Bu çalışma UCLA-CURE Merkezi, Crohn ve Amerika Kariyer Geliştirme Ödülü (# 2691) ve Sağlık NIDDK K01 Ulusal Enstitüsü (DK084256) Hon Wai Koon finansman Kolit Vakfı Pilot ve Fizibilite Çalışması hibe ile finanse edildi. Kemik iliği ışınlama işlemi Bernard Levin ve AIDS Araştırma Fare / İnsan Chimera Çekirdek tesisi için UCLA Merkezi&#39;nde Scott Mutfak tarafından yardım edildi. Flow sitometri çalışması UCLA Vektörel Çekirdek tesisi tarafından yardım edildi.

1. Önce-sen-start Teknik Hususlar <ol><li> Ilgili CD molekülleri ile farelerin büyük fare satıcılardan satın alınabilir çünkü deney için C57/BL6 wild-tip farelerden ve nakavt fareler hem kullanmanızı öneririz. </li><li> Bunu wild-tip farelerden ve kemik iliği transplantasyonu sonrası donör hücreleri türetilmiş nakavt fareler izlemek zor olduğundan, wild-tip farelerden temsil CD45.1 fareler kullanmak gereklidir. (CD45.1 C57/SJL WT farelerde Jackson Laboratuvarları stok # 002014). </li><li> En çok fare koloniler CD45.2 vardır. Bizim knockout farelerde CD45.2 genotipi (: Jackson Laboratuvarları stok # 000664 alternatif bir CD45.2 WT farelerde kaynağı) aittir. CD45.1 veya CD45.2 genotip tayini bu protokolde 7. bölümünde belirtildiği gibi kemik iliği ve periferik kan akım sitometri kullanılarak yapılabilir. </li><li> Işınlama sonrasında Fare bağışıklık tehlikeye. Patojen free özelliği fareler tutun. </li><li> Işınlayıcı Operasyonu özel güvenlik clearanc gerektirire ve eğitim. Eğitim ve onay süreçlerinde zamandan tasarruf etmek için, bu ışınlayıcı çalisabilir kalifiye bir teknisyen ile bir laboratuar ile işbirliği için en iyisidir. </li><li> Birçok kurum deneyimli teknisyenler ile akım sitometri laboratuvarları vardır. Akım sitometri işlemi ile ilgili sorunları en aza indirmek için, başlamadan önce deneyimli teknisyen ile akım sitometri deneme planı tartışmak daha iyidir. </li><li> Fare bu şekilde (grup başına 10 fare) ayrıldılar: </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Grup </td><td></td><td> Alıcıya Kemik iliği donör </td><td> Tedavi </td></tr><tr><td> A </td><td> BM döviz </td><td> CD45.1 WT CD45.2 KO </td><td> DSS kolit </td></tr><tr><td> B </td><td></td><td></td><td> Su normal kontrol </td></tr><tr><td> C </td><td> BM döviz </td><td> CD45.1 WT CD45.2 KO </td><td> DSS kolit </td></tr><tr><td> D </td><td></td><td></td><td> Su normal kontrol </td></tr><tr><td> E </td><td> Sahte </td><td> CD45.1 WT CD45.1 WT </td><td> DSS kolit </td></tr><tr><td> F </td><td></td><td></td><td> Su normal kontrol </td></tr><tr><td> G </td><td> Sahte </td><td> CD45.2 KO CD45.2 KO </td><td> DSS kolit </td></tr><tr><td> H </td><td></td><td></td><td> Su normal kontrol </td></tr></tbody></table> Deneysel protokol * Bir kısa açıklama Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. 2. Alıcı Fare Işınlama <ol><li> Fare yetiştirilen ve patojen-free özelliği tutulur. Filtre ile otoklavlanmış ışınlama pasta koyun fareler. Işınlama pasta her yuvaya bir fare yerleştirin. Işınlayıcı içine pasta yerleştirin ve pikap ve pasta dönüm emin olun. </li><li> Hava pompasını açınhavalandırma için. Işınlayıcı kapağını kapatın ve kilitleyin. </li><li> 10 dk (radyasyon kaynağı ve yarılanma ömrü bağlı olarak) yaklaşık 1,000 rad (10 Gy eşdeğer) sahip fareler ışın. Bu sefer noktadan itibaren, ışınlanmış farelerde immün yetmezlikli ve enfeksiyona karşı zayıf dokunulmazlığım var. Radyasyon sonrası, pasta almak ve hayvan tesis biyogüvenlik kabini ulaşım için steril bir kap içinde yerleştirin. Enfeksiyon riskini en aza indirmek için dış ortama farelerin maruz bırakmaktan kaçının. </li><li> Biyogüvenlik kabini içinde, otoklava yatak (. - 100 ml su başına 3.12 ml kafes başına 4 fare sulfatrim süspansiyon ile yeni steril su ekleyin) ile otoklavlanmış fare kafesleri içine fare aktarın. </li><li> Antibiyotikler ışığa duyarlı olarak alüminyum folyo ile su şişesi sarın. Kafesine yerleştirmeden önce iyice sulfatrim solüsyonu şişesi karıştırmak için sallayın. </li></ol> 3. Donör Kemik İliği Ekstraksiyon <ol><li> Karbon dioksit ya da isoflur ile fareler kurban edinmesafeler ve 1:200 Lysol çözeltisi daha sonra batırmayın. Deri ıslak ve açık kemikleri incelemek için% 70 etanol ile farelerin püskürtün. </li><li> Sterilizasyon için% 70 etanol içinde diseksiyon aletleri bekletin. </li><li> Bir biyogüvenlik kabine diseksiyon gerçekleştirin. Kaslar ve bağlar ekleme ücretsiz humerus, femur, tibia ve fibula kemikleri açığa çıkarmak için steril diseksiyon aletleri kullanın. </li><li> Kırmızı kemik iliği göstermek için kemiklerin iki ucu açık kesin. Forseps ile kemikleri tutun. Bir Petri kabı 3 ml şırınga ve 25G iğne ile soğuk PBS ile kırmızı kemik iliği çalkalayın. Daha fazla kemik iliği hücreleri elde etmek için kemik her iki ucundan yıkayın. </li><li> Tekrarlanan aspirasyon ve ejeksiyon tarafından kırmızı kemik iliği fişleri kırmak için 6 ml şırınga ve 18G1 / 2 iğne kullanın. 50 ml Falcon tüpleri ile kemik iliği aktarın. </li><li> 5 dakika 4 ° C için 1,800 rpm kemik iliği aşağı Spin 5-10 sn vorteks süpernatant, tekrar süspansiyon pelet atın. </li><li> Steril su ile 10X RBC lizis tamponu ile seyreltilir. Iland 1X RBC lizis tamponu (donör fare başına 5 mi), 5 saniye süreyle yeniden girdap ve oda sıcaklığında tam olarak 3 dakika tut. </li><li> 3 dakika sonra, lizis ve karışım durdurmak için 20 ml soğuk PBS ile boru doldurun. Doğrudan yeni bir 50 ml Falcon tüp içine, 40 mikron hücre süzgecinden içerik dökün. </li><li> 5 ml PBS ile durulayın ve orijinal tüpler gibi bir hücre süzgecinden transfer. PBS ve karışımı ile 50 ml kadar ekleyiniz. </li></ol> 4. Kemik İliği Donör Hücreleri Sayma <ol><li> Bir Eppendorf tüp ve bir Eppendorf tüp ve karıştırmak için kemik iliği süspansiyon 100 ul Tripan mavisi 100 ul ekleyin. Hemasitometre için lekeli hücre karışımı pipet. </li><li> Hücrelerin miktarı Falcon tüpleri içinde toplam canlı kemik iliği hücre sayısı = boyanmamış hücre sayısı 16 kareler x 2 (Tripan mavi seyreltme bağlı olarak) x 10,000 x 50 ml hesaplanır </li><li> 5 dakika 4 ° C için 2,000 rpm&#39;de 50 ml Falcon tüpleri içinde kemik iliği hücreleri aşağı Spin </li><li> Süpernatantı. Merkezlitoplam hücre sayıları, ml başına 1 x 10 8 hücre PBS ile pelet tekrar süspansiyon </li></ol> 5. Alıcı Fare için İnfüzyon <ol><li> Bir ısı pedi ve bir ısınma lamba altında alıcı fareler ısıtın. Süzgeç, alıcı fareler koyun. Intravenöz 100-200 ul fare başına 1 x 10 7 hücre enjekte edilir. </li><li> Donör kemik iliği enjeksiyonu ışınlama sonrasında 4-24 saatleri arasında yapılmalıdır. </li><li> Kafes başına 4 enjekte edilmiş farelere kadar tutun. Patojen ücretsiz hayvan tesisi ilk 4 hafta boyunca antibiyotik ile tedavi edilen su ile otoklava kafeslerde enjekte alıcı fareler Bakım ve farelerin bağışıklık kazanmak izin. Değişim kafesleri, antibiyotik ile tedavi edilen su ve gıda her 4 günde bir hijyen sağlamak için. </li></ol> 6. Kolit Kolit ve Değerlendirme İndüksiyon <ol><li> 4 hafta radyoterapi ve kemik iliği nakli sonrası, normal yeniden antibiyotik vermeden düzenli su geçiş ve 2 hafta daha farelerin korumakmikroflora gut. </li><li> 6 hafta kemik iliği enjeksiyonu sonrası, başlangıç ​​vücut ağırlığı ölçmek. Bazı farelerde kolit indüklemek için su ad libitum içme içinde% 5 dekstran sülfat verilmiştir. Bazı fareler sadece normal kontrol grubu olarak normal içme suyu verilir. </li><li> 5 gün sonra, periferik kan geri heparin kaplı borular (Vacutainer) aktarmak ve buz tutmak. 1 tüp 4 farelerden alınan kan Sandalye. Hücre boyama tampon = 600 ul 300 ul kan 300 ul birleştirin. 100 ul 5 Eppendorf tüpleri, her kan bölün. </li><li> Karbon dioksit ya da izofluran ile fareler kurban edin. Makroskopik hasar skorları (ayrıntılar için 1 için başka JOVE video yayın bakınız) değerlendirin. Vücut ağırlığı değişimi ölçün. Dijital kumpas ile ölçün barsak uzunluğu ve kalınlığı. Dışkı dokusu (sert, yumuşak veya kanlı) gözlemleyin. Hemooccult ile dışkıda gizli kan belirleyin. Kolon dokularında inceleyin ve H &amp; E boyama için formalin düzeltin. </li><li> 1 femur bo teşrihne başı fare kemik iliği ayıklamak ve 25G iğne ve 1 ml şırınga ile soğuk PBS ile kemik iliği yıkayın. Havuz 4 kemik iliği 1 tüp takılır ve buz tutmak. </li><li> Hiçbir kemik iliği fişi kalkıncaya kadar Petri, makaslama 18G iğne ve 5 ml şırınga ile birkaç kez kemik iliği fişine kemik iliği dökün. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 1500 devir ile aşağı Spin Süpernatant ve 600 ul hücre boyama tamponu ile tekrar süspansiyon çıkarın. 100 ul 5 Eppendorf tüpleri, her yeniden süspanse kemik iliği bölün. </li></ol> 7. Akış sitometri yöntemi ile Kemik İliği Transplantasyonu Kalite Kontrol <ol><li> Kan veya kemik iliği # 1-5 her numune tüpleri Etiket: </li><li> Karanlık olarak her bir ilgili tüp için antikor karışım hazırlayın. </li></ol> # 1 Hayır antikoru # 2 30 ul FITC izotip kontrol + 30 ul PE izotip kontrol + 15 ul CD16/32 engelleme # 3 30 ul FITC CD45.1 Ab + 15 ul CD16/32 engelleme # 4 30 ul PECD45.2 Ab + 15 ul CD16/32 engelleme # 5 30 ul FITC CD45.1 Ab + 30 ul PE CD45.2 Ab + 15 ul CD16/32 engelleme <table border="1"><tbody><tr><td> Kan veya kemik iliği örneği # 1 şey ekle </td></tr><tr><td> Her kan veya kemik iliği örneği # 2 antikor karışımı arasında 2. 5 ul ekleyin </td></tr><tr><td> Her kan veya kemik iliği örneği # 3 antikor karışımı 3. 3 ul ekleyin </td></tr><tr><td> Her kan veya kemik iliği örneği # 4 antikor karışımı 4. 3 ul ekleyin </td></tr><tr><td> Her kan veya kemik iliği örneği # 5 antikor karışımı # 5 5 ul ekleyin </td></tr></tbody></table><ol start="3"><li> 30 dakika buz içinde karanlıkta saklayın. </li><li> Her tüpe 2 ml 1X eritrosit lizis tamponu ekleyin. 15 dakika boyunca buz üzerinde karanlıkta saklayın. </li><li> 5 dakika 4 ° C&#39;de 1,500 rpm&#39;de hücreleri aşağı Spin (GH 3.8 rotor 1.500 rpm = 350 xg) Süpernatantı. Koyu, daha sonra girdaplı kısa bir süre içinde 500 ul hücre boyama tamponu ile pelet yeniden süspanse edin. </li&gt; <li> Flow sitometri ile immunohistokimyasal kan ve kemik iliği örneklerinde CD45.1 (WT temsilen) ve CD45.2 (KO temsilen) kontrol edin. KO CD45.2 temsil WT CD45.1 ve PE temsil FITC seçin. </li><li> FlowJo yazılım tarafından flow sitometri sonuçları analiz edin. PE oranı veya PE: FITC oranını hesaplayın FITC oranı donör genotipi kan ve kemik iliğinde baskın genotip olup olmadığını belirlemek için. </li></ol>

<ol>
	<li>Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+Intestinal+Inflammation+in+DSS-induced+Model+of+IBD.">Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD.</a> J. Vis. Exp. (60), e3678 (2012).</li><li>Ungaro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+Toll-like+receptor+4+antagonist+antibody+ameliorates+inflammation+but+impairs+mucosal+healing+in+murine+colitis.">A novel Toll-like receptor 4 antagonist antibody ameliorates inflammation but impairs mucosal healing in murine colitis.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 296, 1167-1179 (2009).</li><li>Castagliuolo, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effects+of+neurokinin-1+receptor+during+colitis+in+mice:+role+of+the+epidermal+growth+factor+receptor.">Protective effects of neurokinin-1 receptor during colitis in mice: role of the epidermal growth factor receptor.</a> Br. J. Pharmacol. 136, 271-279 (2002).</li><li>Koon, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cathelicidin+signaling+via+the+Toll-like+receptor+protects+against+colitis+in+mice.">Cathelicidin signaling via the Toll-like receptor protects against colitis in mice.</a> Gastroenterology. 141, 1852-1863 (2011).</li><li>Lee, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=marrow+cells+in+murine+colitis:+multi-signal+analysis+confirms+pericryptal+myofibroblast+engraftment+without+epithelial+involvement.">marrow cells in murine colitis: multi-signal analysis confirms pericryptal myofibroblast engraftment without epithelial involvement.</a> PLoS One. 6, e11 (2011).</li><li>Deng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+cell+therapy+using+bone+marrow-derived+stem+cells/endothelial+progenitor+cells+to+accelerate+neovascularization+in+healing+of+experimental+ulcerative+colitis.">New cell therapy using bone marrow-derived stem cells/endothelial progenitor cells to accelerate neovascularization in healing of experimental ulcerative colitis.</a> Curr. Pharm. Des. 17, 1643-1651 (2011).</li><li>Valcz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoid+aggregates+may+contribute+to+the+migration+and+epithelial+commitment+of+bone+marrow-derived+cells+in+colonic+mucosa.">Lymphoid aggregates may contribute to the migration and epithelial commitment of bone marrow-derived cells in colonic mucosa.</a> J. Clin. Pathol. 64, 771-775 (2011).</li><li>Takaba, J., Mishima, Y., Hatake, K., Kasahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+bone+marrow-derived+monocytes/macrophages+in+the+repair+of+mucosal+damage+caused+by+irradiation+and/or+anticancer+drugs+in+colitis+model.">Role of bone marrow-derived monocytes/macrophages in the repair of mucosal damage caused by irradiation and/or anticancer drugs in colitis model.</a> Mediators Inflamm. 2010, 634145 (2010).</li><li>Bakhautdin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+role+of+macrophage-derived+ceruloplasmin+in+inflammatory+bowel+disease.+.">Protective role of macrophage-derived ceruloplasmin in inflammatory bowel disease. .</a> Gut. , (2012).</li><li>Seta, N., Kuwana, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+multipotent+progenitors+from+human+circulating+CD14++monocytes.">Derivation of multipotent progenitors from human circulating CD14+ monocytes.</a> Exp. Hematol. 38, 557-563 (2010).</li><li>Crain, B. J., Tran, S. D., Mezey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplanted+human+bone+marrow+cells+generate+new+brain+cells.">Transplanted human bone marrow cells generate new brain cells.</a> J. Neurol. Sci. 233, 121-123 (2005).</li><li>Finnberg, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+and+antitumor+effects+of+GFP(+)+bone+marrow-derived+cells+homing+to+syngeneic+mouse+colon+tumors.">High-resolution imaging and antitumor effects of GFP(+) bone marrow-derived cells homing to syngeneic mouse colon tumors.</a> Am. J. Pathol. 179, 2169-2176 (2011).</li><li>Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+bone+marrow+transplantation+(BMT):+providing+optimal+veterinary+and+husbandry+care+to+irradiated+mice+in+BMT+studies.">Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies.</a> J. Am. Assoc. Lab Anim. Sci. 48, 11-22 (2009).</li><li>Chen, B. J., Cui, X., Sempowski, G. D., Domen, J., Chao, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+dose+correlates+with+the+speed+of+immune+reconstitution+after+stem+cell+transplantation.">Hematopoietic stem cell dose correlates with the speed of immune reconstitution after stem cell transplantation.</a> Blood. 103, 4344-4352 (2004).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu, kemik iliği transplantasyonu yaklaşım immünoloji kolit araştırma, enfeksiyon, kanser, aşırı şişmanlık ve diğer hastalıklar için de uygundur. Bu kemik iliği nakli deneyi gen-faiz hem de kemik iliğinden elde edilen ve non-kemik iliğinden elde edilen hücreleri ve gen-faiz ya nüfus hücreleri tarafından hastalık arabuluculuk şüphelenilen ifade edildiğinde gereklidir. Örneğin, antimikrobiyal peptit katelisidin akut kolit modüle etmek için gösterilir. Ancak epitel hücreleri ve bağışıklı...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Hücre boyama tamponu </td><td> Biolegend </td><td> # 420201 </td></tr><tr><td> 10X RBC lizis tamponu </td><td> Biolegend </td><td> # 420301 </td></tr><tr><td> FITC fare izotip kontrol </td><td> Biolegend </td><td> # 400207 </td></tr><tr><td> PE fare izotip kontrol </td><td> Biolegend </td><td> # 400211 </td></tr><tr><td> PE anti-fare CD45.2 </td><td> Biolegend </td><td> # 109807 </td></tr><tr><td> FITC anti-fare CD45.1 </td><td> Biolegend </td><td> # 110705 </td></tr><tr><td> Anti-fare CD16/32 engelleme </td><td> Biolegend </td><td> # 101301 </td></tr><tr><td> 40 mikron hücre süzgecinden </td><td> Fisherbrand </td><td> # 22363547 </td></tr><tr><td> PBS 1X </td><td&gt; MP Biomedicals </td><td> # 1860454 </td></tr><tr><td> Heparin </td><td> Fisherbrand </td><td> # BP2425 </td></tr><tr><td> Sulfatrim (SMZ) </td><td> Qualitest </td><td> NC9242720 (balıkçı) </td></tr><tr><td> Lysol IC </td><td> Andwin Bilimsel </td><td> NC9745686 (balıkçı) </td></tr><tr><td> Vaccutainer </td><td> BD </td><td> # 8000813 </td></tr><tr><td> Fare süzgeç </td><td> Braintree Bilimsel </td><td> # TV-150 </td></tr><tr><td> Işınlayıcının </td><td> JL Çoban ve İştirakler </td><td> Ben 68A işaretle </td></tr><tr><td> Akış sitometresi </td><td> BD </td><td> BD FACSCanto II </td></tr><tr><td> Akış sitometresi test tüpü </td><td> Şahin </td><td> # 352052 </td></tr><tr><td> Dijital kumpas </td><td> Fisherbrand </td><td> 14-648-17 </td></tr><tr><td> Hemoccult BİT </td><td> Beckman Coulter </td><td> G0328QW </td></tr&gt; </tbody></table>

differentiating functional roles of gene expression from immune and non-immune cells in mouse colitis by bone marrow transplantation

Kolit gelişimi arasında bir genin rolünü anlamak için, wild-tip farelerden ve kolit gen-faiz eksik nakavt fareler yanıtları karşılaştırıldı. Gen-of-ilgi kemik iliğinden elde edilen ve konak hücreleri olmayan kemik iliğinden elde edilen hücreler, hem de ifade etmek gerekirse, fakat kemik iliğinden elde edilen hücreler ve olmayan kemik iliği içinde bir ilgi geninin rol ayırt etmek mümkündür kemik iliği nakli tekniği ile elde edilen kök hücrelerin. Farelerin kemik iliği kaynaklı hücre genotipi değiştirmek için, alıcı fareler orijinal kemik iliği radyasyon tarafından tahrip ve daha sonra farklı genotip yeni donör kemik iliği tarafından değiştirildi. Wild-tip farelerden donör kemik iliği knockout farelerde transplante edildiğinde, kemik iliğinden elde edilen hücreleri vahşi tip gen ekspresyonu ile nakavt fareler yaratacaktır. Alternatif olarak, ne zaman nakavt fareler donör kemik iliği gen-faiz ifade vermeden yabani tip alıcı fareler, yabani tip farelere nakledildiKemik iliği kaynaklı hücre üretilmiştir. Bununla birlikte, kemik iliği nakli,% 100 eksik olabilir. Bu nedenle, alıcı fareler ve kemik iliği nakli başarı donör kemik iliğinden elde hücrelerinin oranını izlemek için verici ve alıcı hücre belirteçleri olarak farklılaşma (CD) moleküllerinin kümelenme (CD45.1 ve CD45.2) kullanılmıştır. CD45.2 genotipi ile CD45.1 genotip ve nakavt fareler Wild-tip fareler kullanılmaktadır. Alıcı fareler ışınlanması sonra, farklı genotiplerin donör kemik iliği hücreleri alıcı fareler infüze edildi. Yeni kemik iliği onun dokunulmazlığını devralmaya rejenere zaman, farelerin kolit oluşturulan kimyasal ajan (dekstran sodyum sülfat, DSS% 5) tarafından itiraz edildi. İşte biz de farelerde kolit oluşturulan ve kemik iliğinden elde edilen hücrelerden eksprese ilgilenilen genin rolünü değerlendirmek için yöntem gösterdi. Kemik türetilmiş hücrelerden gen-of-ilgi hastalığının gelişmesinde önemli bir rol (örneğin coli gibi yürütülürsetis), kemik iliği nakli ile alıcı farelerin fenotipi önemli ölçüde değiştirilebilir. Kolit deneyler sonunda, kemik iliği kan ve kemik iliği hücreleri CD45.1 ve CD45.2 karşı antikorlar ile etiketlenmiş edildi ve varoluş nicel oranı flow sitometri ile kemik iliği nakli başarısını değerlendirmek için kullanılan olabilir türetilmiştir. Başarılı kemik iliği nakli alıcı farelerin kemik iliği ve kan hem de alıcı genotip üzerinde donör genotipi (CD molekülünün marker vadede) büyük bir çoğunluğu göstermelidir.

Gen-faiz kolit gelişimi sırasında bağışıklık hücrelerinin önemli bir rol oynarsa, farelerin kemik iliği transplantasyonu (WT KO veya WT KO) aracılığıyla farklı genotip kemik iliği alma DSS kolit değiştirilmiş bir yanıtı olmalıdır. Kolit şiddetini belirleyen en önemli parametrelerden biri kolon dokularında H &amp; E boyama olduğunu. Kolon doku yapısı değişiklikleri ve inflamasyon belirtileri kantitatif H &amp; E histolojisi skorlama sistemi ile değerlendirilebilir. H &amp; DSS kolit model...

Watch this Scientific Journal Video about Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation at JoVE.com

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Kemik iliği nakli Kemik iliği kaynaklı hücrelerin genotipi değiştirmek için bir yol sağlar. Ilgilenilen genin kemik iliğinden elde edilen hücreler ve olmayan kemik iliğinden elde edilen hücreler, hem de ifade etmek gerekirse, kemik iliği transplantasyonu olmayan kemik iliği kaynaklı hücre genotip değiştirmeden, farklı bir genotip için kemik iliği kaynaklı hücre değiştirebilir.

Kemik İliği Transplantasyonu tarafından Fare Kolit immün ve non-immün Hücreler Gen Ekspresyonu İşlevsel Rolleri Farklılaşan

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

differentiating-functional-roles-gene-expression-from-immune-non

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.3K Görüntüleme.  The University of California Los Angeles, Los Angeles. Kemik iliği nakli Kemik iliği kaynaklı hücrelerin genotipi değiştirmek için bir yol sağlar. Ilgilenilen genin kemik iliğinden elde edilen hücreler ve olmayan kemik iliğinden elde edilen hücreler, hem de ifade etmek gerekirse, kemik iliği transplantasyonu olmayan kemik iliği kaynaklı hücre genotip değiştirmeden, farklı bir genotip için kemik iliği kaynaklı hücre değiştirebilir.

Video: Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5 These immune cells, which include mast cells, T-cells and macrophages; store and release a variety of biologically active mediators including cytokines and proteases such as tryptase.6-8 These mediators have been shown to be key players in extracellular matrix metabolism by activating matrix metalloproteinases or causing collagen accumulation by modulating the cardiac fibroblasts' function.9-11 However, available techniques for isolating cardiac immune cells have been problematic because they use bacterial collagenase to digest the myocardial tissue. This technique causes activation of the immune cells and thus a loss of function. For example, cardiac mast cells become significantly less responsive to compounds that cause degranulation.12 Therefore, we developed a technique that allows for the isolation of functional cardiac immune cells which would lead to a better understanding of the role of these cells in cardiac disease.13, 14
This method requires a familiarity with the anatomical location of the rat's xiphoid process, axilla and falciform ligament, and pericardium of the heart. These landmarks are important to increase success of the procedure and to ensure a higher yield of cardiac immune cells. These isolated cardiac immune cells can then be used for characterization of functionality, phenotype, maturity, and co-culture experiments with other cardiac cells to gain a better understanding of their interactions.

This method for isolating functional immune cells from the heart provides an alternative to the conventional methods of collagenase digestion, which causes unwanted immune cell activation, resulting in a decreased responsiveness of these cells. Our method of isolation yields functional cardiac immune cells by avoiding problems associated with enzymatic digestion.

Fonksiyonel Kardiyak Bağışıklık Hücreleri İzolasyon

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or pathogenic effects depending on the inflammatory milieu. Nonetheless, despite the indispensable role of neutrophils in immunity, detailed understanding of the molecular factors that mediate neutrophils' effector and immunopathogenic effects in different infectious diseases and inflammatory conditions is still lacking, partly because of their short half life, the difficulties with handling of these cells and the lack of reliable experimental protocols for obtaining sufficient numbers of neutrophils for downstream functional studies and adoptive transfer experiments. Therefore, simple, fast, economical and reliable methods are highly desirable for harvesting sufficient numbers of mouse neutrophils for assessing functions such as phagocytosis, killing, cytokine production, degranulation and trafficking. To that end, we present a reproducible density gradient centrifugation-based protocol, which can be adapted in any laboratory to isolate large numbers of neutrophils from the bone marrow of mice with high purity and viability. Moreover, we present a simple protocol that uses CellTracker dyes to label the isolated neutrophils, which can then be adoptively transferred into recipient mice and tracked in several tissues for at least 4 hr post-transfer using flow cytometry. Using this approach, differential labeling of neutrophils from wild-type and gene-deficient mice with different CellTracker dyes can be successfully employed to perform competitive repopulation studies for evaluating the direct role of specific genes in trafficking of neutrophils from the blood into target tissues in vivo.

We describe a protocol for isolation and purification of neutrophils from mouse bone marrow by density gradient centrifugation and for neutrophil labeling using CellTracker dyes. This represents a simple, fast, reproducible and economical method for obtaining large numbers of neutrophils for downstream functional studies or adoptive transfer and tracking experiments.

İzolasyon, Arıtma ve İşlevsel Araştırmalar ve Kabul edilmiş Transfer deneyler için Fare Kemik İliği Nötrofiller Etiketlenmesi

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal environment. Biological activities of immune cells mainly rely on their motility capacities. Blood monocytes have short half-life in the bloodstream; they originate in the bone marrow and are constitutively released from it. In inflammatory condition, this process is enhanced, leading to blood monocytosis and subsequent infiltration of the peripheral inflammatory tissues. Identifying the biomechanical events controlling monocyte trafficking from the bone marrow towards the vascular network is an important step to understand monocyte physiopathological relevance. We performed in vivo time-lapse imaging by two-photon microscopy of the skull bone marrow of the Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP (MacBlue) mouse. The MacBlue mouse expresses the fluorescent reporters enhanced cyan fluorescent protein (ECFP) under the control of a myeloid specific promoter 1, in combination with vascular network labelling. We describe how this approach enables the tracking of individual medullar monocytes in real time to further quantify the migratory behaviour within the bone marrow parenchyma and the vasculature, as well as cell-to-cell interactions. This approach provides novel insights into the biology of the bone marrow monocyte subsets and allows to further address how these cells can be influenced in specific pathological conditions.

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Monocytes are key regulators of innate immunity and play a critical role in the renewal of the peripheral mononuclear phagocytic system and in case of inflammation. This manuscript describes the procedure of real time imaging of the mouse calvaria bone marrow to study the monocyte mobilisation mechanism.

Fare Kemik İliği monositlerin Takip<em&gt; İn Vivo</em

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. However, they are difficult to isolate in sufficient numbers to study them in detail, therefore, in vitro models have been developed. In vitro cultures of bone marrow-derived macrophages and dendritic cells are well-established and valuable methods for immunological studies. Here, a method for culturing and identifying both DCs and macrophages from a single culture of primary mouse bone marrow cells using the cytokine granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) is described. This protocol is based on the established procedure first developed by Lutz et al. in 1999 for bone marrow-derived DCs. The culture is heterogeneous, and MHCII and fluoresceinated hyaluronan (FL-HA) are used to distinguish macrophages from immature and mature DCs. These GM-CSF derived macrophages provide a convenient source of in vitro derived macrophages that closely resemble alveolar macrophages in both phenotype and function.

Bone marrow cells cultured with granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) generate a heterogeneous culture containing macrophages and dendritic cells (DCs). This method highlights using MHCII and hyaluronan (HA) binding to differentiate macrophages from the DCs in the GM-CSF culture. Macrophages in this culture have many similarities to alveolar macrophages.

Fare Kemik İliği itibaren Üretimi ve GM-CSF tanımlanması Türetilmiş Alveoler gibi makrofajlar ve dendritik hücrelerin

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

Fare kemik iliğinden plazmasitoid dendritik hücreleri Saflaştırılması floresans ile aktive edilen hücre sınıflandırma

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for hematological and immunological analyses. For example, studies of the cellular and molecular properties of myeloid progenitor populations can reveal mechanisms underlying leukemic transformation, or demonstrate how the immune system responds to pathogen exposure. Previously described flow cytometry strategies for myeloid progenitor identification have enabled significant advances in many fields, but the fractions they identify are very heterogeneous. The most commonly used gating strategies define bone marrow fractions that are enriched for the desired populations, but also contain large numbers of &#34;contaminating&#34; progenitors. Our recent studies have resolved much of this heterogeneity, and the protocol we present here permits the isolation of 6 subpopulations of oligopotent and lineage-committed myeloid progenitors from 2 previously described bone marrow fractions. The protocol describes 3 stages: 1) isolation of bone marrow cells, 2) enrichment for hematopoietic progenitors by magnetic-activated cell sorting (lineage depletion by MACS), and 3) identification of myeloid progenitor subsets by flow cytometry (including fluorescence-activated cell sorting, FACS, if desired). This approach permits progenitor quantification and isolation for a variety of in vitro and in vivo applications, and has already yielded novel insight into pathways and mechanisms of neutrophil, monocyte, and DC differentiation.

We demonstrate how to identify and isolate 6 subsets of myeloid progenitors from murine bone marrow using a combination of magnetic and fluorescence sorting (MACS and FACS). This protocol can be used for in vitro culture assays (methylcellulose or liquid cultures), in vivo adoptive transfer experiments, and RNA/protein analyses.

Kimlik ve yalıtım Oligopotent ve Lineage için kabul edilen miyeloid ataları fare kemik iliği dan

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for ...

Isolation of Lamina Propria Mononuclear Cells from Murine Colon Using Collagenase E

The intestine is the home to the largest number of immune cells in the body. The small and large intestinal immune systems police exposure to exogenous antigens and modulate responses to potent microbially derived immune stimuli. For this reason, the intestine is a major target site of immune dysregulation and inflammation in many diseases including but, not limited to inflammatory bowel diseases such as Crohn&#8217;s disease and ulcerative colitis, graft-versus-host disease (GVHD) after bone marrow transplantation (BMT), and many allergic and infectious conditions. Murine models of gastrointestinal inflammation and colitis are heavily used to study GI complications and to pre-clinically optimize strategies for prevention and treatment. Data gleaned from these models via isolation and phenotypic analysis of immune cells from the intestine is critical to further immune understanding that can be applied to ameliorate gastrointestinal and systemic inflammatory disorders. This report describes a highly effective protocol for the isolation of mononuclear cells (MNC) from the colon using a mixed silica-based density gradient interface. This method reproducibly isolates a significant number of viable leukocytes while minimizing contaminating debris, allowing subsequent immune phenotyping by flow cytometry or other methods.

The goal of this protocol is to isolate mononuclear cells that reside in the lamina propria of the colon by enzymatic digestion of the tissue using collagenase. This protocol allows for the efficient isolation of mononuclear cells resulting in a single cell suspension which in turn can be used for robust immunophenotyping.

Lamina Propria Mononükleer Hücrelerin Murine Kolondan Kollajenaz E Kullanarak İzolasyon

The intestine is the home to the largest number of immune cells in the body. The small and large intestinal immune systems police exposure to exogenous ...

Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease

Allogeneic bone marrow transplantation (BMT) is an effective therapy for hematological malignancies due to the graft-versus-leukemia (GVL) effect to eradicate tumors. However, its application is limited by the development of graft-versus-host disease (GVHD), a major complication of BMT. GVHD is evoked when T-cells in the donor grafts recognizealloantigen expressed by recipient cells and mount unwanted immunological attacks against recipient healthy tissues. Thus, traditional therapies are designed to suppress donor T-cell alloreactivity. However, these approaches substantially impair the GVL effect so that the recipient&#39;s survival is not improved. Understanding the effects of therapeutic approaches on BMT, GVL, and GVHD, is thus essential. Due to the antigen-presenting and cytokine-secreting capacities to stimulate donor T-cells, recipient dendritic cells (DCs) play a significant role in the induction of GVHD. Therefore, targeting recipient DCs becomes a potential approach for controlling GVHD. This work provides a description of a novel BMT platform to investigate how host DCs regulate GVH and GVL responses after transplantation. Also presented is an effective BMT model to study the biology of GVHD and GVL after transplantation.

Graft-versus-host disease is a major complication after allogeneic bone marrow transplantation. Dendritic cells play a critical role in the pathogenesis of graft-versus-host disease. The current article describes a novel bone marrow transplantation platform to investigate the role of dendritic cells in the development of graft-versus-host disease and the graft-versus-leukemia effect.

Kemik İliği Transplantasyon Platformu Greft-versus-Host Hastalığında Dendritik Hücrelerin Rolünü Araştırmak Için

Allogeneic bone marrow transplantation (BMT) is an effective therapy for hematological malignancies due to the graft-versus-leukemia (GVL) effect to ...

Bone Marrow Transplantation Procedures in Mice to Study Clonal Hematopoiesis

Clonal hematopoiesis is a prevalent age-associated condition that results from the accumulation of somatic mutations in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs). Mutations in driver genes, that confer cellular fitness, can lead to the development of expanding HSPC clones that increasingly give rise to progeny leukocytes harboring the somatic mutation. Because clonal hematopoiesis has been associated with heart disease, stroke, and mortality, the development of experimental systems that model these processes is key to understanding the mechanisms that underly this new risk factor. Bone marrow transplantation procedures involving myeloablative conditioning in mice, such as total-body irradiation (TBI), are commonly employed to study the role of immune cells in cardiovascular diseases. However, simultaneous damage to the bone marrow niche and other sites of interest, such as the heart and brain, is unavoidable with these procedures. Thus, our lab has developed two alternative methods to minimize or avoid possible side effects caused by TBI: 1) bone marrow transplantation with irradiation shielding and 2) adoptive BMT to non-conditioned mice. In shielded organs, the local environment is preserved allowing for the analysis of clonal hematopoiesis while the function of resident immune cells is unperturbed. In contrast, the adoptive BMT to non-conditioned mice has the additional advantage that both the local environments of the organs and the hematopoietic niche are preserved. Here, we compare three different hematopoietic cell reconstitution approaches and discuss their strengths and limitations for studies of clonal hematopoiesis in cardiovascular disease.

We describe three methods of bone marrow transplantation (BMT): BMT with total-body irradiation, BMT with shielded irradiation, and BMT method with no pre-conditioning (adoptive BMT) for the study of clonal hematopoiesis in mouse models.

Klonal Hematopoez Çalışması İçin Farelerde Kemik İliği Nakli İşlemleri

Clonal hematopoiesis is a prevalent age-associated condition that results from the accumulation of somatic mutations in hematopoietic stem and progenitor ...

Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines

Functional genomics studies of the immune system require genetic manipulations that involve both deletion of target genes and addition of elements to proteins of interest. Identification of gene functions in cell line models is important for gene discovery and exploration of cell-intrinsic mechanisms. However, genetic manipulations of immune cells such as T cells and macrophage cell lines using CRISPR/Cas9-mediated knock-in are difficult because of the low transfection efficiency of these cells, especially in a quiescent state. To modify genes in immune cells, drug-resistance selection and viral vectors are typically used to enrich for cells expressing the CRIPSR/Cas9 system, which inevitably results in undesirable intervention of the cells. In a previous study, we designed dual fluorescent reporters coupled to CRISPR/Cas9 that were transiently expressed after electroporation. This technical solution leads to rapid gene deletion in immune cells; however, gene knock-in in immune cells such as T cells and macrophages without the use of drug-resistance selection or viral vectors is even more challenging. In this article, we show that by using cell sorting to aid selection of cells transiently expressing CRISPR/Cas9 constructs targeting the Rosa26 locus in combination with a donor plasmid, gene knock-in can be achieved in both T cells and macrophages without drug-resistance enrichment. As an example, we show how to express human ACE2, a receptor of SARS-Cov-2, which is responsible for the current Covid-19 pandemic, in RAW264.7 macrophages by performing knock-in experiments. Such gene knock-in cells can be widely used for mechanistic studies.

This protocol uses fluorescent reporters and cell sorting to simplify knock-in experiments in macrophage and T cell lines. Two plasmids are used for these simplified knock-in experiments, namely a CRISPR/Cas9- and DsRed2-expressing plasmid and a homologous recombination donor plasmid expressing EBFP2, which is permanently integrated at the Rosa26 locus in immune cells.

MACROPHAGE ve T Hücre Hatlarında CRISPR/Cas9 ve Hücre Sıralama tarafından Gen Knock-in

Functional genomics studies of the immune system require genetic manipulations that involve both deletion of target genes and addition of elements to ...