Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalla National Science Foundation (IOS-0920417) (ACL).

1. Costruzione di lentivirali Reporter luciferasi Un costrutto reporter di mammifero circadiano solitamente contiene una cassetta di espressione in cui è fuso con un promotore circadiano il gene della luciferasi. Sia legatura e ricombinazione basata strategie sono comunemente usati per la clonazione del DNA. Come esempio, qui si descrive un metodo basato ricombinazione clonazione per generare una Gateway (Per2) P-d giornalista lentivirale Luc, in cui la luciferasi destabilizzato (d Luc) è sotto il controllo del promotore di topo Per2. <ol><li> Clonazione di Per2 promotore. Utilizzare PCR per amplificare il frammento di DNA Per2 promotore di 526 bp, a monte del sito di inizio trascrizione da un Per2 topo clone BAC 9-13, utilizzando un primer forward (5&#39;-CTCGAGCGGATTACCGAGGCTGGTCACG TC-3 &#39;) e un primer reverse (5&#39; -CTCGAGTCCCTTGCTCGGCCCGTCAC TTGG-3 &#39;), e clone in pENTR5&#39;-vettore TOPO (Invitrogen) per generarepENTR5&#39;-P (Per2). </li><li> Clonazione di d Luc. La Luc d contiene il gene della luciferasi di lucciola e un terminale C sequenza PEST per una rapida degradazione proteica come precedentemente descritto 21. Utilizzare PCR per amplificare il frammento di DNA d Luc, e clone in pENTR / D-TOPO vettore (Invitrogen) per generare pENTR / Dd Luc. </li><li> Costruzione del vettore reporter. Mescolare i due plasmidi pENTR, pENTR5&#39;-P (Per2) e pENTR / Dd Luc, con il vettore di destinazione lentivirale pLV7-Bsd (Bsd, gene di resistenza blasticidina), ed eseguire la reazione di ricombinazione con Clonase per generare un pLV7-Bsd-P (Per2) d-Luc reporter (Figura 1). pLV7-BSD è una versione modificata (realizzato nel nostro laboratorio) di pLenti6/R4R2/V5-DEST (Invitrogen) in cui sono stati inseriti il virus dell&#39;epatite woodchuck post-trascrizionale di regolamentazione elemento (WPRE) sequenze 22 immediatamente a valle dell&#39;espressione ca<html> ssette per migliorare l&#39;espressione genica. </li></ol> 2. Produzione di particelle lentivirali 1. Cellule semi 293T (giorno 1) <ol><li> Crescere renali embrionali umane (HEK) 293T al 90-100% di confluenza in regolare DMEM supplementato con 10% FBS e 1x Penicillina-Streptomicina-Glutammina (PSG) su piatti di coltura 10 centimetri. (Cellule in rapida crescita con il numero di passaggio basso sono fondamentali per la trasfezione efficiente.) </li><li> Prima della semina delle cellule per la trasfezione, coat piastre da 6 pozzetti di coltura con l&#39;aggiunta di 1 ml di 0,001% di poli-L-lisina in PBS ad ogni pozzetto ed incubare a temperatura ambiente per 20 min. Aspirare la soluzione e lavare una volta con PBS 1x prima dell&#39;uso. </li><li> Separa celle 293T con tripsina e di semi di 0.75 x 10 6 cellule su ciascun pozzetto di pre-piastre rivestite con 2 ml di DMEM regolare. Swirl le piastre accuratamente per ottenere una distribuzione uniforme delle cellule in ciascun pozzetto. Crescere le cellule in incubatore a 37 ° C per una notte. </li></ol>tep &quot;&gt; 2. trasfezione transitoria Via Capo 4 / precipitazione del DNA (giorno 2) <ol><li> Osservare le cellule seminate dal giorno 1. Cellulare dovrebbe raggiungere la confluenza del 80-90%. </li><li> Preparare mix plasmide trasfezione in una provetta da microcentrifuga 1,5 ml aggiungendo 2 pg di DNA di un plasmide reporter di lentivirale (ad esempio, pLV7-P (Per2) d-Luc; Liu lab) ed i tre vettori di imballaggio (1,3 mcg Gag / Pol, 0,5 mg Rev, e 0,7 mg VSVG, Invitrogen). Come controllo sia per trasfezione e successiva infezione, di solito comprendono un pozzo supplementare per trasfezione in un vettore lentivirale espressione di GFP, pLV156-CMV-EGFP (Figura 1A), harboring maggiore proteina fluorescente verde (EGFP) sotto il controllo del promotore CMV come descritto in precedenza 20. </li><li> Aggiungere 100 ml di 0,25 M CaCl 2 (diluito con DNasi / RNasi-free DDH 2 O da 2,5 magazzino M) al mix plasmide al punto 2 e mescolare accuratamente. Aggiungere quindi 100 ml di soluzione di 2x BBS (50 mM BES, 280 mM NaCl, 1,5 mM Na 2 HPO 4, pH 6,95) e mescolare delicatamente ma accuratamente. Incubare la miscela DNA a temperatura ambiente per 15 min. </li><li> In attesa, aspirare media da cellule 293T e cambiare a 2 ml di terreno fresco. Riportare la piastra alla incubatore per almeno 10 minuti per equilibrare pH medio prima della transfezione. </li><li> Aggiungi mix di trasfezione dal punto 3 al 293T cellule goccia a goccia. Agitare delicatamente la piastra e osservare la formazione di particelle al microscopio. Incubare al 5% di CO 2, 37 ° C per una notte. (Formazione di particelle di precisione del Capo 4 precipitato / DNA è fondamentale per la trasfezione efficiente.) </li></ol> 3. Particelle virali Harvest (giorni 3-4) <ol><li> Circa 16 ore dopo la trasfezione (giorno 3) con cui cellule tempo dovrebbe raggiungere il 100% di confluenza, aspirare media da cellule e sostituire con 2 ml di DMEM fresco regolare. Incubare a 37 ° C per una notte. </li><li> Il giorno 4, valutare l&#39;efficienza di trasfezione osservando espressione EGFP nel transfection cellule di controllo (efficienza di trasfezione di 90-100% con l&#39;espressione di EGFP elevata è un fattore predittivo affidabile di una buona preparazione virale.) </li><li> Raccogliere il mezzo contenente secrete, particelle virali infettive. Centrifugare a&gt; 2000 xg per 5 minuti per rimuovere i residui di cellule 293T e raccogliere il surnatante contenente virus. In alternativa, il supporto può essere eliminato con un filtro da 0,45 micron membrana. Le particelle virali sono pronti per l&#39;uso in infezioni. </li></ol> 3. Infezione di cellule 3T3 1. Cellule 3T3 Seed (giorno 3) Spalato e numero di sementi adeguate (~ 12.000) di cellule 3T3 su un 12-pozzetti per ottenere 20-30% confluenza di giorno successivo. Incubare a 37 ° C per una notte. 2. Infettare le cellule 3T3 (giorno 4) <ol><li> Osservare le cellule seminate. Confluenza del 20-30% (meno del 50%) è desiderato per l&#39;infezione. </li><li> Aggiungere polibrene ad una concentrazione finale di 5 pg / ml per il mezzo contenente raccolti viraleparticelle. Mescolare bene pipettando. </li><li> Aspirare il terreno da cellule 3T3, e aggiungere 1 ml della suddetta miscela virale per pozzetto. Incubare a 37 ° C per una notte. (Polybrene viene utilizzato per migliorare l&#39;efficienza dell&#39;infezione, ma non è assolutamente necessaria. Come può essere tossico per alcune cellule, previo controllo è raccomandato.) </li></ol> 3. Selezionare cellule infette (giorno 5 e successivi) <ol><li> Ventiquattro ore dopo l&#39;infezione, aspirare terreno contenente virus e polibrene dalle cellule infette, lavare una volta con PBS 1x, e cambiare con terreno fresco. Incubare a 37 ° C per una notte per il recupero e la crescita. </li><li> Quando confluenti (di solito 1-2 giorni dopo), dividere le celle e incubare a 37 ° C per una notte. </li><li> Il giorno seguente, medie aspirato dalle cellule confluenza (&lt;50% è desiderato) e sostituirlo con mezzo fresco contenente 10 ug / ml di blasticidina per selezionare stabilmente trasdotte. (Blasticidina kill-curva deve essere empiricamente determinato per una linea cellulare di particolare.) </li><li&gt; Cambia in terreno fresco contenente blasticidina ogni 2-3 giorni per la selezione continua di antibiotico-resistenti cellule che esprimono i giornalisti di clock (in genere 4-6 giorni in totale). </li></ol> 4. Registrazione bioluminescenza di celle Reporter 1. Seed giornalista cellule Propagare blasticidina cellule resistenti giornalista e dividere su 35 mm piastre di coltura. Incubare a 37 ° C fino confluenti. Noi di solito preparare ≥ 3 piatti per ogni linea cellulare giornalista sotto ogni condizione di fenotipizzazione circadiano. 2. Sincronizzazione e modifica di supporto di registrazione <ol><li> Aspirare il terreno dalle cellule giornalista confluenti, lavare una volta con PBS, e sostituirlo con DMEM contenente 10 pM forskolina (o 200 nM desametasone). Incubare a 37 ° C per 1 ora per sincronizzare le cellule. (In alternativa, le cellule possono essere sincronizzati da 23 cicli di temperatura o scosse siero 24.) </li><li> Durante l&#39;attesa, la preparazione di registrazioneMedio ING per 3T3 come segue: 1x DMEM (HyClone) contenente 10% FBS, 1x Pen / Strep / Gln, 1 pM forskolin, 1 mM luciferina, HEPES 25 mM, pH 7,4. E la concentrazione sierica forskolin possono essere determinate empiricamente. Per le cellule molto debole, rosso fenolo terreno privo possono essere utilizzati. </li><li> Alla fine del trattamento forskolina, aspirare medio e sostituirlo con supporto di registrazione appena fatta. </li></ol> 3. Registrazione bioluminescenza di cellule del reporter <ol><li> Dopo il cambiamento medio, coprire piastre di coltura con 40 millimetri coprioggetto sterili e tenuta in posizione con grasso per vuoto per evitare l&#39;evaporazione. </li><li> Caricare le stoviglie sul luminometro LumiCycle, che è mantenuta all&#39;interno di un incubatore a 36 ° C senza H 2 O e CO 2. </li><li> Inizio registrazione in tempo reale bioluminescenza. Di solito registrare ritmi per 1 settimana, seguito dal cambiamento medio e registrazione continua per la seconda settimana (vedi Savelyev et al. Per i dettagli) 25. (Per la registrazione di 96-noill piatti, Synergy SL2 è stato usato come dispositivo di registrazione, vedere discussione 1.1 per i dettagli). </li></ol> 5. Analisi dei dati e presentazione Cellule Reporter facilitare registrazione ad alta risoluzione quantitativa luminescenza, fondamentale per determinare effetti fenotipici sulla funzione orologio circadiano. Per ottenere i parametri circadiani, compresi l&#39;introduzione, durata del periodo, l&#39;ampiezza del ritmo, e il tasso di smorzamento, si utilizza il programma di analisi LumiCycle (Actimetrics) per analizzare i dati bioluminescenza 5,14. Brevemente, i dati grezzi sono basale installare prima, e basale sottratto dati sono montati una sinusoide, da cui sono determinati i parametri. Per i campioni che mostrano ritmi persistenti, la bontà di adattamento del&gt; 90% si ottiene in genere. A causa di alta bioluminescenza transitoria upon cambiamento medio, di solito esclude il primo ciclo di analisi dati. Per la presentazione dei dati, di solito tracciare i dati grezzi (bioluminescenza, conteggi / sec) contro time (giorni). Se necessario, i dati di base-sottratti possono essere tracciati per confrontare ampiezza e fase. 6. Risultati rappresentativi 1. Giornalisti circadiani fase-specifici L&#39;orologio circadiano è basato su un meccanismo biochimico feedback negativo 1. L&#39;anello di retroazione nucleo è costituito da attivatori trascrizionali Bmal1 e orologio, e repressori PERS e cristallina, che agiscono sulle circadiani E / E&#39;-box per la produzione di elementi enhancer del gene espressione ritmica (con fase mattina, ad esempio, Rev-erb α). Il ciclo di base regola e integra almeno altri due circadiani cis-elementi, l&#39;elemento di legame DBP/E4BP4 (D-box, per la fase giorno, ad esempio, PER3) e il ROR / REV-ERB elemento di rilegatura (RRE, per la fase notte, ad esempio, Bmal1) 17. Regolazione combinatoria da più elementi circadiani può generare nuove fasi intermedie. Per esempio, Cry1 trascrizionezione è mediata da tre elementi circadiani (cioè E / E&#39;-box e D-box elementi del promotore e RREs nel primo introne del gene Cry1), dando luogo alla distinta Cry1 sera-tempo di fase 13. Sulla base di questi meccanismi di regolazione genica, abbiamo generato quattro costrutti diversi giornalista: P (Per2)-d Luc e P (Cry1)-d reporter Luc contenenti sia E / E&#39;-box e D-box elementi nella regione regolatrice 17, 26,27, P (Cry1) - Intron-d Luc rappresenta regolazione combinatoria da tutti e tre gli elementi (ad esempio, E / E&#39;-box, D-box, e RRE), 13,17, e P (Bmal1)-d Luc regolamentato esclusivamente da RRE 9,17,19,21. Abbiamo introdotto questi giornalisti in cellule 3T3 per produrre le fasi previste distinte di espressione giornalista (Figura 2). 2. Knockdown Gene tramite RNAi e farmacologicamente Active composti Quando è alta efficienza di trasfezione, siRNA sintetico può essere trasfettate in cellule di abbattere espressione genica. Quando trasfezione è tecnicamente difficile, un vettore di espressione shRNA può essere stabilmente trasdotti nelle cellule tramite infezione lentivirale, così che shRNA prodotta dalla cella viene elaborato per siRNA per knockdown gene (KD). Presentiamo qui di effetti KD Cry1 e Cry2 geni usando siRNA in cellule U2OS (Figura 3A) e shRNA in cellule 3T3 usando un vettore di espressione pLL3.7 Gateway 9 (Figura 3B). Oltre alle cellule 3T3, il modello U2OS è diventato un altro modello preminente orologio cellulare soprattutto perché soddisfa i requisiti chiave per high-throughput screening di librerie disponibili in commercio siRNA umani (ad esempio, l&#39;origine umana, in grado di generare robusti ritmi circadiani, funzione convalidato di tutti i geni orologio noti e suscettibili di transfezione altamente efficiente eregistrazione luminescenza quantitativa). In entrambi i tipi di cellule, mediato da RNAi KD portato a fenotipi orologio coerenti con knockout mouse precedente (KO) e cellulari studi KD 5,10,11,28. Ad esempio, Cry1 KD periodo accorcia lunghezza e riduce la persistenza del ritmo, mentre Cry2 KD allunga periodo. Inoltre, selezionate piccole molecole possono essere utilizzate per farmacologicamente bersaglio e funzione proteica perturbano (Figura 3C). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4234/4234fig1.jpg" /> Figura 1. Il lentivirus-mediata gene delivery system. (A) Rappresentazione schematica di due lentivirale P (Per2)-d vettori giornalista Luc e CMV-EGFP costruire. Solo la regione di integrazione nel genoma della cellula ospite viene mostrato. In entrambi i costrutti reporter, la trascrizione di d Luc è sotto il controllo diretto del promotore Per2. Nel pLV7-Bsd-P (Per2)-d Luc vettore (ricombinazione basata clonazione), un gene di resistenza coexpressed blasticidina (Bsd) facilita la selezione di cellule infette. Nel pLV156-P (Per2) d-Luc vettoriale (legatura basata clonazione), traduzione EGFP è mediata da un sito interno voce ribosoma (IRES) a valle di Luc d, consentendo l&#39;osservazione visiva e smistamento FACS di cellule infette. Inoltre, un promotore SV40 / terminatore (P / T) viene utilizzato come isolante (vedere discussione 1.3). Nel CMV-EGFP controllo vettoriale, espressione EGFP è sotto il controllo di un forte promotore CMV. (B) di immagini fluorescenti GFP-transfettate esprimenti e cellule infettate. Tipicamente, ottenere elevata efficienza sia in trasfezione transiente di cellule 293T e nelle infezioni lentivirali di linee cellulari di nostro interesse, come indicato dall&#39;espressione GFP in queste cellule. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4234/4234fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 2" src = &quot;/ files/ftp_upload/4234/4234fig2.jpg&quot; /&gt; Figura 2. Fase-specifico espressione del reporter bioluminescenza in cellule 3T3 I vettori lentivirali del reporter usati in questo esperimento sono pLV7-BSD-P (Per2) d-Luc, P (Cry1) d-Luc, P (Cry1) -. Intron d-Luc, e P (Bmal1)-d Luc. Ogni giornalista presenta una distinta fase di oscillazione, come indicato dalle frecce. Mentre il Per2 e Cry1 unità promotori bioluminescenza picco a mattina-day fasi e il promotore Bmal1 nella fase notte, regolazione combinatoria dalla P (Cry1) - Intron ospitare E-box, D-box, e gli elementi RRE conferisce fase serata di bioluminescenza picco . <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4234/4234fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4234/4234fig3.jpg" /> Figura 3. Perturbazione genetica e farmacologica dei ritmi circadiani bioluminescenza nelle cellule reporter. (A) Effetti di Cry1 e Cry2 atterramento da siRNA sui ritmi cellulari delle cellule del reporter U2OS. Luminometro LumiCycle utilizzata per la registrazione bioluminescenza di cellule in piastre da 35 mm. Figura è adattato da Reference # 10, con il permesso di Elsevier (2009). (B) Effetti di Cry2 knockdown da shRNAs sui ritmi cellulari delle cellule 3T3 giornalista. Un pLL3.7 vettore contenente un Gateway U6-shRNA cassetta è stata utilizzata per Cry2 knockdown gene. shRNA2 ha un&#39;efficienza migliore di knockdown shRNA1 come determinato mediante analisi Western blot (dati non mostrati). Un luminometro sinergia è stata utilizzata per la registrazione bioluminescenza di cellule in una piastra a 96 pozzetti. Le impostazioni di registrazione sono le seguenti: temperatura dell&#39;incubatore., 33 ° C, tempo di integrazione, 15 sec; intervallo di tempo, 30 min (C) Effetti di piccole molecole inibitrici di celritmi lular di cellule giornalista U2OS. Chir99021 e Roscovitine sono inibitori diretti contro GSK-3 e CDK, rispettivamente. Il sistema ViewLux (Chir99021 assay) e un luminometro Tecan (Roscovitine saggio) sono stati utilizzati per le registrazioni bioluminescenza di cellule in piastre a 384 pozzetti. Figura di riferimento è tratto da # 19 (Copyright 2008 National Academy of Sciences, USA). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4234/4234fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> .

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

1. Modifiche al protocollo corrente 1,1 i dispositivi di registrazione e le considerazioni di throughput A causa della sua disponibilità commerciale, il LumiCycle (Actimetrics) è diventato lo strumento più comunemente usato luminometro automatizzati per registrazione in tempo reale 4,5,9,19,29-31. Il LumiCycle impiega tubi fotomoltiplicatori (PMT) come rivelatori di luce, che forniscono elevata sensibilità e basso rumore 14, ed è quindi part...

<table border="1"><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> HyClone </td><td> SH30243FS </td><td> Per regolare la crescita cellulare </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12100-046 </td><td> Per luminometria </td></tr><tr><td> FBS </td><td> HyClone </td><td> SH3091003 </td><td></td></tr><tr><td> Pen / Strep / Gln (100x) </td><td> HyClone </td><td> SV3008201 </td><td></td></tr><tr><td> B-27 </td><td> Invitrogen </td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> D-Luciferin </td><td> Biosynth </td><td> L-8220 </td><td></td></tr><tr><td> Poli-L-lisina </td><td> Sigma </td><td> P4707 </td><td></td></tr><tr><td> Polibrene </td><td> Millipore </td><td&gt; TR-1003-G </td><td></td></tr><tr><td> Forskolin </td><td> Sigma </td><td> F6886 </td><td></td></tr><tr><td> Tutti gli altri prodotti chimici </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Attrezzatura </td></tr><tr><td> Coltura tissutale incubatore </td><td></td><td></td><td> 5% di CO2 a 37 ° C </td></tr><tr><td> Tissue cultura cappuccio </td><td></td><td></td><td> BSL-2 certificata </td></tr><tr><td> Light &amp; microscopio a fluorescenza </td><td></td><td></td><td> Contrasto di fase opzionale </td></tr><tr><td> LumiCycle </td><td> Actimetrics </td><td></td><td></td></tr></table>

monitoring cell-autonomous circadian clock rhythms of gene expression using luciferase bioluminescence reporters

Nei mammiferi, molti aspetti del comportamento e della fisiologia, come cicli sonno-veglia e il metabolismo del fegato sono regolati da orologi circadiani endogeni (recensione 1,2). Il circadiano cronometraggio è un sistema gerarchico multi-oscillatore di rete, con l&#39;orologio centrale situato nel nucleo soprachiasmatico (SCN), la sincronizzazione e il coordinamento extra-SCN e periferiche orologi altrove 1,2. Le singole cellule sono le unità funzionali per la generazione e il mantenimento dei ritmi circadiani 3,4, e questi oscillatori di diversi tipi di tessuto della quota di un organismo molto simile meccanismo biochimico feedback negativo. Tuttavia, a causa di interazioni a livello della rete neuronale nel SCN e attraverso ritmiche, segnali sistemici a livello organismal, ritmi circadiani a livello organismal non sono necessariamente cellula-autonoma 5-7. Rispetto agli studi tradizionali di attività locomotoria in vivo e ex vivo SCN espianti, cell-base in vitro permettono la scoperta di difetti circadiani cellule autonome 5,8. Strategica, a base di cellule modelli sono più trattabili sperimentalmente per la caratterizzazione fenotipica e rapida scoperta di meccanismi di clock di base 5,8-13. Dato che i ritmi circadiani sono dinamiche, misure longitudinali con alta risoluzione temporale sono necessari per valutare la funzione orologio. Negli ultimi anni, registrazione in tempo reale utilizzando bioluminescenza luciferasi di lucciola come reporter è diventata una tecnica comune per studiare ritmi circadiani nei mammiferi 14,15, in quanto permette di esaminare la persistenza e dinamiche di ritmi molecolare. Per monitorare ritmi circadiani cellule autonome di espressione genica, reporter luciferasi può essere introdotto nelle cellule tramite trasfezione transiente 13,16,17 o trasduzione stabile 5,10,18,19. Qui si descrive un protocollo stabile trasduzione con lentivirus-mediata consegna del gene. Tl sistema vettore lentivirale è superiore ai metodi tradizionali come trasfezione transiente e trasmissione germinale causa della sua efficienza e versatilità: consente consegna efficiente e stabile integrazione nel genoma dell&#39;ospite sia divisione e non divisione delle cellule 20. Una volta che una linea cellulare reporter viene stabilita, la dinamica della funzione orologio può essere monitorata tramite registrazione bioluminescenza. Per prima cosa descrivere la generazione di P (Per2)-d linee giornalista Luc, e quindi i dati presenti di questo e di altri giornalisti circadiani. In questi saggi, fibroblasti di topo 3T3 e osteosarcoma U2OS cellule umani sono usati come modelli cellulari. Discutiamo anche diversi modi di utilizzo di questi modelli di clock in studi circadiani. Metodi descritti qui può essere applicato ad una grande varietà di tipi cellulari per studiare le basi cellulari e molecolari di orologi circadiani, e possono risultare utili per affrontare problemi in altri sistemi biologici.

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Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters

Orologi circadiani funzionare all&#39;interno di singole celle, cioè, sono cellule autonome. Qui, descriviamo i metodi per la generazione di cellule autonome modelli di orologio con tecniche non invasive, luciferasi a base di tecnologia in tempo reale bioluminescenza. Cellule Reporter fornire trattabili, sistemi modello per lo studio della biologia funzionale circadiano.

Monitoraggio Cell-autonome Ritmi orologio circadiano di espressione genica mediante bioluminescenza Reporter luciferasi

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks ...

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Research

JoVE Journal

Biology

22.1K Views.  The University of Memphis. Orologi circadiani funzionare all'interno di singole celle, cioè, sono cellule autonome. Qui, descriviamo i metodi per la generazione di cellule autonome modelli di orologio con tecniche non invasive, luciferasi a base di tecnologia in tempo reale bioluminescenza. Cellule Reporter fornire trattabili, sistemi modello per lo studio della biologia funzionale circadiano.

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Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Batterica analisi di espressione genica mediante microarray

Ricerca

Biologia

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

La preparazione di colture primarie di cellule emopoietiche dal midollo osseo murino per elettroporazione

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Utilizzando il sistema di elettroporazione Gene Pulser MXcell per trasfettare cellule primarie con alta efficienza

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

L&#39;utilizzo di un contatore automatico cella per semplificare gli studi sull&#39;espressione genica: Knockdown siRNA di IL-4 genica dipendente nelle celle Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Ricostituzione in vitro di Active T. castaneum telomerasi

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Analisi globale di RNA Sintesi a livello di singola cellula seguente ipossia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

Misurazione del tasso metabolico in<em&gt; Drosophila</em&gt; Utilizzando respirometria

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic levels. Tight control over ER calcium is imperative for protein folding, modification and trafficking. Perturbations to ER calcium can result in the activation of the unfolded protein response, a three-prong ER stress response mechanism, and contribute to pathogenesis in a variety of diseases. The ability to monitor ER calcium alterations during disease onset and progression is important in principle, yet challenging in practice. Currently available methods for monitoring ER calcium, such as calcium-dependent fluorescent dyes and proteins, have provided insight into ER calcium dynamics in cells, however these tools are not well suited for in vivo studies. Our lab has demonstrated that a modification to the carboxy-terminus of Gaussia luciferase confers secretion of the reporter in response to ER calcium depletion. The methods for using a luciferase based, secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) for in vitro and in vivo applications are described herein. This video highlights hepatic injections, pharmacological manipulation of GLuc-SERCaMP, blood collection and processing, and assay parameters for longitudinal monitoring of ER calcium.

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Endoplasmic reticulum calcium homeostasis is disrupted in diverse pathologies. A secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) reporter can be used to detect disruptions in the ER calcium store. This protocol describes the use of a Gaussia luciferase SERCaMP to examine ER calcium homeostasis in vitro and in vivo.

Monitoraggio reticolo endoplasmatico calcio omeostasi Utilizzando un<em&gt; Gaussia</em&gt; Luciferasi SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, rat, human, pig and others. The verification of iPS clones mainly relies on the detection of the endogenous expression of different pluripotency genes. These genes mostly represent transcription factors which are located in the cell nucleus. Traditionally, the proof of their endogenous expression is supplied by immunohistochemical staining after fixation of the cells. This approach requires replicate cultures of each clone at this early stage to preserve validated clones for further experiments. The present protocol describes an approach with gene-specific nanoparticles which allows the evaluation of intracellular gene expression directly in live cells by fluorescence. The nanoparticles consist of a central gold particle coupled to a capture strand carrying a sequence complementary to the target mRNA as well as a quenched reporter strand. These nanoparticles are actively endocytosed and the target mRNA displaces the reporter strand which then start to fluoresce. Therefore, specific target gene expression can be detected directly under the microscope. In addition, the emitted fluorescence allows the identification, isolation and enrichment of cells expressing a specific gene by flow cytometry. This method can be applied directly to live cells in culture without any manipulation of the target cells.

This manuscript describes a novel technique which allows the detection of intracellular gene expression after endocytosis of fluorescence-labeled nanoparticles directly in live cells. The method does not require manipulation of the cells and is not restricted with respect to the target gene or species.

Rilevazione di intracellulare genica in cellule vive di murini, umana e suina origine utilizzando nanoparticelle di fluorescenza marcata

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...

Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable biotic and abiotic stress. Conversely, disruption of circadian timekeeping severely compromises plant health and reduces agricultural crop yields. It is therefore imperative that we understand the intricate regulation of circadian rhythms in plants, including the factors that affect motion of the transcriptional clockwork itself.
Testing circadian defects in the model plant Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) traditionally involves crossing specific mutant lines to a line rhythmically expressing firefly luciferase from a circadian clock gene promoter. This approach is laborious, time-consuming, and could be fruitless if a mutant has no circadian phenotype. The methodology presented here allows a rapid initial assessment of circadian phenotypes. Protoplasts derived from mutant and wild-type Arabidopsis are isolated, transfected with a rhythmically expressed luminescent reporter, and imaged under constant light conditions for 5 days. Luminescent traces will directly reveal whether the free-running period of mutant plants is different from wild-type plants. The advantage of the method is that any Arabidopsis line can efficiently be screened, without the need for generating a stably transgenic luminescent clock marker line in that mutant background.

The circadian clock regulates about a third of the Arabidopsis transcriptome, but the percentage of genes that feed back into timekeeping remains unknown. Here we visualize a method to rapidly assess circadian phenotypes in any mutant line of Arabidopsis using luminescent imaging of a circadian reporter transiently expressed in protoplasts.

Analisi Rapida di fenotipi circadiani in Arabidopsis protoplasti transfettate con un luminescenti Clock Reporter

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable ...