NIH hibe RC1-HL-101102, P01-CA039542, T32-HL007622, ​​Hartwell Vakfı ve Doris Duke Vakfı tarafından desteklenir. Dr Paczesny Eric Hartwell fonu ve Amy Strelzer Manasevit Araştırma Programı bir dedektiftir.

1. Deney Gün 0: IL-2Rα, REG3α ve HGF için Yakalama Antikor ile Numune Hazırlama ve ELISA Testi Levha Kaplama <ol><li> Analiz edilecek Plazma kısım örnekler çözülmüş ve plazma üst alt ve lipidler de pıhtıları ayırmak için 10 dakika 12.000 rpm&#39;de bükülmüş, çekilecektir. Seyreltilmemiş plazma 150 ul önceden haritalarına göre manuel pipetleme ile (kaynak plaka) bir 96-gözlü V-alt plaka üzerine her bir numuneden kaplanmış olacaktır. Alikotları parafilm sarılmış ve tüm süreç boyunca 4 ° C&#39;de nemli odasında muhafaza edilecektir; artık daha 72 saat. </li><li> IL-2Rα ve HGF yakalama antikorlar sulandırılır ve üretici teknik özellikleri ve 50 ul başına seyreltilmiş sonra sızdırmaz ve 4 gecede inkübe edilir ilgili 96-de yüksek bağlayıcı yarım kuyucuğu her iyi ° C içine kaplama olacak olacak Alternatif olarak, çok sayıda plaka 37 ° C sıcaklıkta kurutuldu ve ° C daha sonra kullanılmak üzere, bağlı 4 saklanabilirprotein istikrarı ing. </li><li> REG3α yakalama antikor sonra mühürlenir ve 4 de bir gece inkübe edilir bir 384-kuyucuklu Nunc Maxi Sorp-plakanın her ° C &#39;de kaplanmış olacaktır üretici kaplama tamponu ve 25 ul kullanılarak üreticinin protokolüne uygun olarak seyreltilebilir olacaktır </li></ol> 2. Deney 1. Gün: IL-2Rα ELISA (Şekil 1) <ol><li> IL-2Rα test plakasına, yıkanmış TBS içinde Blotto ile bloke ve standart kurulur ve 8 noktalı bir standart eğri üretici protokolüne göre hazırlanır. </li><li> Bloke etme adımı aşağıdaki plaka yıkandıktan sonra, plazma sulandırılmamış 50 ul kaynak plaka plaka ELISA testi için suret halinde kaplama olup, her bir standart 50 ul kopya halinde kaplıdır. Plaka 300 rpm&#39;de ayarlanmış bir plaka döndürücü üzerine kapatılmış ve oda sıcaklığında 2 saat süreyle inkübe edilmektedir. </li><li> Plazma IL-2Rα ELISA testi plaka geri istenmeye ve un geri yerleştirilirplazma kaynağı plakası seyreltilir. ELISA imalatçı protokolü (yarı oyuklu plakalar için düzeltilmiş hacim ile) ve 450-570 nm dalga boyuna sahip bir plaka okuyucu kümesi kullanılarak okunacak her çukurun optik yoğunluk göre tamamlandı ve veriler kaydedilir ve analiz edilir. </li></ol> 3. Deney 1. Gün: REG3α ELISA (Şekil 1) <ol><li> Seyreltilmemiş 10 ul plazma bir ayrı v-alt kaynak plakasına transfer edilir. Imalatçı tarafından sağlanan seyreltme tamponu 90 ul bir 1:10 seyreltme kaynak plaka oluşturmak için her bir oyuğa ilave edilir. </li><li> REG3α ELISA üretici protokolüne göre yapılır (hacimli 384-kuyucuğu için düzeltilmiş) ve her kuyu optik yoğunluğu 450-620 nm ayarlanmış bir plaka okuyucu kullanarak okunacak ve veriler kaydedilir ve analiz edilecektir. </li></ol> 4. Deney 1. Gün: Elafin ve Capture Antikor ile TNFR1 Testi Levha Kaplama <ol><li> Elafin ve TNFR1 yakalama antikorlar sulandırılmış ve dil olacaküretici şartname ve 50 ul başına uted sonra mühürlenir ve Elafin için oda sıcaklığında bir gece inkübe edilir sırasıyla 96-de yüksek bağlayıcı yarı oyuklu plakalar her oyuğuna kaplama, ve 4 ° C sıcaklıkta TNFR1 için olacaktır. </li></ol> 5. Deney Gün 1-2: HGF ELISA (Şekil 1) <ol><li> IL-2Rα ELISA tamamlanması ve deney temin sonra tekrar edilmesi gerekmez, seyreltilmemiş ve 60 ul plazma yeni bir kaynak plaka aktarılır ve daha sonra 1 x PBS içinde% 1 BSA ve 60 ul bir hale getirmek için her bir oyuğa ilave edilir 01:02 seyreltilmiş plazma kaynağı plakası. </li><li> HGF test plakasına, yıkanmış TBS içinde Blotto ile bloke ve standart kurulur ve 8 noktalı bir standart eğri üretici protokolüne göre hazırlanır. </li><li> Bloke etme adımı aşağıdaki plaka yıkandıktan sonra, 1:2 seyreltilmiş plazma 50 ul ELISA testi plaka üzerinde kopya halinde kaplama olup, her bir standart 50 ul kopya halinde kaplıdır. Plakası kapatılmış ve300 rpm&#39;de ayarlanmış bir plaka Döndürücü üzerinde gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edildi. </li><li> 1:2 seyreltilmiş plazma HGF ELISA testi plaka geri istenmeye ve 1:2 seyreltilmiş plazma kaynağı plaka geri yerleştirilir. ELISA imalatçı protokolü (yarı oyuklu plakalar için düzeltilmiş hacim ile) ve 450-570 nm dalga boyuna sahip bir plaka okuyucu kümesi kullanılarak okunacak her çukurun optik yoğunluk göre tamamlandı ve veriler kaydedilir ve analiz edilir. </li></ol> 6. Deney 2. Gün: Elafin ELISA <ol><li> Seyreltilmemiş 10 ul plazma yeni bir kaynak plaka transfer edilir ve daha sonra 1 x PBS içinde% 1 BSA, 190 ul plazma dluted 1:20 200 ul olmak için her bir oyuğa ilave edilir. </li><li> Elafin ELISA olarak 450-570 nm ayarlanmış bir plaka okuyucu kullanarak okunacaktır üreticisi protokolü (hacimleri ile yarı-kuyucuğu için düzeltilmiş) ve her kuyu optik yoğunluğuna göre yapılır ve veriler kaydedilir ve analiz. </li></ol> 7. Deneme Day 2: ELISA TNFR1 <ol><li> PBS içinde% 1 BSA ve 25 ul 1:25 seyreltilmiş 125 ul plazma elde etmek için 1:20 kaynak plaka (şimdi 01:20 plazma ihtiva eden 100 ul) eklenir. </li><li> TNFR1 ELISA üretici protokole göre tamamlanmış (yarım-kuyucuğu için ayarlanabilir hacimli) ve her kuyu optik yoğunluğu 450-570 nm ayarlanmış bir plaka okuyucu kullanarak okunacak ve verilerin kaydedilmesini ve analiz. </li></ol> 8. Deney 2. Gün: IL-8 ELISA <ol><li> 1:02 seyreltilmiş ve 60 ul plazma yeni bir kaynak plaka aktarılır ve daha sonra IL-8 seyreltici, 180 ul plazma bir 1:06 seyreltilmiş kaynak plakası olmak için her bir oyuğa ilave edilir. </li><li> IL-8 ELISA üretici protokole göre tamamlanmış (yarım-kuyucuğu için ayarlanabilir hacimli) ve her kuyu optik yoğunluğu 450-570 nm ayarlanmış bir plaka okuyucu kullanarak okunacak ve verilerin kaydedilmesini ve analiz. </li></ol> Tüm ELISA&#39;lar, unuse tamamlandıktan sonrad stok plazma çözülmüş alikotları içine değiştirilir ve ileride kullanmak için dondurulmuş olacaktır.

<ol>
	<li>Paczesny, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biomarker+panel+for+acute+graft-versus-host+disease.">A biomarker panel for acute graft-versus-host disease.</a> Blood. 113, 273-278 (2009).</li><li>Paczesny, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elafin+is+a+biomarker+of+graft-versus-host+disease+of+the+skin.">Elafin is a biomarker of graft-versus-host disease of the skin.</a> Science Translational Medicine. 2, 13ra12 (2010).</li><li>Ferrara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerating+islet-derived+3+alpha+is+a+biomarker+of+gastrointestinal+graft-versus-host+disease.">Regenerating islet-derived 3 alpha is a biomarker of gastrointestinal graft-versus-host disease.</a> Blood. , (2011).</li><li>Ferrara, J. L., Levine, J. E., Reddy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graft-versus-host+disease.">Graft-versus-host disease.</a> Lancet. 373, 1550-1561 (2009).</li><li>Miyamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+concentration+of+the+soluble+interleukin-2+receptor+for+monitoring+acute+graft-versus-host+disease.">Serum concentration of the soluble interleukin-2 receptor for monitoring acute graft-versus-host disease.</a> Bone Marrow Transpl. 17, 185-190 (1996).</li><li>Holler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+tumor+necrosis+factor+alpha+in+acute+graft-versus-host+disease+and+complications+following+allogeneic+bone+marrow+transplantation.">Role of tumor necrosis factor alpha in acute graft-versus-host disease and complications following allogeneic bone marrow transplantation.</a> Transplant. Proc. 25, 1234-1236 (1993).</li><li>Okamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+hepatocyte+growth+factor+in+serum+in+acute+graft-versus-host+disease.">Increased hepatocyte growth factor in serum in acute graft-versus-host disease.</a> Bone Marrow Transpl. 28, 197-200 (2001).</li><li>Uguccioni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+interleukin-8+serum+concentrations+in+beta-thalassemia+and+graft-versus-host+disease.">Elevated interleukin-8 serum concentrations in beta-thalassemia and graft-versus-host disease.</a> Blood. 81, 2252-2256 (1993).</li><li>Osuchowski, M. F., Siddiqui, J., Copeland, S., Remick, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+ELISA+to+profile+multiple+cytokines+from+small+volumes.">Sequential ELISA to profile multiple cytokines from small volumes.</a> J. Immunol. Methods. 302, 172-181 (2005).</li><li>Osuchowski, M. F., Remick, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+repetitive+use+of+samples+to+measure+multiple+cytokines:+the+sequential+ELISA.">The repetitive use of samples to measure multiple cytokines: the sequential ELISA.</a> Methods. 38, 304-311 (2006).</li><li>Schweitzer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+protein+profiling+on+microarrays+by+rolling-circle+amplification.">Multiplexed protein profiling on microarrays by rolling-circle amplification.</a> Nat. Biotechnol. 20, 359-365 (2002).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

<html> Burada sunulan sıralı ELISA yöntemi örneğin fare 9,10 elde nadir hastalıklar veya plazma örnekleri ile insan denekler örnekleri de yeri doldurulamaz edinme ve / veya zor olabilir plazma küçük hacimlerde birden fazla plazma proteinlerinin ölçümü sağlar. Sıralı ELISA&#39;lar genellikle gerektiren ELISA&#39;lar ile artan plazma seyreltme faktörü amacıyla yapılan plazma seyreltilmiş ≥ genellikle istenirse bu yapılabilir, ancak iadesi olmaya gerek yok 01:10. Vardır Ardışık ELISA gerçekleştirmek için yetenek plazma diğer reaktifler ile karıştırıldığında ya da farklı olan seyreltme tampon plazma için gerekli olan ELISA kitleri / protokoller ile sınırlıdır, bu yeniden kullanımı bir örnek dolayı bir uyumsuz kaygılar ablility engellemektedir tampon / reaktif Belirli bir testin performansını etkileyecektir. Dikkatli planlama ile, 10 ya da daha fazla aynı ELISA&#39;lar plazma örneği üzerinde gerçekleştirilebilir. ent &quot;&gt; Bireysel laboratuarlarda denek gelen örneklerde ilgi protein beklenen plazma konsantrasyonlarına dayalı yorumlanabilir sonuçlar elde etmek için plazma dilüsyonları ayarlamanız gerekebilir. laboratuar ekipmanları farklılıklar inkübasyon ve kolorimetrik geliştirme optimize etmek için ihtiyaç neden olabilir kez, yıkar sayısı ve / veya yıkama herhangi bir ELISA optimize etmek amacıyla kez ıslatın. High-throughput kapasitesi ve doğruluğu artırmak için ve maliyet-etkin bir şekilde analizler yaparak, 384 iyi plakaları üzerinde analiz ve istifleme ünitesi ile otomatik plaka yıkayıcı yeteneğine sahip bir robot sıvı taşıma platform kullanımı tavsiye edilir. Bu cihaz birden fazla kullanıcı tarafından yapılan analizlerin doğruluğunu ve hassasiyetini artırmak, ve inter-ve intra-analiz varyasyonu azaltmak için analiz tutarlılığı sağlamaya yardımcı olabilir. ) 1 çoğu: Biz iki nedenden dolayı mevcut multipleks platformlar üzerinde sıralı ELISAroman proteinler için antikor çiftleri kolayca boncuk veya diğer malzemelerin üzerine konjuge yanı sıra, zaman alıcı ve pahalı olamaz; 2) Bireysel ELISA deneyleri çapraz reaktivite 11 yokluğu sekonder multipleks mikroarray veya boncuklar, daha kesindir. Güvenilir bir yöntem çoğaltılmış, boncuk esaslı mikrodizileri gerçekleştirmek için kurulmuştur, bu ardışık ELISA işlemi yerine mümkün olabilir, fakat boncuklar ve / eşlenik antikorların yeteneğini ya da olması istenen proteinlerin sayısı ile sınırlıdır edilebilir analiz.

Akut graft-versus-host hastalığı (GVHD), allojeneik hematopoietik kök hücre transplantasyonu (HKHT) sonrasında non-relaps mortalite (UYM) önde gelen nedeni, üç organ sistemi disfonksiyonu ile ölçülür: deri, karaciğer ve gastrointestinal (Gİ) yolu 4. Akut GVHH genellikle iki ila sekiz hafta nakli sonra oluşur ancak daha sonra ortaya çıkabilir ve genellikle rejimin toksisite, enfeksiyon veya ilaç yan etkileri gibi diğer post-HKHT komplikasyonlar klinik olarak ayirt olduğunu. Sıralı ELISA kullanılarak proteomik stratejileri ve high-throughput doğrulama kullanımı sayesinde, kimin konsantrasyonları GVHH klinik belirtilerin başlangıcında yükselir 6 proteinler belirledik. 4 biyomarker paneli birleştirilir IL-2Rα, TNFR1, HGF ve IL-8, klinik semptomların başlangıcında GVHD teşhis edebilir ve bağımsız GVHH şiddeti 1 post-HKHT sağkalım tahmin edebilirsiniz. Elafin, sk GVHH için bir biyomarker, bu tür ilaç döküntüleri gibi diğer nedenler GVHH döküntü ve döküntü ayırt edebilir ve nakli sağkalım 2. tahmin edebilirsiniz. Biz son zamanlarda alt gastrointestinal GVHH bir biyomarker olarak REG3α belirledik, hedef organ en UYM ile ilişkilidir. Plazma REG3α konsantrasyonu güvenilir post-HKHT ishal nedeni olarak GVHD tespit ve teşhis barsak biyopsilerde GVHH histolojik şiddeti ilişkili olabilir. GI GVHH başlangıcında REG3α konsantrasyonları da GVHH tedavisi ve UYM 3 yanıt tahmin edebilirsiniz. Klinik bakım içine bu valide GVHH biyobelirteçlerin birleşme anda klinik çalışmalarda araştırılmaktadır. Bu deneyler yeri doldurulamaz ve sınırlı büyüklüktedir GVHH başlama zamanında 2000 ve 2010 yılları arasında HKHT alan hastalardan toplanan küçük plazma alikotları yapıldı. Bu örneklerin değerli doğası gereği, biz bir araya geldi geliştirdikaşırı donma-çözülme döngüleri, çözünme zamanı ve plazma kullanımını ortadan kaldırmak için etkili, tekrarlanabilir bir şekilde birden fazla plazma protein konsantrasyonu ölçüm hod. Bu teknik (ler), diğer bir reaktif ile karıştırılmak üzere gerek yoktur örnekleri verilen aynı numune üzerinde birden fazla protein / ilgi sitokinler için ELISA&#39;da gerçekleştirmek için uygulanabilir. ELISA kitleri önceden kaplanmış plakalar, 96-iyi yarı oyuklu plakalar ya da 384-kuyucuklu levhalar ihtiva etmediği takdirde daha ileri örnekleri / reaktiflerin kullanımını en aza indirmek için kullanılabilir. Bu yazıda GVHH biyolojik ölçüm teknolojik yönleri üzerinde duruluyor.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> İnsan IL-2 Duoset R alfa </td><td> R &amp; D Systems </td><td> DY223 </td><td></td></tr><tr><td> İnsan HGF Duoset </td><td> R &amp; D Systems </td><td> DY294 </td><td></td></tr><tr><td> İnsan IL-8 OptEIA TAKIMI II </td><td> Becton Dickinson </td><td> 550999 </td><td></td></tr><tr><td> Ab-Match MONTAJ İnsan PAP1 (REG3α) Kit </td><td> MBL Uluslararası </td><td> 5323 </td><td></td></tr><tr><td> Ab-Match UNIVERSAL Takımı </td><td> MBL Uluslararası </td><td> 5310 </td><td></td></tr><tr><td> İnsan sTNFRI/TNFRSF1A Duoset </td><td> R &amp; D Systems </td><td> DY225 </td><td></td></tr><tr><td> İnsan Trappin-2/Elafin Duoset </td><td> Ar-Ge Sykaynaklanıyor </td><td> DY1747 </td><td></td></tr><tr><td> 96-polistiren konik alt plakalar </td><td> Thermo Scientific </td><td> 249570 </td><td> Plazma kaynağı plakaları için kullanılır </td></tr><tr><td> Costar yarım sıra yüksek bağlayıcı 96 oyuklu plakalar </td><td> Corning </td><td> 3690 </td><td> IL-2Rα, HGF, TNFR1 ve elafin ELISA&#39;lar için </td></tr><tr><td> Nunc 384-iyi MaxiSorp plakaları </td><td> Nunc </td><td> 464718 </td><td> REG3α Elisa için </td></tr><tr><td> HyClone Fosfat, 1x Tamponlu Salin </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30256.02 </td><td></td></tr><tr><td> Bovine Serum Albumin, Fraksiyon V, Tedavi Isı Şoku </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP1600-100 </td><td></td></tr><tr><td> TBS içinde Engelleyicisi Blotto </td><td> Thermo Scientific </td><td> 37530 </td><td> IL-2Rα HGF ve TNFR1 ELISA&#39;lar için engelleme ajan </td></tr><tr><td> DulbeccoTuzlu Fosfat-Buffered </td><td> Gibco </td><td> 21600-069 </td><td> IL-2Rα, HGF, Elafin ve TNFR1 ELISA&#39;lar için tampon yıkayın </td></tr><tr><td> TMB Peroksit Susbtrate </td><td> Kirkegaard ve Perry Laboratuvarları </td><td> 50-76-00 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Acros Organics </td><td> 233362500 </td><td> IL-2Rα, HGF, Elafin ve TNFR1 ELISA&#39;lar için tampon yıkayın </td></tr><tr><td> Sülfürik Asit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 84720 </td><td> (2N Seyreltilmiş) stop çözüm </td></tr></tbody></table>

high throughput sequential elisa for validation of biomarkers of acute graft-versus-host disease

Tarafsız keşif proteomik stratejiler klinik ortamda tanısal ve prognostik test artırabilir ve kılavuz terapötik girişimlere yardımcı olabilecek yeni biyomarkerler sayıda tanımlamak için bir potansiyele sahiptir. Aday proteinleri çok sayıda tespit edildiğinde, bu tür akut başlangıçlı itibariyle sonlu hacim, olay odaklı ve yeri doldurulamaz olan hasta plazma numuneleri, bir zamanında ve verimli bir şekilde aday biyobelirteçlerin doğrulamak zor olabilir graft-versus- host hastalığı (GVHH), allojeneik hematopoietik kök hücre transplantasyonu (HKHT) bir potansiyel olarak yaşamı tehdit eden bir komplikasyondur. En aza indirmek için ardışık bir şekilde IL-2Rα 5, 6 TNFR1, HGF 7, IL-8 8, elafin 2, 3 ve REG3α (aynı zamanda PAP1 olarak da bilinir): Burada altı doğrulanmış GVHD proteinler için ticari olarak mevcut ELISA&#39;lar gerçekleştirme işlemini tarif donma-çözülme döngüleri, Plazma zaman ve plazma kullanımı çözülmüş. Optimum sıralı ELISA performansı kolaylaştırmak için küçük ayarlamalar ile üretici ELISA kitleri ve protokollerini kullanarak Laboratuvarımızda kurulmuş olarak örnek seyreltme faktörü ile belirlenir, bu işlem için biz sırayla ELISA&#39;lar gerçekleştirin. Çıkan plazma biyolojik konsantrasyonları sonra derlenen ve bir hasta kohort içinde önemli bulgular için analiz edilebilir. Bu biyobelirteçlerin sadece araştırma amaçlı anda olsa da, klinik bakım onların içine eklenmesi halen klinik çalışmalarda araştırılmaktadır. Bu teknik (ler), diğer bir reaktif ile karıştırılmak üzere gerek yoktur örnekleri verilen aynı numune üzerinde birden fazla protein / ilgi sitokinler için ELISA&#39;da gerçekleştirmek için uygulanabilir. ELISA kitleri önceden kaplanmış plakalar, 96-iyi yarı oyuklu plakalar ya da 384-kuyucuklu levhalar ihtiva etmediği takdirde daha ileri örnekleri / reaktiflerin kullanımını en aza indirmek için kullanılabilir.

<html> Biyomarker iş akışı ve zaman çizelgesi, sırasıyla Tablo 1 ve Tablo 2&#39;de ayrıntılı olarak verilmektedir. Bir kere tamamlandı, 6 farklı protein konsantrasyonu hemen plazma 150 ul toplam plazma kullanılarak aynı numune üzerinde ölçülebilir edilmiştir. Test başına nüsha örnekleri Kaplama CV% 10&#39;un altında optimum olmak üzere, iç kalite güvence sağlar. Çok plakalı, yüksek standartları tutarlı optik yoğunlukları üzerinde sıralı ELISA gerçekleştirerek tercih ve ölçümlerin gelişmiş arası plaka güvenilirlik için izin iseniz; standart eğri ODS ELISA performansı tutarsızlık (Şekil 2) için değerlendirmek bakmak plakaları arasındaki mukayese edilebilir. Tetrametilbenzidin kolorimetrik alt tabaka ve yüksek konsantrasyon kullanılarak ODS Development kez laboratuarımızda her bir biyolojik için gözlenen Tablo 3 de listelenmiştir. tp_upload/4247/4247fig1.jpg &quot;alt =&quot; Şekil 1 &quot;/&gt; Şekil 1. IL-2Rα, REG3α ve HGF ELISA&#39;lar için iş akışı. Plazma örnekleri, IL-2Rα ELISA plakaları üzerinde kaplanmış edildikten sonra, diğer ELISA&#39;lar için seyreltme kaynak plakaları yapmak için yapıştırılır. HGF ELISA için, plazma IL-8 1:06 seyreltme plaka hazırlamak için yapıştırılır. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4247/4247fig1large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam için tıklayınız</a> . <img src="/files/ftp_upload/4247/4247fig2.jpg" alt="Şekil 2,"/> Şekil 2. İlk REG3α GI GVHH biyomarker raporu 3 test 1084 hastaya karşılık REG3α konsantrasyonlarını ölçmek 7 farklı ELISA plakaları standart eğri için optik Yoğunlukları. Plakalar arasındaki Tutarlı ODS plakaları arasında tutarlı protein konsantrasyonu ölçümleri sağlamak. Protein konsantrasyonlarıplazma numuneleri standart eğri optik yoğunlukları numunenin optik yoğunlukları karşılaştırılarak hesaplanmıştır. <table border="1"><tbody><tr><td> Deney Gün 0 </td><td> 1. Örnekler hazırlayın </td></tr><tr><td></td><td> 2. IL-2Rα, HGF ve REG3α yakalama Ab </td></tr><tr><td> Deney 1. Gün </td><td> 1. IL-2RαELISA </td></tr><tr><td></td><td> 2. REG3αELISA </td></tr><tr><td></td><td> 3. HGF ELISA (örnek sayesinde kaplama) </td></tr><tr><td></td><td> 4. Elafin ve TNFR yakalama Ab </td></tr><tr><td> Deney 2. Gün </td><td> 1. HGF ELISA tamamlama </td></tr><tr><td></td><td> 2. Elafin ELISA </td></tr><tr><td></td><td> 3. TNFR1 ELISA </td></tr><tr><td></td><td> 4. IL-8 ELISA </td></tr><tr><td></td><td> 5. Kullanılmayan dondurulabilirplazma </td></tr></tbody></table> Tablo 1. GVHH Biyomarker İş Akışına Genel Bakış <table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Gün 0 </td><td colspan="3"> Numune hazırlama ve geceleme yakalama vücut inkübasyon </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> ELISA </td><td> IL-2Rα </td><td> REG3α </td><td> HGF </td><td> Elafin </td><td> TNFR1 </td><td> IL-8 </td></tr><tr><td> Süresi (saat) </td><td> 0.0 </td><td> Bloke etme </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 1.0 </td><td> Kaplama, Örnekleri </td><td></td><td></td><td></td><td></td> &lt;td&gt; </td></tr><tr><td></td><td> 3.0 </td><td> Algılama Ab; plazma numuneleri Reclaim </td><td> Engelleme; Prepare Örnekleri (1:10 seyreltme) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 4.0 </td><td></td><td> Kaplama Örnekleri (1:10) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5.0 </td><td> Streptavidin-HRP </td><td> Algılama Ab </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5.5 </td><td> TMB </td><td> Streptavidin-HRP </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 6 </td><td> Plaka Okuma </td><td> TMB </td><td> Engelleme; Prepare örnekleri (1:2 seyreltme) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 6.5 </td><td></td><td> Plaka Okuma </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 7 </td><td></td><td></td><td> Kaplama Örnekleri (1:2) </td><td> Ab (gecelik inkübasyon) Yakalama </td><td> Ab (gecelik inkübasyon) Yakalama </td><td></td></tr><tr><td> 2. Gün </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Süresi (saat) </td><td> 0.0 </td><td></td><td></td><td> Plazma, Algılama Ab Reclaim </td><td> Engelleme; Prepare örnekleri (1:20) </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 1.0 </td><td></td><td></td><td></td><td> Örnek kaplama (1:2) </td><td> Engelleme; 01:20 örneklerin ilave seyreltme 1:25 seyreltme </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 2.0 </td><td></td><td></td><td> HRP </td><td></td><td> Örnek kaplama (1:25) </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 2.5 </td><td></td><td></td><td> TMB </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 3.0 </td><td></td><td></td><td> Plaka Okuma </td><td> Algılama Ab </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 3.5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Örnekleri (1:6 seyreltme) hazırlayın </td></tr><tr><td></td><td> 4.0 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Algılama Ab </td><td> Örnek kaplama (1:6) </td></tr><tr><td></td><td> 5.0 </td><td></td><td></td><td></td><td> HRP </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5.5 </td><td></td><td></td><td></td><td> TMB </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 6 </td><td></td><td></td><td></td><td> Plaka Okuma </td&gt; <td> HRP </td><td> Algılama Ab </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> TMB </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 7 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Plaka Okuma </td><td> TMB </td></tr><tr><td></td><td> 7.5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Plaka okuma </td></tr><tr><td colspan="2"> Tamamlanmasından sonra, </td><td colspan="6"> Alikotları içine kaynak plazma değiştirin ve daha sonra kullanmak için dondurma </td></tr></tbody></table> Tablo 2. ELISA&#39;lar gerçekleştirmek için zaman çizelgesi. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Plazma Seyreltme faktörü </td><td> Yüksek Standart Konsantrasyon </td><td> Yüzey Geliştirme Süresi (dk) </td><td> Yüksek OD </td><td> Eğri </td></tr><tr><td> IL-2Rα </td><td> 01:01 </td><td> 2,000 pg / ml </td><td> 5 </td><td> 1 </td><td> Doğrusal </td></tr><tr><td> HGF </td><td> 01:02 </td><td> 4.000 pg / ml </td><td> 22 </td><td> 2.1 </td><td> 4-parametreli </td></tr><tr><td> IL-8 </td><td> 01:06 </td><td> 200 pg / ml </td><td> 12 </td><td> 2.7 </td><td> 4-parametreli </td></tr><tr><td> REG3α </td><td> 01:10 </td><td> 100 ng / ml </td><td> 12 </td><td> 1.7 </td><td> 4-parametreli </td></tr><tr><td> Elafin </td><td> 01:20 </td><td> 2,000 pg / ml </td><td> 20 </td><td> 1.9 </td><td> 4-parametreli </td></tr><tr><td> TNFR1 </td><td> 01:25 </td><td> 800 pg / ml </td><td> 8 </td><td> 2.7 </td><td> Doğrusal </td></tr></tbody></table> 6 GVHH Biyobelirteçler için Tablo 3. ELISA Detayları.

Watch this Scientific Journal Video about High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease at JoVE.com

High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease

Birden fazla aday biyobelirteçlerin Yüksek throughput doğrulama donma / çözülme çevrimleri en aza indirmek ve değerli plazma numunesi kullanmak için sıralı ELISA ile yapılabilir. Burada, sıralı altı farklı valide plazma biyobelirteçleri için ELISA&#39;lar gerçekleştirmek için nasıl göstermek<sup&gt; 1-3</sup&gt; Graft-versus-host hastalığı (GVHH)<sup&gt; 4</sup&gt; Aynı plazma örneği üzerinde.

Akut Graft-Versus-Host Hastalığı Biyomarkörler onaylanması için Yüksek Verimli Sıralı ELISA

Unbiased discovery proteomics strategies have  the potential to identify large numbers of novel biomarkers that can improve  diagnostic and prognostic ...

high-throughput-sequential-elisa-for-validation-biomarkers-acute

Research

JoVE Journal

Medicine

15.7K Görüntüleme.  University of Michigan. Birden fazla aday biyobelirteçlerin Yüksek throughput doğrulama donma / çözülme çevrimleri en aza indirmek ve değerli plazma numunesi kullanmak için sıralı ELISA ile yapılabilir. Burada, sıralı altı farklı valide plazma biyobelirteçleri için ELISA'lar gerçekleştirmek için nasıl göstermek 1-3 Graft-versus-host hastalığı (GVHH) 4 Aynı plazma örneği üzerinde.

Video: High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease

A High-throughput Automated Platform for the Development of Manufacturing Cell Lines for Protein Therapeutics

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing requirement for drug supplies. The generation of production cell lines has traditionally involved manual operations that are labor-intensive, low-throughput and vulnerable to human errors. We report here an integrated high-throughput and automated platform for development of manufacturing cell lines for the production of protein therapeutics.
The combination of BD FACS Aria Cell Sorter, CloneSelect Imager and TECAN Freedom EVO liquid handling system has enabled a high-throughput and more efficient cell line development process. In this operation, production host cells are first transfected with an expression vector carrying the gene of interest 1, followed by the treatment with a selection agent. The stably-transfected cells are then stained with fluorescence-labeled anti-human IgG antibody, and are subsequently subject to flow cytometry analysis 2-4. Highly productive cells are selected based on fluorescence intensity and are isolated by single-cell sorting on a BD FACSAria. Colony formation from single-cell stage was detected microscopically and a series of time-laps digital images are taken by CloneSelect Imager for the documentation of cell line history. After single clones have formed, these clones were screened for productivity by ELISA performed on a TECAN Freedom EVO liquid handling system. Approximately 2,000 - 10,000 clones can be screened per operation cycle with the current system setup.
This integrated approach has been used to generate high producing Chinese hamster ovary (CHO) cell lines for the production of therapeutic monoclonal antibody (mAb) as well as their fusion proteins. With the aid of different types of detecting probes, the method can be used for developing other protein therapeutics or be applied to other production host systems. Comparing to the traditional manual procedure, this automated platform demonstrated advantages of significantly increased capacity, ensured clonality, traceability in cell line history with electronic documentation and much reduced opportunity in operator error.

A high-throughput, automated platform of manufacturing cell line development for producing protein therapeutics is described. Implementation of BD FACS Aria Cell Sorter, CloneSelect Imager and TECAN Freedom EVO liquid handling system has demonstrated significantly increased processing capacity in cell line development with improved cell line quality and high reproducibility.

Protein Therapeutics İmalat Hücre Hatları Kalkınma Yüksek throughput Otomatik Platformu

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing ...

Tıp

Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular degeneration, photoreceptor degeneration, cataract, glaucoma, retinoblastoma, and diabetic retinopathy have been recapitulated in transgenic mice.1-5 Most transgenic and knockout mice have been generated by laboratories to study non-ophthalmic diseases, but genetic conservation between organ systems suggests that many of the same genes may also play a role in ocular development and disease. Hence, these mice represent an important resource for discovering new genotype-phenotype correlations in the eye. Because these mice are scattered across the globe, it is difficult to acquire, maintain, and phenotype them in an efficient, cost-effective manner. Thus, most high-throughput ophthalmic phenotyping screens are restricted to a few locations that require on-site, ophthalmic expertise to examine eyes in live mice. 6-9 An alternative approach developed by our laboratory is a method for remote tissue-acquisition that can be used in large or small-scale surveys of transgenic mouse eyes. Standardized procedures for video-based surgical skill transfer, tissue fixation, and shipping allow any lab to collect whole eyes from mutant animals and send them for molecular and morphological phenotyping. In this video article, we present techniques to enucleate and transfer both unfixed and perfusion fixed mouse eyes for remote phenotyping analyses.

The dissection technique illustrates enucleation of the mouse eye for tissue fixation to perform phenotyping in high-throughput screens.

Uzaktan Yüksek throughput fenotipleme için Fare Göz Enükleasyon

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

Ardışık<em&gt; In vivo</em&gt; Kırık Onarım sırasında Osteojenik Kök / Progenitör Hücrelerinin Görüntüleme

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Minimal Invasive Surgical Procedure of Inducing Myocardial Infarction in Mice

Myocardial infarction still remains the main cause of death in western countries, despite considerable progress in the stent development area in the last decades. For clarification of the underlying mechanisms and the development of new therapeutic strategies, the availability of valid animal models are mandatory. Since we need new insights into pathomechanisms of cardiovascular diseases under in vivo conditions to combat myocardial infarction, the validity of the animal model is a crucial aspect. However, protection of animals are highly relevant in this context. Therefore, we establish a minimally invasive and simple model of myocardial infarction in mice, which assures a high reproducibility and survival rate of animals. Thus, this models fulfils the requirements of the 3R principle (Replacement, Refinement and Reduction) for animal experiments and assure the scientific information needed for further developing of therapeutical strategies for cardiovascular diseases.

A highly reproducible model for myocardial infarction in mice with minimal invasive manipulations is described. The model can be easily performed, resulting in a high reproducibility and survival rate. Thus, the described model will reduce the number of required animals as requested by the 3R principle (Replacement, Refinement and Reduction).

Farelerde Miyokard İnfarktüsü Oluşturan Minimal İnvaziv Cerrahi Prosedür

Myocardial infarction still remains the main cause of death in western countries, despite considerable progress in the stent development area in the last ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to develop strategies for treating a variety of diseases. The purpose of this study was to develop and characterize MSCs as cellular vehicles engineered for delivery of therapeutic factors as part of a neuroprotective strategy for rescuing the damaged or diseased nervous system. In this study we used mouse MSCs that were genetically modified using lentiviral vectors, which encoded brain-derived neurotrophic factor (BDNF) or glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), together with green fluorescent protein (GFP). 
Before proceeding with in vivo transplant studies it was important to characterize the engineered cells to determine whether or not the genetic modification altered aspects of normal cell behavior. Different culture substrates were examined for their ability to support cell adhesion, proliferation, survival, and cell migration of the four subpopulations of engineered MSCs. High content screening (HCS) was conducted and image analysis performed. 
Substrates examined included: poly-L-lysine, fibronectin, collagen type I, laminin, entactin-collagen IV-laminin (ECL). Ki67 immunolabeling was used to investigate cell proliferation and Propidium Iodide staining was used to investigate cell viability. Time-lapse imaging was conducted using a transmitted light/environmental chamber system on the high content screening system.
Our results demonstrated that the different subpopulations of the genetically modified MSCs displayed similar behaviors that were in general comparable to that of the original, non-modified MSCs. The influence of different culture substrates on cell growth and cell migration was not dramatically different between groups comparing the different MSC subtypes, as well as culture substrates. 
This study provides an experimental strategy to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

This study describes an experimental platform to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

Nöroprotektif Stratejileri Tedavi Faktörleri teslimi için tasarlandı Erişkin Kök Hücre Yüksek Verimli Karakterizasyonu

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

Detection of Disease-associated &#945;-synuclein by Enhanced ELISA in the Brain of Transgenic Mice Overexpressing Human A53T Mutated &#945;-synuclein

In addition to established methods like Western blot, new methods are needed to quickly and easily quantify disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) in experimental models of synucleopathies. A transgenic mouse line (M83) over-expressing the human A53T &#945;S and spontaneously developing a dramatic clinical phenotype between eight and 22 months of age, characterized by symptoms including weight loss, prostration, and severe motor impairment, was used in this study. For molecular analyses of &#945;SD (disease-associated &#945;S) in these mice, an ELISA was designed to specifically quantify &#945;SD in sick mice. Analysis of the central nervous system in this mouse model showed the presence of &#945;SD mainly in the caudal brain regions and the spinal cord. There were no differences in &#945;SD distribution between different experimental conditions leading to clinical disease, i.e., in uninoculated and normally aging transgenic mice and in mice inoculated with brain extracts from sick mice. The specific detection of &#945;SD immunoreactivity using an antibody against Ser129 phosphorylated &#945;S by ELISA essentially correlated with that obtained by Western blot and immunohistochemistry. Unexpectedly, similar results were observed with several other antibodies against the C-terminal part of &#945;S. The propagation of &#945;SD, suggesting the involvement of a &#8220;prion-like&#8221; mechanism, can thus be easily monitored and quantified in this mouse model using an ELISA approach.

Detection of Disease-associated &amp;#945;-synuclein by Enhanced ELISA in the Brain of Transgenic Mice Overexpressing Human A53T Mutated &amp;#945;-synuclein

An ELISA offering a novel quantitative approach is described. It specifically detects disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) in a transgenic mouse model (M83) of synucleinopathy using several antibodies against either the Ser129 phosphorylated &#945;S form or the C-terminal part of the protein.

İnsan A53T aşırı eksprese eden transjenik farelerin beyninde Geliştirilmiş ELISA ile Hastalık ile ilişkili α-sinüklein tespiti α-sinüklein Mutasyona uğramış

In addition to established methods like Western blot, new methods are needed to quickly and easily quantify disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and heterogeneity of patient-derived multiple myeloma (MM) cells. This approach consists in seeding primary MM cells freshly extracted from bone marrow aspirates into microfluidic chambers implemented in multi-well plates, each consisting of a reconstruction of the bone marrow microenvironment, including extracellular matrix (collagen or basement membrane matrix) and stroma (patient-derived mesenchymal stem cells) or human-derived endothelial cells (HUVECs). The chambers are drugged with different agents and concentrations, and are imaged sequentially for 96 hr through bright field microscopy, in a motorized microscope equipped with a digital camera. Digital image analysis software detects live and dead cells from presence or absence of membrane motion, and generates curves of change in viability as a function of drug concentration and exposure time. We use a computational model to determine the parameters of chemosensitivity of the tumor population to each drug, as well as the number of sub-populations present as a measure of tumor heterogeneity. These patient-tailored models can then be used to simulate therapeutic regimens and estimate clinical response.

We describe a high-throughput drug sensitivity assay for primary multiple myeloma cells. It consists of a reconstruction of the bone marrow microenvironment (including extracellular matrix and stroma) in multi-well plates, and a non-invasive method for longitudinal quantification of cell viability.

Primer Multipl Miyelom Hücrelerinin İlaç Duyarlılık Karakterizasyonu için bir Organotipik Yüksek Verimli Sistemi

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be important in the development of future novel therapies. Often&#160;potential new biomarkers do not make it&#160;into the clinic&#160;due to limitations&#160;in their development and&#160;high costs.&#160;However,&#160;targeted proteomics using Multiple Reaction Monitoring Liquid Chromatography-tandem/Mass Spectrometry (MRM LC-MS/MS), specifically using triple quadrupole mass spectrometers, is one method that can be used to rapidly evaluate and validate biomarkers&#160;for clinical translation into diagnostic laboratories. Traditionally, this platform has been used extensively for measurement of small molecules&#160;in clinical laboratories, but it is the potential to analyze proteins, that makes it an attractive alternative to ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)-based methods. We describe here how targeted proteomics can be used to measure multiplexed markers of dementia, including the detection and quantitation of the known risk factor apolipoprotein E isoform 4 (ApoE4).
In order to make the assay suitable for translation, it is designed to be rapid, simple, highly specific and cost effective. To achieve this, every step in the development of the assay must be optimized for the individual proteins and tissues they are analyzed in. This method describes a typical workflow including various tips and tricks to developing a targeted proteomics MRM LC-MS/MS for translation.
The method development is optimized using custom synthesized versions of tryptic quantotypic peptides, which calibrate&#160;the MS for detection and then spiked into CSF to determine correct identification of the endogenous peptide in the chromatographic separation prior to analysis in the MS. To achieve absolute quantitation, stable isotope-labeled internal standard versions of the peptides with short amino acid sequence tags and containing a trypsin cleavage site, are included in the assay.

We describe a high-throughput, multiplex, and targeted proteomic cerebrospinal fluid (CSF) assay developed with potential for clinical translation. The test can quantitate potential markers and risk factors for neurodegeneration, such as the apolipoprotein E variants (E2, E3 and E4), and measure their allelic expression.

Bir Yüksek Verimli, Çoklanmış ve Hedefli Proteomik BOS Deneyi nörodejeneratif Biyomarkerleri ve Apolipoprotein E İzoformları Durum belirlememize

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be ...

Study of In Vivo Glucose Metabolism in High-fat Diet-fed Mice Using Oral Glucose Tolerance Test (OGTT) and Insulin Tolerance Test (ITT)

Obesity represents the most important single risk factor in the pathogenesis of type 2 diabetes, a disease which is characterized by a resistance to insulin-stimulated glucose uptake and a gross decompensation of systemic glucose metabolism. Despite considerable progress in the understanding of glucose metabolism, the molecular mechanisms of its regulation in health and disease remain under-investigated, while novel approaches to prevent and treat diabetes are urgently needed. Diet derived glucose stimulates the pancreatic secretion of insulin, which serves as the principal regulator of cellular anabolic processes during the fed-state and thus balances blood glucose levels to maintain systemic energy status. Chronic overfeeding triggers meta-inflammation, which leads to alterations in peripheral insulin receptor-associated signaling and thus reduces the sensitivity to insulin-mediated glucose disposal. These events ultimately result in elevated fasting glucose and insulin levels as well as a reduction in glucose tolerance, which in turn serve as important indicators of insulin resistance. Here, we present a protocol for the generation and metabolic characterization of high-fat diet (HFD)-fed mice as a frequently used model of diet-induced insulin resistance. We illustrate in detail the oral glucose tolerance test (OGTT), which monitors the peripheral disposal of an orally administered glucose load and insulin secretion over time. Additionally, we present a protocol for the insulin tolerance test (ITT) to monitor whole-body insulin action. Together, these methods and their downstream applications represent powerful tools to characterize the general metabolic phenotype of mice as well as to specifically assess alterations in glucose metabolism. They may be especially useful in the broad research field of insulin resistance, diabetes and obesity to provide a better understanding of pathogenesis as well as to test the effects of therapeutic interventions.

Study of In Vivo Glucose Metabolism in High-fat Diet-fed Mice Using Oral Glucose Tolerance Test OGTT and Insulin Tolerance Test ITT

The current article describes the generation and metabolic characterization of high-fat diet-fed mice as a model of diet-induced insulin resistance and obesity. It further features detailed protocols to perform the oral glucose tolerance test and the insulin tolerance test, monitoring whole-body alterations of glucose metabolism in vivo.

Vivo glikoz metabolizması farelerde Oral glukoz tolerans testi (OGTT) ve insülin tolerans testi (ITT) kullanarak yüksek yağlı diyet beslenen incelenmesi

Obesity represents the most important single risk factor in the pathogenesis of type 2 diabetes, a disease which is characterized by a resistance to ...

Digital PCR for Quantifying Circulating MicroRNAs in Acute Myocardial Infarction and Cardiovascular Disease

Circulating serum microRNAs (miRNAs) have shown promise as biomarkers for the cardiovascular disease and acute myocardial infarction (AMI), being released from the cardiovascular cells into the circulation. Circulating miRNAs are highly stable and can be quantified. The quantitative expression of specific miRNAs can be linked to the pathology, and some miRNAs show high tissue and disease specificity. Finding novel biomarkers for cardiovascular diseases is of importance for medical research. Quite recently, digital polymerase chain reaction (dPCR) has been invented. dPCR, combined with fluorescent hydrolysis probes, enables specific direct absolute quantification. dPCR exhibits superior technical qualities, including a low variability, high linearity, and high sensitivity compared to the quantitative polymerase chain reaction (qPCR). Thus, dPCR is a more accurate and reproducible method for directly quantifying miRNAs, particularly for the use in large multi-center cardiovascular clinical trials. In this publication, we describe how to effectively perform digital PCR in order to assess the absolute copy number in serum samples.

Circulating microRNAs have shown promise as biomarkers for cardiovascular diseases and acute myocardial infarctions. In this study, we describe a protocol for miRNA extraction, reverse transcription, and digital PCR for the absolute quantification of miRNAs in the serum of patients with cardiovascular disease.

Akut miyokard infarktüsü ve kardiyovasküler hastalık mikroRNA'lar dolaşan miktarının için dijital PCR

Circulating serum microRNAs (miRNAs) have shown promise as biomarkers for the cardiovascular disease and acute myocardial infarction (AMI), being released ...