır. Tekniğin geliştirilmesi boyunca veya yetişkin dokulardan nöronal subpopülasyonunun izole etmek için uygulanabilir.

Fetal Fare Visseral Organlardan Otonom Sinir progenitörlerin Floresans aktive Hücre Sıralama (FACS) İzolasyon için bir optimize Prosedürü

During development neural crest (NC)-derived neuronal progenitors migrate away from the neural tube to form autonomic ganglia in visceral organs like the ...

an-optimized-procedure-for-fluorescence-activated-cell-sorting-facs

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

13.6K Görüntüleme.  Vanderbilt University School of Medicine. Fetal fare dokulardan nöral krest kaynaklı nöronal ataları arındırmak için optimize edilmiş bir prosedür anlatılmıştır. Bu yöntem, floresan ile aktive olan hücre sıralama (FACS) tarafından ayrı nüfus yalıtmak için floresan muhabiri allellerinin ifade yararlanır. Tekniğin geliştirilmesi boyunca veya yetişkin dokulardan nöronal subpopülasyonunun izole etmek için uygulanabilir.

Video: An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting FACS Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ultimately give rise to intermediate progenitors and later, the various neuronal and glial cell subtypes that form the cerebral cortex. The capacity to generate and expand human NSCs (so called neurospheres) from discarded normal fetal tissue provides a means with which to directly study the functional aspects of normal human NSC development 1-5. This approach can also be directed toward the generation of NSCs from known neurological disorders, thereby affording the opportunity to identify disease processes that alter progenitor proliferation, migration and differentiation 6-9. We have focused on identifying pathological mechanisms in human Down syndrome NSCs that might contribute to the accelerated Alzheimer's disease phenotype 10,11. Neither in vivo nor in vitro mouse models can replicate the identical repertoire of genes located on human chromosome 21. 
Here we use a simple and reliable method to isolate Down syndrome NSCs from aborted human fetal cortices and grow them in culture. The methodology provides specific aspects of harvesting the tissue, dissection with limited anatomical landmarks, cell sorting, plating and passaging of human NSCs. We also provide some basic protocols for inducing differentiation of human NSCs into more selective cell subtypes.

A simple and reliable method on isolation and culture of neural stem cells from discarded human fetal cortical tissue is described. Cultures derived from known human neurological disorders can be used for characterization of pathological cellular and molecular processes, as well as provide a platform to assess pharmacological efficacy.

Atılan İnsan Fetal Kortikal Doku Sinir Kök Hücre Üretimi

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

Nörobilim

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Embriyonik Mürin Nöral Tüp çıkan sinirsel Crest Hücre İzolasyonu ve Kültür

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout the developing vertebrate embryo. In addition to providing peripheral glia and neurons, NCC generate melanocytes as well as most of the cranio-facial skeleton. NCC migration and differentiation is controlled by a combination of their axial origin along the neural tube and their exposure to regionally distinct extracellular cues. Such contribution of extracellular ligands is especially evident during the formation of the enteric nervous system (ENS), a complex interconnected network of neural ganglia that locally controls (among other things) gut muscle movement and intestinal motility. Most of the ENS is derived from a small initial pool of NCC that undertake a long journey in order to colonize - in a rostral to caudal fashion - the entire length of the prospective gut. Among several signaling pathways known to influence enteric NCC colonization, GDNF/RET signaling is recognized as the most important. Indeed, spatiotemporally controlled secretion of the RET ligand GDNF by the gut mesenchyme is chiefly responsible for the attraction and guidance of RET-expressing enteric NCC to and within the embryonic gut. Here, we describe an ex vivo cell migration assay, making use of a transgenic mouse line possessing fluorescently labeled NCC, which allows precise quantification of enteric NCC migration potential in the presence of various growth factors, including GDNF.

We present an ex vivo cell migration assay that allows precise quantification of enteric neural crest cell migration potential in the presence of various growth factors.

Kemirgen Enterik Sinir progenitörlerin için Kantitatif Hücre Göç Tahlili

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult neural stem cells in vitro. These assays can be used to compare the precursor potential of cells isolated from genetically different or differentially treated animals&#160;to determine the effects of exogenous factors on neural precursor cell proliferation and differentiation and to generate neural precursor cell lines that can be assayed over continuous passages. The neurosphere assay is traditionally used for the post-hoc identification of stem cells, primarily due to the lack of definitive markers with which they can be isolated from primary tissue&#160;and has the major advantage of giving a quick estimate of precursor cell numbers in brain tissue derived from individual animals. Adherent monolayer cultures, in contrast, are not traditionally used to compare proliferation between individual animals, as each culture is generally initiated from the combined tissue of between 5-8 animals. However, they have the major advantage that, unlike neurospheres, they consist of a mostly homogeneous population of precursor cells and are useful for following the differentiation process in single cells. Here, we describe, in detail, the generation of neurosphere cultures and, for the first time, adherent cultures from individual animals. This has many important implications including paired analysis of proliferation and/or differentiation potential in both the subventricular zone (SVZ) and dentate gyrus (DG) of treated or genetically different mouse lines, as well as a significant reduction in animal usage.

Here we describe a detailed protocol for the simultaneous generation of neural precursor cell cultures, as either adherent monolayers or neurospheres, from the subventricular zone and dentate gyrus of individual adult mice.

Bir Fare, İki Kültür: İzolasyon ve Yetişkin Nöral Kültür Bireysel Farelerde iki Nörojenik Bölgeler&#39;den Kök Hücre

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant cell type in the brain, neurons are the most widely studied of these cell types given their direct role in impacting behaviors. Other cell types in the brain also impact neuronal function and behavior via the signaling molecules they produce. Neuroscientists must understand the interactions between the cell types in the brain to better understand how these interactions impact neural function and disease. To date, the most common method of analyzing protein or gene expression utilizes the homogenization of whole tissue samples, usually with blood, and without regard for cell type. This approach is an informative approach for examining general changes in gene or protein expression that may influence neural function and behavior; however, this method of analysis does not lend itself to a greater understanding of cell-type-specific gene expression and the effect of cell-to-cell communication on neural function. Analysis of behavioral epigenetics has been an area of growing focus which examines how modifications of the deoxyribonucleic acid (DNA) structure impact long-term gene expression and behavior; however, this information may only be relevant if analyzed in a cell-type-specific manner given the differential lineage and thus epigenetic markers that may be present on certain genes of individual neural cell types. The Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) technique described below provides a simple and effective way to isolate individual neural cells for the subsequent analysis of gene expression, protein expression, or epigenetic modifications of DNA. This technique can also be modified to isolate more specific neural cell types in the brain for subsequent cell-type-specific analysis.

The goal of this protocol is to use the fluorescence activated cell sorting (FACS) technique to sort specific types of neural cells for subsequent analysis of cell-type-specific gene expression, epigenetic markers, and or protein expression.

Sıçan beyin dokusunda incelemek için THP kullanılarak hücre-tipi-spesifik gen ifadesi

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. They successively generate transit amplifying cells (TACs) and neuroblasts that differentiate into neurons once they integrate the olfactory bulbs. Emerging fluorescent activated cell sorting (FACS) techniques have allowed the isolation of NSCs as well as their progeny and have started to shed light on gene regulatory networks in adult neurogenic niches. We report here a cell sorting technique that allows to follow and distinguish the cell cycle dynamics of the above-mentioned cell populations from the adult SVZ with a LeX/EGFR/CD24 triple staining. Isolated cells are then plated as adherent cells to explore in details their cell cycle progression by time-lapse video microscopy. To this end, we use transgenic Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) mice in which cells are red-fluorescent during G1 phase due to a G1 specific red-Cdt1 reporter. This method has recently revealed that proliferating NSCs progressively lengthen their G1 phase during aging, leading to neurogenesis impairment. This method is easily transposable to other systems and could be of great interest for the study of the cell cycle dynamics of brain cells in the context of brain pathologies.

We report a Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)-based method to isolate neural stem cells (NSCs) and their progeny from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain. Applied to Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) transgenic mice, it allows the study of cell cycle progression by live imaging.

Hücre Yetişkin Fare subventricular Bölgesinden Nöral Kök ve Progenitör Hücreler Sıralama ve Hücre Döngüsü Dynamics Canlı görüntüleme

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific sets of sparsely distributed activated neurons called neuronal ensembles that mediate learned associations. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) has recently been optimized for adult rat brain tissue and allowed isolation of activated neurons using antibodies against the neuronal marker NeuN and Fos protein, a marker of strongly activated neurons. Until now, Fos-expressing neurons and other cell types were isolated from fresh tissue, which entailed long processing days and allowed very limited numbers of brain samples to be assessed after lengthy and complex behavioral procedures. Here we found that yields of Fos-expressing neurons and Fos mRNA from dorsal striatum were similar between freshly dissected tissue and tissue frozen at -80 &#186;C for 3 - 21 days. In addition, we confirmed the phenotype of the NeuN-positive and NeuN-negative sorted cells by assessing gene expression of neuronal (NeuN), astrocytic (GFAP), oligodendrocytic (Oligo2) and microgial (Iba1) markers, which indicates that frozen tissue can also be used for FACS isolation of glial cell types. Overall, it is possible to collect, dissect and freeze brain tissue for multiple FACS sessions. This maximizes the amount of data obtained from valuable animal subjects that have often undergone long and complex behavioral procedures.

Fluorescence Activated Cell Sorting FACS and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Here we present a Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) protocol to study molecular alterations in Fos-expressing neuronal ensembles from both fresh and frozen brain tissue. The use of frozen tissue allows FACS isolation of many brain areas over multiple sessions to maximize the use of valuable animal subjects.

Floresan Aktif Hücre Sıralama (FACS) ve Taze ve Dondurulmuş Rat Beyin Dokusu gelen Fos-ifade nöronlar Gen İfadesi Analizi

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific ...

Isolation and Cultivation of Neural Progenitors Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

Brain development is a complex process, which is controlled in a temporo-spatial manner by gradients of morphogens and different transcriptional programs. Additionally, epigenetic chromatin modifications, like histone methylation, have an important role for establishing and maintaining specific cell fates within this process. The vast majority of histone methylation occurs on the flexible histone tail, which is accessible to histone modifiers, erasers, and histone reader proteins. In contrast, H3K79 methylation is located in the globular domain of histone 3 and is implicated in different developmental functions. H3K79 methylation is evolutionarily conserved and can be found in a wide range of species from Homo sapiens to Saccharomyces cerevisiae. The modification occurs in different cell populations within organisms, including neural progenitors. The location of H3K79 methylation in the globular domain of histone 3 makes it difficult to assess. Here, we present methods to isolate and culture cortical progenitor cells (CPCs) from embryonic cortical brain tissue (E11.5-E14.5) or cerebellar granular neuron progenitors (CGNPs) from postnatal tissue (P5-P7), and to efficiently immunoprecipitate H3K79me2 for quantitative PCR (qPCR) and genome-wide sequencing.

We present an effective and reproducible method to isolate and culture neural progenitor cells from embryonic and postnatal brain tissue for chromatin immunoprecipitation (ChIP) of histone 3 lysine 79 dimethylation (H3K79me2) - a histone mark located within the globular domain of histone 3.

Yalıtım ve sinirsel ataları Kromatin-Immunoprecipitation Histon 3 lizin 79 Dimethylation Mark tarafından takip tarımı

Brain development is a complex process, which is controlled in a temporo-spatial manner by gradients of morphogens and different transcriptional programs. ...

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can be cultured in defined media for 16 days in vitro and are amenable to any analyses typically performed on dissociated cultures, including electrophysiological, morphological and survival analyses. The major advantage of these cultures is that specific cell types can be selectively studied in the absence of complex external influences, such as those arising from glial cells or other neuron types. When planning experiments with purified cells, however, it is important to note that neurons strongly depend on glia-conditioned media for their growth and survival. In addition, glutamatergic neurons further depend on glia-secreted factors for the establishment of synaptic transmission. We therefore also describe a method for co-culturing neurons and glial cells in a non-contact arrangement. Using these methods, we have identified major differences between the development of GABAergic and glutamatergic neuronal networks. Thus, studying cultures of purified neurons has great potential for furthering our understanding of how the nervous system develops and functions. Moreover, purified cultures may be useful for investigating the direct action of pharmacological agents, growth factors or for exploring the consequences of genetic manipulations on specific cell types. As more and more transgenic animals become available, labeling additional specific cell types of interest, we expect that the protocols described here will grow in their applicability and potential.

This protocol describes a cell sorting based method for the purification and culture of fluorescent GABAergic or glutamatergic neurons from the neocortex and hippocampus of postnatal mice or rats.

Floresans ile kurulan Purified Gabaerojik veya glutamaterjik nöronların primer hücre kültürü-aktif hücre sıralama

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...

Dissection of Pelvic Autonomic Ganglia and Associated Nerves in Male and Female Rats

The bilateral major pelvic ganglia (MPG; synonym, pelvic ganglia) are the primary source of postganglionic sympathetic and parasympathetic neurons innervating pelvic organs of rodents; the functionally equivalent structure in humans is the inferior hypogastric plexus. The major pelvic ganglia also provide the route by which lumbar and sacral sensory axons reach the pelvic organs. These complex, mixed ganglia can prove challenging to identify and dissect for further experimental study of normal autonomic mechanisms or to establish preclinical models of disease, injury or visceral pain. Here we describe a protocol to access and visualize these ganglia and their associated nerve tracts. We provide this protocol with schematics for both male and female rats, as the ganglion size and landmarks for identification differ between sexes. The protocol describes removal of the ganglion for in vitro studies, but this method can be integrated into a surgical recovery protocol for experimental interventions (e.g., nerve crush, nerve resection) or for mapping neuronal circuits (e.g., by microinjection of neural tracers). We also demonstrate the primary structures of the ganglion and its associated nerves immediately following dissection and following immunohistochemical staining.

The major pelvic ganglia contain parasympathetic and sympathetic neurons that innervate pelvic organs. Here we describe a dissection method and provide schematics for identification of these ganglia and their associated nerves. These methods can be applied to experimental manipulation of these ganglia in vivo or removal post-mortem for further study.