Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı (IOS-0920417) (ACL) tarafından kısmen desteklenmiştir.

1. Lentiviral Lusiferaz Muhabirleri İnşaatı Bir memeli sirkadyen raportör yapı genellikle sirkadiyen bir promotör, lusiferaz gen ile birleşmesini sağlayan bir ifade kaseti içerir. Hem ligasyonu ile rekombinasyon bazlı stratejilerin genellikle DNA klonlama için kullanılır. Bir örnek olarak, burada istikrarsız lusiferaz (d Luc) fare Per2 promotörün kontrolü altında olduğu bir P (Per2)-D Luc lentiviral raportör üretilmesi için bir rekombinasyon bazlı ağ geçidi klonlama yöntem açıklanmaktadır. <ol><li> Per2 organizatörü klonlanması. Bir ileri primer (5&#39;-CTCGAGCGGATTACCGAGGCTGGTCACG TC-3 &#39;) ve bir ters primeri (5&#39; ile, yukan doğru bir fare BAC klon Per2 9-13 transkripsiyon başlatma sitesinin 526 bp promoter Per2 DNA fragmanı amplifiye etmek için PCR kullanarak -CTCGAGTCCCTTGCTCGGCCCGTCAC TTGG-3 &#39;), ve pENTR5&#39; TOPO-vektörüne (İnvitrojen) içine klon elde edilmektedirpENTR5&#39;-P (Per2). </li><li> D Luc klonlanması. D Luc ateşböceği lusiferaz gen ve daha önce 21 açıklandığı gibi hızlı protein yıkımı için bir C-terminal PEST dizisi içerir. Pentr / Dd Luc üretmek için pentr / D-TOPO vektörüne (İnvitrojen) içine d Luc DNA fragmanı, ve klon amplifiye etmek için PCR kullanarak. </li><li> Muhabir vektör İnşaatı. Lentiviral hedef vektör pLV7-BSD (BSD, blasticidin e dirençli gen) ile iki pentr plazmidler, pENTR5&#39;-P (Per2) ve pentr / Dd Luc, karıştırılır, ve bir pLV7-BSD-P oluşturmak için klonaz kullanılarak rekombinasyon tepkime gerçekleştirmek (Per2)-d Luc muhabiri (Şekil 1). pLV7-BSD woodchuck hepatit virüsü transkripsiyon sonrası düzenleyici element (WPRE) dizileri 22 ifadenin ca aşağı hemen takılı edildiği pLenti6/R4R2/V5-DEST (Invitrogen) değiştirilmiş bir sürümü (bizim laboratuarımızda yapılan)<html> gen ekspresyonunu artırmak için ssette. </li></ol> 2. Lentiviral Parçacıkların Üretimi 1. Tohum 293T hücreleri (1. gün) <ol><li> % 10 FBS ve 1x 10 cm kültür tabaklarında üzerine Penisilin-Streptomisin-Glutamin (PSG) ile desteklenmiş düzenli DMEM% 90-100 izdiham insan embriyonik böbrek (HEK) 293T hücreleri büyümek. (Düşük geçiş sayısı ile hızla büyüyen hücreler verimli transfeksiyon için önemlidir.) </li><li> Önceki her oyuğa PBS içinde% 0.001 poli-L-lizin, 1 ml eklenmesi ve 20 dakika süre ile oda sıcaklığında inkübe ile transfeksiyon, ceket 6 oyuklu kültür plakaları için hücreler ile tohumlama. Solüsyonu aspire ve kullanımdan önce 1x bir kez PBS ile yıkayın. </li><li> Tripsin ve tohum 0.75 ile 293T hücreleri ayrışır 2 x 10 ml normal DMEM ile önceden kaplanmış plakalar her bir yanı üzerine 6 hücre. Karıştırıcı levha iyice her bir kuyu içinde hücrelerinin eşit bir dağılım elde edilir. 37 ° C&#39;da gece boyunca kuluçka makinesi içinde hücreler büyütün. </li></ol>Capo 4 / DNA yağış (2. gün) aracılığıyla tep &quot;&gt; 2. Geçici transfeksiyon <ol><li> Gün 1 numaralı seribaşı hücreleri gözlemleyin. Hücre% 80-90 arasında izdiham ulaştırılması gerekmektedir. </li><li> Ve 3 paketleme vektörleri (1.3 ug Gag / Pol, 0.5 ug; lentiviral raportör plazmid DNA 2 mg (Liu laboratuvar örneğin, pLV7-P (Per2)-d Luc) ilave edilerek 1.5 mL mikrosantrifüj tüpü içinde plazmid transfeksiyon karışımı hazırlayın Rev, ve 0.7 mikrogram VSVG; Invitrogen). Transfeksiyondan ve sonraki enfeksiyon her ikisi için bir kontrol olarak, genellikle, CMV promotörün kontrolü altında gelişmiş yeşil flüoresan protein (EGFP) barındıran bir lentiviral GFP ifade vektörü için transfeksiyon ek bir yanı, pLV156-CMV-EGFP (Şekil 1A) da içermektedir daha önce 20 tarif. </li><li> 2. adımda plazmid karışımı 0.25 M CaCl2 100 ul (2,5 M stoktan DNaz / RNaz-serbest GKD 2 O ile seyreltilmiş) ekleyin ve iyice karıştırın. Daha sonra 2x BBS çözeltisinden 100 ul (50 mm eklemekS, 280 mM NaCl, 1.5 2 HPO 4, pH 6.95) Na mM ve yavaşça ama iyice karıştırın. 15 dakika süreyle oda sıcaklığında DNA karışımı inkübe edin. </li><li> Beklerken, 293T hücreleri orta aspirat ve 2 ml taze orta değiştirin. Transfeksiyondan önce ortam pH dengelemek için, en azından 10 dakika boyunca kuluçka makinesi ile levha geri dönün. </li><li> Damla 293T hücreleri damlasına kadar adım 3 transfeksiyon karışımı ekleyin. Swirl hafifçe plaka ve mikroskop altında partikül oluşumunu gözlemlemek. % 5 ° C de bir gece CO2, 37 inkübe edin. (Capo 4 / DNA çökelti Güzel parçacık oluşumu verimli transfeksiyon için önemlidir.) </li></ol> 3. Hasat viral partiküller (günde 3-4) <ol><li> Hakkında 16 saat sonrası transfeksiyon (günde 3) hangi zaman hücreler,% 100 izdiham ulaşması gerektiğini hücrelerinden orta aspirat ve 2 ml taze düzenli DMEM ile değiştirin. 37 ° C de bir gece inkübe edin. </li><li> 4. günde, tran EGFP ifade gözlemleyerek transfeksiyon verimliliği değerlendirmeksfection kontrol hücreleri (yüksek EGFP ifadesi ile% 90-100 arasında Transfeksiyon verimliliği iyi bir viral hazırlık güvenilir bir belirleyicisidir.) </li><li> Salgılanan, bulaşıcı viral partiküller içeren orta toplayın. Rezidüel 293T hücreleri kaldırmak ve virüs içeren süpernatant toplamak için 5 dakika süreyle&gt; 2.000 x g&#39;de santrifüjleyin. Alternatif olarak, ortam bir 0.45 mikron membran filtre ile temizlenebilir. Viral parçacıkların enfeksiyon kullanıma hazırdır. </li></ol> 3. 3T3 Hücreleri Enfeksiyon 1. Tohum 3T3 hücreleri (günde 3) 12-plaka üzerinde Split ve 3T3 hücreleri tohum uygun sayıda (~ 12.000) tarafından ertesi gün% 20-30 izdiham elde etmek. 37 ° C de bir gece inkübe edin. 2. 3T3 hücreleri (günde 4) Infect <ol><li> Numaralı seribaşı hücreleri gözlemleyin. % 20-30 (en az% 50) izdiham enfeksiyon için arzu edilir. </li><li> Viral içeren toplanmış ortama 5, ug / ml &#39;lik nihai bir konsantrasyona polybrene eklemeparçacıklar. Pipetleme ile iyice karıştırın. </li><li> 3T3 hücreleri, orta aspire ve kuyu başına yukarıda viral karışım 1 ml ekleyin. 37 ° C de bir gece inkübe edin. (Polybrene enfeksiyon etkinliğini arttırmak için kullanılır, ancak kesinlikle gerekli değildir. Bazı hücrelere karşı toksik olabilir gibi, testten önce önerilir.) </li></ol> 3. Enfekte hücreler (Günde 5 ve yukarısı) seçin <ol><li> Yirmi dört saat sonrası enfeksiyon, enfekte olmuş hücrelerde virüs ve polybrene içeren orta aspire, 1x kez PBS ile yıkayın ve taze orta değiştirin. 37 iyileşme ve büyüme için ° C&#39;de gece boyunca inkübe edin. </li><li> Ne zaman konfluent (genellikle 1-2 gün sonra), 37 ° C&#39;de gece boyunca inkübe hücreleri ve ayrıldı. </li><li> Ertesi gün, aspirat hücreleri (&lt;% 50 kesişme noktası tercih edilir) arasından orta ve stabil bir şekilde seçmek için 10 ug / ml Blasticidin içeren taze aracı madde ile yerine hücreleri transdük. (Blasticidin kill-eğrisi ampirik belirli bir hücre hattı için tespit edilmesi gerekmektedir.) </li><li&gt; Saat gazetecilere (genellikle 4-6 gün toplam) ifade antibiyotiğe dirençli hücrelerin sürekli seçim için 2-3 günde Blasticidin içeren taze orta değiştirin. </li></ol> 4. Muhabir Hücrelerinin Biyoparlaklık Kaydı 1. Tohum muhabiri hücreleri Blasticidin dayanıklı muhabiri hücreleri yayma ve 35-mm&#39;lik kültür kaplarına yayılmıştır. Konfluent kadar 37 ° C&#39;de inkübe edin. Biz genellikle sirkadiyen fenotipleme için her koşulda, her muhabiri hücre hattı için ≥ 3 yemekleri hazırlamak. 2. Senkronizasyon ve kayıt ortamı değişiklik <ol><li> Konfluent muhabiri hücrelerden orta aspire kez PBS ile yıkayın ve DMEM 10 uM forskolin (veya 200 nM deksametazon) içeren ile değiştirin. Hücreler senkronize etmek için 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. (Alternatif olarak, hücre sıcaklık döngüleri 23 veya serum şok 24 ile senkronize edilebilir.) </li><li> Beklerken, kayıt hazırlamakaşağıdaki gibi 3T3 hücreleri için ing orta: FBS, 1x Pen / Strep / Gln, 1 uM forskolin, 1 mM lusiferin, 25 mM HEPES, pH 7.4 ile% 10 oranında içeren 1x DMEM (HyClone). Serum ve forskolin konsantrasyon ampirik olarak belirlenmektedir. Çok loş hücreleri, fenol kırmızı içermeyen aracı madde kullanılabilir. </li><li> Forskolin ile tedavi sonunda, ortam aspire ve taze kayıt ortamı ile değiştirin. </li></ol> 3. Raportör hücrelerin Bio-ışıldama, kayıt <ol><li> Orta değişikliğinin ardından, buharlaşmayı önlemek için vakum gres ile yerde 40 mm steril lamelleri ve mühür ile kültür kaplarına kapsamaktadır. </li><li> H 2 O veya CO 2 olmadan 36 ° C&#39;de bir inkübatör set içinde tutulur LumiCycle luminometre, üzerine yemekleri yükleyin. </li><li> Gerçek zamanlı biyolüminesans kayda başlayın. Biz genellikle bir ikinci hafta için orta değişim ve sürekli kayıt (Savelyev ark. Ayrıntılar için) 25, ardından 1 hafta ritimleri kaydetmek. (96-biz kayıt edilmesi için,ll plakaları, Sinerji SL2 kayıt cihazı olarak kullanılan; detaylar için Tartışma 1.1). </li></ol> 5. Veri Analizi ve Sunumu Muhabir hücreleri sirkadiyen saat fonksiyonu üzerinde fenotipik etkileri belirlemek için kritik yüksek çözünürlüklü kantitatif lüminesans kayıt kolaylaştırır. Faz, periyot uzunluğu, ritim genlik ve sönüm oranı dahil sirkadiyen parametrelerini elde etmek için, biz biyolüminesans verileri 5,14 analiz LumiCycle Analiz programı (Actimetrics) kullanın. Kısaca, ham veri taban ilk donatılmıştır ve bazal çıkarıldığı veri parametreleri belirlenmiştir hangi bir sinüs dalgası için donatılmıştır. Kalıcı ritimleri,&gt;% 90 genellikle elde edilir iyiliği-of-fit gösteren örnekler için. Orta değişim üzerine yüksekten geçici biyoparlaklık nedeniyle, biz genellikle analiz verilerinin ilk döngüsü hariç. Veri sunumu için, genellikle ti karşı ham veri (biyoparlaklık, sayım / sn) çizmekBana (gün). Gerektiğinde, bazal çıkarıldığı veri genlik ve faz karşılaştırmak için çizilebilir. 6. Temsilcisi Sonuçlar 1. Faz-spesifik sirkadiyen gazetecilere Sirkadiyen saat biyokimyasal bir negatif geri bildirim mekanizması 1 dayanmaktadır. Çekirdek geribesleme döngüsü ritmik gen ekspresyonu (sabah faz, örneğin, Rev-erb α ile) üretmek için sirkadiyen E / E&#39;-box arttırıcı unsurları harekete transkripsiyonel aktivatörleri BMAL1 ve SAAT ve baskılayıcılar pers ve crys oluşmaktadır. Çekirdek döngü en az diğer iki sirkadiyen cis-elementler, DBP/E4BP4 bağlama elemanı düzenler ve entegre (D-box; günlük faz, örneğin, Per3 için); gece faz ve ROR / REV-ERB bağlama elemanı (HKD örneğin, BMAL1) 17. Birden sirkadiyen elemanları tarafından Kombinatoryal düzenleme yeni ara fazları üretebilirsiniz. Örneğin, Cry1 transkripsiyontion farklı Cry1 akşam-zaman aralığı 13 &#39;nün her üç sirkadyen elemanları (Cry1 geninin ilk intron içinde promotör ve RREs yani, D / E&#39;-kutu ve D-box elemanları), aracılık etmektedir. Gen regülasyonu bu mekanizmaların dayanarak, dört farklı muhabiri yapıları oluşturulur: P (Per2)-d Luc ve P (Cry1) E / E&#39;-box ve düzenleyici bölgesinde 17 D-box elemanları hem de içeren-d Luc gazetecilere, 26,27; P (Cry1) - Tüm üç unsur tarafından kombinatoryal düzenlenmesi (örneğin, E / E&#39;-kutusu, D-box ve HKD) 13,17 temsil Intron-d Luc ve P (BMAL1)-d Luc düzenlenmiş münhasıran RRE 9,17,19,21 tarafından. Biz muhabiri ifade beklenen farklı faz (Şekil 2) üretmek için 3T3 hücreleri içine bu gazetecilere tanıtıldı. 2. RNAi ve farmakolojik acti yoluyla Gen devirmeDaha önce bileşikleri Transfeksiyon verimliliği yüksek olduğunda, sentetik siRNA geçici gen ekspresyonu yıkmak için hücrelere transfekte edilebilir. Transfeksiyondan teknik olarak zor olduğunda, bir ifade vektörü shRNA hücre tarafından üretilen shRNA gen devirme (KD) için siRNA için işlemden geçirilir, böylece stabil bir şekilde lentiviral enfeksiyon yoluyla hücre içine transdüksiyon ile olabilir. Burada bir ağ geçidi pLL3.7 ifade vektörü 9 (Şekil 3B) kullanılarak 3T3 hücreleri içinde U2OS hücrelerinde siRNA (Şekil 3A) ve shRNA kullanılarak Cry1 ve cry2 genlerin KD etki yaratmadığı. 3T3 hücreleri ek olarak, U2OS modeli, piyasada bulunan bir insan siRNA kütüphanelerinin yüksek verimli tarama teknikleri (örn., insan kaynaklı, sağlam sirkadyen ritim, nin onaylanmış fonksiyon üretme yeteneğine sahip için anahtar gereksinimlerini büyük ölçüde karşılayan bir üstün hücresel saat modeli olmuştur bilinen tüm saat genler ve yüksek verimli transfeksiyon ve mükellefkantitatif lüminesans kaydı). Her iki hücre tiplerinde, RNAi-aracılı KD önceki fare nakavt (KO) ve hücresel KD çalışmalar 5,10,11,28 ile tutarlı saat fenotipler ile sonuçlanmıştır. Örneğin, Cry1 KD kısaltır süre uzunluğu ve ritim sebat azaltır, cry2 KD dönemi uzatır oysa. Buna ek olarak, seçilmiş küçük moleküller ve farmakolojik olarak hedef protein işlevi perturb (Şekil 3C) için de kullanılabilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4234/4234fig1.jpg" /> Şekil 1. Lentivirüs-aracılı gen dağıtım sistemi. İki lentiviral P (Per2)-d Luc muhabiri vektörler ve CMV-EGFP (A) şematik diyagramı oluşturmak. Konak hücre genomu içine entegre için sadece bölge gösterilmiştir. Her iki muhabiri yapıları, d Luc transkripsiyon Per2 organizatörü doğrudan kontrolü altındadır. PLV7-BSD-P (Per2)-d Luc vektör (rekombinasyon bazlı klonlama), bir coexpressed Blasticidin direnç geni (BSD) ile enfekte olan hücrelerin seçilmesi mümkündür. PLV156-P (Per2) In-d Luc vektörü (ligasyon bazlı klonlama), EGFP çeviri görsel gözlem ile enfekte olmuş hücreler FACS sıralamak için izin veren bir dahili ribozom giriş bölgesini (IRES) d Luc aşağı aracılık etmektedir. Buna ek olarak, bir SV40 promoter / terminatör (P / T) bir yalıtkan (tartışma 1.3) olarak kullanılır. CMV-EGFP kontrol vektör olarak, EGFP ifade güçlü bir CMV promotörün kontrolü altındadır. Transfekte edilen ve enfekte GFP-ifade eden hücrelerin (B) Floresan görüntüler. Genellikle, 293T hücreleri geçici transfeksiyon ve bu hücreleri GFP ile gösterilir bizim ilgi hücre hatları, lentiviral enfeksiyon hem de yüksek verim elde etmek. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4234/4234fig1large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 2," sRc = &quot;/ files/ftp_upload/4234/4234fig2.jpg&quot; /&gt; Şekil 2. 3T3 hücreleri biyolüminesans gazetecilere Faz-spesifik ekspresyonu Bu deneyde kullanılan lentiviral muhabiri vektörleri pLV7-BSD-P (Per2)-d Luc, P (Cry1)-d Luc, P (Cry1) -. Intron-d Luc, ve P (BMAL1)-d Luc. Her bir raportör olarak oklarla gösterilen salınım farklı bir faz sergiler. Per2 ve sabah günlük evreleri ve gece aşamasında BMAL1 organizatörü, P (Cry1) tarafından kombinatoryal düzenlenmesine Cry1 yararlanıcı sürücü pik biyolüminesans iken - Intron E-box barındıran, D-box ve RRE elemanlar pik biyolüminesensin akşamı faz bahşeder . <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4234/4234fig2large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4234/4234fig3.jpg" /> Şekil 3. Muhabir hücrelerinde sirkadiyen biyolüminesans ritimlerin genetik ve farmakolojik pertürbasyon. (A) Cry1 Etkileri ve U2OS muhabiri hücresel ritimleri siRNA&#39;lar tarafından cry2 devirme. LumiCycle luminometrede 35 mm tabaklar içinde hücre biyolüminesans kayıt için kullanılmıştır. Şekil uyarlanmıştır Referans Elsevier (2009) izni ile 10.. 3T3 muhabiri hücresel ritimleri shRNAs tarafından cry2 knockdown (B) Etkileri. gelen Bir U6-shRNA kaset içeren bir ağ geçidi pLL3.7 vektör cry2 gen demonte için kullanılmıştır. shRNA2 Western blot analizi (veriler gösterilmemiştir) tarafından belirlendiği gibi shRNA1 daha iyi bir devirme verimliliğine sahiptir. A Sinerji luminometrede 96 çukurlu bir plaka içinde biyolüminesans hücrelerin kayıt için kullanılmıştır. Kayıt için ayarları aşağıdaki gibidir:. Inkübatör sıcaklığı, 33 ° C; entegrasyon süresi, 15 saniye; cel küçük molekül inhibitörlerin zaman aralığı, 30 dk (C) EtkileriU2OS raportör hücre lular ritim. Chir99021 ve Roscovitine sırasıyla, GSK-3 ve CDK karşı inhibitörleridir. ViewLux sistemi (Chir99021 tahlil) ve bir Tecan luminometrede (Roscovitine tahlil) 384 oyuklu plakalar hücre biyolüminesans kayıtlar için kullanılmıştır. Şekil Referans # 19 (Bilimler Copyright 2008 Ulusal Bilimler Akademisi, ABD) &#39;den uyarlanmıştır. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4234/4234fig3large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> .

Çıkar çatışması ilan etti.

1. Mevcut Protokol Değişiklikler 1.1 Kayıt cihazları ve üretilen düşünceler Çünkü ticari durumu, LumiCycle (Actimetrics) gerçek zamanlı kayıt 4,5,9,19,29-31 için en sık kullanılan otomatik luminometre aygıt haline gelmiştir. LumiCycle son derece yüksek hassasiyet ve düşük gürültü 14 sağlamak ışık dedektörü olarak fotoçoğaltıcı borular (Proje Yönetim Ekipleri) kullanır, ve bu nedenle son derece loş lusiferaz ...

<table border="1"><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> HyClone </td><td> SH30243FS </td><td> Düzenli hücre büyümesi için </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12100-046 </td><td> Luminometry için </td></tr><tr><td> FBS </td><td> HyClone </td><td> SH3091003 </td><td></td></tr><tr><td> Kalem / Strep / Gln (100x) </td><td> HyClone </td><td> SV3008201 </td><td></td></tr><tr><td> B-27 </td><td> Invitrogen </td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> D-lusiferin </td><td> Biosynth </td><td> L-8220 </td><td></td></tr><tr><td> Poli-L-lisin </td><td> Sigma </td><td> P4707 </td><td></td></tr><tr><td> Polybrene </td><td> Millipore </td><td&gt; TR-1003-G </td><td></td></tr><tr><td> Forskolin </td><td> Sigma </td><td> F6886 </td><td></td></tr><tr><td> Tüm diğer kimyasal maddeler </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Ekipman </td></tr><tr><td> Doku kültürü inkübatör </td><td></td><td></td><td> 37 ° C&#39;de% 5 CO2 </td></tr><tr><td> Doku kültürü kaputu </td><td></td><td></td><td> BSL-2 sertifikalı </td></tr><tr><td> Floresan ve Işık mikroskobu </td><td></td><td></td><td> Isteğe Faz kontrast </td></tr><tr><td> LumiCycle </td><td> Actimetrics </td><td></td><td></td></tr></table>

monitoring cell-autonomous circadian clock rhythms of gene expression using luciferase bioluminescence reporters

Memelilerde, davranış ve uyku-uyanıklık döngüsü ve karaciğer metabolizması gibi fizyolojisi birçok açıdan endojen sirkadiyen saat (1,2 yorumlanan) tarafından düzenlenir. Sirkadiyen zaman tutma sistemi senkronize ve başka yerlerde 1,2 ekstra SCN ve periferik saatler koordine suprakiazmatik nükleus (SCN) bulunan merkez saati ile, hiyerarşik bir multi-osilatör ağıdır. Bireysel hücrelerin üretimi ve sirkadiyen ritim 3,4 ve organizma payı farklı doku tiplerinin bir oldukça benzer biyokimyasal negatif geribildirim mekanizmasının bu osilatörler bakımı için fonksiyonel birimlerdir. Bununla birlikte, SCN nöronal ağ seviyesinde ve organizma seviyesinde ritmik, sistemik işaretler ile etkileşimler nedeniyle, organizma seviyesinde ritminin hücre-bağımsız 5-7 olması gerekli değildir. In vivo ve SCN eksplantlar ex vivo, c lokomotor aktivite geleneksel çalışmaları ile karşılaştırıldığındaell-tabanlı cep özerk sirkadiyen kusurları 5,8 keşfi için izin vitro tayinlerde. Stratejik, hücre tabanlı modeller fenotipik karakterizasyonu ve temel saat mekanizmaları 5,8-13 hızlı keşif için daha fazla deneysel uysal vardır. Sirkadiyen ritim dinamik olduğundan, yüksek zamansal çözünürlüğe sahip boylamasına ölçümleri saat fonksiyonu değerlendirmek için gereklidir. Son yıllarda, bir muhabir olarak ateşböceği lusiferaz kullanarak gerçek zamanlı biyolüminesans kayıt, moleküler ritimlerin sebat ve dinamiklerinin incelenmesi için izin verir gibi, memeliler 14,15 bölgesindeki sirkadiyen ritim eğitimi için ortak bir teknik haline gelmiştir. Gen ekspresyonu hücre-özerk sirkadiyen ritim izlemek için, lusiferaz gazetecilere geçici transfeksiyon 13,16,17 veya stabil transdüksiyon 5,10,18,19 yoluyla hücre içine sokulabilir. Burada lentivirüs-aracılı gen teslimat kullanarak istikrarlı iletimi protokol açıklar. TO lentiviral vektör sistemi böyle nedeniyle verimlilik ve çok yönlülük geçici transfeksiyon ve germline iletimi gibi geleneksel yöntemlere üstündür: bölünerek ve hücreler 20 sigara bölünmesi hem konak genom içine verimli teslimat ve istikrarlı entegrasyonuna izin verir. Bir muhabir hücre hattı kurulduktan sonra, saat fonksiyonu dinamikleri biyolüminesans kayıt yoluyla incelenebilir. İlk olarak P (Per2)-D Luc raportör hatları, ve daha sonra bu ve diğer sirkadyen muhabirlerden mevcut veri üretimini açıklıyoruz. Bu analizlerde, 3T3 fare fibroblastlarının ve U2OS insan osteosarkom hücre hücresel model olarak kullanılmıştır. Biz de sirkadiyen çalışmalarda bu saat modelleri kullanmanın çeşitli yollarını tartışmak. Burada anlatılan Yöntemleri sirkadiyen saatlerin hücresel ve moleküler temeli incelemek için hücre tipleri çok çeşitli uygulanabilir, ve diğer biyolojik sistemlerde sorunlara mücadelede yararlı olabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters at JoVE.com

Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters

Sirkadiyen saatler tek tek hücrelerin içinde fonksiyon, yani, bu hücre-özerktir. Burada, non-invaziv, lusiferaz tabanlı gerçek zamanlı biyolüminesans teknolojisini kullanarak cep özerk saat modelleri üretme yöntemleri açıklanmaktadır. Muhabir hücreleri sirkadiyen biyoloji eğitimi için uysal, fonksiyonel model sistemleri sağlıyoruz.

Lusiferaz Biyoparlaklık Gazeteciler kullanma Gen Ekspresyonunun Hücre-özerk Sirkadiyen Saat Ritimleri İzlenmesi

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks ...

monitoring-cell-autonomous-circadian-clock-rhythms-gene-expression

Research

JoVE Journal

Biology

22.1K Görüntüleme.  The University of Memphis. Sirkadiyen saatler tek tek hücrelerin içinde fonksiyon, yani, bu hücre-özerktir. Burada, non-invaziv, lusiferaz tabanlı gerçek zamanlı biyolüminesans teknolojisini kullanarak cep özerk saat modelleri üretme yöntemleri açıklanmaktadır. Muhabir hücreleri sirkadiyen biyoloji eğitimi için uysal, fonksiyonel model sistemleri sağlıyoruz.

Video: Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Bakteriyel Gen İfadesi Analizi Mikroarray&#39;ler Kullanımı

Biyoloji

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Hazırlık Elektroporasyon murin Kemik İliği itibaren İlköğretim Hematopoetik Hücre Kültürleri

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Yüksek Verimli Primer Hücre Transfect Gen Verici MXcell Elektroporasyon Sistemi

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Gen İfadesi Çalışmaları basitleştirin Otomatik Hücre Sayıcı kullanma: Namalwa Hücreler IL-4 Bağımlı Gen İfadesi siRNA demonte

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Active T. in vitro Sulandırma castaneum Telomeraz

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Ününüz Aşağıdaki Tek Hücre Düzeyinde Küresel RNA Sentezi Analizi

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

Metabolik Oranı Ölçümü<em&gt; Drosophila</em&gt; Respirometrik kullanarak

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic levels. Tight control over ER calcium is imperative for protein folding, modification and trafficking. Perturbations to ER calcium can result in the activation of the unfolded protein response, a three-prong ER stress response mechanism, and contribute to pathogenesis in a variety of diseases. The ability to monitor ER calcium alterations during disease onset and progression is important in principle, yet challenging in practice. Currently available methods for monitoring ER calcium, such as calcium-dependent fluorescent dyes and proteins, have provided insight into ER calcium dynamics in cells, however these tools are not well suited for in vivo studies. Our lab has demonstrated that a modification to the carboxy-terminus of Gaussia luciferase confers secretion of the reporter in response to ER calcium depletion. The methods for using a luciferase based, secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) for in vitro and in vivo applications are described herein. This video highlights hepatic injections, pharmacological manipulation of GLuc-SERCaMP, blood collection and processing, and assay parameters for longitudinal monitoring of ER calcium.

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Endoplasmic reticulum calcium homeostasis is disrupted in diverse pathologies. A secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) reporter can be used to detect disruptions in the ER calcium store. This protocol describes the use of a Gaussia luciferase SERCaMP to examine ER calcium homeostasis in vitro and in vivo.

Bir kullanılması Endoplazmik retikulum kalsiyum dengesi İzleme<em&gt; Gaussia</em&gt; Lusiferaz SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, rat, human, pig and others. The verification of iPS clones mainly relies on the detection of the endogenous expression of different pluripotency genes. These genes mostly represent transcription factors which are located in the cell nucleus. Traditionally, the proof of their endogenous expression is supplied by immunohistochemical staining after fixation of the cells. This approach requires replicate cultures of each clone at this early stage to preserve validated clones for further experiments. The present protocol describes an approach with gene-specific nanoparticles which allows the evaluation of intracellular gene expression directly in live cells by fluorescence. The nanoparticles consist of a central gold particle coupled to a capture strand carrying a sequence complementary to the target mRNA as well as a quenched reporter strand. These nanoparticles are actively endocytosed and the target mRNA displaces the reporter strand which then start to fluoresce. Therefore, specific target gene expression can be detected directly under the microscope. In addition, the emitted fluorescence allows the identification, isolation and enrichment of cells expressing a specific gene by flow cytometry. This method can be applied directly to live cells in culture without any manipulation of the target cells.

This manuscript describes a novel technique which allows the detection of intracellular gene expression after endocytosis of fluorescence-labeled nanoparticles directly in live cells. The method does not require manipulation of the cells and is not restricted with respect to the target gene or species.

Floresan etiketli Nanopartiküller kullanma Fare, İnsan ve domuz Menşe Canlı hücreler hücre içi Gen İfade Algılama

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...

Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable biotic and abiotic stress. Conversely, disruption of circadian timekeeping severely compromises plant health and reduces agricultural crop yields. It is therefore imperative that we understand the intricate regulation of circadian rhythms in plants, including the factors that affect motion of the transcriptional clockwork itself.
Testing circadian defects in the model plant Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) traditionally involves crossing specific mutant lines to a line rhythmically expressing firefly luciferase from a circadian clock gene promoter. This approach is laborious, time-consuming, and could be fruitless if a mutant has no circadian phenotype. The methodology presented here allows a rapid initial assessment of circadian phenotypes. Protoplasts derived from mutant and wild-type Arabidopsis are isolated, transfected with a rhythmically expressed luminescent reporter, and imaged under constant light conditions for 5 days. Luminescent traces will directly reveal whether the free-running period of mutant plants is different from wild-type plants. The advantage of the method is that any Arabidopsis line can efficiently be screened, without the need for generating a stably transgenic luminescent clock marker line in that mutant background.

The circadian clock regulates about a third of the Arabidopsis transcriptome, but the percentage of genes that feed back into timekeeping remains unknown. Here we visualize a method to rapidly assess circadian phenotypes in any mutant line of Arabidopsis using luminescent imaging of a circadian reporter transiently expressed in protoplasts.

Bir Lüminesans Saat Reporter ile Arabidopsis Protoplasts transfekte içinde Sirkadiyen fenotipleri Hızlı Analizi

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable ...