Biz finansman (CBET-0.846.259) için NSF kabul etmek istiyorum.

Bu protokol başvurulan tüm medya, tamponlar ve çözümler hazırlanması için Tablo 1&#39;e bakınız. 1. Aha-Etiketli Adenovirüs Üretimi <ol><li> Onlar 80 gelinceye kadar 37 ° C&#39;de HEK 293 hücre büyüme ortamında tutulan insan embriyonik böbrek hücre onbir 100 mm doku kültürü yemekleri (HEK 293) (bkz. Tablo 1) hazırlayın -% 90 konfluense. (Not:.% 90 üzerinde konfluense ile Kültürler bulaştırmak ve istediğiniz gibi virüsler üretmek olmayabilir zor olabilir) </li><li> İlk sonra tripsin-EDTA (1 ×) 1 ml bir dakika süreyle kuluçkaya hücreleri, TD tampon 5 ml ile bir kez durulama, büyüme medyumu kaldırarak tabaklar birinde hücreleri gevşetmek. </li><li> HEK 293 hücre büyümesi orta 9 ml ekleyin ve bu yemeğin gelen hasat HEK 293 hücrelerinin sayısını saymak için bir hemositometre kullanın. Bir multiplicit kullanarak enfeksiyonu için gerekli adenovirus tip 5 (Ad5) miktarını hesaplamak için bu numarayı kullanın10 PFU / hücre enfeksiyon y (İçişleri Bakanlığı) değeri. Normal Ad5 için, enfektivite endeksi (partiküllerin sayısı ile bulaşıcı parçacıklar oranında) tipik olarak 1:20 olması için hesap. </li><li> Enfeksiyonuna tampon 10 ml hazırlayın. </li><li> Yavaşça TD tamponu, 5 ml ile yıkama, daha sonra kalan on kültür kaplarından HEK 293 hücre büyümesini orta kaldırın. 1 saat için 37 ° C&#39;de her çanağı ve inkübe enfeksiyon tampon 1 ml ekleyin. Bu enfeksiyon dönemde, yavaşça 15 dakika aralıklarla tarafına her kültürün çanak tarafında sallayın. </li><li> Enfeksiyondan sonra, 18 saat süreyle 37 ° C&#39;de taze HEK 293 hücre büyümesi, orta ve inkübe 9 ml ilave edilir. </li><li> Aha etiketleme ortamı (veya denetimi için kontrol orta Met), 100 ml hazırlayın. Etiketleme medya hazırlamadan önce bir 0.2-um steril enjektör filtre ile yoğun stok solüsyonlar filtre emin olun. </li><li> Dikkatlice (böylece bulaşmış hücrelerin yıkayacak değil) 18 saat sonra bir HEK 293 hücre büyümesi orta kaldırmaknd TD tampon 5 ml her kültürün çanak yıkayın. </li><li> TD tampon yıkama solüsyonu çıkarın ve her kültürün çanak Aha etiketleme orta 10 ml ekleyin. Bir kontrol için, metionin kontrolü orta bu aşamada yerine Aha etiketlenmesi ortamının kullanılması gerekir. </li><li> 6 saat boyunca 37 ° C&#39;da medium etiketlemede enfekte olmuş hücreler inkübe. Etiketleme 12 arasındaki herhangi bir zamanda yapılabilir - 24 saat post-enfeksiyonu, ancak süresi 6 saat daha uzun olmamalıdır. Sağlanması enfektivite önemli ölçüde azalarak değilken bu aralık viral yapısal protein çeviri ile örtüşen maksimize etmek için tespit edilmiştir. 7 </li><li> Dikkatle etiketleme orta kaldırmak böylece hücreleri bozmak için değil. Her bir çanak taze HEK 293 hücre büyümesi orta 10 ml ilave edilir ve bir başka 18 saat süreyle 37 ° C&#39;de inkübe edilir hücreleri. Bu basamak sırasında enfekte olmuş hücreler kaybı minimize etmek için, bunun tamamıyla etiketleme çözeltisi kaldırmak için gerekli değildir. HEK 293 hücre büyüme ortamı M aşırı miktarda içerirve hangi herhangi bir kalıntı Aha outcompete olacaktır. </li><li> Saflaştırma için 3. adıma geçin. </li></ol> 2. Azido-Şeker-Etiketli Adenovirüs Üretimi <ol><li> Kadar ve adım dahil olmak üzere 1.5 Aha-Etiketli Adenovirüs üretimi başlıklı prosedürü takip edin. </li><li> Azido-şeker etiketleme orta 100 ml hazırlayın. </li><li> 44 saat boyunca 37 ° C&#39;de taze Azido-etiketleme şeker, orta ve inkübe 10 ml ile hücreleri kapsar. </li></ol> 3. Azid-Etiketli adenoviral Parçacıklarının Arıtma <ol><li> Her kültürün çanak ve konik tüpler için transfer enfekte hücre ile birlikte medya çıkarın. 4 azından 10 dakika süreyle 2000 g&#39;de santrifüje ° C. Süpernatantı ve TD tampon pelet (10 yemekleri başına TD tampon 8 ml kullanarak) tekrar süspansiyon. </li><li> Sıvı nitrojen ve bir 37 ° C arasında bir su banyosunda Dewar şişeye kullanılarak tekrarlandı (3 ya da daha fazla) dondurma-eritme çevrimi ile enfekte olmuş hücreler Lyse. 10 dk için 2000 g&#39;de santrifüje4 ° C&#39;de süpernatan gelen hücre enkazları ayırmak. </li><li> Önce bir Ultra temizle santrifüj tüpüne 1.25 g / ml CsCl 2.5 ml çözelti pipet ile bir CsCl yoğunluk gradyanı santrifüj tüpüne hazırlayın. Sonra, yavaş gradyanı arayüz rahatsız özen, 1.4 g / ml solüsyon CsCl 2.0 ml eklemek için tüpün altında konumlandırılmış olan ucu ile bir pipetle kullanımı. </li><li> CsCl yoğunluk gradiyenti tüpün üstüne adımı 3.2 süpernatan Pipeti ve tüp doldurmak için gerekli eklentiyi TD tampon durumunda. 15 de 1 saat süre ile 125,000 g azından bir sallanan bir kova rotor ° C bir ultrasantrifüjdeki in örnekleri santrifüjlenir. </li><li> Ultrasantrifüj tamamlanmasından sonra, virüs partiküllerinin, iki CsCl çözeltilerinin arayüzüne bir kalın beyaz bir bant olarak görülmelidir. Çözeltisi damla damla akmasını sağlamak için steril bir iğne ile borunun alt kısmında küçük bir delikli edin. </li><li> Kalınlığında beyaz bant toplayın, hangi dolaşıyor, etiketli Ad5 parçacıklar içermelidirg bakım aşırı CsCl çözümü dışlamak için. Virüs katman üzerinde açılımının teşvik edecek hücresel proteinlerin toplama kaçının. Ayrıca biraz kalın beyaz virüs bant üzerinde hafif bir tabaka oluşturur boş virion capsids değildir. </li><li> İsteğe bağlı olarak, etiketlenmiş Ad5 partiküllerin üzerindeki bir nihai saflaştırma gerçekleştirmek. Adım 3,6 bir 4-ml ultrasantrifüjdeki tüpüne toplanan fraksiyonu ekleyin ve 1.35 g / ml CsCl çözeltisi ile tüp doldurun. 15 ° C&#39;de 18 saat süreyle 125,000 g&#39;de santrifüje ve adımları 3.5 ve 3.6 &#39;da anlatıldığı gibi, borunun ortasında oluşturan kalın beyaz bir bant toplamak. (Viral titrenin düşükse, beyaz bir bant ikinci santrifüjlemeden sonra görünür olmayabilir, ve etiketli virüs kurtarmak için mümkün olmayacaktır dikkat ediniz). </li><li> Uzun süreler boyunca virüs partiküllerinin depolanması için, toplanan virüsü ekstresinin diyaliz tamponu virüsü depolama karşı gerçekleştirilmelidir. -80 ° C&#39;de diyalizlenmiş virüs numunelerinin Mağaza </li></ol> 4. LiGerilme-Promoted Azid-Alkinler Siklokatılma kullanarak Alkinler Probları Modifiye adenoviral Parçacıkların kolayca dolaşmak (SPAAC) <ol><li> Virüs depolama tampon içinde azit-değiştirilmiş Ad5 50 ul&#39;lik bir çözeltisine, SPAAC etiketleme çözeltinin 0.25 ul ekleyin. (Ticari olarak mevcut gergin alkinlerin venders listesi için reaktiflerin tabloya bakın). </li><li> Gece boyunca oda sıcaklığında devam etmek için gerginlik-terfi Siklokatılma tepki verin. Işığa duyarlı bir sonda (örn. TAMRA) kullanılması durumunda, alüminyum folyo ile tepkime kabına kapsamaktadır. </li><li> 6. adıma göre etiketli virüs arındırın. </li></ol> 5.. Deoksijenize Atmosferde Bakır (I)-Katalizli Azid-Alkinler Siklokatılma (CuAAC) kullanarak Alkinler Probları Modifiye adenoviral Parçacıklarının Ligasyonu <ol><li> Bakır yerine 7,2 mg (I), bir Eppendorf tüpüne bromür (CuBr) toz, alüminyum folyo ile kaplanmıştır. </li><li> Ikinci bir Eppendorf tüpüne DMSO pipetle 1 ml. </li><li> HazırlamakÜçüncü bir Eppendorf tüpüne CuAAC etiketleme solüsyonu 50 ul. Alkin prob ışığa duyarlı ise alüminyum folyo ile sarın (örneğin TAMRA-Alkinler). </li><li> 6 saat boyunca bir deoxygenated eldiven çanta içinde üç Eppendorf tüpleri, kapağını açıp, yerleştirin. Tüm numuneler CuAAC reaksiyon tamamlanıncaya kadar eldiven çanta içinde kalmalıdır. </li><li> 5,4 adıma uygun olarak oksijeni edilmiş, her ikisi de, CuBr tozunun 7.2 mg DMSO 1 ml ilave edilerek CuBr bir 50 × stok çözeltisi hazırlayın. </li><li> 5,4 adıma uygun olarak oksijeni edilmiştir CuAAC etiketleme çözeltisi, 50 ul Bu CuBr stok solüsyonu 1 ul pipet ile CuAAC reaksiyona girerler. Eldiven çanta içinde 12 saat devam etmek için tepki verin. </li><li> 6. adıma göre etiketli virüs arındırın. </li></ol> 6. Etiketli Virüs Parçacıkların Arıtma ve Depolama <ol><li> Centri-Eyl jel filtrasyon Spin kullanarak c etiketli virüs numunelerinin arındırınüreticinin yönergelerine Virüs Depolama Buffer ile dengelenmiş olumns. </li><li> Alternatif olarak, saflaştırma Virüs Depolama tampona karşı diyaliz ile gerçekleştirilebilir. </li><li> Etiketli virüs partiküllerinin -80 ° C&#39;de saklanabilir </li></ol> 7. Etiketli Adenovirüs ve Floresanlar Jel Tarama SDS-PAGE <ol><li> 10 dakika süre ile etiketlenmiş virüsü ve kaynamaya saflaştırılmış 20 ul 20 ul Laemmli numune tamponu (2 x) eklenir. Çökeltileri herhangi bir çözünmeyen kaldırmak için 30 saniye için örnekleri santrifüjleyin. Kalan bakır arıtma sonrası varsa, örnek kaynatarak görselleştirme sırasında zorluk, SDS-PAGE jel protein kalın çizgiler neden olabilir. Bu durumda, bu basamakta örneğin kaynama gelmemektedir. </li><li> Elektroforez hücre jel kaset takın ve çalışan tampon ekleyin. Viral protein örnekleri ile kuyu gerekli sayıda yükleyin. Iyi öncesi stai yüklemek için birini kullanınned molekül ağırlığı işaretleri. 200, 1 saat boyunca jel çalıştırın V. süresi boyunca alüminyum folyo kaplı elektroforez hücre fluorofor etiketin photobleaching azaltmak için tutun. </li><li> En iyi çözünürlük ve tüm özgür fluorofor kaldırmak için, izleme boya elektroforez sırasında jel dışında çalışmasına izin verin. Elektroforez durdurun ve hızlı bir floresan jel tarayıcıya jel aktarmak ve uygun dalga boyu (TAMRA için 574 nm) floresans emisyon için jel tarayın. </li><li> Her bir partikül viral konjuge boya moleküllerin sayısı çeşitli standart TAMRA konsantrasyonlarının ölçülmesi ve floresans adım 7.3 örnek ile karşılaştırılarak ölçülebilir. </li></ol> 8. Temsilcisi Sonuçlar SDS-PAGE ve TAMRA-konjuge Ad5 floresan jel tarama gözlemlenen Sonuçlar Şekil 3 içerisinde gösterilmiştir. Bu fluoresan jel taramaları örnekleri modifiye yapıldı rağmenprobları ile SPAAC ligate edilir olduğunda CuAAC yoluyla tanımladı, sonuç olarak benzer olması gerekir. Bu jel taramaları gösteriyor ki üç Ad5 kapsid proteinleri (Hexon, Penton ve Fiber) modifikasyonu ile Aha etiketleme sonuçları, şeker etiketleme sadece Fiber kapsid proteini değiştirir iken. Dahası, konsantrasyon Aha bir artış (4 mM vs 32 mM) Aha esas daha büyük bir ölçüde neden olan, fakat aynı zamanda enfektivite azaltmak için gösterilmiştir. Önce sonuçları 7 4mm üretilen Ad5 için Aha, maruz metiyonin sitelerin yaklaşık% 5 32 mM Aha kullanıldığında bu sayı% 10 artış ile, TAMRA-değiştirilmiş olduğunu göstermektedir. Bu sırasıyla yaklaşık 280 ve 510, Ad5 parçacık başına boya etiketli siteler karşılık gelir. Şeker-etiketleme 1 analizi kabaca 22 Ad5 üzerinde 36 glikozilasyon sitelerin bir azido şeker tarafından işgal ve daha sonra TAMRA etiketli belirtti. Tarif edildiği gibi on doku kültür plakaları azit-değiştirilmiş Ad5 üretmek için kullanıldığı takdirde<html> Bu protokolde, 200 - azit-değiştirilmiş virüsünün 300 ul yaklaşık 1.5 bir titresi x 10 12 parçacıklar / ml, 3.6 adım toplanan beyaz bir bant elde edilmelidir. Bu yöntemin yaygın bir zorluk düşük viral titre atfedilebilir bu arıtma adımı, bir viral grubun olmamasıdır. Enfeksiyondan sonra plakadan gevşetilmiş olur - ki - adım 1 sırasında yıkarken Bu genellikle aşırı ya da altında birleşmiş, ya da hücreleri yıkayarak olan hücrelerini enfekte bir sonucudur. <img src="/files/ftp_upload/4246/4246fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Protokol genel bakış. Azid içeren Aha veya GalNAz ilk adenovirüs partikülleri içine dahil edilmiştir. Bir floresan alkin prob ile ligasyon sonra &quot;klik&quot; kimyası ile yapılır. Son olarak, SDS-PAGE flüoresan prob ligasyonu göstermek için kullanılır. igure 2 &quot;/&gt; Şekil 2,. Üzerine alkin prob Ligation azit-değiştirilmiş de-oksijenli altında (a) SPAAC, (b) CuAAC ve (c) oksijenli bir atmosfer üzeri virüsü. <img src="/files/ftp_upload/4246/4246fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. TAMRA-Alkinler ile CuAAC konjugasyon sonra azid etiketli adenovirus tip 5 (Ad5) SDS-PAGE Floresan tarar. (A) Aha iki farklı konsantrasyonu kullanılarak, Ad5 Aha-etiketli. Etiketleme artan Aha konsantrasyonu ile artan etiketleme derecesi ile, adenovirüs Hexon, Penton ve Fiber kapsid proteinleri meydana görünüyor. (B) Ac 4 GalNAz-etiketli adenovirüs sadece Fiber kapsid protein etiketli gibi görünüyor. <table border="1"><tbody><tr><td> Çözüm </td><td> Hazırlık </td><td> Notlar </td></tr><tr><td> Ad5 depolama tamponu </td><td> 5 mM Tris-HCl tampon (pH 8.0) ihtiva eden 0.5 mM MgCl2, 50 mM NaCl,% 25 (v / v) gliserol, ve% 0.05 (a / h) Bovine Serum Albumin (BSA) </td><td> -20 ° C&#39;de deposunda </td></tr><tr><td> Ad5 enfeksiyonu tampon </td><td> 2% (v / v) sığır serumu, 1 × TC çözeltisi, Ad5 depolama tampon içinde (MOI bir 10 PFU / hücre ve 01:20 bir enfektivite indeksi kullanılarak belirlenir hacmi). TD tamponu kullanılarak nihai hacme çözüm getirmek </td><td> Ad5 konsantrasyon UV absorpsiyon yoluyla belirlenebilir. </td></tr><tr><td> TC çözüm (200 ×) </td><td> 136 mM CaCl2, 100 mM MgCl2 </td><td> 4 at ° C&#39;nin </td></tr><tr><td> TD tampon </td><td> 137 mM NaCl, 5 mM KCI, mM Na 2 HPO 4, ve 25 mM Tris-HCl, pH 7.5 0.07 </td><td> 4 at ° C&#39;nin </td></tr><tr><td> HEK 293 hücre büyüme ortamı </td><td> Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 10% (v / v) sığır serumu (BSC) ve 1% (v / v) Pen Strep ile desteklenmiş </td><td> 4 at ° C&#39;nin </td></tr><tr><td> Cys stok solüsyonu (100 ×) </td><td> DMEM (-Met /-Cys) 200 mM L-sistein ile desteklenmiş </td><td> Kullanmadan önce bir 0.2-um steril şırınga filtresi ile taze ve filtre hazırlayın. </td></tr><tr><td> Aha stok solüsyonu (25 ×) </td><td> DMEM (-Met /-Cys) 100 mM L-Azidohomoalanine ile desteklenmiş </td><td> Kullanmadan önce bir 0.2-um steril şırınga filtresi ile taze ve filtre hazırlayın. </td></tr><tr><td> Aha etiketleme orta </td><td> DMEM (-Met /-Cys) 2 mM L-sistein% 10 MKC, Aha stok solüsyonu (1 x) ile desteklenmiş </td><td> Kullanmadan önce taze hazırlayın. Bu, bir 4 mM c tekabülAHA oncentration, farklı konsantrasyonlarda (Temsilcisi Sonuçlar bakınız) kullanılmakla beraber. </td></tr><tr><td> Met stok solüsyonu (25 ×) </td><td> DMEM (-Met /-Cys) L-Metionin 100 mM ile desteklenmiş </td><td> Kullanmadan önce bir 0.2-um steril şırınga filtresi ile taze ve filtre hazırlayın. </td></tr><tr><td> Met kontrolü orta </td><td> DMEM (-Met /-Cys) stok solüsyonu (1 x), Met,% 10 MKC ile desteklenmiş 2 mM L-sistein </td><td> Kullanmadan önce taze hazırlayın. </td></tr><tr><td> Ac 4 GalNAz stok solüsyonu (1.000 ×) </td><td> Metanol içinde 50 mM N-peracetylated azidoacetylgalactosamine (Ac 4 GalNAz) </td><td> 4 ° C&#39;de depolamak Ac 4 GalNAz GlcNAz bir metabolik öncüsüdür. </td></tr><tr><td> Azido-şeker etiketleme orta </td><td> 100 ul Ac 4 GalNAz stok çözeltisi, 100 ml HEK 293 hücre büyüme ortamı </td><td> Metanol HEK 293 hücre büyümesi orta eklemeden önce buharlaşmasına izin verin. </td></tr><tr><td> Sezyum klorür çözümler </td><td> CsCl TD tampon içinde çözülmüş: 1.25 g / ml (18.08 g / 50 ml H2O) 1.35 g / ml (25.60 g / 50 ml H2O) 1.40 g / ml (31.00 g / 50 ml H2O) </td><td> Ultrasantrifüj için Yoğunluk gradyanlar </td></tr><tr><td> Virüs depolama tamponu </td><td> Fosfat CaCl2, 0.9 mM MgCl2 ve% 10 (v / v) gliserol ihtiva eden 0.5 mM, tuzlu su (PBS), pH 7.2 tampon </td><td> -20 ° C&#39;de deposunda </td></tr><tr><td> TAMRA-BCN (SPAAC) etiketleme çözümü </td><td> DMSO içinde TAMRA-BCN: <ol><li> UV ab kullanınAdım 4.1 virüsü çözeltisi titresi belirlemek için sorbance (OD 260 Assay) </li><li> 50 ul alikotu viral partiküllerin sayısı (N Ad5) belirlemek </li><li> TAMRA-BCN molarite (M) kullanılarak belirlenir: c BCN = 4 × 10 × 8 (N Ad5 / N Avo) N Avo = 6.022 × 10 23 (Aşama 4 hazırlanan tepkime karışımı virion başına 100 alkin probları içerir, böylece) </li></ol></td><td> Gerilme-terfi alkin prob SDS-PAGE ile, yaklaşık 10 12 parçacıklar / ml &#39;lik bir viral titrenin önerilmiştir için </td></tr><tr><td> TAMRA-Alkinler (CuAAC) etiketleme çözümü </td><td> Virüs depolama tampon içinde azit-değiştirilmiş Ad5 (N Ad5 yukarıdaki gibi belirlenmiştir) 50 ul, 1.5 mM Batho<html> fenantrolin disülfonat (yani 1.5 × son CuBr konsantrasyon), TAMRA-Alkinler. TAMRA-Alkinler molarite (M) kullanılarak belirlenmektedir: c Alk = 2 × 10 × 6 (N Ad5 / N Avo) (5. Basamak hazırlanan tepkime karışımı virion başına 100 alkin probları içerir, böylece) </td><td> Tris tampon bakır, rekabetçi bir önleyici ve ligand olarak da bilinir. 8 </td></tr><tr><td> Laemmli numune tamponu (2 ×) </td><td> 125 mM Tris-HCl (pH 6.8),% 4 (w / v) SDS, 20% (v / v) gliserol,% 10 (v / v) 2-merkaptoetanol, ve% 0.004 (w / v) Bromofenol mavi </td><td></td></tr><tr><td> Tampon Koşu </td><td> 187 mM glisin, 19 mM Tris-HCl, H2O, 3,5 mM SDS </td><td> 4 at ° C&#39;nin </td></tr></tbody></table>t &quot;&gt; Tablo 1. Bu protokol gerektirdiği tamponlar ve çözeltilerinin hazırlanması.

<ol>
	<li>Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoselective+Attachment+of+Small+Molecule+Effector+Functionality+to+Human+Adenoviruses+Facilitates+Gene+Delivery+to+Cancer+Cells.">Chemoselective Attachment of Small Molecule Effector Functionality to Human Adenoviruses Facilitates Gene Delivery to Cancer Cells.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 13615-13617 (2010).</li><li>Banerjee, P. S., Carrico, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoselective+Modification+of+Viral+Proteins+Bearing+Metabolically+Introduced+"Clickable"+Amino+Acids+and+Sugars.">Chemoselective Modification of Viral Proteins Bearing Metabolically Introduced "Clickable" Amino Acids and Sugars.</a> Methods Mol. Biol. 751, 55-66 (2011).</li><li>Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+targeted+viral+vectors+for+gene+therapy.">Engineering targeted viral vectors for gene therapy.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 573-587 (2007).</li><li>Magnusson, M. K., Hong, S. S., Henning, P., Boulanger, P., Lindholm, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Retargeting+of+Adenovirus+Vectors:+Functionality+of+Targeting+Ligands+and+Their+Influence+on+Virus+Viability.">Genetic Retargeting of Adenovirus Vectors: Functionality of Targeting Ligands and Their Influence on Virus Viability.</a> J. Gene Med. 4, 356-370 (2002).</li><li>Henning, P., Lundgren, E., Carlsson, M., Frykholm, K., Johannisson, J., Magnusson, M. K., TÃ¥ng, E., Franqueville, L., Hong, S. S., Lindholm, L., Boulanger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+Type+5+Fiber+Knob+Domain+has+a+Critical+Role+in+Fiber+Protein+Synthesis+and+Encapsidation.">Adenovirus Type 5 Fiber Knob Domain has a Critical Role in Fiber Protein Synthesis and Encapsidation.</a> J. Gen. Virol. 87, 3151-3160 (2006).</li><li>Zhang, M. M., Tsou, L. K., Charron, G., Raghavan, A. S., Hang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+fluorescence+imaging+of+dynamic+S-acylation+and+protein+turnover.">Tandem fluorescence imaging of dynamic S-acylation and protein turnover.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 8627-8632 (2010).</li><li>Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unnatural+amino+acid+incorporation+onto+adenoviral+(Ad)+coat+proteins+facilitates+chemoselective+modification+and+retargeting+of+Ad+type+5+vectors.">Unnatural amino acid incorporation onto adenoviral (Ad) coat proteins facilitates chemoselective modification and retargeting of Ad type 5 vectors.</a> J. Virol. 85, 7546-7554 (2011).</li><li>Hong, V., Presolski, S. I., Ma, C., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+Optimization+of+Copper-Catalyzed+Azide-Alkyne+Cycloaddition+for+Bioconjugation.">Analysis and Optimization of Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition for Bioconjugation.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48, 9879-9883 (2009).</li><li>Best, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+Chemistry+and+Bioorthogonal+Reactions:+Unprecedented+Selectivity+in+the+Labeling+of+Biological+Molecules.">Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules.</a> Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).</li><li>Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Strain-Promoted+[3+++2]+Azide-Alkyne+Cycloaddition+for+Covalent+Modification+of+Biomolecules+in+Living+Systems.">A Strain-Promoted [3 + 2] Azide-Alkyne Cycloaddition for Covalent Modification of Biomolecules in Living Systems.</a> J. Am. Chem. Soc. 46, 15046-15047 (2004).</li><li>Dommerholt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Readily+Accessible+Bicyclononynes+for+Bioorthogonal+Labeling+and+Three-Dimensional+Imaging+of+Living+Cells.">Readily Accessible Bicyclononynes for Bioorthogonal Labeling and Three-Dimensional Imaging of Living Cells.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 49, 9422-9425 (2010).</li><li>Link, A. J., Vink, M. K. S., Tirrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+the+functionalizable+methionine+surrogate+azidohomoalanine+via+copper-catalyzed+diazotransfer.">Preparation of the functionalizable methionine surrogate azidohomoalanine via copper-catalyzed diazotransfer.</a> Nat. Protoc. 2, 1879-1883 (2007).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Azidler olanlar dahil Kemoselektif ve bioorthogonal tıklayın reaksiyonlar, gelişimi bir araştırma hızla gelişen bir alandır ve sonradan bioconjugation uygulamalar için seçim için bu reaksiyonlar giderek artan sayıda vardır. Biz kendi laboratuar ve tüm reaktifler ticari durumu çünkü onların kullanışlılığı seçildi yalnızca iki yöntem eklemek için bu protokol kapsamında sınırlama getirdik. Bu tür ilk rotada - strain-terfi azid-alkin Siklokatılma (SPAAC) - alkin ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Bir GFP transgen içeren Adenovirüs tip 5 (Ad5) </td><td> BCBC </td><td> 391 </td></tr><tr><td> İnsan embriyonik böbrek (HEK 293) hücreleri </td><td> ATCC </td><td> CRL-1573 </td></tr><tr><td> Dulbecco Modifiye Eagle Orta (DMEM), Yüksek Glukoz </td><td> Invitrogen </td><td> 11965-092 </td></tr><tr><td> Dulbecco Modifiye Eagle Orta, hiçbir Metionin, hiçbir Sistein (DMEM-Met /-Cys), Yüksek Glukoz </td><td> Invitrogen </td><td> 21013-024 </td></tr><tr><td> Sığır Buzağı Serumu </td><td> Invitrogen </td><td> 16170-078 </td></tr><tr><td> Penisilin - Streptomisin 100 × Çözüm (Pen Strep) </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> % 0.5 Tripsin-EDTA (10 x) </td><td&gt; Invitrogen </td><td> 15400-054 </td></tr><tr><td> 100 mm Hücre Kültürü Bulaşık, doku kültürü ile tedavi edilen polistiren </td><td> BD Falcon </td><td> 353003 </td></tr><tr><td> Hücre kültürü CO2 inkübatör </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hemositometre </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Biyogüvenlik kabini </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Steril şırınga filtresi (0.2 um, selüloz asetat) </td><td> VWR </td><td> 28145-477 (NA), 514-0061 (Avrupa) </td></tr><tr><td> Avanti JE santrifüj </td><td> Beckman Coulter </td><td> 369001 </td></tr><tr><td> Konik tüpler (50 ml, steril) </td><td> BD Falcon </td><td> 352098 </td></tr><tr><td> Tüp, Thinwall, Ultra Clear, 13.2 ml, 14 x 89 mm </td><td> Beckman </td><td> 344059 </td></tr><tr><td> Bir GB 41 GB ve 60 r ile donatılmış ultrasantrifüjdekiOTOR </td><td> Beckman </td><td></td></tr><tr><td> Eppendorf Biopur Safe-Lock Tüpler, 1.5 ml </td><td> Eppendorf </td><td> 0030 121.589 </td></tr><tr><td> 5418 Santrifüj </td><td> Eppendorf </td><td> 5418 </td></tr><tr><td> Centri-Eyl jel filtrasyon sıkma sütunlar </td><td> Princeton Ayrımları </td><td> CS-901 </td></tr><tr><td> Steril iğne, 18 gauge </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Azot eldiven çanta (deoxygenated CuAAC yapılacak ise) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dewar şişesi </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sıvı azot </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Elektroforez hücre </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Floresan jel tarayıcı </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hazır Jel Tris-HCl Jel </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-1105 </td></tr><tr><td> L-Azidohomoalanine </td><td> AnaSpec </td><td> 63669 </td></tr><tr><td> Jena Biosciences </td><td> CLK-AA005 </td><td></td></tr><tr><td> Peracetylated N-azidoacetylgalactosamine (Ac 4 GalNAz) </td><td> Invitrogen </td><td> C33365 </td></tr><tr><td> Thermo Scientific </td><td> 88905 </td><td></td></tr><tr><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7480 </td><td></td></tr><tr><td> Bathophenanthroline disülfonik asit (BDA) disodyum tuzu </td><td> MP Biomedicals </td><td> 0215011201 </td></tr><tr><td> Dimetil sülfoksit (DMSO) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Metanol </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tris baz (tris (hidroksimetil) aminometan) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Disodyum Fosfat (Na2 HPO 4) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fosfat (PBS) tamponlu </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1M HCI </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gliserin </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bovine Serum Albumin </td><td></td><td></td></tr><tr><td> L-sistein </td><td></td><td></td></tr><tr><td> L-metiyonin </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SDS (sodyum dodesil sülfat) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2-merkaptoetanol </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Glisin </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bromofenol mavi </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sezyum Klorür (CsCl) </td><td></td><td> &amp; Nbsp; </td></tr><tr><td> Bakır (I) bromit (CuBr) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kalsiyum Klorür (CaCl2) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Potasyum Klorür (KCl) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Magnezyum Klorür (MgCl 2) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sodyum Klorür (NaCI) </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="3"></td></tr><tr><td> CuAAC * için alkin prob </td><td></td><td></td></tr><tr><td> TAMRA Alkinler </td><td> Invitrogen </td><td> T10183 </td></tr><tr><td colspan="3"></td></tr><tr><td> SPAAC * için gergin alkin prob </td><td></td><td></td></tr><tr><td> TAMRA DIBO Alkinler </td><td> Invitrogen </td><td> C10410 </td></tr></tbody></table> Click kimyası reaktifler ve kitler * Önemli satıcıları Invitrogen, Jena Biosciences, Berry Associates, Sigma-Aldrich, Glen Araştırma, Kimya Araçlar &#39;ı ve Baseclick içerir. Alkin boyalar ve ligandları çeşitli bu üreticilerinin katalogları bulunabilir.

chemoselective modification of viral surfaces via bioorthogonal click chemistry

Virüs partiküllerinin modifikasyonu gen tedavisi, onkolitik uygulamaları ve aşı geliştirme etkileyen yönelik muazzam bir potansiyele dikkat önemli bir miktar aldı. Çoğunlukla genetik tabanlı olduğu viral yüzeyler, değiştirmek amacıyla 1,2,3 Şu yaklaşımlar genellikle zayıflama muzdarip virüs üretim, enfektivite ve hücresel iletimi. 4,5 Kemoselektif click kimyası kullanarak, son derece esnek ve erişilebilir hem de kalan süre bu konularda sidesteps basit bir alternatif yaklaşım geliştirdik. 1,2 Bu protokolün amacı adenovirüs tip 5 parçacıkların yüzey değiştirme bioorthogonal tıklama kimyası ile etkinliğini göstermektir. Bu proteinler üzerine hedef moleküllerin, boyalar veya ilgi diğer moleküllerin Kemoselektif ligasyonu sağlayan bu iki adımlı süreç hem terapötik 1 veya analitik, 2,6 kullanılabilirazid etiketleri ile önceden etiketli. Bu yöntemin üç büyük avantajları (1) metabolik etiketleme viral spor üzerinde hiçbir etkisi, 1,7 az gösteriyor ki vardır (2) efektör ligandlar geniş bir yelpazede kullanılabilir, ve (3) oldukça hızlı, güvenilir ve kolay erişim. 1,2,7 Bu işlemin ilk adımda, adenovirüs partikülleri işlevsel bir azid (N-3) içermesi, her ikisi de azidohomoalanine (Aha, bir metiyonin vekil) veya doğal olmayan bir şeker O-bağlı N-azidoacetylglucosamine (O-GlcNAz), ya taşıyan üretilir grubu. Azid-modifiye edilmiş virüs partiküllerinin saflaştırıldıktan sonra, flüoresan TAMRA parçasını içeren bir prob alkin önceden etiketlenmiş proteinleri veya glikoproteinleri bir Kemoselektif şekilde ligate edilir. Son olarak, bir SDS-PAGE ile analiz viral proteinlerin kapsid üzerine prob başarılı ligasyonu göstermek için gerçekleştirilir. Aha dahil tüm viral kapsid etiketlemek için gösterilirproteinleri (Hexon, Penton ve Fiber), sadece Fiber etiketlenmesi O-GlcNAz birleştirmeyecektir ederken. Bu gelişen alanında, azid-alkin ligasyonu için birden çok yöntem başarıyla geliştirilmiştir, ancak biz en uygun olduğu tespit sadece iki tanesini burada gösterilmiştir - strain-terfi azid-alkin Siklokatılma (SPAAC) ve bakır-katalize azid-alkin Siklokatılma (CuAAC) deoxygenated atmosferi altında.

Watch this Scientific Journal Video about Chemoselective Modification of Viral Surfaces via Bioorthogonal Click Chemistry at JoVE.com

Chemoselective Modification of Viral Surfaces via Bioorthogonal Click Chemistry

Adenovirüs parçacıklar doğal olmayan bir amino asit analog azidohomoalanine veya azido şeker içermesi için tasarlanmıştır<em&gt; O</em&gt;-GlcNAz. Her bir azid grubu chemoselectively viral yüzey değiştirme aracı olarak &quot;ı&quot; kimyası reaksiyon yoluyla ligate edilir.

Bioorthogonal tıklayın Kimya ile Viral Yüzeylerin Kemoselektif Modifikasyonu

The modification of virus particles has received a significant amount of attention for its tremendous potential for impacting gene therapy, oncolytic ...

chemoselective-modification-viral-surfaces-via-bioorthogonal-click

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

24.0K Görüntüleme.  Stony Brook University. Adenovirüs parçacıklar doğal olmayan bir amino asit analog azidohomoalanine veya azido şeker içermesi için tasarlanmıştır O-GlcNAz. Her bir azid grubu chemoselectively viral yüzey değiştirme aracı olarak "ı" kimyası reaksiyon yoluyla ligate edilir.

Video: Chemoselective Modification of Viral Surfaces via Bioorthogonal Click Chemistry

Microfluidic On-chip Capture-cycloaddition Reaction to Reversibly Immobilize Small Molecules or Multi-component Structures for Biosensor Applications

Methods for rapid surface immobilization of bioactive small molecules with control over orientation and immobilization density are highly desirable for biosensor and microarray applications. In this Study, we use a highly efficient covalent bioorthogonal [4+2] cycloaddition reaction between trans-cyclooctene (TCO) and 1,2,4,5-tetrazine (Tz) to enable the microfluidic immobilization of TCO/Tz-derivatized molecules. We monitor the process in real-time under continuous flow conditions using surface plasmon resonance (SPR). To enable reversible immobilization and extend the experimental range of the sensor surface, we combine a non-covalent antigen-antibody capture component with the cycloaddition reaction. By alternately presenting TCO or Tz moieties to the sensor surface, multiple capture-cycloaddition processes are now possible on one sensor surface for on-chip assembly and interaction studies of a variety of multi-component structures. We illustrate this method with two different immobilization experiments on a biosensor chip; a small molecule, AP1497 that binds FK506-binding protein 12 (FKBP12); and the same small molecule as part of an immobilized and in situ-functionalized nanoparticle.

We present a method for rapid, reversible immobilization of small molecules and functionalized nanoparticle assemblies for Surface Plasmon Resonance (SPR) studies, using sequential on-chip bioorthogonal cycloaddition chemistry and antibody-antigen capture.

Tersi Küçük Moleküller veya Biosensor Uygulamaları için Çok bileşenli Yapılar hareketsiz için microfluidic On-chip Yakalama sikloeklenme Tepki

Methods  for rapid surface immobilization of bioactive small molecules with control over  orientation and immobilization density are highly desirable for ...

Kimya

Efficient and Site-specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-alkyne Cycloaddition

There are currently many chemical tools available to introduce chemical probes into proteins to study their structure and function. A useful method is protein conjugation by genetically introducing an unnatural amino acid containing a bioorthogonal functional group. This report describes a detailed protocol for site-specific antibody conjugation. The protocol includes experimental details for the genetic incorporation of an azide-containing amino acid, and the conjugation reaction by strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC). This strain-promoted reaction proceeds by simple mixing of the reacting molecules at physiological pH and temperature, and does not require additional reagents such as copper(I) ions and copper-chelating ligands. Therefore, this method would be useful for general protein conjugation and development of antibody drug conjugates (ADCs).

Here, we present a protocol to site-specifically introduce chemical probes into an antibody fragment by genetically incorporating an azide-containing amino acid, and subsequently coupling the azide with a chemical probe by strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC).

Verimli ve Siteye özgü Gerilme-terfi Azid-alkin Siklokatılma tarafından Antikor Etiketleme

There are currently many chemical tools available to introduce chemical probes into proteins to study their structure and function. A useful method is ...

Biyokimya

Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells

The genetic incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) via amber stop codon suppression is a powerful technique to install artificial probes and reactive moieties onto proteins directly in the live cell. Each ncAA is incorporated by a dedicated orthogonal suppressor-tRNA/amino-acyl-tRNA-synthetase (AARS) pair that is imported into the host organism. The incorporation efficiency of different ncAAs can greatly differ, and be unsatisfactory in some cases. Orthogonal pairs can be improved by manipulating either the AARS or the tRNA. However, directed evolution of tRNA or AARS using large libraries and dead/alive selection methods are not feasible in mammalian cells. Here, a facile and robust fluorescence-based assay to evaluate the efficiency of orthogonal pairs in mammalian cells is presented. The assay allows screening tens to hundreds of AARS/tRNA variants with a moderate effort and within a reasonable time. Use of this assay to generate new tRNAs that significantly improve the efficiency of the pyrrolysine orthogonal system is described, along with the application of ncAAs to the study of G-protein coupled receptors (GPCRs), which are challenging objects for ncAA mutagenesis. First, by systematically incorporating a photo-crosslinking ncAA throughout the extracellular surface of a receptor, binding sites of different ligands on the intact receptor are mapped directly in the live cell. Second, by incorporating last-generation ncAAs into a GPCR, ultrafast catalyst-free receptor labeling with a fluorescent dye is demonstrated, which exploits bioorthogonal strain-promoted inverse Diels Alder cycloaddition (SPIEDAC) on the live cell. As ncAAs can be generally applied to any protein independently on its size, the method is of general interest for a number of applications. In addition, ncAA incorporation does not require any special equipment and is easily performed in standard biochemistry labs.

A facile fluorescence assay is presented to evaluate the efficiency of amino-acyl-tRNA-synthetase/tRNA pairs incorporating non-canonical amino-acids (ncAAs) into proteins expressed in mammalian cells. The application of ncAAs to study G-protein coupled receptors (GPCRs) is described, including photo-crosslinking mapping of binding sites and bioorthogonal GPCR labeling on live cells.

Kimyasal ve genetik eklenmesi en iyi duruma getirme GPCRs fotoğraf-çapraz eşleme ve canlı memeli hücreleri Bioorthogonal kimyada probları

The genetic incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) via amber stop codon suppression is a powerful technique to install artificial probes and ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, it is therefore important to have a quick and reliable way of measuring transcriptional activity in infected cells. Traditionally, transcription has been measured either by incorporation of radioactive nucleosides such as 3H-uridine followed by detection via autoradiography or scintillation counting, or incorporation of halogenated uridine analogs such as 5-bromouridine (BrU) followed by detection via immunostaining. The use of radioactive isotopes, however, requires specialized equipment and is not feasible in a number of laboratory settings, while the detection of BrU can be cumbersome and may suffer from low sensitivity.
The recently developed click chemistry, which involves a copper-catalyzed triazole formation from an azide and an alkyne, now provides a rapid and highly sensitive alternative to these two methods. Click chemistry is a two step process in which nascent RNA is first labeled by incorporation of the uridine analog 5-ethynyluridine (EU), followed by detection of the label with a fluorescent azide. These azides are available as several different fluorophores, allowing for a wide range of options for visualization.
This protocol describes a method to measure transcriptional suppression in cells infected with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12 using click chemistry. Concurrently, expression of viral proteins in these cells is determined by classical intracellular immunostaining. Steps 1 through 4 detail a method to visualize transcriptional suppression via fluorescence microscopy, while steps 5 through 8 detail a method to quantify transcriptional suppression via flow cytometry. This protocol is easily adaptable for use with other viruses.

This method describes the use of click chemistry to measure changes in host cell transcription after infection with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12. Results can be visualized qualitatively via fluorescence microscopy or obtained quantitatively through flow cytometry. This method is adaptable for use with other viruses.

Ana-Hücre RNA sentezi üzerinde Viral Enfeksiyon Etkisi Tedbir tıklayın Kimya Kullanımı

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in addition to its implications in cancer and neurodegenerative diseases. Recent developments in fatty acylation detection methods have enabled efficient and non-hazardous detection of fatty acylated proteins, particularly through the use of click chemistry with bio-orthogonal labeling. However, click chemistry detection can be limited by the poor solubility and potential toxic effects of adding long chain fatty acids to cell culture. Described here is a labeling approach with optimized delivery using saponified fatty acids in combination with fatty-acid free BSA, as well as delipidated media, which can improve detection of hard to detect fatty acylated proteins. This effect was most pronounced with the alkynyl-stearate analog, 17-ODYA, which has been the most commonly used fatty acid analog in click chemistry detection of acylated proteins. This modification will improve cellular incorporation and increase sensitivity to acylated protein detection. In addition, this approach can be applied in a variety of cell types and combined with other assays such as pulse-chase analysis, stable isotope labeling with amino acids in cell culture, and mass spectrometry for quantitative profiling of fatty acylated proteins.

The study of fatty acylation has important implications in cellular protein interactions and diseases. Presented here is a modified protocol to improve click chemistry detection of fatty acylated proteins, which can be applied in various cell types and combined with other assays, including pulse-chase and mass spectrometry.

Click Kimya Kullanarak Yağ Asillenmiş Proteinlerin Tespiti için Alkinil Yağ Asidi Analoglarının Optimize Edilmiş Birleştirilmesi

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in ...

Design, Synthesis, and Photochemical Properties of Clickable Caged Compounds

Caged compounds enable the photo-mediated manipulation of the cell physiology with high spatiotemporal resolution. However, the limited structural diversity of currently available caging groups and the difficulties in synthetic modification without sacrificing their photolysis efficiencies are obstacles to expanding the repertoire of caged compounds for live cell applications. As the chemical modification of coumarin-type photo-caging groups is a promising approach for the preparation of caged compounds with diverse physical and chemical properties, we report a method for the synthesis of clickable caged compounds that can be modified easily with various functional units via the copper(I)-catalyzed Huisgen cyclization. The modular platform molecule contains a (6-bromo-7-hydroxycoumarin-4-yl)methyl (Bhc) group as a photo-caging group, which exhibits a high photolysis efficiency compared to those of the conventional 2-nitrobenzyls. General procedures for the preparation of clickable caged compounds containing amines, alcohols, and carboxylates are presented. Additional properties such as the water solubility and cell targeting ability can be readily incorporated into clickable caged compounds. Furthermore, the physical and photochemical properties, including the photolysis quantum yield, were measured and were found to be superior to those of the corresponding Bhc caged compounds. The described protocol could therefore be considered a potential solution for the lack of structural diversity in the available caged compounds.

A protocol for the synthesis and measurement of the photochemical properties of modular caged compounds with clickable moieties is presented.

Tıklanabilir Kafesli Bileşiklerin Tasarımı, Sentezi ve Fotokimyasal Özellikleri

Caged compounds enable the photo-mediated manipulation of the cell physiology with high spatiotemporal resolution. However, the limited structural ...

Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of various diseases. This application relies on genetic modification, self-assembly, and cysteine conjugation to fulfill the tumor-targeting application of recombinant VLPs. Compared with genetic modification alone, chemical conjugation of foreign peptides to VLPs offers a significant advantage because it allows a variety of entities, such as synthetic peptides or oligosaccharides, to be conjugated to the surface of VLPs in a modulated and flexible manner without alteration of the VLP assembly.
Here, we demonstrate how to use the hepatitis E virus nanoparticle (HEVNP), a modularized theranostic capsule, as a multifunctional delivery carrier. Functions of HEVNPs include tissue-targeting, imaging, and therapeutic delivery. Based on the well-established structural research of HEVNP, the structurally independent and surface-exposed residues were selected for cysteine replacement as conjugation sites for maleimide-linked chemical groups via thiol-selective linkages. One particular cysteine-modified HEVNP (a Cys replacement of the asparagine at 573 aa (HEVNP-573C)) was conjugated to a breast cancer cell-specific ligand, LXY30 and labeled with near-infrared (NIR) fluorescence dye (Cy5.5), rendering the tumor-targeted HEVNPs as effective diagnostic capsules (LXY30-HEVNP-Cy5.5). Similar engineering strategies can be employed with other macromolecular complexes with well-known atomic structures to explore potential applications in theranostic delivery.

We have engineered the capsid protein of hepatitis E virus as a theranostic nanoparticle (HEVNP). HEVNP self-assembles into a stable icosahedral cage in mucosal delivery. Here, we describe the modification of HEVNPs for tumor targeting by mutating surface-exposed residues to cysteines, which conjugate synthetic ligands that specifically bind tumor cells.

Hepatit E virüs nano tanecikleri kimyasal konjugasyon yöntemlerle yüzey Functionalization

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of ...

Biyomühendislik

Making Conjugation-induced Fluorescent PEGylated Virus-like Particles by Dibromomaleimide-disulfide Chemistry

The recent rise in virus-like particles (VLPs) in biomedical and materials research can be attributed to their ease of biosynthesis, discrete size, genetic programmability, and biodegradability. While they&#39;re highly amenable to bioconjugation reactions for adding synthetic ligands onto their surface, the range in bioconjugation methodologies on these aqueous born capsids is relatively limited. To facilitate the direction of functional biomaterials research, non-traditional bioconjugation reactions must be considered. The reaction described in this protocol uses dibromomaleimides to introduce new functionality in the solvent exposed disulfide bonds of a VLP based upon Bacteriophage Q&#946;. Furthermore, the final product is fluorescent, which has the added benefit of generating a trackable in vitro probe using a commercially available filter set.

Here, we present a procedure to fluorescently functionalize the disulfides on Q&#946; VLP with dibromomaleimide. We describe Q&#946; expression and purification, the synthesis of dibromomaleimide-functionalized molecules, and the conjugation reaction between dibromomaleimide and Q&#946;. The resulting yellow fluorescent conjugated particle can be used as a fluorescence probe inside cells.

Konjugasyon kaynaklı floresan pegile virüs benzeri moleküller tarafından Dibromomaleimide-disülfür Kimya yapma

The recent rise in virus-like particles (VLPs) in biomedical and materials research can be attributed to their ease of biosynthesis, discrete size, ...

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce informative probes or labels into expressed receptors that do not perturb receptor function. We used amber codon suppression technology to genetically-encode the unnatural amino acid, p-azido-L-phenylalanine (azF) at various targeted positions in GPCRs heterologously expressed in mammalian cells. The versatility of the azido group is illustrated here in different applications to study GPCRs in their native cellular environment or under detergent solubilized conditions. First, we demonstrate a cell-based targeted photocrosslinking technology to identify the residues in the ligand-binding pocket of GPCR where a tritium-labeled small-molecule ligand is crosslinked to a genetically-encoded azido amino acid. We then demonstrate site-specific modification of GPCRs by the bioorthogonal Staudinger-Bertozzi ligation reaction that targets the azido group using phosphine derivatives. We discuss a general strategy for targeted peptide-epitope tagging of expressed membrane proteins in-culture and its detection using a whole-cell-based ELISA approach. Finally, we show that azF-GPCRs can be selectively tagged with fluorescent probes. The methodologies discussed are general, in that they can in principle be applied to any amino acid position in any expressed GPCR to interrogate active signaling complexes.

We genetically-encode the unnatural amino acid, p-azido-L-phenylalanine at various targeted positions in GPCRs and show the versatility of the azido group in different applications. These include a targeted photocrosslinking technology to identify residues in the ligand-binding pocket of a GPCR, and site-specific bioorthogonal modification of GPCRs with a peptide-epitope tag or fluorescent probe.

Genetik olarak kodlanmış Molecular Probes G protein-bağlanmış alıcılar Çalışması için

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

Biyoloji

Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific positions in DNA, RNA, proteins and small biomolecules. This natural methylation reaction can be expanded to a wide variety of alkylation reactions using synthetic cofactor analogues. Replacement of the reactive sulfonium center of AdoMet with an aziridine ring leads to cofactors which can be coupled with DNA by various DNA MTases. These aziridine cofactors can be equipped with reporter groups at different positions of the adenine moiety and used for Sequence-specific Methyltransferase-Induced Labeling of DNA (SMILing DNA). As a typical example we give a protocol for biotinylation of pBR322 plasmid DNA at the 5&#8217;-ATCGAT-3&#8217; sequence with the DNA MTase M.BseCI and the aziridine cofactor 6BAz in one step. Extension of the activated methyl group with unsaturated alkyl groups results in another class of AdoMet analogues which are used for methyltransferase-directed Transfer of Activated Groups (mTAG). Since the extended side chains are activated by the sulfonium center and the unsaturated bond, these cofactors are called double-activated AdoMet analogues. These analogues not only function as cofactors for DNA MTases, like the aziridine cofactors, but also for RNA, protein and small molecule MTases. They are typically used for enzymatic modification of MTase substrates with unique functional groups which are labeled with reporter groups in a second chemical step. This is exemplified in a protocol for fluorescence labeling of histone H3 protein. A small propargyl group is transferred from the cofactor analogue SeAdoYn to the protein by the histone H3 lysine 4 (H3K4) MTase Set7/9 followed by click labeling of the alkynylated histone H3 with TAMRA azide. MTase-mediated labeling with cofactor analogues is an enabling technology for many exciting applications including identification and functional study of MTase substrates as well as DNA genotyping and methylation detection.

DNA and proteins are sequence-specifically labeled with affinity or fluorescent reporter groups using DNA or protein methyltransferases and synthetic cofactor analogues. Depending on the cofactor specificity of the enzymes, aziridine or double activated cofactor analogues are employed for one- or two-step labeling.

Methyltransferases ve Kofaktör Analoglarının ile Nükleik Asitler ve Proteinler Dizi-spesifik Etiketleme

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific ...