Yazarlar DNA saflaştırılması ile ilgili yardım için veri toplama ve Monica Pillon sırasında yardım için NSLS (Brookhaven Ulusal Laboratuvarı) da PXRR personel teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Sağlık Araştırması Kanada Enstitüleri (MOP 67189) tarafından desteklenmiştir.

1. Protein Saflaştırma Bağlayan esnek bağlayıcı N-(oligomerizasyonun) ve C-terminal (DNA bağlayıcı) SeqA yardımları DNA üzerinde 1-3 tur ayırarak hemimethylated GAİK tekrarlarının tanınması etki. Bu çalışma için, biz daha oligomerizasyonun ve tarafından özel olarak ayrılmış tandem GAİK için bağlayıcı DNA tekrarlar kısıtlayan kısaltılmış bir bağlayıcı engeller N-terminal etki alanındaki bir nokta mutasyonu ile SeqA bir dimerik varyantı (SeqAΔ (41-59)-A25R) kullanılır DNA üzerindeki bir dönüş (Şekil 1) 2,8. <ol><li> T7 promotörü kontrolü altında kodlama plazmid SeqA ile BL21 (DE3) hücreleri Transform </li><li> Levha 100 ug / ml ampisilin içeren LB agar plakaları içinde dönüşüm reaksiyonu </li><li> Küçük ölçekli bir gecede kültürü aşılamak için karışık koloniler seçin (LB ortamı 100 mg / ml ampisilin ile), </li><li> Ertesi sabah overni bir 1:100 dilüsyon kullanarak bir ortam 1 L aşılamakGHT kültür, </li><li> ~ 0.7 bir OD 600 hücrelerinin büyümesini ve 1 mM nihai bir konsantrasyona izopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) ilavesiyle protein üretimi indükleyebilir </li><li> , Orbital sallama ile 37 ° C &#39;de 3 saat boyunca inkübasyon devam edilmesi ve daha sonra santrifüjle (3,300 g, 10 dakika) ile hücreler hasat </li><li> Saflaştırma tampon A hücre pelletini tekrar ve sonication tarafından lyse, </li><li> Santrifüj (39,000 g hızında 40 dakika) ile temizleyin ve lizat arıtma tamponu ile dengelenmiş bir sütun üzerine heparin süpernatant yük, </li><li> Zehir SeqA, 1 M NaCl (~ 0.7 M NaCl SeqA elutes) bir doğrusal gradyan kullanılarak </li><li> Havuz bir arada SeqA içeren fraksiyonları, saflaştırma tamponu ile dengelenmiş bir katyon-değişim kromatografisi kolon içine iyonik gücü ve örnek yükünü azaltmak için seyreltin </li><li> Doğrusal bir tuz degrade kullanarak, saf SeqA, ~ 0.4 M NaCl elutes </li><li> Birlikte Havuz SeqA içeren fraksiyonları, concentratE (3 mg / ml) ve depolama tampon içinde saklayın. </li></ol> 2. DNA Saflaştırma <ol><li> Favori şirket Sipariş tamamlayıcı unmethylated ve metil oligonükleotidler </li><li> , Otoklavlanmış GKD 2 O, vorteks 800 ul Her liyofilize tek iplikli DNA 1 mmol çözülür ve 10-20 dakika bekletin </li><li> Her oligonükleotid için ısıtılmış 2X yükleme tampon 800 ul ekleyin, </li><li> 20-30 nükleotid uzunluğunda oligonükleotidler, büyük bir% 10 denatüre edici jel kolonu (160 x 250 x 1 mm) hazırlanması: * Iyi% 10 SAYFA karışımı, 80 ul TEMED ve jel başına 800 ul amonyum persülfat 80 ml karıştırın ve dökün, * Bir kez polimerize, tarak kaldırmak ve GKD 2 O iyice ile kuyu durulayın * Soğutma plakası içeren jel dökme üzerine jeller birleştirin ve sonra (1X TBE) tamponu ile çalışan üst ve alt rezervuarları doldurmak, * 55 ° C jel ısınmak için 700-750 V jel önceden çalıştırın, * Run durdurun ve kuyular THORO durulamaughly tampon çalışan. </li><li> 90 oligonükleotidler ısıtılır ° C&#39;de 2 dakika süreyle, </li><li> Vortex ve örnekleri spin ve hemen jel yüklemeden önce, </li><li> ~ 700 V jel çalıştırın ve oligonükleotid yarıya göç etmiş bir kez bunu durdurmak. (% 10 poliakrilamid jel üzerinde bromofenol mavi ~ 60 üsleri uzun ~ 20 üsleri uzun ve ksilen cyanol FF oligonükleotidler ile işbirliği geçirir unutmayın) </li><li> Jel durdurun, jel kutusundan sökmeye ve pullar çıkarın </li><li> Düz bir yüzey üzerinde, bir cam plaka kaldırmak ve plastik wrap ile jel kapağı </li><li> , Jel Dönün diğer cam plaka kaldırmak ve plastik ile ortun </li><li> , DNA gölge görmek için jel arkasındaki UV ışığı ve floresan plaka kullanarak bantları işaretleyin </li><li> Küçük parçalar halinde bir jilet ile bant kesin ve steril bir 15 ml tüp içine aktarın, </li><li> Elüsyon tampon 9 ml ekleyin ve ajitasyon ile 37 ° C gecede Zehir, </li><li> Dikkatle çözümü aktarmakaktarımı akrilamid parçalar önlemek ve pH 7&#39;de 3 M sodyum asetat (1:10 seyreltme) 1 ml artı soğutulmuş% 100 etanol (2.5 hacim) ve 25 ml eklemek için bir jel yükleme pipet ucu kullanılarak bir otoklav santrifüj tüpüne, </li><li> En azından 3 saat boyunca -20 ° C&#39;de inkübe </li><li> , Aşağı spin ve ayrı bir tüpe supernatant aktarın </li><li> Orta ısıda hız amfi üzerine pelet kurulayın, </li><li> Otoklavlanmış GKD 2 O 400 ul pelletini tekrar ve yeni bir tüp aktarmak, </li><li> PH 7&#39;de 3 M sodyum asetat ve% 100 etanol ve 1 mL, 40 ul ekle; iyi karışımı (vorteks) ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir, 30 dakika -20 ° C&#39;de, ardından </li><li> 18.000 g&#39;de 15 dakika boyunca santrifüj ve süpernatant atmak </li><li> 18.000 g, 6 dakika için pelet ve dönüş sonrası kalan tuz çıkarmak için% 70 etanol soğuk 100 ul ile pelet durulayın. , Etanol atın ve hız-amfi üzerine pelet kuru </li><li> Otoklavlanmış GKD 100 ul olmak üzere toplam pelet yeniden süspanse edin <sub&gt; 2 O. , Oligonükleotid konsantrasyonunu ölçmek </li><li> Hemimethylated DNA dubleksler tavlama için, onlara su banyosu içinde yavaş yavaş oda sıcaklığına soğumaya bırakın daha sonra tamamlayıcı tek iplikçikleri ekimolar konsantrasyonları karıştırıp ° C de 5 dakika su banyosunda 95 karışımlarının ısı ve. </li></ol> 3. Protein-DNA Kompleks Oluşumu ve Analizi <ol><li> Saflaştırılmış SeqAΔ eşit hacimde (41-59)-A25 (81 uM) ve hemimethylated DNA (81 uM), Mix </li><li> 4 az 15 dakika ve mağaza için oda sıcaklığında inkübe ° C bunu kullanmaya hazır oluncaya kadar, </li><li> Ticari seyrek matris ekranları kullanarak kristalizasyon koşulları için Ekran, </li><li> İlk kristalizasyon kabloları tespit edildikten sonra, kırınım kalite kristalleri büyümeye koşulları optimize </li><li> Ya da% 25&#39;lik bir nihai konsantrasyona (göre kristallendirme çözeltisi içinde mevcut PEG 400 miktarı artırılarak edilen SeqA-DNA kristaller Cryoprotectv / v) ya da, kristalleşme çözeltisine% 20 gliserol (v / v) eklendikten </li><li> Naylon bir döngü ile bireysel kristaller Scoop, ve sıvı azot içinde onları flaş dondurma, </li><li> 100 K &#39;de her bir kristal bir kırınım limit test </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Hemimethylated GAİK dizileri arasındaki mesafeyi (i); dubleks (ii) uzunluğunda ve (iii): hemimethylated DNA&#39;ya bağlandığı SeqAΔ (41-59)-A25R kristal yapısı elde etmek için, ardışık DNA üzerindeki üç parametre optimize yokluğu / 5 &#39;çıkıntılarının varlığı. Elektro-mobilite kayma deneyleri SeqAΔ (41-59)-A25R tercihen 9-10 baz çifti (Şekil 1) ile ayrılır GAİK tekrarlar bağlandığını göstermektedir. Bu nedenle, başlangıçta uzun 9 ya da 10 bps ile ayrılmış iki hemimethylated GAİK dizileri içeren (bps) dubleksler 23-24 baz çifti gösterildi. Üç dubleksler güzel şekilli kristaller (Şekil 2) vermiştir. Alyüksek çözünürlüklü kırınan kristaller hiçbiri, 23 9 bps GAİK ayrılması kristalizasyon için tercih edildi belirten diğerlerinden daha iyi X-ışınları kırınım 9 baz puan ile ayrılan iki GAİK siteleri ile uzun dubleks bps olsa. Bu nedenle, sonraki tüm ekranlar için 9 bps arası GAİK boşluk giderilmiştir. Birden fazla DNA molekülleri kristal 9 içindeki B-DNA sürekli oluşturmak için baş-kuyruk yığını olabilir çünkü genellikle DNA kristalizasyon tam sarmal dönüşler karşılık dubleks uzunlukları için tercih edilmektedir. Bu nedenle, 21 bps (yani iki sarmal dönüşler) için dubleksler toplam uzunluğu kısalır. Künt uçlu bir 21 bps duplex kırınım kaliteli kristaller (veriler gösterilmemiştir), kristaller verim vermedi her iki ucundaki nükleotid tek bir 5 &#39;çıkıntı ile 21 bps duplex bizim evde kaynağındaki 5 Å için kırınan. Verim almazken Kırınım sınırı üzerinde iyileştirme uçtan uca dubleks dernek gerçekten lehine olduğunu öne sürdüing kristal paketleme. SeqA DNA aynı yüzü üzerinde GAİK dizileri ile etkileşime girer, DNA dubleks bir ters yüz çözücü maruz olmalıdır. Daha da karmaşık ve kristaller iyileştirmek için, daha sonra çift yönlü ters yüz yoluyla kristal içinde bitişik DNA molekülleri ile oluk-omurga etkileşimi teşvik etmek için iki GAİK siteleri arasında bir CG dinükleotid, bir yöntem dahil etmek için çift yönlü dizisini değiştirilmiş Bu son 10 içinde DNA kristalleşme geliştirmek için kullanılmıştır. Bununla birlikte, CG-içeren çift yönlü ile Büyüyen kristallerin kırınım sınırı CG dinükleotid (Şekil 3) içermiyordu benzer bir dupleks DNA ile büyümüş olan ile aynıydı. Bu sonuç oluk omurgası etkileşimleri bu durumda önemli olmadığını belirtti. Bu daha sonra her iki adet ek nükleotid olan bir dubleks DNA ile Büyüyen kristallerin karşılaştırarak çıkmalarla uzunluğu optimize5 &#39;ucu. Bu değişiklik, kristal morfoloji üzerinde önemli bir etkisi olduğu gibi, sınır kırınım ek nükleotid büyük ölçüde moleküler temas ve gelişmiş kristal organizasyon (Şekil 3) değiştiğini göstermektedir. SeqAΔ (41-59)-A25R kristal yapısı DNA&#39;nın çift yönlü ücretsiz yüz kristal arasındaki temaslara olmadığını doğruladı bu son DNA dubleks bağlı olarak bir CG-dinükleotid tanıtılması sınırlı etkisi bekleniyor. Protein ve DNA göreceli büyüklüğüne rağmen, simetri arkadaşları arasındaki en etkileşimleri protein-protein ve protein-DNA etkileşmeleri (Şekil 4) aracılık eder. İlginç bir şekilde, bu özel durumda, bir 5 &#39;çıkıntı dinükleotid yararlı etkisi olan bir sözde-sürekli DNA oluşumuna bağlı değildir. Bunun yerine, 5 &#39;uzak DNA eksenleri gelen metile iplikçik projelerin sonu ve neden iki nükleotidler w açıklayan karmaşık proksimal SeqA molekülü ile etkileşime<html> ere kesinlikle 8,11 ambalaj kristal değiştirmek için gereklidir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4266/4266fig1.jpg" /> Şekil 1. Hemimethylated DNA ile SeqAΔ (41-59)-A25R bağlanması. SeqA bir etki (A) şematik aracılık protein oligomerizasyonun ve DNA bağlayıcı olduğunu. Baz çiftlerinin giderek artan sayıda (ile ayrılmış iki hemimethylated GAİK dizileri içeren DNA&#39;lar ile SeqAΔ (41-59)-A25R (B) Elektroforetik Devingenlik Değişimi Analizi X). En soldaki şerit (Boş etiketli) SeqAΔ yokluğunda (41-59) olarak iki GAİK sekanslar arasında bir ekimolar 5 ile DNA karışımı, 7, 12, 21, 25 ve 34 baz çiftini içermektedir-A25R. (C) Diyagram kırınım kaliteli kristaller elde DNA dubleksler üzerine optimize edilmiş üç değişken tasvir. upload/4266/4266fig2.jpg &quot;fo: content-width =&quot; 6in &quot;fo: src =&quot; / files/ftp_upload/4266/4266fig2highres.jpg &quot;/&gt; Şekil 2. 9 ya da 10 baz çifti ile ayrılmış iki hemimethylated GAİK bölgelerini içeren bir 23-24 bp uzunluğunda dupleksler ile elde kullanılan oligonükleotidler ve kristaller arası mesafe GAİK. Özeti değişen etkisi. Kristallerin Tüm resimler aynı büyütme düzeyinde alınan ve ölçek çubuğu 100 mikron gösterir edildi. Her SeqAΔ ve çözünürlük sınırı (41-59)-A25R-DNA kristal bir RIGAKU RU-300 X-ışını jeneratörü sistemi üzerinde toplanan kırınım görüntüleri dayanmaktadır. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4266/4266fig2large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4266/4266fig3.jpg" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4266/4266fig3highres.jpg" /> Şekil 3,. T DNA değişen etkisi sona erer. Özeti21 baz uzunluğunda dupleksler 9 baz çifti ile ayrılmış iki hemimethylated GAİK siteleri içeren ve 0, 1 ya da 2 nükleotid 5 &#39;ucunu içeren çıkıntılar ile o oligonükleotidler kullanılır ve kristaller elde edilmiştir. Kristallerin Tüm resimler aynı büyütme düzeyinde alınan ve ölçek çubuğu 100 mikron gösterir edildi. Her SeqAΔ ve çözünürlük sınırı (41-59)-A25R-DNA kristal (NSLS, BNL) X12C ve X29 beamlines toplanan kırınım görüntüleri dayanmaktadır. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4266/4266fig3large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/4266/4266fig4.jpg" /> Şekil 4. SeqAΔ Crystal ambalaj (41-59)-A25R dinükleotid çıkıntı ile DNA bağlı: (A) üst ve yan (B) Baktı. Asimetrik birim iki SeqAΔ (41-59)-A25R-DNA, DNA turuncu gösterilen sırasında protein gri gösterilmiştir kompleksleri içerir. SimetrikRy ilgili SeqAΔ (41-59)-A25R-DNA moleküllerinin protein ve DNA sarı için beyaz gösterilmiştir. Bu şekil, PyMOL 12 kullanılarak hazırlanmıştır. Bu rakam Movie 1 ile ilgilidir. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4266/4266fig4large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . Film 1. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4266/4266movie1.avi" target="_blank">filmi görmek için buraya tıklayın</a> .

<ol>
	<li>Campbell, J. L., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E.+coli+oriC+and+the+dnaA+gene+promoter+are+sequestered+from+dam+methyltransferase+following+the+passage+of+the+chromosomal+replication+fork.">E. coli oriC and the dnaA gene promoter are sequestered from dam methyltransferase following the passage of the chromosomal replication fork.</a> Cell. 62, 967-979 (1990).</li><li>Guarn&#233;, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+SeqA-N+filament:+implications+for+DNA+replication+and+chromosome+organization.">Crystal structure of a SeqA-N filament: implications for DNA replication and chromosome organization.</a> Embo. J. 24, 1502-1511 (2005).</li><li>Brendler, T., Austin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+SeqA+protein+to+DNA+requires+interaction+between+two+or+more+complexes+bound+to+separate+hemimethylated+GATC+sequences.">Binding of SeqA protein to DNA requires interaction between two or more complexes bound to separate hemimethylated GATC sequences.</a> Embo. J. 18, 2304-2310 (1999).</li><li>Jordan, S. R., Whitcombe, T. V., Berg, J. M., Pabo, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+variation+in+DNA+length+yields+highly+ordered+repressor-operator+cocrystals.">Systematic variation in DNA length yields highly ordered repressor-operator cocrystals.</a> Science. 230, 1383-1385 (1985).</li><li>Tan, S., Hunziker, Y., Pellegrini, L., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+the+yeast+MATalpha2/MCM1/DNA+ternary+complex:+general+methods+and+principles+for+protein/DNA+cocrystallization.">Crystallization of the yeast MATalpha2/MCM1/DNA ternary complex: general methods and principles for protein/DNA cocrystallization.</a> J. Mol. Biol. 297, 947-959 (2000).</li><li>Rice, P. A., Yang, S., Mizuuchi, K., Nash, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+an+IHF-DNA+complex:+a+protein-induced+DNA+U-turn.">Crystal structure of an IHF-DNA complex: a protein-induced DNA U-turn.</a> Cell. 87, 1295-1306 (1996).</li><li>Yang, W., Steitz, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+site-specific+recombinase+gamma+delta+resolvase+complexed+with+a+34+bp+cleavage+site.">Crystal structure of the site-specific recombinase gamma delta resolvase complexed with a 34 bp cleavage site.</a> Cell. 82, 193-207 (1995).</li><li>Chung, Y. S., Brendler, T., Austin, S., Guarne, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+cooperative+binding+of+SeqA+to+a+tandem+GATC+repeat.">Structural insights into the cooperative binding of SeqA to a tandem GATC repeat.</a> Nucleic Acids Res. , (2009).</li><li>Anderson, J., Ptashne, M., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cocrystals+of+the+DNA-binding+domain+of+phage+434+repressor+and+a+synthetic+phage+434+operator.">Cocrystals of the DNA-binding domain of phage 434 repressor and a synthetic phage 434 operator.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 1307-1311 (1984).</li><li>Timsit, Y., Moras, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+self-fitting:+the+double+helix+directs+the+geometry+of+its+supramolecular+assembly.">DNA self-fitting: the double helix directs the geometry of its supramolecular assembly.</a> Embo J. 13, 2737-2746 (1994).</li><li>Chung, Y. S., Guarne, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+X-ray+diffraction+analysis+of+SeqA+bound+to+a+pair+of+hemimethylated+GATC+sites.">Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of SeqA bound to a pair of hemimethylated GATC sites.</a> Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 64, 567-571 (2008).</li><li>DeLano, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The PyMOL Molecular Graphic Systems. , (2002).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Makromoleküler X-ışını kristalografisi en büyük zorluklardan biri difraksiyon kaliteli kristaller elde edilir. Protein veya protein-DNA kompleksleri halinde, bu sorun optimize edilmesi gerekmektedir ilave değişkenlere bağlı olarak daha da artmaktadır. Bu yaygın DNA uzunluğu ve yapışkan çıkıntılar varlığında daha uzun bir yarı-ana dubleks parametrelerini optimize etmek için olan komşu DNA moleküllerinin ilişki artırmak için düşünülmektedir. Bununla birlikte, bu çıkıntılar doğası ve...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog # </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> TRIS </td><td> Bioshop </td><td> TRS003.5 </td><td></td></tr><tr><td> Etilendiamintetraasetik asit (EDTA) </td><td> Fisher Scientific </td><td> E478-500 </td><td></td></tr><tr><td> Dithiotheitrol (DTT) </td><td> Bio Basic Inc </td><td> DB0058 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Bioshop </td><td> SOD002.10 </td><td></td></tr><tr><td> Gliserin </td><td> Caledon </td><td> 5350-1 </td><td></td></tr><tr><td> Sakaroz </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5016-500G </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum dodesil sülfat (SDS) </td><td> Bioshop </td><td> SDS001.500 </td><td></td></tr><tr><td> Üre </td><td> Bioshop </td><td> URE001.5 </td><td></td></tr><tr><td> 40% 29:1 Bis / akrilamit </td><td> Bio Basic Inc </td><td> A0007-500ml </td><td> 4 ° C&#39;de saklayın </td></tr><tr><td> Asit borik </td><td> EMD </td><td> BX0865-1 </td><td></td></tr><tr><td> Ksilen cyanol FF </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0423 </td><td></td></tr><tr><td> Bromophenol Mavi </td><td> Bioshop </td><td> BR0222 </td><td></td></tr><tr><td> Çift Ayarlanabilir Dikey Jel Sistemi </td><td> CBC Bilimsel Company Inc </td><td> DASG-250 </td><td></td></tr><tr><td> Endeks kristalizasyon ekranı </td><td> Hampton Araştırma </td><td> HR2-144 </td><td> 4 ° C&#39;de saklayın </td></tr><tr><td> Sihirbazı Ben kristalizasyon ekranı </td><td> Zümrüt BioSystems </td><td> EBS-WIZ-1 </td><td> 4 ° C&#39;de saklayın </td></tr><tr><td> Wizard II kristalizasyon ekranı </td><td&gt; Zümrüt BioSystems </td><td> EBS-WIZ-2 </td><td> 4 ° C&#39;de saklayın </td></tr><tr><td> Klasikler kristalizasyon ekranı </td><td> Qiagen </td><td> 130701 </td><td> 4 ° C&#39;de saklayın </td></tr><tr><td> Intelliplate tepsileri </td><td> Sanat Robbins Aletleri </td><td> 102-0001-00 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Çözümler Protein saflaştırma tamponu: 100 mM Tris pH 8, 2 mM EDTA, 2 mM DTT,% 5 gliserol. Protein saklama tamponu: 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl, 5 mM DTT, 0.5 mM EDTA,% 5 gliserol. Jel yükleme karışımı: otoklavlanmış GKD 2 O. 70 ml kadar sakaroz ve 20 g, bromofenol mavi 25 mg, ksilen cyanol FF 25 mg,% 10 w / v SDS, 1 ml ve 10X TBE 10 ml Sukroz eriyene kadar hafif ısıtma ile karıştırın ve nihai ayarlayınhacmi 100 otoklavlanmış GKD 2 O. ml 4 ° C&#39;de depolayın 2X yükleme tamponu: jel yükleme karışımı 10 ml üre, 11 g ekleyin. Üre eriyinceye kadar sıcak tabakta karıştırın. 4 az 2 ml tüpler ve mağaza kısım ° C. 10X PAGE karışımı: Karışım üre 420,4 g, 10X TBE 100 ml (otoklavlanmış),% 40, 250 ml 29:1 GKD 2 O. Bis / akrilamid Tamamen çözülene kadar karıştırın ve 1 litrelik hacim ayarlayın. 4 ° C&#39;de karanlıkta şişelerde saklayın 10X TBE: eritilir 108 g TRIS, GKD 2 O. 1 litre borik asit ve 55 g EDTA ve 9.3 g Otoklav oda sıcaklığında depolanır. Elüsyon tamponu: GKD 2 O. 200 ml 5 M NaCI, 1 M Tris, pH 7.5, 0.5 M EDTA, pH 8, 0,4 ml, 2 ml seyreltik 8 ml Otoklav oda sıcaklığında depolanır. </td></tr></tbody></table&gt;

iterative optimization of dna duplexes for crystallization of seqa-dna complexes

Escherichia coli SeqA çoğaltma 1 kökeni olan iyon hemimethylated GAİK kümelere göre prematüre reinitiation olayları önler DNA replikasyonunun negatif düzenleyicisidir. Kökeni ötesinde, SeqA çoğaltma çatal, daha yüksek sıralı yapılarına yeni çoğaltılmış DNA düzenlemektedir 2 de bulunur. SeqA ortakları yalnızca zayıf tek GAİK dizilerine sahip, ancak birden çok GAİK siteleri içeren DNA dubleksler yüksek afinite kompleksleri oluşturur. SeqA arasında en az işlevsel ve yapısal birim böylece hemimethylated DNA 3 ile yüksek afiniteli kompleks oluşumu için en az iki GAİK dizileri ihtiyacını açıklayan bir dimer. Ayrıca, oligomerizasyonun ve esnek bir bağlayıcı ile ayrılmış DNA-bağlayıcı etki ile SeqA mimarisi, üç helisel tur kadar ayrılmış GAİK tekrarlar için bağlayıcı sağlar. Bu nedenle, bir moleküler düzeyde SeqA fonksiyonu anlama yapısal ana gerektirirSeqA parçalanma birden GAİK dizileri bağlanmıştır. Protein-DNA kristalizasyon DNA, protein ve DNA göreceli boyutları ve mimariye bağlı olarak ambalaj etkileşimleri üzerinde olağanüstü bir etkisi yok olabilir. Protein veya DNA izleri, DNA&#39;nın çoğu daha büyük ise, kristal paketleme öncelikle protein-protein etkileşimleri aracılığı ile ortaya çıkmaktadır. Tersine, protein DNA ile aynı büyüklükte veya daha az olduğu veya sadece DNA, DNA-DNA, DNA-protein etkileşimlerinin bir kısmını kapsayan zaman kristal paketleme hakim. Bu nedenle, protein-DNA kompleksleri kristalleşme DNA uzunluğu 4 ile DNA uçları (küt çıkıntı veya) 5-7 sistematik olarak tarama gerektirir. Bu yazıda, tasarımı optimize, arındırmak ve yapı tayini için uygundur kristaller elde SeqA bir dimerik varyantı (SeqAΔ (41-59)-A25R) ile kompleks içinde tandem GAİK tekrarlar içeren hemimethylated DNA dubleksler kristalize nasıl açıklar.

Watch this Scientific Journal Video about Iterative Optimization of DNA Duplexes for Crystallization of SeqA-DNA Complexes at JoVE.com

Iterative Optimization of DNA Duplexes for Crystallization of SeqA-DNA Complexes

Protein-DNA kompleksleri Kristal yapısı, protein işlevi, etki mekanizması, aynı zamanda, belirli bir etkileşimin doğasını ilişkin bilgi sağlayabilir. Burada ile birlikte kristalleşme için uzunluk, sekans ve dupleks DNA uçları optimize etmek için rapor<em&gt; Escherichia coli</em&gt; SeqA, çoğaltma inisiyasyon negatif regülatörü.

SeqA-DNA kompleksleri kristalleşmesi için DNA dupleksler optimizasyonu İteratif

Escherichia coli SeqA is a negative regulator of DNA replication that prevents premature reinitiation events by sequestering hemimethylated GATC clusters ...

iterative-optimization-dna-duplexes-for-crystallization-seqa-dna

Research

JoVE Journal

Biology

9.9K Görüntüleme.  McMaster University. Protein-DNA kompleksleri Kristal yapısı, protein işlevi, etki mekanizması, aynı zamanda, belirli bir etkileşimin doğasını ilişkin bilgi sağlayabilir. Burada ile birlikte kristalleşme için uzunluk, sekans ve dupleks DNA uçları optimize etmek için rapor Escherichia coli SeqA, çoğaltma inisiyasyon negatif regülatörü.

Video: Iterative Optimization of DNA Duplexes for Crystallization of SeqA-DNA Complexes

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The availability of atomic resolution structures provides a deep and unique understanding of protein function, and helps to unravel the inner workings of the living cell. To date, 86% of the Protein Data Bank (rcsb-PDB) entries are macromolecular structures that were determined using X-ray crystallography.
To obtain crystals suitable for crystallographic studies, the macromolecule (e.g. protein, nucleic acid, protein-protein complex or protein-nucleic acid complex) must be purified to homogeneity, or as close as possible to homogeneity. The homogeneity of the preparation is a key factor in obtaining crystals that diffract to high resolution (Bergfors, 1999; McPherson, 1999).
Crystallization requires bringing the macromolecule to supersaturation. The sample should therefore be concentrated to the highest possible concentration without causing aggregation or precipitation of the macromolecule (usually 2-50 mg/ mL). Introducing the sample to precipitating agent can promote the nucleation of protein crystals in the solution, which can result in large three-dimensional crystals growing from the solution. There are two main techniques to obtain crystals: vapor diffusion and batch crystallization. In vapor diffusion, a drop containing a mixture of precipitant and protein solutions is sealed in a chamber with pure precipitant. Water vapor then diffuses out of the drop until the osmolarity of the drop and the precipitant are equal (Figure 1A). The dehydration of the drop causes a slow concentration of both protein and precipitant until equilibrium is achieved, ideally in the crystal nucleation zone of the phase diagram. The batch method relies on bringing the protein directly into the nucleation zone by mixing protein with the appropriate amount of precipitant (Figure 1B). This method is usually performed under a paraffin/mineral oil mixture to prevent the diffusion of water out of the drop.
Here we will demonstrate two kinds of experimental setup for vapor diffusion, hanging drop and sitting drop, in addition to batch crystallization under oil.

The 3-D structure of a molecule provides a unique understanding of how the molecule functions. The principal method for structure determination at near-atomic resolution is X-ray crystallography. Here, we demonstrate the current methods for obtaining three-dimensional crystals of any given macromolecule that are suitable for structure determination by X-ray crystallography.

X-ray Kristalografi Protein Kristalizasyon

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

Biyoloji

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

Lipidik Mesophases Membran Proteinleri Kristallendirilmesi

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

Yüksek verim Kristalizasyon lipidik Bicelle Yöntemiyle Membran Proteinleri

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

Lipidik Mesophases Membran Proteinleri Yüksek throughput Kristalizasyon için bir robot kullanımı

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short period of time. However, this technology is only just beginning to be applied to large-scale production as many technological obstacles to scale up are now being overcome. Here, we demonstrate a simple and reproducible method for industrial-scale transient protein production based on vacuum infiltration of Nicotiana plants with Agrobacteria carrying launch vectors. Optimization of Agrobacterium cultivation in AB medium allows direct dilution of the bacterial culture in Milli-Q water, simplifying the infiltration process. Among three tested species of Nicotiana, N. excelsiana (N. benthamiana &#215; N. excelsior) was selected as the most promising host due to the ease of infiltration, high level of reporter protein production, and about two-fold higher biomass production under controlled environmental conditions. Induction of Agrobacterium harboring pBID4-GFP (Tobacco mosaic virus-based) using chemicals such as acetosyringone and monosaccharide had no effect on the protein production level. Infiltrating plant under 50 to 100 mbar for 30 or 60 sec resulted in about 95% infiltration of plant leaf tissues. Infiltration with Agrobacterium laboratory strain GV3101 showed the highest protein production compared to Agrobacteria laboratory strains LBA4404 and C58C1 and wild-type Agrobacteria strains at6, at10, at77 and A4. Co-expression of a viral RNA silencing suppressor, p23 or p19, in N. benthamiana resulted in earlier accumulation and increased production (15-25%) of target protein (influenza virus hemagglutinin).

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Transient protein production in Nicotiana plants based on vacuum infiltration with Agrobacteria carrying launch vectors (Tobacco mosaic virus-based) is a rapid and economic approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins. We simplified the procedure and improved target accumulation by optimizing conditions of bacteria cultivation, selecting host species, and co-introducing RNA silencing suppressors.

Optimizasyon ve Kullanımı<em&gt; Agrobacterium</emIn&gt; aracılı Geçici Protein Üretimi<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) micro/nano-indentations, for a JPK&#160;AFM. Specifically, in this protocol we measure the apparent Young&#8217;s modulus of cell walls at subcellular resolutions across regions of up to 100 &#181;m&#160;x 100 &#181;m in floral meristems, hypocotyls, and roots. This requires careful preparation of the sample, the correct selection of micro-indenters and indentation depths. To account for cell wall properties only, measurements are performed in highly concentrated solutions of mannitol in order to plasmolyze the cells and thus remove the contribution of cell turgor pressure.
In contrast to other extant techniques, by using different indenters and indentation depths, this method allows simultaneous multiscale measurements, i.e. at subcellular resolutions and across hundreds of cells comprising a tissue. This means that it is now possible&#160;to spatially-temporally characterize the changes that take place in the mechanical properties of cell walls during development, enabling these changes to be correlated with growth and differentiation. This represents a key step to understand how coordinated microscopic cellular changes bring about macroscopic morphogenetic events.
However, several limitations remain: the method can only be used on fairly small samples (around 100 &#181;m in diameter) and only on external tissues; the method is sensitive to tissue topography; it measures only certain aspects of the tissue&#8217;s complex mechanical properties. The technique is being developed rapidly and it is likely that most of these limitations will be resolved in the near future.

We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.

Hücre Duvarları Elastik Özelliklerinin AFM-tabanlı Haritalama: doku, hücresel ve Subselüler Çözünürlüklerde

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

Oranlı metrik Bimoleküler Fenerleri kullanma Yaşam Hücrelerde Tek Engineered RNA Transkriptlerinin Gerçek zamanlı Görüntüleme

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes

INO80 chromatin remodeling complexes regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Human INO80 complexes consist of 14 protein subunits including Ino80, a SNF2-like ATPase, which serves both as the catalytic subunit and the scaffold for assembly of the complexes. Functions of the other subunits and the mechanisms by which they contribute to the INO80 complex&#39;s chromatin remodeling activity remain poorly understood, in part due to the challenge of generating INO80 subassemblies in human cells or heterologous expression systems. This JOVE protocol describes a procedure that allows purification of human INO80 chromatin remodeling subcomplexes that are lacking a subunit or a subset of subunits. N-terminally FLAG epitope tagged Ino80 cDNA are stably introduced into human embryonic kidney (HEK) 293 cell lines using Flp-mediated recombination. In the event that a subset of subunits of the INO80 complex is to be deleted, one expresses instead mutant Ino80 proteins that lack the platform needed for assembly of those subunits. In the event an individual subunit is to be depleted, one transfects siRNAs targeting this subunit into an HEK 293 cell line stably expressing FLAG tagged Ino80 ATPase. Nuclear extracts are prepared, and FLAG immunoprecipitation is performed to enrich protein fractions containing Ino80 derivatives. The compositions of purified INO80 subcomplexes can then be analyzed using methods such as immunoblotting, silver staining, and mass spectrometry. The INO80 and INO80 subcomplexes generated according to this protocol can be further analyzed using various biochemical assays, which are described in the accompanying JOVE protocol. The methods described here can be adapted for studies of the structural and functional properties of any mammalian multi-subunit chromatin remodeling and modifying complexes.

This protocol describes a procedure for generating and purifying wild type and mutant versions of the human INO80 chromatin remodeling complex. Epitope tagged versions of INO80 subunits are stably expressed in HEK293 cells, and complete complexes and complexes lacking specific sets of subunits are purified by immunoaffinity chromatography.

Nesil ve İnsan INO80 Kromatin Yaptırma Kompleksleri ve subcomplexes saflaştırılması

INO80 chromatin remodeling complexes regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Human INO80 ...

Efficient Mammalian Cell Expression and Single-step Purification of Extracellular Glycoproteins for Crystallization

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time and cost efficient protocol for secreted protein expression in mammalian cells and one step purification using nickel affinity chromatography. The system is based on large scale transient transfection of mammalian cells in suspension, which greatly decreases the time to produce protein, as it eliminates steps, such as developing expression viruses or generating stable expressing cell lines. This protocol utilizes cheap transfection agents, which can be easily made by simple chemical modification, or moderately priced transfection agents, which increase yield through increased transfection efficiency and decreased cytotoxicity. Careful monitoring and maintaining of media glucose levels increases protein yield. Controlling the maturation of native glycans at the expression step increases the final yield of properly folded and functional mammalian proteins, which are ideal properties to pursue X-ray crystallography. In some cases, single step purification produces protein of sufficient purity for crystallization, which is demonstrated here as an example case.

This is a quick, cost-efficient protocol for the production of secreted, glycosylated mammalian proteins and subsequent single-step purification with sufficient yields of homogenous protein for X-ray crystallography and other biophysical studies.

Verimli memeli hücre ekspresyon ve Kristalizasyon için hücre dışı Glikoproteinlerin Tek aşamalı saflaştırma

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Retroviral Entegrasyon Siteleri Amplifikasyon, Yeni Nesil Sıralama ve Genomik DNA Haritalama

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...