Biz finansman (CBET-0.846.259) için NSF kabul etmek istiyorum.

Bu protokol başvurulan tüm medya, tamponlar ve çözümler hazırlanması için Tablo 1&#39;e bakınız. 1. Aha-Etiketli Adenovirüs Üretimi <ol><li> Onlar 80 gelinceye kadar 37 ° C&#39;de HEK 293 hücre büyüme ortamında tutulan insan embriyonik böbrek hücre onbir 100 mm doku kültürü yemekleri (HEK 293) (bkz. Tablo 1) hazırlayın -% 90 konfluense. (Not:.% 90 üzerinde konfluense ile Kültürler bulaştırmak ve istediğiniz gibi virüsler üretmek olmayabilir zor olabilir) </li><li> İlk sonra tripsin-EDTA (1 ×) 1 ml bir dakika süreyle kuluçkaya hücreleri, TD tampon 5 ml ile bir kez durulama, büyüme medyumu kaldırarak tabaklar birinde hücreleri gevşetmek. </li><li> HEK 293 hücre büyümesi orta 9 ml ekleyin ve bu yemeğin gelen hasat HEK 293 hücrelerinin sayısını saymak için bir hemositometre kullanın. Bir multiplicit kullanarak enfeksiyonu için gerekli adenovirus tip 5 (Ad5) miktarını hesaplamak için bu numarayı kullanın10 PFU / hücre enfeksiyon y (İçişleri Bakanlığı) değeri. Normal Ad5 için, enfektivite endeksi (partiküllerin sayısı ile bulaşıcı parçacıklar oranında) tipik olarak 1:20 olması için hesap. </li><li> Enfeksiyonuna tampon 10 ml hazırlayın. </li><li> Yavaşça TD tamponu, 5 ml ile yıkama, daha sonra kalan on kültür kaplarından HEK 293 hücre büyümesini orta kaldırın. 1 saat için 37 ° C&#39;de her çanağı ve inkübe enfeksiyon tampon 1 ml ekleyin. Bu enfeksiyon dönemde, yavaşça 15 dakika aralıklarla tarafına her kültürün çanak tarafında sallayın. </li><li> Enfeksiyondan sonra, 18 saat süreyle 37 ° C&#39;de taze HEK 293 hücre büyümesi, orta ve inkübe 9 ml ilave edilir. </li><li> Aha etiketleme ortamı (veya denetimi için kontrol orta Met), 100 ml hazırlayın. Etiketleme medya hazırlamadan önce bir 0.2-um steril enjektör filtre ile yoğun stok solüsyonlar filtre emin olun. </li><li> Dikkatlice (böylece bulaşmış hücrelerin yıkayacak değil) 18 saat sonra bir HEK 293 hücre büyümesi orta kaldırmaknd TD tampon 5 ml her kültürün çanak yıkayın. </li><li> TD tampon yıkama solüsyonu çıkarın ve her kültürün çanak Aha etiketleme orta 10 ml ekleyin. Bir kontrol için, metionin kontrolü orta bu aşamada yerine Aha etiketlenmesi ortamının kullanılması gerekir. </li><li> 6 saat boyunca 37 ° C&#39;da medium etiketlemede enfekte olmuş hücreler inkübe. Etiketleme 12 arasındaki herhangi bir zamanda yapılabilir - 24 saat post-enfeksiyonu, ancak süresi 6 saat daha uzun olmamalıdır. Sağlanması enfektivite önemli ölçüde azalarak değilken bu aralık viral yapısal protein çeviri ile örtüşen maksimize etmek için tespit edilmiştir. 7 </li><li> Dikkatle etiketleme orta kaldırmak böylece hücreleri bozmak için değil. Her bir çanak taze HEK 293 hücre büyümesi orta 10 ml ilave edilir ve bir başka 18 saat süreyle 37 ° C&#39;de inkübe edilir hücreleri. Bu basamak sırasında enfekte olmuş hücreler kaybı minimize etmek için, bunun tamamıyla etiketleme çözeltisi kaldırmak için gerekli değildir. HEK 293 hücre büyüme ortamı M aşırı miktarda içerirve hangi herhangi bir kalıntı Aha outcompete olacaktır. </li><li> Saflaştırma için 3. adıma geçin. </li></ol> 2. Azido-Şeker-Etiketli Adenovirüs Üretimi <ol><li> Kadar ve adım dahil olmak üzere 1.5 Aha-Etiketli Adenovirüs üretimi başlıklı prosedürü takip edin. </li><li> Azido-şeker etiketleme orta 100 ml hazırlayın. </li><li> 44 saat boyunca 37 ° C&#39;de taze Azido-etiketleme şeker, orta ve inkübe 10 ml ile hücreleri kapsar. </li></ol> 3. Azid-Etiketli adenoviral Parçacıklarının Arıtma <ol><li> Her kültürün çanak ve konik tüpler için transfer enfekte hücre ile birlikte medya çıkarın. 4 azından 10 dakika süreyle 2000 g&#39;de santrifüje ° C. Süpernatantı ve TD tampon pelet (10 yemekleri başına TD tampon 8 ml kullanarak) tekrar süspansiyon. </li><li> Sıvı nitrojen ve bir 37 ° C arasında bir su banyosunda Dewar şişeye kullanılarak tekrarlandı (3 ya da daha fazla) dondurma-eritme çevrimi ile enfekte olmuş hücreler Lyse. 10 dk için 2000 g&#39;de santrifüje4 ° C&#39;de süpernatan gelen hücre enkazları ayırmak. </li><li> Önce bir Ultra temizle santrifüj tüpüne 1.25 g / ml CsCl 2.5 ml çözelti pipet ile bir CsCl yoğunluk gradyanı santrifüj tüpüne hazırlayın. Sonra, yavaş gradyanı arayüz rahatsız özen, 1.4 g / ml solüsyon CsCl 2.0 ml eklemek için tüpün altında konumlandırılmış olan ucu ile bir pipetle kullanımı. </li><li> CsCl yoğunluk gradiyenti tüpün üstüne adımı 3.2 süpernatan Pipeti ve tüp doldurmak için gerekli eklentiyi TD tampon durumunda. 15 de 1 saat süre ile 125,000 g azından bir sallanan bir kova rotor ° C bir ultrasantrifüjdeki in örnekleri santrifüjlenir. </li><li> Ultrasantrifüj tamamlanmasından sonra, virüs partiküllerinin, iki CsCl çözeltilerinin arayüzüne bir kalın beyaz bir bant olarak görülmelidir. Çözeltisi damla damla akmasını sağlamak için steril bir iğne ile borunun alt kısmında küçük bir delikli edin. </li><li> Kalınlığında beyaz bant toplayın, hangi dolaşıyor, etiketli Ad5 parçacıklar içermelidirg bakım aşırı CsCl çözümü dışlamak için. Virüs katman üzerinde açılımının teşvik edecek hücresel proteinlerin toplama kaçının. Ayrıca biraz kalın beyaz virüs bant üzerinde hafif bir tabaka oluşturur boş virion capsids değildir. </li><li> İsteğe bağlı olarak, etiketlenmiş Ad5 partiküllerin üzerindeki bir nihai saflaştırma gerçekleştirmek. Adım 3,6 bir 4-ml ultrasantrifüjdeki tüpüne toplanan fraksiyonu ekleyin ve 1.35 g / ml CsCl çözeltisi ile tüp doldurun. 15 ° C&#39;de 18 saat süreyle 125,000 g&#39;de santrifüje ve adımları 3.5 ve 3.6 &#39;da anlatıldığı gibi, borunun ortasında oluşturan kalın beyaz bir bant toplamak. (Viral titrenin düşükse, beyaz bir bant ikinci santrifüjlemeden sonra görünür olmayabilir, ve etiketli virüs kurtarmak için mümkün olmayacaktır dikkat ediniz). </li><li> Uzun süreler boyunca virüs partiküllerinin depolanması için, toplanan virüsü ekstresinin diyaliz tamponu virüsü depolama karşı gerçekleştirilmelidir. -80 ° C&#39;de diyalizlenmiş virüs numunelerinin Mağaza </li></ol> 4. LiGerilme-Promoted Azid-Alkinler Siklokatılma kullanarak Alkinler Probları Modifiye adenoviral Parçacıkların kolayca dolaşmak (SPAAC) <ol><li> Virüs depolama tampon içinde azit-değiştirilmiş Ad5 50 ul&#39;lik bir çözeltisine, SPAAC etiketleme çözeltinin 0.25 ul ekleyin. (Ticari olarak mevcut gergin alkinlerin venders listesi için reaktiflerin tabloya bakın). </li><li> Gece boyunca oda sıcaklığında devam etmek için gerginlik-terfi Siklokatılma tepki verin. Işığa duyarlı bir sonda (örn. TAMRA) kullanılması durumunda, alüminyum folyo ile tepkime kabına kapsamaktadır. </li><li> 6. adıma göre etiketli virüs arındırın. </li></ol> 5.. Deoksijenize Atmosferde Bakır (I)-Katalizli Azid-Alkinler Siklokatılma (CuAAC) kullanarak Alkinler Probları Modifiye adenoviral Parçacıklarının Ligasyonu <ol><li> Bakır yerine 7,2 mg (I), bir Eppendorf tüpüne bromür (CuBr) toz, alüminyum folyo ile kaplanmıştır. </li><li> Ikinci bir Eppendorf tüpüne DMSO pipetle 1 ml. </li><li> HazırlamakÜçüncü bir Eppendorf tüpüne CuAAC etiketleme solüsyonu 50 ul. Alkin prob ışığa duyarlı ise alüminyum folyo ile sarın (örneğin TAMRA-Alkinler). </li><li> 6 saat boyunca bir deoxygenated eldiven çanta içinde üç Eppendorf tüpleri, kapağını açıp, yerleştirin. Tüm numuneler CuAAC reaksiyon tamamlanıncaya kadar eldiven çanta içinde kalmalıdır. </li><li> 5,4 adıma uygun olarak oksijeni edilmiş, her ikisi de, CuBr tozunun 7.2 mg DMSO 1 ml ilave edilerek CuBr bir 50 × stok çözeltisi hazırlayın. </li><li> 5,4 adıma uygun olarak oksijeni edilmiştir CuAAC etiketleme çözeltisi, 50 ul Bu CuBr stok solüsyonu 1 ul pipet ile CuAAC reaksiyona girerler. Eldiven çanta içinde 12 saat devam etmek için tepki verin. </li><li> 6. adıma göre etiketli virüs arındırın. </li></ol> 6. Etiketli Virüs Parçacıkların Arıtma ve Depolama <ol><li> Centri-Eyl jel filtrasyon Spin kullanarak c etiketli virüs numunelerinin arındırınüreticinin yönergelerine Virüs Depolama Buffer ile dengelenmiş olumns. </li><li> Alternatif olarak, saflaştırma Virüs Depolama tampona karşı diyaliz ile gerçekleştirilebilir. </li><li> Etiketli virüs partiküllerinin -80 ° C&#39;de saklanabilir </li></ol> 7. Etiketli Adenovirüs ve Floresanlar Jel Tarama SDS-PAGE <ol><li> 10 dakika süre ile etiketlenmiş virüsü ve kaynamaya saflaştırılmış 20 ul 20 ul Laemmli numune tamponu (2 x) eklenir. Çökeltileri herhangi bir çözünmeyen kaldırmak için 30 saniye için örnekleri santrifüjleyin. Kalan bakır arıtma sonrası varsa, örnek kaynatarak görselleştirme sırasında zorluk, SDS-PAGE jel protein kalın çizgiler neden olabilir. Bu durumda, bu basamakta örneğin kaynama gelmemektedir. </li><li> Elektroforez hücre jel kaset takın ve çalışan tampon ekleyin. Viral protein örnekleri ile kuyu gerekli sayıda yükleyin. Iyi öncesi stai yüklemek için birini kullanınned molekül ağırlığı işaretleri. 200, 1 saat boyunca jel çalıştırın V. süresi boyunca alüminyum folyo kaplı elektroforez hücre fluorofor etiketin photobleaching azaltmak için tutun. </li><li> En iyi çözünürlük ve tüm özgür fluorofor kaldırmak için, izleme boya elektroforez sırasında jel dışında çalışmasına izin verin. Elektroforez durdurun ve hızlı bir floresan jel tarayıcıya jel aktarmak ve uygun dalga boyu (TAMRA için 574 nm) floresans emisyon için jel tarayın. </li><li> Her bir partikül viral konjuge boya moleküllerin sayısı çeşitli standart TAMRA konsantrasyonlarının ölçülmesi ve floresans adım 7.3 örnek ile karşılaştırılarak ölçülebilir. </li></ol> 8. Temsilcisi Sonuçlar SDS-PAGE ve TAMRA-konjuge Ad5 floresan jel tarama gözlemlenen Sonuçlar Şekil 3 içerisinde gösterilmiştir. Bu fluoresan jel taramaları örnekleri modifiye yapıldı rağmenprobları ile SPAAC ligate edilir olduğunda CuAAC yoluyla tanımladı, sonuç olarak benzer olması gerekir. Bu jel taramaları gösteriyor ki üç Ad5 kapsid proteinleri (Hexon, Penton ve Fiber) modifikasyonu ile Aha etiketleme sonuçları, şeker etiketleme sadece Fiber kapsid proteini değiştirir iken. Dahası, konsantrasyon Aha bir artış (4 mM vs 32 mM) Aha esas daha büyük bir ölçüde neden olan, fakat aynı zamanda enfektivite azaltmak için gösterilmiştir. Önce sonuçları 7 4mm üretilen Ad5 için Aha, maruz metiyonin sitelerin yaklaşık% 5 32 mM Aha kullanıldığında bu sayı% 10 artış ile, TAMRA-değiştirilmiş olduğunu göstermektedir. Bu sırasıyla yaklaşık 280 ve 510, Ad5 parçacık başına boya etiketli siteler karşılık gelir. Şeker-etiketleme 1 analizi kabaca 22 Ad5 üzerinde 36 glikozilasyon sitelerin bir azido şeker tarafından işgal ve daha sonra TAMRA etiketli belirtti. Tarif edildiği gibi on doku kültür plakaları azit-değiştirilmiş Ad5 üretmek için kullanıldığı takdirde<html> Bu protokolde, 200 - azit-değiştirilmiş virüsünün 300 ul yaklaşık 1.5 bir titresi x 10 12 parçacıklar / ml, 3.6 adım toplanan beyaz bir bant elde edilmelidir. Bu yöntemin yaygın bir zorluk düşük viral titre atfedilebilir bu arıtma adımı, bir viral grubun olmamasıdır. Enfeksiyondan sonra plakadan gevşetilmiş olur - ki - adım 1 sırasında yıkarken Bu genellikle aşırı ya da altında birleşmiş, ya da hücreleri yıkayarak olan hücrelerini enfekte bir sonucudur. <img src="/files/ftp_upload/4246/4246fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Protokol genel bakış. Azid içeren Aha veya GalNAz ilk adenovirüs partikülleri içine dahil edilmiştir. Bir floresan alkin prob ile ligasyon sonra &quot;klik&quot; kimyası ile yapılır. Son olarak, SDS-PAGE flüoresan prob ligasyonu göstermek için kullanılır. igure 2 &quot;/&gt; Şekil 2,. Üzerine alkin prob Ligation azit-değiştirilmiş de-oksijenli altında (a) SPAAC, (b) CuAAC ve (c) oksijenli bir atmosfer üzeri virüsü. <img src="/files/ftp_upload/4246/4246fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. TAMRA-Alkinler ile CuAAC konjugasyon sonra azid etiketli adenovirus tip 5 (Ad5) SDS-PAGE Floresan tarar. (A) Aha iki farklı konsantrasyonu kullanılarak, Ad5 Aha-etiketli. Etiketleme artan Aha konsantrasyonu ile artan etiketleme derecesi ile, adenovirüs Hexon, Penton ve Fiber kapsid proteinleri meydana görünüyor. (B) Ac 4 GalNAz-etiketli adenovirüs sadece Fiber kapsid protein etiketli gibi görünüyor. <table border="1"><tbody><tr><td> Çözüm </td><td> Hazırlık </td><td> Notlar </td></tr><tr><td> Ad5 depolama tamponu </td><td> 5 mM Tris-HCl tampon (pH 8.0) ihtiva eden 0.5 mM MgCl2, 50 mM NaCl,% 25 (v / v) gliserol, ve% 0.05 (a / h) Bovine Serum Albumin (BSA) </td><td> -20 ° C&#39;de deposunda </td></tr><tr><td> Ad5 enfeksiyonu tampon </td><td> 2% (v / v) sığır serumu, 1 × TC çözeltisi, Ad5 depolama tampon içinde (MOI bir 10 PFU / hücre ve 01:20 bir enfektivite indeksi kullanılarak belirlenir hacmi). TD tamponu kullanılarak nihai hacme çözüm getirmek </td><td> Ad5 konsantrasyon UV absorpsiyon yoluyla belirlenebilir. </td></tr><tr><td> TC çözüm (200 ×) </td><td> 136 mM CaCl2, 100 mM MgCl2 </td><td> 4 at ° C&#39;nin </td></tr><tr><td> TD tampon </td><td> 137 mM NaCl, 5 mM KCI, mM Na 2 HPO 4, ve 25 mM Tris-HCl, pH 7.5 0.07 </td><td> 4 at ° C&#39;nin </td></tr><tr><td> HEK 293 hücre büyüme ortamı </td><td> Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 10% (v / v) sığır serumu (BSC) ve 1% (v / v) Pen Strep ile desteklenmiş </td><td> 4 at ° C&#39;nin </td></tr><tr><td> Cys stok solüsyonu (100 ×) </td><td> DMEM (-Met /-Cys) 200 mM L-sistein ile desteklenmiş </td><td> Kullanmadan önce bir 0.2-um steril şırınga filtresi ile taze ve filtre hazırlayın. </td></tr><tr><td> Aha stok solüsyonu (25 ×) </td><td> DMEM (-Met /-Cys) 100 mM L-Azidohomoalanine ile desteklenmiş </td><td> Kullanmadan önce bir 0.2-um steril şırınga filtresi ile taze ve filtre hazırlayın. </td></tr><tr><td> Aha etiketleme orta </td><td> DMEM (-Met /-Cys) 2 mM L-sistein% 10 MKC, Aha stok solüsyonu (1 x) ile desteklenmiş </td><td> Kullanmadan önce taze hazırlayın. Bu, bir 4 mM c tekabülAHA oncentration, farklı konsantrasyonlarda (Temsilcisi Sonuçlar bakınız) kullanılmakla beraber. </td></tr><tr><td> Met stok solüsyonu (25 ×) </td><td> DMEM (-Met /-Cys) L-Metionin 100 mM ile desteklenmiş </td><td> Kullanmadan önce bir 0.2-um steril şırınga filtresi ile taze ve filtre hazırlayın. </td></tr><tr><td> Met kontrolü orta </td><td> DMEM (-Met /-Cys) stok solüsyonu (1 x), Met,% 10 MKC ile desteklenmiş 2 mM L-sistein </td><td> Kullanmadan önce taze hazırlayın. </td></tr><tr><td> Ac 4 GalNAz stok solüsyonu (1.000 ×) </td><td> Metanol içinde 50 mM N-peracetylated azidoacetylgalactosamine (Ac 4 GalNAz) </td><td> 4 ° C&#39;de depolamak Ac 4 GalNAz GlcNAz bir metabolik öncüsüdür. </td></tr><tr><td> Azido-şeker etiketleme orta </td><td> 100 ul Ac 4 GalNAz stok çözeltisi, 100 ml HEK 293 hücre büyüme ortamı </td><td> Metanol HEK 293 hücre büyümesi orta eklemeden önce buharlaşmasına izin verin. </td></tr><tr><td> Sezyum klorür çözümler </td><td> CsCl TD tampon içinde çözülmüş: 1.25 g / ml (18.08 g / 50 ml H2O) 1.35 g / ml (25.60 g / 50 ml H2O) 1.40 g / ml (31.00 g / 50 ml H2O) </td><td> Ultrasantrifüj için Yoğunluk gradyanlar </td></tr><tr><td> Virüs depolama tamponu </td><td> Fosfat CaCl2, 0.9 mM MgCl2 ve% 10 (v / v) gliserol ihtiva eden 0.5 mM, tuzlu su (PBS), pH 7.2 tampon </td><td> -20 ° C&#39;de deposunda </td></tr><tr><td> TAMRA-BCN (SPAAC) etiketleme çözümü </td><td> DMSO içinde TAMRA-BCN: <ol><li> UV ab kullanınAdım 4.1 virüsü çözeltisi titresi belirlemek için sorbance (OD 260 Assay) </li><li> 50 ul alikotu viral partiküllerin sayısı (N Ad5) belirlemek </li><li> TAMRA-BCN molarite (M) kullanılarak belirlenir: c BCN = 4 × 10 × 8 (N Ad5 / N Avo) N Avo = 6.022 × 10 23 (Aşama 4 hazırlanan tepkime karışımı virion başına 100 alkin probları içerir, böylece) </li></ol></td><td> Gerilme-terfi alkin prob SDS-PAGE ile, yaklaşık 10 12 parçacıklar / ml &#39;lik bir viral titrenin önerilmiştir için </td></tr><tr><td> TAMRA-Alkinler (CuAAC) etiketleme çözümü </td><td> Virüs depolama tampon içinde azit-değiştirilmiş Ad5 (N Ad5 yukarıdaki gibi belirlenmiştir) 50 ul, 1.5 mM Batho<html> fenantrolin disülfonat (yani 1.5 × son CuBr konsantrasyon), TAMRA-Alkinler. TAMRA-Alkinler molarite (M) kullanılarak belirlenmektedir: c Alk = 2 × 10 × 6 (N Ad5 / N Avo) (5. Basamak hazırlanan tepkime karışımı virion başına 100 alkin probları içerir, böylece) </td><td> Tris tampon bakır, rekabetçi bir önleyici ve ligand olarak da bilinir. 8 </td></tr><tr><td> Laemmli numune tamponu (2 ×) </td><td> 125 mM Tris-HCl (pH 6.8),% 4 (w / v) SDS, 20% (v / v) gliserol,% 10 (v / v) 2-merkaptoetanol, ve% 0.004 (w / v) Bromofenol mavi </td><td></td></tr><tr><td> Tampon Koşu </td><td> 187 mM glisin, 19 mM Tris-HCl, H2O, 3,5 mM SDS </td><td> 4 at ° C&#39;nin </td></tr></tbody></table>t &quot;&gt; Tablo 1. Bu protokol gerektirdiği tamponlar ve çözeltilerinin hazırlanması.

<ol>
	<li>Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoselective+Attachment+of+Small+Molecule+Effector+Functionality+to+Human+Adenoviruses+Facilitates+Gene+Delivery+to+Cancer+Cells.">Chemoselective Attachment of Small Molecule Effector Functionality to Human Adenoviruses Facilitates Gene Delivery to Cancer Cells.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 13615-13617 (2010).</li><li>Banerjee, P. S., Carrico, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoselective+Modification+of+Viral+Proteins+Bearing+Metabolically+Introduced+"Clickable"+Amino+Acids+and+Sugars.">Chemoselective Modification of Viral Proteins Bearing Metabolically Introduced "Clickable" Amino Acids and Sugars.</a> Methods Mol. Biol. 751, 55-66 (2011).</li><li>Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+targeted+viral+vectors+for+gene+therapy.">Engineering targeted viral vectors for gene therapy.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 573-587 (2007).</li><li>Magnusson, M. K., Hong, S. S., Henning, P., Boulanger, P., Lindholm, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Retargeting+of+Adenovirus+Vectors:+Functionality+of+Targeting+Ligands+and+Their+Influence+on+Virus+Viability.">Genetic Retargeting of Adenovirus Vectors: Functionality of Targeting Ligands and Their Influence on Virus Viability.</a> J. Gene Med. 4, 356-370 (2002).</li><li>Henning, P., Lundgren, E., Carlsson, M., Frykholm, K., Johannisson, J., Magnusson, M. K., TÃ¥ng, E., Franqueville, L., Hong, S. S., Lindholm, L., Boulanger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+Type+5+Fiber+Knob+Domain+has+a+Critical+Role+in+Fiber+Protein+Synthesis+and+Encapsidation.">Adenovirus Type 5 Fiber Knob Domain has a Critical Role in Fiber Protein Synthesis and Encapsidation.</a> J. Gen. Virol. 87, 3151-3160 (2006).</li><li>Zhang, M. M., Tsou, L. K., Charron, G., Raghavan, A. S., Hang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+fluorescence+imaging+of+dynamic+S-acylation+and+protein+turnover.">Tandem fluorescence imaging of dynamic S-acylation and protein turnover.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 8627-8632 (2010).</li><li>Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unnatural+amino+acid+incorporation+onto+adenoviral+(Ad)+coat+proteins+facilitates+chemoselective+modification+and+retargeting+of+Ad+type+5+vectors.">Unnatural amino acid incorporation onto adenoviral (Ad) coat proteins facilitates chemoselective modification and retargeting of Ad type 5 vectors.</a> J. Virol. 85, 7546-7554 (2011).</li><li>Hong, V., Presolski, S. I., Ma, C., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+Optimization+of+Copper-Catalyzed+Azide-Alkyne+Cycloaddition+for+Bioconjugation.">Analysis and Optimization of Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition for Bioconjugation.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48, 9879-9883 (2009).</li><li>Best, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+Chemistry+and+Bioorthogonal+Reactions:+Unprecedented+Selectivity+in+the+Labeling+of+Biological+Molecules.">Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules.</a> Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).</li><li>Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Strain-Promoted+[3+++2]+Azide-Alkyne+Cycloaddition+for+Covalent+Modification+of+Biomolecules+in+Living+Systems.">A Strain-Promoted [3 + 2] Azide-Alkyne Cycloaddition for Covalent Modification of Biomolecules in Living Systems.</a> J. Am. Chem. Soc. 46, 15046-15047 (2004).</li><li>Dommerholt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Readily+Accessible+Bicyclononynes+for+Bioorthogonal+Labeling+and+Three-Dimensional+Imaging+of+Living+Cells.">Readily Accessible Bicyclononynes for Bioorthogonal Labeling and Three-Dimensional Imaging of Living Cells.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 49, 9422-9425 (2010).</li><li>Link, A. J., Vink, M. K. S., Tirrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+the+functionalizable+methionine+surrogate+azidohomoalanine+via+copper-catalyzed+diazotransfer.">Preparation of the functionalizable methionine surrogate azidohomoalanine via copper-catalyzed diazotransfer.</a> Nat. Protoc. 2, 1879-1883 (2007).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Azidler olanlar dahil Kemoselektif ve bioorthogonal tıklayın reaksiyonlar, gelişimi bir araştırma hızla gelişen bir alandır ve sonradan bioconjugation uygulamalar için seçim için bu reaksiyonlar giderek artan sayıda vardır. Biz kendi laboratuar ve tüm reaktifler ticari durumu çünkü onların kullanışlılığı seçildi yalnızca iki yöntem eklemek için bu protokol kapsamında sınırlama getirdik. Bu tür ilk rotada - strain-terfi azid-alkin Siklokatılma (SPAAC) - alkin ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Bir GFP transgen içeren Adenovirüs tip 5 (Ad5) </td><td> BCBC </td><td> 391 </td></tr><tr><td> İnsan embriyonik böbrek (HEK 293) hücreleri </td><td> ATCC </td><td> CRL-1573 </td></tr><tr><td> Dulbecco Modifiye Eagle Orta (DMEM), Yüksek Glukoz </td><td> Invitrogen </td><td> 11965-092 </td></tr><tr><td> Dulbecco Modifiye Eagle Orta, hiçbir Metionin, hiçbir Sistein (DMEM-Met /-Cys), Yüksek Glukoz </td><td> Invitrogen </td><td> 21013-024 </td></tr><tr><td> Sığır Buzağı Serumu </td><td> Invitrogen </td><td> 16170-078 </td></tr><tr><td> Penisilin - Streptomisin 100 × Çözüm (Pen Strep) </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> % 0.5 Tripsin-EDTA (10 x) </td><td&gt; Invitrogen </td><td> 15400-054 </td></tr><tr><td> 100 mm Hücre Kültürü Bulaşık, doku kültürü ile tedavi edilen polistiren </td><td> BD Falcon </td><td> 353003 </td></tr><tr><td> Hücre kültürü CO2 inkübatör </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hemositometre </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Biyogüvenlik kabini </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Steril şırınga filtresi (0.2 um, selüloz asetat) </td><td> VWR </td><td> 28145-477 (NA), 514-0061 (Avrupa) </td></tr><tr><td> Avanti JE santrifüj </td><td> Beckman Coulter </td><td> 369001 </td></tr><tr><td> Konik tüpler (50 ml, steril) </td><td> BD Falcon </td><td> 352098 </td></tr><tr><td> Tüp, Thinwall, Ultra Clear, 13.2 ml, 14 x 89 mm </td><td> Beckman </td><td> 344059 </td></tr><tr><td> Bir GB 41 GB ve 60 r ile donatılmış ultrasantrifüjdekiOTOR </td><td> Beckman </td><td></td></tr><tr><td> Eppendorf Biopur Safe-Lock Tüpler, 1.5 ml </td><td> Eppendorf </td><td> 0030 121.589 </td></tr><tr><td> 5418 Santrifüj </td><td> Eppendorf </td><td> 5418 </td></tr><tr><td> Centri-Eyl jel filtrasyon sıkma sütunlar </td><td> Princeton Ayrımları </td><td> CS-901 </td></tr><tr><td> Steril iğne, 18 gauge </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Azot eldiven çanta (deoxygenated CuAAC yapılacak ise) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dewar şişesi </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sıvı azot </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Elektroforez hücre </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Floresan jel tarayıcı </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hazır Jel Tris-HCl Jel </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-1105 </td></tr><tr><td> L-Azidohomoalanine </td><td> AnaSpec </td><td> 63669 </td></tr><tr><td> Jena Biosciences </td><td> CLK-AA005 </td><td></td></tr><tr><td> Peracetylated N-azidoacetylgalactosamine (Ac 4 GalNAz) </td><td> Invitrogen </td><td> C33365 </td></tr><tr><td> Thermo Scientific </td><td> 88905 </td><td></td></tr><tr><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7480 </td><td></td></tr><tr><td> Bathophenanthroline disülfonik asit (BDA) disodyum tuzu </td><td> MP Biomedicals </td><td> 0215011201 </td></tr><tr><td> Dimetil sülfoksit (DMSO) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Metanol </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tris baz (tris (hidroksimetil) aminometan) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Disodyum Fosfat (Na2 HPO 4) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fosfat (PBS) tamponlu </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1M HCI </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gliserin </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bovine Serum Albumin </td><td></td><td></td></tr><tr><td> L-sistein </td><td></td><td></td></tr><tr><td> L-metiyonin </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SDS (sodyum dodesil sülfat) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2-merkaptoetanol </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Glisin </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bromofenol mavi </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sezyum Klorür (CsCl) </td><td></td><td> &amp; Nbsp; </td></tr><tr><td> Bakır (I) bromit (CuBr) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kalsiyum Klorür (CaCl2) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Potasyum Klorür (KCl) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Magnezyum Klorür (MgCl 2) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sodyum Klorür (NaCI) </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="3"></td></tr><tr><td> CuAAC * için alkin prob </td><td></td><td></td></tr><tr><td> TAMRA Alkinler </td><td> Invitrogen </td><td> T10183 </td></tr><tr><td colspan="3"></td></tr><tr><td> SPAAC * için gergin alkin prob </td><td></td><td></td></tr><tr><td> TAMRA DIBO Alkinler </td><td> Invitrogen </td><td> C10410 </td></tr></tbody></table> Click kimyası reaktifler ve kitler * Önemli satıcıları Invitrogen, Jena Biosciences, Berry Associates, Sigma-Aldrich, Glen Araştırma, Kimya Araçlar &#39;ı ve Baseclick içerir. Alkin boyalar ve ligandları çeşitli bu üreticilerinin katalogları bulunabilir.

chemoselective modification of viral surfaces via bioorthogonal click chemistry

Virüs partiküllerinin modifikasyonu gen tedavisi, onkolitik uygulamaları ve aşı geliştirme etkileyen yönelik muazzam bir potansiyele dikkat önemli bir miktar aldı. Çoğunlukla genetik tabanlı olduğu viral yüzeyler, değiştirmek amacıyla 1,2,3 Şu yaklaşımlar genellikle zayıflama muzdarip virüs üretim, enfektivite ve hücresel iletimi. 4,5 Kemoselektif click kimyası kullanarak, son derece esnek ve erişilebilir hem de kalan süre bu konularda sidesteps basit bir alternatif yaklaşım geliştirdik. 1,2 Bu protokolün amacı adenovirüs tip 5 parçacıkların yüzey değiştirme bioorthogonal tıklama kimyası ile etkinliğini göstermektir. Bu proteinler üzerine hedef moleküllerin, boyalar veya ilgi diğer moleküllerin Kemoselektif ligasyonu sağlayan bu iki adımlı süreç hem terapötik 1 veya analitik, 2,6 kullanılabilirazid etiketleri ile önceden etiketli. Bu yöntemin üç büyük avantajları (1) metabolik etiketleme viral spor üzerinde hiçbir etkisi, 1,7 az gösteriyor ki vardır (2) efektör ligandlar geniş bir yelpazede kullanılabilir, ve (3) oldukça hızlı, güvenilir ve kolay erişim. 1,2,7 Bu işlemin ilk adımda, adenovirüs partikülleri işlevsel bir azid (N-3) içermesi, her ikisi de azidohomoalanine (Aha, bir metiyonin vekil) veya doğal olmayan bir şeker O-bağlı N-azidoacetylglucosamine (O-GlcNAz), ya taşıyan üretilir grubu. Azid-modifiye edilmiş virüs partiküllerinin saflaştırıldıktan sonra, flüoresan TAMRA parçasını içeren bir prob alkin önceden etiketlenmiş proteinleri veya glikoproteinleri bir Kemoselektif şekilde ligate edilir. Son olarak, bir SDS-PAGE ile analiz viral proteinlerin kapsid üzerine prob başarılı ligasyonu göstermek için gerçekleştirilir. Aha dahil tüm viral kapsid etiketlemek için gösterilirproteinleri (Hexon, Penton ve Fiber), sadece Fiber etiketlenmesi O-GlcNAz birleştirmeyecektir ederken. Bu gelişen alanında, azid-alkin ligasyonu için birden çok yöntem başarıyla geliştirilmiştir, ancak biz en uygun olduğu tespit sadece iki tanesini burada gösterilmiştir - strain-terfi azid-alkin Siklokatılma (SPAAC) ve bakır-katalize azid-alkin Siklokatılma (CuAAC) deoxygenated atmosferi altında.

Watch this Scientific Journal Video about Chemoselective Modification of Viral Surfaces via Bioorthogonal Click Chemistry at JoVE.com

Chemoselective Modification of Viral Surfaces via Bioorthogonal Click Chemistry

Adenovirüs parçacıklar doğal olmayan bir amino asit analog azidohomoalanine veya azido şeker içermesi için tasarlanmıştır<em&gt; O</em&gt;-GlcNAz. Her bir azid grubu chemoselectively viral yüzey değiştirme aracı olarak &quot;ı&quot; kimyası reaksiyon yoluyla ligate edilir.

Bioorthogonal tıklayın Kimya ile Viral Yüzeylerin Kemoselektif Modifikasyonu

The modification of virus particles has received a significant amount of attention for its tremendous potential for impacting gene therapy, oncolytic ...

chemoselective-modification-viral-surfaces-via-bioorthogonal-click

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

23.8K Görüntüleme.  Stony Brook University. Adenovirüs parçacıklar doğal olmayan bir amino asit analog azidohomoalanine veya azido şeker içermesi için tasarlanmıştır O-GlcNAz. Her bir azid grubu chemoselectively viral yüzey değiştirme aracı olarak "ı" kimyası reaksiyon yoluyla ligate edilir.

Video: Chemoselective Modification of Viral Surfaces via Bioorthogonal Click Chemistry

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

Viral Patojenler Klinik Örnekler Ekranına bir Pan-Viral Mikroarray Testi (Virochip)

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the generation of extreme population diversity that facilitates virus adaptation and evolution. Increasing evidence shows that the intrinsic error rates, and the resulting mutation frequencies, of RNA viruses can be modulated by subtle amino acid changes to the viral polymerase. Although biochemical assays exist for some viral RNA polymerases that permit quantitative measure of incorporation fidelity, here we describe a simple method of measuring mutation frequencies of RNA viruses that has proven to be as accurate as biochemical approaches in identifying fidelity altering mutations. The approach uses conventional virological and sequencing techniques that can be performed in most biology laboratories. Based on our experience with a number of different viruses, we have identified the key steps that must be optimized to increase the likelihood of isolating fidelity variants and generating data of statistical significance. The isolation and characterization of fidelity altering mutations can provide new insights into polymerase structure and function1-3. Furthermore, these fidelity variants can be useful tools in characterizing mechanisms of virus adaptation and evolution4-7.

The present article describes the steps required to isolate and characterize RNA polymerase fidelity variants of RNA viruses and how to use mutation frequency data to confirm fidelity changes in tissue culture.

Virüs mutasyon Frekans RNA Virüsler ve Karakterizasyonu Fidelity Varyantlar izolasyonu

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. Several downstream applications require large quantities of pure viral DNA, which is provided by this protocol. These applications include viral genome sequencing, where the removal of host DNA is crucial to optimize data output for viral sequences, and the production of new viral recombinant strains, where co-transfection of purified plasmid and linear viral DNA facilitates recombination.1,2,3 
This procedure utilizes a combination of extractions and density-based centrifugation to isolate purified linear herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells.4,5 The initial purification steps aim to isolate purified viral capsids, which contain and protect the viral DNA during the extractions and centrifugation steps that remove cellular proteins and DNA. Lysis of nucleocapsids then releases viral DNA, and two final phenol-chloroform steps remove remaining proteins. The final DNA captured from solution is highly concentrated and pure, with an average OD260/280 of 1.90. Depending on the quantity of infected cells used, yields of viral DNA range from 150-800 &mu;g or more. The purity of this DNA makes it stable during long-term storage at 4C. This DNA is thus ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections. 
Prior to beginning the protocol, it is important to know the average number of cells per dish (e.g. an average of 8 x 106 PK-15 cells in a confluent 15 cm dish), and the titer of the viral stock to be used (e.g. 1 x 108 plaque-forming units per ml). These are necessary to calculate the appropriate multiplicity of infection (MOI) for the protocol.6 For instance, to infect one 15 cm dish of PK-15 cells with the above viral stock, at an MOI of 5, you would use 400 &mu;l of viral stock and dilute it with 3.6 ml of medium (total inoculation volume of 4 ml for one 15 cm plate).
Multiple viral DNA preparations can be prepared at the same time. The number of simultaneous preparations is limited only by the number of tubes held by the ultracentrifuge rotor (one per virus; see step 3.9 below). Here we describe the procedure as though being done for one virus.

We describe the process of isolating high purity herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells. The final DNA captured from solution is of high concentration and purity, making it ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections to produce new viral recombinants.

Nucleocapsids gelen Viral DNA hazırlanması

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

Primer insan T hücrelerinin piggyBac Transposon Sistem Modifikasyon

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate directional responses to pathogen exposure in vivo. Thus, ideal in vitro models for examining cellular responses to respiratory pathogens polarize, forming apical and basolateral surfaces. One such model is differentiated normal human bronchial epithelial cells (NHBE). However, this system requires lung tissue samples, expertise isolating and culturing epithelial cells from tissue, and time to generate an air-liquid interface culture.
Calu-3 cells, derived from a human bronchial adenocarcinoma, are an alternative model for examining the response of proximal airway epithelial cells to respiratory insult1, pharmacological compounds2-6, and bacterial7-9 and viral pathogens, including influenza virus, rhinovirus and severe acute respiratory syndrome - associated coronavirus10-14. Recently, we demonstrated that Calu-3 cells are susceptible to respiratory syncytial virus (RSV) infection in a manner consistent with NHBE15,16 . Here, we detail the establishment of a polarized, liquid-covered culture (LCC) of Calu-3 cells, focusing on the technical details of growing and culturing Calu-3 cells, maintaining cells that have been cultured into LCC, and we present the method for performing respiratory virus infection of polarized Calu-3 cells.
To consistently obtain polarized Calu-3 LCC, Calu-3 cells must be carefully subcultured before culturing in Transwell inserts. Calu-3 monolayer cultures should remain below 90% confluence, should be subcultured fewer than 10 times from frozen stock, and should regularly be supplied with fresh medium. Once cultured in Transwells, Calu-3 LCC must be handled with care. Irregular media changes and mechanical or physical disruption of the cell layers or plates negatively impact polarization for several hours or days. Polarization is monitored by evaluating trans-epithelial electrical resistance (TEER) and is verified by evaluating the passive equilibration of sodium fluorescein between the apical and basolateral compartments17,18 . Once TEER plateaus at or above 1,000 &Omega;&times;cm2, Calu-3 LCC are ready to use to examine cellular responses to respiratory pathogens.

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The findings and conclusions in this report are those of the authors and do not necessarily represent the views of the Centers for Disease Control and Prevention.

Polarize İnsan Havayolu bir sıvı kaplı Kültürünün Oluşturulması Solunum Patojenler için Host Hücre Yanıtı Okumak Epitel Calu-3 Hücreler<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, it is therefore important to have a quick and reliable way of measuring transcriptional activity in infected cells. Traditionally, transcription has been measured either by incorporation of radioactive nucleosides such as 3H-uridine followed by detection via autoradiography or scintillation counting, or incorporation of halogenated uridine analogs such as 5-bromouridine (BrU) followed by detection via immunostaining. The use of radioactive isotopes, however, requires specialized equipment and is not feasible in a number of laboratory settings, while the detection of BrU can be cumbersome and may suffer from low sensitivity.
The recently developed click chemistry, which involves a copper-catalyzed triazole formation from an azide and an alkyne, now provides a rapid and highly sensitive alternative to these two methods. Click chemistry is a two step process in which nascent RNA is first labeled by incorporation of the uridine analog 5-ethynyluridine (EU), followed by detection of the label with a fluorescent azide. These azides are available as several different fluorophores, allowing for a wide range of options for visualization.
This protocol describes a method to measure transcriptional suppression in cells infected with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12 using click chemistry. Concurrently, expression of viral proteins in these cells is determined by classical intracellular immunostaining. Steps 1 through 4 detail a method to visualize transcriptional suppression via fluorescence microscopy, while steps 5 through 8 detail a method to quantify transcriptional suppression via flow cytometry. This protocol is easily adaptable for use with other viruses.

This method describes the use of click chemistry to measure changes in host cell transcription after infection with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12. Results can be visualized qualitatively via fluorescence microscopy or obtained quantitatively through flow cytometry. This method is adaptable for use with other viruses.

Ana-Hücre RNA sentezi üzerinde Viral Enfeksiyon Etkisi Tedbir tıklayın Kimya Kullanımı

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. burnetii DNA in cell cultures and clinical samples. PCR requires specialized equipment and extensive end user training, and therefore, it is not suitable for routine work especially in a resource-constrained area. We have developed a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay to detect the presence of C. burnetii in patient samples. This method is performed at a single temperature around 60 &#176;C in a water bath or heating block. The sensitivity of this LAMP assay is very similar to PCR with a detection limit of about 25 copies per reaction. This report describes the preparation of the reaction using lyophilized reagents and visualization of results using hydroxynaphthol blue (HNB) or a UV lamp with fluorescent intercalating dye in the reaction. The LAMP reagents were lyophilized and stored at room temperature (RT) for one month without loss of detection sensitivity. This LAMP assay is particularly robust because the reaction mixture preparation does not involve complex steps. This method is ideal for use in resource-limited settings where Q fever is endemic.

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

tespiti için Liyofilize Döngü aracılı İzotermal Amplifikasyon Reaktifler Gelişimi<em&gt; Coxiella burnetii</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

Enzim-linked Lektin Testi tarafından Grip Nöraminidaz İnhibisyon antikor titreleri Ölçme

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

Yüzeyler İnsan Norovirus Tespiti sürüntü Örnekleme Yöntemi

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in the caseous cores of cavities and lesions is especially crucial because they harbor subpopulations of drug-tolerant bacteria also commonly referred to as persisters. Existing methods for the measurement of drug penetration in tuberculosis lesions involve costly and time-consuming in vivo pharmacokinetic studies coupled to bioanalytical or imaging techniques. The in vitro measurement of drug binding to caseum macromolecules was proposed as an alternative to such techniques since this binding hinders the passive diffusion of drug molecules through caseum. Rapid equilibrium dialysis is a fast and reliable system for performing plasma protein and tissue binding studies. In this protocol, we used a rapid equilibrium dialysis (RED) device to measure drug binding to homogenates of caseum that is excised from the lesions and cavities of tuberculosis-infected rabbits. The protocol also describes how to generate a surrogate matrix from lipid loaded THP-1 macrophages to use in place of caseum. This caseum/surrogate binding assay is an important tool in tuberculosis drug discovery and can be adapted to help study drug distribution in lesions or abscesses caused by other diseases.

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

Here we describe a rapid equilibrium dialysis (RED) method to measure drug binding to caseum from pulmonary tuberculosis lesions and cavities. The protocol is also used with a foamy macrophage-derived matrix that is an effective surrogate to caseum.

bir<em&gt; In vitro</emTüberküloz Lezyonlarında İlaç Penetrasyonunu Öngören Caseum Bağlanma Testi

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...