Bu yöntem, yağ asitlerinin hücrelere verilmesini iyileştirir ve onları serbest yağ asidi dağıtımının toksik etkilerinden korur, böylece daha tutarlı etiketleme sağlar. Tıklama kimyası algılamasının hassasiyeti ve verimliliği, yağ asidi etiketinin etkili bir şekilde alınmasına bağlıdır. Bunun büyük ölçüde geliştirilebileceğini gösterdik.
Protokolün birkaç adımı çok spesifiktir ve yakından takip edilmesi gerekir. Görsel bir gösterim, örneğin, etiketleme karışımında katı madde oluşumunun nasıl önleneceğini açıklığa kavuşturabilir ve gösterebilir. Etiketleme ortamını hazırlamak için, DMEM'i% 5 dekstran / kömür kaplı FBS, 1X penisilin streptomisin, iki milimolar L-glutamin ve 100 milimolar sodyum piruvat ile tamamlayın, ardından kullanmadan önce 37 santigrat dereceye ısıtın.
Bir gün önce kaplanmış HEK-293 T hücrelerini PBS ile altı delikli bir doku kültürü kabında nazikçe yıkayın, ardından PBS'yi etiketleme ortamıyla değiştirin. Yağ asitleri ile metabolik etiketlemeye geçmeden önce hücreleri% 5 karbondioksit ile yaklaşık 45 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Yağ asidi analoglarını sabunlaştırmak için, pipet, alkinil yağ asidi analogunun en az iki mikrolitresini doğrudan üç mililitrelik bir konik reaksiyon şişesinin dibine yerleştirin.
Pipet, camın kenarındaki reaksiyon şişesinin dibine yakın eşit miktarda seyreltilmiş potasyum hidroksit verir, böylece potasyum hidroksitin dağıtılan hacmi yağ asidi ile karışır. Şişenin kapağını kapatın ve çözeltileri karıştırmak için hafifçe dokunun. Reaksiyon şişesini yaklaşık beş dakika boyunca veya çözelti netleşene kadar 65 santigrat derecede ısıtın, bu da yağ asidinin dahil edildiğini gösterir.
Bununla birlikte, sıvının çok fazla buharlaşmamasına dikkat edin. Daha sonra, pipet% 20 yağ asidi içermeyen BSA'yı önceden ısıttı, böylece yağ asitlerinin potasyum hidroksite yağ asidi içermeyen BSA'ya hacim oranı 1-1-50 olur ve 20X BSA'ya bağlı alkinil yağ asitlerinin nihai konsantrasyonuna ulaşır. Çözeltiyi yukarı ve aşağı pipetleyerek, karıştırın, ardından 37 santigrat derecede 15 dakika boyunca inkübe edin.
HEK-293 T-hücrelerini, 25 mikromolar alkinil miristat veya 100 mikromolar alkinil palmitat ve alkinil stearat içinde% 1'lik bir BSA nihai konsantrasyonu elde etmek için 20X yağ asidi BSA konjugatını doğrudan açlık ortamına ekleyerek etiketleyin. Karşılaştırma için, iki mikrolitre etiketlenmemiş yağ asidini doğrudan açlık ortamına pipetleyerek sabunlaşmamış sıvılar ekleyin, ardından hücreleri üç ila altı saat boyunca inkübatöre geri yerleştirin. Kuluçka tamamlandıktan sonra, hücreleri oda sıcaklığında PBS ile nazikçe yıkayın, ardından 500 mikrolitre EDTA içermeyen modifiye RIPA tamponu ekleyerek ve lizatları dört santigrat derecede 15 dakika döndürerek hücreleri toplayın ve lize edin.
Lisatları dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 16.000 kez G'de santrifüj yapın, ardından süpernatantı 1.7 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerinde toplayın ve eksi 20 santigrat derecede saklayın. EDTA içermeyen modifiye RIPA tamponunu kullanarak 1.7 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerinde 50 ila 100 mikrogram protein lizatını eşit bir hacme getirin. Reaksiyon hacmini mümkün olduğunca küçük tutun.
%1'lik son konsantrasyona ulaşmak için her numuneye STS ekleyinTıklama reaktiflerinin ana karışımını hazırlayın ve lizatlara uygun hacimler ekleyin, ardından yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Lisatları karanlıkta 30 dakika boyunca 37 santigrat derecelik bir su banyosunda ara sıra karıştırarak inkübe edin. İmmünopresipitasyon için, lizatları tavşan anti-GFP ile karıştırın ve dört santigrat derecede rotasyonla gece boyunca inkübe edin.
Her tüpe %0,1 SDS RIPA ile önceden dengelenmiş 15 ila 20 mikrolitre manyetik boncuk ekleyin ve üç saat boyunca dört santigrat derecede uçtan uca reaksiyona girmesine izin verin. Boncukları lizis tamponu ile yıkayın ve% 1 SDS içeren 45 mikrolitre 50 milimolar HEPES tamponunda yeniden askıya alın. Boncukları 15 dakika boyunca 80 santigrat derecede ısıtın.
Kuluçka sırasında, tüpleri yaklaşık her beş dakikada bir ters çevirin veya çalkalayın, ardından tüm tüpleri kısaca döndürün. Örnekler hala sıcakken, proteinleri içeren süpernatantı toplayın. Süpernatantın 43 mikrolitresini yedi mikrolitre tıklama reaktifleri ana karışımı ile birleştirin ve karanlıkta 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca reaksiyona girmelerine izin verin.
Bir Batı grafiğinde, saponifiye edilmiş ve sabunlaştırılmamış alkinil yağ asitleri arasında tıklama kimyası tespiti için etiketleme verimliliğinde, açil zincirlerinin artan uzunluğu ile gözle görülür bir etki gözlenmiştir. Alkinil stearat ile etiketlenmiş hücrelerde, yağ asidinin sabunlaştırılması ve metabolik etiketleme için BSA ile verilmesi, tıklama kimyası ve floresan azitoprob ile tespit yoluyla S-asillenmiş protein sinyalinin tespitini büyük ölçüde artırdı ve alkinil yağ asidi etiketinin hücresel katılımında genel bir artış olduğunu düşündürdü. Tersine, en kısa ve en çözünür yağ asidi alkinil miristat ile tedavi edilen hücrelerde gözle görülür bir fark gözlenmedi.
Alkinil palmitat ile etiketlenmiş hücreler, alkinil miristat ile karşılaştırıldığında etikette bir ara artış gösterdi, ancak alkinil stearattan daha azdı. Önemli olarak, PVDF membranlarının 0.1 molar potasyum hidroksit ile muamele edilmesi, yağ asidi etiketlerini alkinil palmitat ve alkinil stearat ile inkübe edilmiş hücrelerden büyük ölçüde kaldırdı ve sinyalin çoğunluğunun bir ester veya tiyoester bağından geçtiğini doğruladı. Beklendiği gibi, alkinil miristatın dahil edilmesi, sayısız statın bir amid bağı yoluyla proteinlere bağlanması nedeniyle çoğunlukla alkaliye dirençliydi.
Klik kimyasını takiben, immünoçökitatların yanı sıra lizatlarda vahşi tip miristotelile C-terminal Huntington GFP'nin miristoilasyonu tespit edilirken, G2A mutasyonu C-terminali Huntington GFP'nin miristoilasyonunu tamamen bloke etti. Klik kimyasını takiben, kütle spektrometrisi için yağlı asillenmiş proteinlerin afinite saflaştırmasını gerçekleştirebiliriz. Bu, hücreleri toksisiteden koruyarak farklı bir yağ asillenmiş protein profili verebilir.
