Bu çalışma Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Ulusal Enstitüsü (NIAID), Ulusal Sağlık Enstitüsü (NIH), ABD İntramural Araştırma Bölümü tarafından desteklenmiştir. Tüm fareler Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Ulusal Enstitüsü (NIAID) de Laboratuar Hayvan Bakımı-akredite hayvan tesisin Akreditasyon için Amerikan Derneği muhafaza ve Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu belirtilen usullere uygun olarak muhafaza edildi NIAID ve Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmış bir protokol himayesinde.

1. Fare Kemik İliği Hücreleri İzolasyon <ol><li> Kurumun hayvan bakım komitesi tarafından onaylanan protokolünü kullanarak fareler Euthanize ve% 70 etanol ile hayvan yüzey sprey. </li><li> Orta karın deri bir kesi yapmak ve alt ekstremite kaplayan deri ve fare distal kısmından cilt kaldırmak. </li><li> Makas kullanarak alt ekstremite kasları kesilmiş ve femur başı kırılma kaçınarak dikkatle, kalça eklemi gelen asetabulum yerinden. </li><li> Bir neşter ve makas kullanılarak femur ve tibia gelen kalan kasları çıkarın ve kemik uçları kırmak değil diz egzersiz bakım de tibia gelen femur ayırın. % 10 FBS ve% 1 penisilin / streptomisin ile desteklenmiş buz gibi soğuk RPMI 1640 1X içeren bir Petri kabındaki kemikleri yerleştirin. </li><li> Bir doku kültürü kaputu altında aşağıdaki adımlara devam edin. Neutrophi önlemek için sıkı steril teknikleri korumak için ekstra önlem alınl aktivasyonu. </li><li> Kemik yüzeyinden etanol durulayın buz soğukluğunda steril PBS içinde üç yıkamadan sonra (Petri içinde) ve ardından% 70 etanol (bir Petri kabı içinde) ile her bir kemik durulayın. </li><li> Temiz bir steril Petri kabı içinde, kemiklerin epifizleri kesti ve onları bir kenara saklayın. </li><li> Bir 25-gauge iğne ve RPMI,% 10 FBS ve 2 mM EDTA eklenmiş ile dolu bir 12 cc şırınga kullanarak ve bir 100 mikron ile donatılmış, 50 ml&#39;lik vida üst Falcon tüpüne kemik şaftlann her iki ucunda ikinci kemik iliği hücrelerinin bir hizada filtre. Etkili bir biçimde hücreleri çıkarmak amacıyla, 25-gauge iğne kullanılarak kemik iç yüzeyi raspa. </li></ol> NOT: kemik haşlama hücreleri yeterince kazınmış olduğunu gösterir. NOT: femur / tibia çifti temizlemek için medya yaklaşık 10 ml kullanın. Orta EDTA ekleyerek hücrelerin kümeleşmeyi önlemek için gereklidir. <ol start="9"><li> Kemik epifizleri CutBir neşter ve bir 2.5 ml Eppendorf Combitip Artı Biopur pipet arka uç kullanarak 100 mikron filtre aracılığıyla şut küçük 0.5-1 mm 3 adet. </li><li> 4 ° C, 7 dakika boyunca 1400 rpm&#39;de santrifüj </li><li> Yaklaşık olarak 20 saniye boyunca% 0.2 NaCl, 20 ml hücre pelletini tekrar süspanse ederek, kırmızı kan hücrelerinin lize% 1.6 NaCl, 20 ml ilave edilir. (Kritik: kemik iliği hücre ölümü önlemek için hipotonik lizis 20-30 sn aşmayın ikinci nötrofil aktive potansiyeline sahiptir, çünkü parçalama için hipotonik NaCl kullanımı ACK parçalama tampon üzerinde tavsiye edilir.). </li><li> 4 at 1.400 rpm 7 dakika santrifüj ° C hücreleri toplamak için. </li><li> % 10 FBS ve 2 mM EDTA ile takviye edilmiş RPMI 1640 hücreleri 1X yıkayın ve adım 1.12 olarak santrifüj. </li><li> Bu yöntemi kullanarak, kemik iliği hücrelerinin verimi yaklaşık 60-80.000.000 enfekte 8-12 haftalık C57BL / 6 fare başına verilir. </li></ol> 2. Nötrofiller ayrılmasıyoğunluk dereceli santrifüj yoluyla <ol><li> Kemik iliği hücreleri saymak ve buz soğukluğunda steril 1 ml PBS içinde yeniden süspanse. </li><li> 15 ml konik bir tüp içinde Histopaque 1119, 3 ml (yoğunluğu, 1.119 g / ml) eklenir. </li><li> Histopaque 1119, 3 ml üzerinde Histopaque 1077 kaplama 3 ml (yoğunluk 1.077 g / ml). </li></ol> NOT: Histopaque 1.119 ve Histopaque 1.077 18-26 ısındı olmalıdır ° C kullanmadan önce. Kritik Adım: hemen önceden degrade iki kat ve optimal nötrofil saflık ve kurtarma arasındaki difüzyon ile sonuçlanır hazırlama gibi kullanmadan önce geçişlerini hazırlayın. Kritik Adım: Kaplama santrifüj sırasında hücre ayırma engel olan iki yoğunlukları, karıştırma önlemek için yavaş yavaş yapılması 1119 ihtiyaçları üzerinde Histopaque 1.077. <ol start="4"><li> Histopaque 1077 üstüne kemik iliği hücre süspansiyonu Yerleşimi. </li></ol> Kritik Adım: Overlhücreler ve Histopaque 1077 arasındaki ara rahatsız etmemek amacıyla yavaşça yapılması gereken Histopaque 1077 ihtiyaçları üzerinde kemik iliği hücre süspansiyonu Aying. Not: 1 ml PBS enfekte olmamış bir fare kemik iliği hücreleri Resuspending,&gt;% 90 saflıkta nötrofil verir. Bununla birlikte, pek çok kemik iliği örneklerinden havuzu nötrofil saflık uzlaşma, örneğin, 3 ml PBS ~% 80 ile&gt;% 90 saflıkta nötrofil azaltır 300 x 10 6 hücre yeniden süspansiyon haline getirilmesi. Bu nedenle, araştırmacılar kendi özel deneyler için ideal bir hücre sayısı / hacim koşulları tanımlamak için Pilot deneyler yapmalıdır <ol start="5"><li> 25 2.000 rpm&#39;de 30 dakika ° frensiz C için santrifüj. </li></ol> NOT: Oda sıcaklığında gradyan santrifüj nötrofil etkin bir şekilde ayrılması için önemli ve gereklidir. <ol start="6"><li> Histopaque 1119 arayüzü nötrofil toplayın ve 1.077 katmanları Histopaque. </li&gt; <li> RPMI ile iki kere yıkayın toplanan nötrofillerden 1X 1640% 10 FBS ve 4, 7 dakika boyunca 1400 rpm&#39;de% 1 penisilin / streptomisin ve santrifüj ° C ile desteklenmiş </li><li> Nötrofil saymak ve canlılığı belirler. </li></ol> Not: Nötrofiller, tipik olarak&gt; FACS analizi ile belirlendiği gibi% 95 uygulanabilir ve&gt;% 90 saf. Bulaşmamış 8-12 haftalık C57BL / 6 fare kemik iliğinden nötrofillerin tipik verim (yani 2 femur ve tibia kemikleri 2) ~ 6-12.000.000 hücredir. Nötrofil enfekte hayvanların kemik iliğinden hasat edilir, bu numara büyük ölçüde daha büyüktür. Candida ile enfekte farelerde hücre hasat 6 kullanıldı zaman Bu nedenle, ~, 30-40 milyon nötrofil / fare ele geçmiştir. 3. CellTracker Boyalar kullanarak Nötrofiller etiketlenmesi <ol><li> 5. nötrofil süspanse x 10 6 hücre / mL PBS içinde 37 ° C&#39;de önceden ılıtılır </li><li> Son bir concent bir CellTracker boya ekle5 mcM oranı. </li></ol> Not: CellTracker Yeşil (CMFDA (5-Chloromethylfluorescein diasetat) ve CellTracker Turuncu (CMTMR (5 - (and-6)-4-klorometil benzoil amino tetramethylrhodamine) için farklı yabani tip ve gen-eksikliği nötrofillerin etiketlemek için bu protokolü kullanılmıştır fareler. NOT: Deney gününe kadar -80 10 CellTracker Green mM ve CellTracker Portakal, kısım, ve mağaza bir stok solüsyonu ° C hazırlayın. <ol start="3"><li> Karanlıkta çalkalanan bir su banyosu içerisinde 37 ° C &#39;de 10 dakika boyunca, karşılık gelen CellTracker boya 5 uM nötrofil inkübe edin. </li><li> % 10 FBS ve% 1 penisilin / streptomisin ile takviye edilmiş buz gibi soğuk RPMI 1640 hücreleri 1X ile iki kere yıkayın. </li></ol> NOT: hücrelerin Verimli yıkama CellTracker boya ile etiketleme adım çıkışlar için diferansiyel-etiketli nötrofil nüfus karıştırmadan önce boya çapraz bulaşmayı önlemek için gereklidir sonratream rekabetçi repopulation çalışmaları. 4. Fare ve Akım Sitometri kullanarak Aktarılan Nötrofiller Analizinde nötrofillerin Kabul edilmiş Transfer <ol><li> 25 x 10 6 hücre / ml ile 5 x 10 6 nötrofil fare başına aktarılır, böylece, yanal kuyruk damarı içine süspansiyonu 200 ul enjekte edilir bir konsantrasyonda buz gibi soğuk PBS içinde süspanse nötrofil. Rekabetçi repopulation nötrofil çalışmaları için, bir 1:1 oranında yabani tip ve gen-eksikliği nötrofil karıştırmak ve yukarıdaki gibi fare başına 5 x 10 6 nötrofiller toplam enjekte edilir. </li></ol> NOT: En az en fazla 10 x 10 6 nötrofil adoptively hayvanlara açık hemen toksisite olmadan fare başına devredilebilir. <ol start="2"><li> Evlatlık transferi (örneğin 1, 2, 3 veya 4 saat sonrası transferi) ardından farklı zamanlarda, fare ve hasat kan euthanize ve / veya ilgi kemik iliği ve / veya diğer hedef organ (lar). </li><li> Si hazırlayınyayınlanan protokolleri 6,15 kullanarak adoptively transfer etiketli nötrofil nicel ve nitel analiz için bu dokulardan ngle hücre süspansiyonları. </li><li> Ölü / canlı canlılığı boyama ve Fc abluka, CD45 (klon 30-F11) ile etiket hücreleri, Ly6G (klon 1A8) ve CD11b&#39;nin (klon M1/70) ve kapı canlı CD45 + Ly6G + CD11b + nötrofiller üzerinde. Ardından Bu kapının Nötrofiller FITC (+ CellTracker Yeşil ile etiketlenmiş) veya PE + (Hücre Takibi Portakal ile etiketlenmiş varsa) olan alıcı fare yerli nötrofiller gibi adoptif transfer etiketli nötrofiller bulunmaktadır. </li></ol> NOT: Nötrofiller en az 4 saat sonrası transferi için Candida ile enfekte farelerde kan, kemik iliği ve böbrek izlenen olabilir. Not: PBS içinde% 2 paraformaldehit ile sabitleme olumsuz CellTracker Gr ile etiketlenmiş, nötrofillerin ortalama floresan yoğunluğu etkilemezEn az 48 saat süre ile ya da een CellTracker Turuncu.

<ol>
	<li>Lehrer, R. I., Ganz, T., Selsted, M. E., Babior, B. M., Curnutte, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+and+host+defense.">Neutrophils and host defense.</a> Ann. Intern. Med. 109 (2), 127-142 (1988).</li><li>Rot, A., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+in+innate+and+adaptive+host+defense:+basic+chemokinese+grammar+for+immune+cells.">Chemokines in innate and adaptive host defense: basic chemokinese grammar for immune cells.</a> Annu. Rev. Immunol. 22, 891-928 (2004).</li><li>Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+function:+from+mechanisms+to+disease.">Neutrophil function: from mechanisms to disease.</a> Annu. Rev. Immunol. 30, 459-489 (2012).</li><li>Blomgran, R., Ernst, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+neutrophils+facilitate+activation+of+naive+antigen-specific+CD4++T+cells+during+Mycobacterium+tuberculosis+infection.">Lung neutrophils facilitate activation of naive antigen-specific CD4+ T cells during Mycobacterium tuberculosis infection.</a> J. Immunol. 186 (12), 7110-7119 (2011).</li><li>Narasaraju, T., Yang, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excessive+neutrophils+and+neutrophil+extracellular+traps+contribute+to+acute+lung+injury+of+influenza+pneumonitis.">Excessive neutrophils and neutrophil extracellular traps contribute to acute lung injury of influenza pneumonitis.</a> Am. J. Pathol. 179 (1), 199-210 (2011).</li><li>Lionakis, M. S., Fischer, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+receptor+Ccr1+drives+neutrophil-mediated+kidney+immunopathology+and+mortality+in+invasive+candidiasis.">Chemokine receptor Ccr1 drives neutrophil-mediated kidney immunopathology and mortality in invasive candidiasis.</a> PLoS Pathog. 8 (8), (2012).</li><li>Casc&#227;o, R., Ros&#225;rio, H. S., Souto-Carneiro, M. M., Fonseca, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+rheumatoid+arthritis:+More+than+simple+final+effectors.">Neutrophils in rheumatoid arthritis: More than simple final effectors.</a> Autoimmun. Rev. 9 (8), 531-535 (2010).</li><li>Denny, M. F., Yalavarthi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinct+subset+of+proinflammatory+neutrophils+isolated+from+patients+with+systemic+lupus+erythematosus+induces+vascular+damage+and+synthesizes+type+I+IFNs.">A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs.</a> J. Immunol. 184 (6), 3284-3297 (2010).</li><li>Kim, N. D., Chou, R. C., Seung, E., Tager, A. M., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+requirement+for+the+leukotriene+B4+receptor+BLT1+for+neutrophil+recruitment+in+inflammatory+arthritis.">A unique requirement for the leukotriene B4 receptor BLT1 for neutrophil recruitment in inflammatory arthritis.</a> J. Exp. Med. 203 (4), 829-835 (2006).</li><li>Cotter, M. J., Norman, K. E., Hellewell, P. G., Ridger, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+isolation+of+neutrophils+from+murine+blood+using+negative+immunomagnetic+separation.">A novel method for isolation of neutrophils from murine blood using negative immunomagnetic separation.</a> Am. J. Pathol. 159 (2), 473-481 (2001).</li><li>Hasenberg, M., K&#246;hler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+immunomagnetic+negative+enrichment+of+neutrophil+granulocytes+from+murine+bone+marrow+for+functional+studies+in+vitro+and+in+vivo.">Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo.</a> PLoS One. 6 (2), e17314 (2011).</li><li>Gao, J. L., Lee, E. J., Murphy, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+antibacterial+host+defense+in+mice+lacking+the+N-formylpeptide+receptor.">Impaired antibacterial host defense in mice lacking the N-formylpeptide receptor.</a> J. Exp. Med. 189 (4), 657-662 (1999).</li><li>Pruijt, J. F., Verzaal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+are+indispensable+for+hematopoietic+stem+cell+mobilization+induced+by+interleukin-8+in+mice.">Neutrophils are indispensable for hematopoietic stem cell mobilization induced by interleukin-8 in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (9), 6228-6233 (2002).</li><li>Eash, K. J., Greenbaum, A. M., Gopalan, P. K., Link, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR2+and+CXCR4+antagonistically+regulate+neutrophil+trafficking+from+murine+bone+marrow.">CXCR2 and CXCR4 antagonistically regulate neutrophil trafficking from murine bone marrow.</a> J. Clin. Invest. 120 (7), 2423-2431 (2010).</li><li>Lionakis, M. S., Lim, J. K., Lee, C. C., Murphy, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-specific+innate+immune+responses+in+a+mouse+model+of+invasive+candidiasis.">Organ-specific innate immune responses in a mouse model of invasive candidiasis.</a> J. Innate. Immun. 3 (2), 180-199 (2011).</li><li>Boxio, R., Bossenmeyer-Pouri&#233;, C., Steinckwich, N., Dournon, C., N&#252;sse, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+bone+marrow+contains+large+numbers+of+functionally+competent+neutrophils.">Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils.</a> J. Leukoc. Biol. 75 (4), 604-611 (2004).</li><li>Kim, N. D., Chou, R. C., Seung, E., Tager, A. M., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+requirement+for+the+leukotriene+B4+receptor+BLT1+for+neutrophil+recruitment+in+inflammatory+arthritis.">A unique requirement for the leukotriene B4 receptor BLT1 for neutrophil recruitment in inflammatory arthritis.</a> J. Exp. Med. 203 (4), 829-835 (2006).</li><li>Gunzer, M., Weishaupt, C., Planelles, L., Grabbe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+negative+enrichment+of+CD4++and+CD8++T+cells+from+murine+spleen+via+nylon+wool+adherence+and+an+optimized+antibody+cocktail.">Two-step negative enrichment of CD4+ and CD8+ T cells from murine spleen via nylon wool adherence and an optimized antibody cocktail.</a> J. Immunol. Methods. 258 (1-2), 55-63 (2001).</li><li>Tosello Boari, J., Amezcua Vesely, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-17RA+signaling+reduces+inflammation+and+mortality+during+Trypanosoma+cruzi+infection+by+recruiting+suppressive+IL-10-producing+neutrophils.">IL-17RA signaling reduces inflammation and mortality during Trypanosoma cruzi infection by recruiting suppressive IL-10-producing neutrophils.</a> PLoS Pathog. 8 (4), e1002658 (2012).</li><li>Hattori, H., Subramanian, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+screen+identifies+reactive+oxygen+species+as+key+regulators+of+neutrophil+chemotaxis.">Small-molecule screen identifies reactive oxygen species as key regulators of neutrophil chemotaxis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (8), 3546-3351 (2010).</li><li>Wan, W., Lionakis, M. S., Liu, Q., Roff&#234;, E., Murphy, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Deletion+of+Chemokine+Receptor+Ccr7+Exacerbates+Atherogenesis+in+ApoE-deficient+Mice.">Genetic Deletion of Chemokine Receptor Ccr7 Exacerbates Atherogenesis in ApoE-deficient Mice.</a> Cardiovasc. Res. 97 (3), 580-588 (2013).</li><li>Ueda, Y., Kondo, M., Kelsoe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+the+reciprocal+production+of+granulocytes+and+lymphocytes+in+bone+marrow.">Inflammation and the reciprocal production of granulocytes and lymphocytes in bone marrow.</a> J. Exp. Med. 201 (11), 1771-1780 (2005).</li><li>Berkow, R. L., Dodson, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+functional+evaluation+of+mature+neutrophils+from+human+bone+marrow.">Purification and functional evaluation of mature neutrophils from human bone marrow.</a> Blood. 68 (4), 853-860 (1986).</li></ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederim.

Bu olgu, bir yoğunluk gradyan santrifüj yaklaşım kullanılarak yüksek saflıkta ve canlılığı olan farelerin kemik iliğinden nötrofil sayıda izolasyonu için güvenilir, basit, hızlı ve ekonomik bir protokol mevcut. Bu protokol doğru gerçekleştirildiğinde, ~ 6-12 x 10 6 nötrofil enfekte olmamış bir fareden elde edilebilir ve en çok ~ olarak 30-40 x 10 6 nötrofil enfeksiyonu 6 sonra bir fareden izole edilebilir. Izole nötrofil% 80-95 saf ve&gt;% 95 yaşayabilir. </p...

Nötrofiller, insanlarda en bol lökositlerdir. Onlar mikroorganizmaların işgalci karşı ilk savunma hattı olarak doğuştan gelen bağışıklık sistemi ve hareket temel hücresel bileşenidir. Nötrofil sayısı ve / veya fonksiyonunu etkileyen kazanılmış nötropeni ve primer immün yetmezlikler olan hastalar konak savunma 1 bu hücrelerin önemini vurgulayarak hayatı tehdit eden invazif bakteriyel ve mantar enfeksiyonları, geliştirmek. Iltihaplı doku 2 içine kan dolaşımından işe nötrofil yeteneğine sahip bir kemotaktik degrade oluşturmak chemoattractants salgılanmasına yol açan bir yönetilen doğal immün yanıt, en indüksiyon kendi soydaş desen tanıma reseptörleri sonuçları enfeksiyon yerinde patojenlerin işgalci bağışıklık tanınması . Nötrofiller enfeksiyon sitesine girmek sonra, aktif hale, hangi sitokin ve kemokin üretimi, patojen alımı yol açar ve oksidatif ve non-oksidatif beni ile öldürüyorchanisms 3. Doğuştan gelen bağışıklık onların iyi bilinen rolü yanı sıra, nötrofil yakın zamanda etkili adaptif immün yanıtları 4 başlatanlar gibi önemli rol oynar gösterilmiştir. 5-7 bulaşıcı ve öz bağışıklık hastalıklarının çeşitli &#39;de gösterildiği gibi, diğer yandan, ayrı bağışıklık kendi koruyucu rolleri, nötrofiller, aynı zamanda, aşırı birikimi ve / veya inflamasyon bölgelerinde aktivasyonuna bağlı doku hasarı ve İmmünopatoloji aracılık edebilir. Montaj etkili doğal immün yanıtları ve çeşitli enfeksiyon hastalıkları ve inflamatuar durumlar, güvenilir deneysel protokollerin bu hücrelerin ve eksikliği taşıma ile teknik zorluklar içinde pleiotropik efektör fonksiyonları nötrofil vazgeçilmez bir rol rağmen geçmiş yıllarda nötrofil, araştırma engellemiştir. Bu nedenle, nötrofillerin izolasyonu için tekrarlanabilir analizlerin kullanımı ve nötrofil aracılı immunolo için daha fazla araştırma kolaylaştırmalıdırjik fonksiyonları, ex vivo ve in vivo. Bugüne kadar, çeşitli yöntemler, örneğin insan kanı, yoğunluk gradyanlı santrifüjlemeye ve fare kan veya kemik iliği 8,9, fare kan veya kemik iliği 10,11 nötrofillerin pozitif veya negatif zenginleştirme immünomanyetik olarak nötrofillerin izolasyonu için anlatıldığı ve hasat edilmiştir tiyoglikolat veya diğer enflamatuar ajanların 12 intraperitoneal enjeksiyonu takiben farelerin periton boşluğundan nötrofillerin. Nötrofiller insan kanından kolayca çok sayıda izole edilebilir, ancak bu yöntem, işlevsel çalışmalar ve adoptif transfer deneyleri 13 için yeterli nötrofil izole edilmesini önleyen fare kan sınırlı bir hacme bağlı olarak farelerde suboptimaldir. Verimi tiyoglikolat-ortaya çıkardı, ancak ek olarak, periton boşluğundan kan hücrelerinin fare ile karşılaştırıldığında daha büyüktür, inflamatuar peritoneal lavaj nötrofillerin saflık arasında değişir% 60-90, ve izole edilen nötrofillerin aktive edilmiş bir fenotip sergiler. Bu yüzden, hücreler, fare peritoneal boşluğuna kararlı durum 12 az sayıda nötrofil olduğu gibi bu yöntem sadece, aktif fonksiyonel çalışmalar yapmak için kullanılmaz, ancak uyarılmamış nötrofil edilebilir kullanılarak toplandı. Bunun yerine, kemik iliği ve daha sonra, fagositoz, öldürme ve degranülasyonu veya alıcı farelere adoptif transfer gibi akım aşağı fonksiyonel çalışmalar için kullanılabilir ya da uyarılmamış ve aktifleştirilmiş nötrofillerin 11,14, çok sayıda hasat edilmesi için uygun bir haznedir. Bu yazıda, yüksek verim sağlayan basit ve hızlı (~ 2 saat) protokolü, tarif (~ 6-12 × 10 6 nötrofil / bulaşmamış fare veya 30-40 × 10 6 nötrofil / enfekte fare) saf (80 -95%) kemik iliğinden&gt;% 95 canlılığı ile nötrofil. Bu yöntem, yoğunluk gradyanlı hücre ayrı olarak ticari olarak temin edilebilen Histopaque kullanırFicoll ve sodyum diatrizoate oluşan oranı ortam, farelerin kemik iliğinden nötrofil ayırmak için. Bu yöntem, kan ya da periton boşluğu ile karşılaştırıldığında fare başına nötrofil önemli ölçüde daha fazla sayıda verir, bu kararlı durum ya da enfeksiyon sonrası her iki farenin nötrofillerin toplamak için kullanılan ve süreksiz kullanan yoğunluk gradyan santrifüj yönteme göre tabakası daha kolay olabilir % 55 /% 65 / PBS içinde 75% 9 Percoll oluşan Percoll gradient. Buna ek olarak, zaman ve saf nötrofil toplamak için gerekli kaynakları önemli ölçüde Floresan-Aktif Hücre Ayırma kullanarak nötrofil izolasyon göre azalmıştır. Ayrıca, bu yöntem, bir immünomanyetik zenginleştirme aşamasında anlamına gelmez, çünkü daha düşük maliyetli olan ve bu nedenle nötrofil aktivasyonunun olasılığını azaltarak, manyetik kolonu ve antikorlar hücrelerinin maruz kalma önler. Izole neutroph fonksiyonel çalışmalar performans ek olarakils ex vivo ve alıcı farelere hücrelerinin adoptif transfer, bu protokol, aynı zamanda farklı CellTracker boyalar kullanılarak izole nötrofil etiketlenmesi için bir yöntem açıklanır. Çeşitli genetik kökenden farelerden alınan nötrofil Diferansiyel etiketleme kandan nötrofil ticareti belirli genlerin doğrudan rol mekanik fikir sağlayabilir akım sitometri kullanarak alıcı farelerin dokularında transfer nötrofil izlemek için rekabetçi repopulation çalışmalarda adapte edilebilir hedef iltihaplı organları 6 içine.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Reagents</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RPMI 1640 1X with L-glutamine and 25 mM HEPES</td>
 <td>Cellgro</td>
 <td>10-041-CV</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fetal Bovine Serum (Heat inactivated)</td>
 <td>GemCell</td>
 <td>100500</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep)</td>
 <td>GIBCO</td>
 <td>15140</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.5 M EDTA</td>
 <td>Quality Biological Inc</td>
 <td>351-027-101</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.2% and 1.6% sodium chloride</td>
 <td>JT Baker</td>
 <td>3624</td>
 <td>Sodium chloride solutions prepared using distilled water and sterile filtered</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sterile filtered Histopaque 1077</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>10771</td>
 <td>Histopaque 1077 needs to be brought to 18-26 &deg;C before use</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sterile filtered Histopaque 1119</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>11191</td>
 <td>Histopaque 1119 needs to be brought to 18-26 &deg;C before use</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium</td>
 <td>Cellgro</td>
 <td>210-40-CV</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethyl Alcohol (200 proof)</td>
 <td>The Warner Graham Company</td>
 <td>64-17-5</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CellTracker Green (CMFDA, 5-Chloromethylfluorescein Diacetate)</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>C-7025</td>
 <td>Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CellTracker Orange (CMTMR, 5-(and 6)-4-Chloromethyl Benzoyl Amino Tetramethylrhodamine)</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>C-2927</td>
 <td>Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-mouse CD45 (Clone 30-F11)</td>
 <td>eBioscience</td>
 <td>170451-82</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8)</td>
 <td>BD Pharmingen</td>
 <td>551461</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8)</td>
 <td>BD Pharmingen</td>
 <td>560599</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-mouse CD11b (Clone M1/70)</td>
 <td>eBioscience</td>
 <td>47-0112-82</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)</td>
 <td>BD Pharmingen</td>
 <td>553141</td>
 <td>Use at 1:100 dilution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit</td>
 <td>Molecular Probes</td>
 <td>L-23105</td>
 <td>Use at 1:1000 dilution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>67-68-5</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS</td>
 <td>USB Corporation</td>
 <td>19943</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Table 1. Reagents for isolation, labeling and tracking of adoptively transferred neutrophils.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Materials</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>C57BL/6 mice</td>
 <td>Taconic</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>15 ml centrifuge tubes</td>
 <td>Corning</td>
 <td>430053</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 ml centrifuge tubes</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>352070</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>25 ml serological pipettes</td>
 <td>Celltreat</td>
 <td>229225B</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 ml serological pipettes</td>
 <td>Celltreat</td>
 <td>229210B</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 ml serological pipettes</td>
 <td>Celltreat</td>
 <td>229205B</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pasteur pipettes (3 ml)</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>357575</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>12 ml syringes</td>
 <td>Kendall monoject</td>
 <td>512878</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles)</td>
 <td>BD</td>
 <td>305122</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>100 mm cell strainers</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>352360</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bactericidal Petri dishes</td>
 <td>BD Falcon</td>
 <td>351029</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Combitips Plus Biopur</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>2249608-5</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mouse dissecting instruments (Scissors, forceps, scalpel)</td>
 <td>Biomedical Research Instruments</td>
 <td>10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000</td>
 <td>Instruments sterilized prior to use</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue culture hood</td>
 <td>The Baker Company</td>
 <td>SG403</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Refrigerated centrifuge</td>
 <td>Thermo Fischer Scientific</td>
 <td>75004521</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>37 &deg;C shaking water bath</td>
 <td>Thermo Fischer Scientific</td>
 <td>3166721</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>Table 2. List of Materials and Equipment used in this protocol.</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments

Nötrofiller doğuştan gelen bağışıklık sisteminin önemli efektör hücrelerdir. Bunlar hızla akut inflamasyon bölgelerinde işe ve inflamatuar ortamı bağlı olarak koruyucu veya patojenik etkiler gösterebilir vardır. Bununla birlikte, farklı bulaşıcı hastalıklar ve inflamatuar koşullarda nötrofil &#39;efektör ve immunopathogenic etkileri aracılık moleküler faktörlerin bağışıklık, ayrıntılı bir anlayış nötrofil vazgeçilmez bir rol rağmen hala kısmen, kısa yarı ömrü, bunların kullanımı ile zorluklar, eksik hücreleri ve alt fonksiyonel çalışmalar ve evlat edinen transferi deneyler için nötrofil yeterli sayıda elde etmek için güvenilir deneysel protokollerin eksikliği. Bu nedenle, basit, hızlı, ekonomik ve güvenilir bir yöntem gibi fagositoz, öldürme, sitokin üretimi, degranülasyonunun ve ticareti gibi işlevleri değerlendirmek için fare nötrofil yeterli sayıda hasat için son derece arzu edilir. Bu amaçla,yüksek saflıkta ve canlılığı olan farelerin kemik iliğinden nötrofil sayıda izole etmek için, herhangi bir laboratuvar olarak adapte edilebilir, tekrarlanabilir yoğunluk gradyan santrifüj tabanlı bir protokol, mevcut. Ayrıca, daha sonra adoptively akım sitometri kullanarak en az 4 saat sonrası transferi için alıcı farelere transfer ve çeşitli dokularda izlenebilir izole nötrofil, etiketlemek için CellTracker boyalar kullanan basit bir protokol mevcut. Bu yaklaşımı kullanarak, farklı CellTracker boyalarla yabani tip ve gen-eksik fareler nötrofil diferansiyel etiketleme başarılı bir şekilde in vivo olarak hedef dokulara kan nötrofilleri ticareti özel genlerin doğrudan rolünün değerlendirilmesi için rekabet repopulation çalışmaların gerçekleştirilmesi için kullanılabilecektir .

Bu protokol, farelerden elde edilen kemik iliği hücreleri ve ticari olarak temin edilebilen hücre ayırma ortamı Histopaque kullanılarak yoğunluk dereceli santrifüj yoluyla, bu hücrelerin, nötrofillerin sonraki ayırma hasat için optimize edilmiştir. Nötrofiller, bu yöntemi kullanan alt fonksiyonel çalışmalar, ex vivo çeşitli ve alıcı farelerde adoptif transfer deneyleri için de kullanılabilir izole edilmiştir. Bulaşmamış 8-12 haftalık C57BL / 6 fare baş?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments at JoVE.com

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Bir yoğunluk dereceli santrifüj yoluyla ve CellTracker boyalar kullanılarak nötrofil etiketlemesi için fare kemik iliğinden nötrofillerin izolasyonu ve saflaştırılması için bir protokol açıklamaktadır. Bu aşağı fonksiyonel çalışmalar ya da evlatlık transferi ve izleme deneyler için nötrofil çok sayıda elde etmek için basit, hızlı, tekrarlanabilir ve ekonomik yöntem temsil eder.

İzolasyon, Arıtma ve İşlevsel Araştırmalar ve Kabul edilmiş Transfer deneyler için Fare Kemik İliği Nötrofiller Etiketlenmesi

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

isolation-purification-labeling-mouse-bone-marrow-neutrophils-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

61.3K Görüntüleme.  National Institute of Allergy and Infectious Diseases, NIH. Bir yoğunluk dereceli santrifüj yoluyla ve CellTracker boyalar kullanılarak nötrofil etiketlemesi için fare kemik iliğinden nötrofillerin izolasyonu ve saflaştırılması için bir protokol açıklamaktadır. Bu aşağı fonksiyonel çalışmalar ya da evlatlık transferi ve izleme deneyler için nötrofil çok sayıda elde etmek için basit, hızlı, tekrarlanabilir ve ekonomik yöntem temsil eder.

Video: Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Experimental Metastasis and CTL Adoptive Transfer Immunotherapy Mouse Model

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into mouse tail veins and colonize in the lungs, thereby, resembling the last steps of tumor cell spontaneous metastasis: survival in the circulation, extravasation and colonization in the distal organs. From a therapeutic point of view, the experimental metastasis model is the simplest and ideal model since the target of therapies is often the end point of metastasis: established metastatic tumor in the distal organ. In this model, tumor cells are injected i.v into mouse tail veins and allowed to colonize and grow in the lungs. Tumor-specific CTLs are then injected i.v into the metastases-bearing mouse. The number and size of the lung metastases can be controlled by the number of tumor cells to be injected and the time of tumor growth. Therefore, various stages of metastasis, from minimal metastasis to extensive metastasis, can be modeled. Lung metastases are analyzed by inflation with ink, thus allowing easier visual observation and quantification.

An experimental lung metastasis and CTL immunotherapy mouse model for analysis of tumor cells-T cell interaction in vivo.

Deneysel metastaz ve CTL Kabul edilmiş Transfer İmmünoterapi Fare Modeli

Experimental metastasis mouse model is a simple and yet physiologically relevant metastasis model. The tumor cells are injected intravenously (i.v) into ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone marrow, spleen, lymph nodes and Peyer's patches 1-3. DCs present in peripheral tissues sample the organism for the presence of antigens, which they take up, process and present in their surface in the context of major histocompatibility molecules (MHC). Then, antigen-loaded DCs migrate to immunological organs where they present the processed antigen to T lymphocytes triggering specific immune responses. One way to evaluate the migratory capabilities of DCs is to label them with fluorescent dyes 4.
Herewith we demonstrate the use of Qdot fluorescent nanocrystals to label murine bone marrow-derived DC. The advantage of this labeling is that Qdot nanocrystals possess stable and long lasting fluorescence that make them ideal for detecting labeled cells in recovered tissues. To accomplish this, first cells will be recovered from murine bone marrows and cultured for 8 days in the presence of granulocyte macrophage-colony stimulating factor in order to induce DC differentiation. These cells will be then labeled with fluorescent Qdots by short in vitro incubation. Stained cells can be visualized with a fluorescent microscopy. Cells can be injected into experimental animals at this point or can be into mature cells upon in vitro incubation with inflammatory stimuli. In our hands, DC maturation did not determine loss of fluorescent signal nor does Qdot staining affect the biological properties of DCs. Upon injection, these cells can be identified in immune organs by fluorescent microscopy following typical dissection and fixation procedures.

Dendritic cells uptake antigens and migrate towards immune organs to present processed antigens to T cells. Qdot nanocrystal labeling provides a long-lasting and stable fluorescent signal. This allows tracking of dendritic cells to different organs by fluorescent microscopy.

İzleme Araştırmaları Qdot nanokristaller murin Kemik İliği-türevli dendritik hücrelerin üretilmesi ve Etiketleme

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice to colitis. If the gene-of-interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells of the host; however, it is possible to differentiate the role of a gene of interest in bone marrow derived cells and non- bone marrow derived cells by bone marrow transplantation technique. To change the bone marrow derived cell genotype of mice, the original bone marrow of recipient mice were destroyed by irradiation and then replaced by new donor bone marrow of different genotype. When wild-type mice donor bone marrow was transplanted to knockout mice, we could generate knockout mice with wild-type gene expression in bone marrow derived cells. Alternatively, when knockout mice donor bone marrow was transplanted to wild-type recipient mice, wild-type mice without gene-of-interest expressing from bone marrow derived cells were produced. However, bone marrow transplantation may not be 100% complete. Therefore, we utilized cluster of differentiation (CD) molecules (CD45.1 and CD45.2) as markers of donor and recipient cells to track the proportion of donor bone marrow derived cells in recipient mice and success of bone marrow transplantation. Wild-type mice with CD45.1 genotype and knockout mice with CD45.2 genotype were used. After irradiation of recipient mice, the donor bone marrow cells of different genotypes were infused into the recipient mice. When the new bone marrow regenerated to take over its immunity, the mice were challenged by chemical agent (dextran sodium sulfate, DSS 5%) to induce colitis. Here we also showed the method to induce colitis in mice and evaluate the role of the gene of interest expressed from bone-marrow derived cells. If the gene-of-interest from the bone derived cells plays an important role in the development of the disease (such as colitis), the phenotype of the recipient mice with bone marrow transplantation can be significantly altered. At the end of colitis experiments, the bone marrow derived cells in blood and bone marrow were labeled with antibodies against CD45.1 and CD45.2 and their quantitative ratio of existence could be used to evaluate the success of bone marrow transplantation by flow cytometry. Successful bone marrow transplantation should show a vast majority of donor genotype (in term of CD molecule marker) over recipient genotype in both the bone marrow and blood of recipient mice.

Bone marrow transplantation provides a way to change the genotype of the bone marrow derived cells. If the gene of interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells, bone marrow transplantation can change the bone marrow derived cells to a different genotype without changing the non-bone marrow derived cell genotype.

Kemik İliği Transplantasyonu tarafından Fare Kolit immün ve non-immün Hücreler Gen Ekspresyonu İşlevsel Rolleri Farklılaşan

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of various fields in biomedical science. The method described below is a simple and effective way to isolate murine monocytes from heterogeneous bone marrow.
Bone marrow from the femur and tibia of Balb/c mice is harvested by flushing with phosphate buffered saline (PBS). Cell suspension is supplemented with macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) and cultured on ultra-low attachment surfaces to avoid adhesion-triggered differentiation of monocytes. The properties and differentiation of monocytes are characterized at various intervals. Fluorescence activated cell sorting (FACS), with markers like CD11b, CD115, and F4/80, is used for phenotyping. At the end of cultivation, the suspension consists of 45%&#177; 12% monocytes. By removing adhesive macrophages, the purity can be raised up to 86%&#177; 6%. After the isolation, monocytes can be utilized in various ways, and one of the most effective and common methods for in vivo delivery is intravenous tail vein injection. 
This technique of isolation and application is important for mouse model studies, especially in the fields of inflammation or immunology. Monocytes can also be used therapeutically in mouse disease models.

Here we present a protocol that generates large amounts of murine monocytes from heterogeneous bone marrow for translational applications. In comparison to others, this new method helps reduce the number of sacrificed animals and lowers costs by avoiding expensive methods such as high gradient magnetic cell separation (MACS).

İzolasyon ve Kemirgen Kemik İliği intravenöz enjeksiyon Türetilmiş Monositler

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal environment. Biological activities of immune cells mainly rely on their motility capacities. Blood monocytes have short half-life in the bloodstream; they originate in the bone marrow and are constitutively released from it. In inflammatory condition, this process is enhanced, leading to blood monocytosis and subsequent infiltration of the peripheral inflammatory tissues. Identifying the biomechanical events controlling monocyte trafficking from the bone marrow towards the vascular network is an important step to understand monocyte physiopathological relevance. We performed in vivo time-lapse imaging by two-photon microscopy of the skull bone marrow of the Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP (MacBlue) mouse. The MacBlue mouse expresses the fluorescent reporters enhanced cyan fluorescent protein (ECFP) under the control of a myeloid specific promoter 1, in combination with vascular network labelling. We describe how this approach enables the tracking of individual medullar monocytes in real time to further quantify the migratory behaviour within the bone marrow parenchyma and the vasculature, as well as cell-to-cell interactions. This approach provides novel insights into the biology of the bone marrow monocyte subsets and allows to further address how these cells can be influenced in specific pathological conditions.

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Monocytes are key regulators of innate immunity and play a critical role in the renewal of the peripheral mononuclear phagocytic system and in case of inflammation. This manuscript describes the procedure of real time imaging of the mouse calvaria bone marrow to study the monocyte mobilisation mechanism.

Fare Kemik İliği monositlerin Takip<em&gt; İn Vivo</em

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, biomechanics, and stem cell biology. Despite the importance of the bone in healthy and pathologic states, however, it is a largely under-researched organ due to lack of specialized knowledge of bone dissection and bone marrow isolation. Mice are a common model organism to study effects on bone and bone marrow, necessitating a standardized and efficient method for long bone dissection and bone marrow isolation for processing of large experimental cohorts. We describe a straightforward dissection procedure for the removal of the femur and tibia that is suitable for downstream applications, including but not limited to histomorphologic analysis and strength testing. In addition, we outline a rapid procedure for isolation of bone marrow from the long bones via centrifugation with limited handling time, ideal for cell sorting, primary cell culture, or DNA, RNA, and protein extraction. The protocol is streamlined for rapid processing of samples to limit experimental error, and is standardized to minimize user-to-user variability.

Here we present a protocol for the dissection of hind limb long bones (femurs and tibiae) from the laboratory mouse. We further describe a rapid technique for bone marrow isolation from these bones that utilizes centrifugation for removal of bone marrow from the bone marrow space.

Murin Hind Ekstremite Uzun Kemik Diseksiyon ve Kemik İliği İzolasyonu

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

Fare kemik iliğinden plazmasitoid dendritik hücreleri Saflaştırılması floresans ile aktive edilen hücre sınıflandırma

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Isolation and Characterization of Neutrophil-derived Microparticles for Functional Studies

Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in diameter. MPs are a newly evolving, important part of cell-to-cell communication and signaling machinery. Because of their size and the nature of their release, until recently MP existence was overlooked. However, with improved technology and analytical methods their function in health and disease is now emerging. The protocols presented here are aimed at isolating and characterizing PMN-MPs by flow cytometry and immunoblotting. Moreover, several implementation examples are given. These protocols for MP isolation are fast, low-cost, and do not require the use of expensive kits. Furthermore, they allow for the labeling of MPs following isolation, as well as pre-labeling of source cells prior to MP release, using a membrane-specific fluorescent dye for visualization and analysis by flow cytometry. These methods, however, have several limitations including purity of PMNs and MPs and the need for sophisticated analytical instrumentation. A high-end flow cytometer is needed to reliably analyze MPs and minimize false positive reads due to noise or auto-fluorescence. The described protocols can be used to isolate and define MP biogenesis, and characterize their markers and variation in composition under different stimulating conditions. Size heterogeneity can be exploited to investigate whether the content of membrane particles versus exosomes is different, and whether they fulfill different roles in tissue homeostasis. Finally, following isolation and characterization of MPs, their function in cellular responses and various disease models (including, PMN-associated inflammatory disorders, such as Inflammatory Bowel Diseases or Acute Lung Injury) can be explored.

New protocols are described here to isolate and characterize microparticles derived from human and mouse neutrophils. These protocols utilize ultracentrifugation, flow cytometry, and immunoblotting techniques to analyze microparticle content, and they can be used to study the role of microparticles derived from various cell types in cellular function.

Yalıtım ve nötrofil kaynaklı Microparticles karakterizasyonu için fonksiyonel çalışmalar

Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in ...

Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for hematological and immunological analyses. For example, studies of the cellular and molecular properties of myeloid progenitor populations can reveal mechanisms underlying leukemic transformation, or demonstrate how the immune system responds to pathogen exposure. Previously described flow cytometry strategies for myeloid progenitor identification have enabled significant advances in many fields, but the fractions they identify are very heterogeneous. The most commonly used gating strategies define bone marrow fractions that are enriched for the desired populations, but also contain large numbers of &#34;contaminating&#34; progenitors. Our recent studies have resolved much of this heterogeneity, and the protocol we present here permits the isolation of 6 subpopulations of oligopotent and lineage-committed myeloid progenitors from 2 previously described bone marrow fractions. The protocol describes 3 stages: 1) isolation of bone marrow cells, 2) enrichment for hematopoietic progenitors by magnetic-activated cell sorting (lineage depletion by MACS), and 3) identification of myeloid progenitor subsets by flow cytometry (including fluorescence-activated cell sorting, FACS, if desired). This approach permits progenitor quantification and isolation for a variety of in vitro and in vivo applications, and has already yielded novel insight into pathways and mechanisms of neutrophil, monocyte, and DC differentiation.

We demonstrate how to identify and isolate 6 subsets of myeloid progenitors from murine bone marrow using a combination of magnetic and fluorescence sorting (MACS and FACS). This protocol can be used for in vitro culture assays (methylcellulose or liquid cultures), in vivo adoptive transfer experiments, and RNA/protein analyses.

Kimlik ve yalıtım Oligopotent ve Lineage için kabul edilen miyeloid ataları fare kemik iliği dan

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for ...

Isolation and Adoptive Transfer of High Salt Treated Antigen-presenting Dendritic Cells

Excess dietary salt intake contributes to inflammation and plays a vital role in the development of hypertension. We previously found that antigen-presenting dendritic cells (DCs) can sense elevated extracellular sodium leading to the activation of the NADPH oxidase and formation of isolevuglandin (IsoLG)-protein adducts. These IsoLG-protein adducts react with self-proteins and promote an autoimmune-like state and hypertension. We have developed and optimized state-of-the-art methods to study DC function in hypertension. Here, we provide a detailed protocol for isolation, in vitro treatment with elevated sodium, and adoptive transfer of murine splenic CD11c+ cells into recipient mice to study their role in hypertension.

Here, we present a protocol to isolate dendritic cells from murine spleens by magnetic cell sorting and subsequent adoptive transfer into na&#239;ve mice. The model of high-salt activated dendritic cells was chosen to explain the step-by-step procedures of adoptive transfer and flow cytometry.