Protokol, ATP'ye bağımlı kromatin remodeling proteinlerinin neden olduğu DNA'nın ikinci yeniden yapılanmasındaki değişiklikleri görselleştirmemizi sağlar. DNA yapısındaki değişiklik transkripsiyon yönetmeliği ile ilişkilendirilebilir. Bu, oligonükleotiddeki yapısal değişiklikleri kaydetmek için çok az miktarda saf DNA kullanan kolay ve son derece hassas bir tekniktir.
Bu yöntem, ATP'ye bağımlı kromatin remodeling proteinlerinin aracılık ettiği transkripsiyon regülasyonu hakkında fikir verebilir. Başlamak için, tamponların ve diğer reaksiyon bileşenlerinin çalışma konsantrasyonlarını taze hazırlayın ve reaksiyonları ayarlamadan önce dört santigrat derecede tutun, ardından NADH bağlantılı oksidasyon testi kullanarak farklı DNA moleküllerinin varlığında proteinin ATPase aktivitesini ölçün. 0,1 milimolar ADAAD, iki milimolar ATP, 10 nanomolar DNA ve 1X REG tamponu 96 kuyulu bir plakada 250 mikrolitrelik son hacme karıştırın.
Ardından, reaksiyonu 37 santigrat derecelik bir inkübatörde 30 dakika kuluçkaya bırakın, ardından mikro plaka okuyucu ile birlikte sağlanan yazılımı kullanarak NAD + miktarını ölçün. Emiciliği 340 nanometre olarak ölçmek için NADH testine tıklayın ve 96 kuyu plakasını enstrümandaki plaka tutucusuna yerleştirin, ardından emiciliği kaydetmek için okuma plakası düğmesine tıklayın. CD spektrumunu yüksek saydamlıklı kuvars cuvettes'te toplayın.
Dikdörtgen veya silindirik cuvettes kullanın. Cuvettes temizlemek için, birkaç kez su ile yıkayın, sonra temiz olup olmadığını kontrol etmek için cuvette su veya tampon tarama alın. Reaksiyonlar için PAGE saflaştırılmış DNA oligonükleotidleri kullanın.
Hızlı soğutma için, DNA'yı ısıtma bloğunda üç dakika boyunca 94 santigrat derecede ısıtın ve hemen buzda soğutun. Yavaş bir soğutma için, DNA'yı üç dakika boyunca 94 santigrat derecede ısıtarak oda sıcaklığına dakika başına bir santigrat derece soğumasını bekleyin. Taban çizgisi spektrumunu kaydetmek için, 1,5 mililitre santrifüj tüpünde birer birer toplam beş kontrol reaksiyonunu ayarlayın.
Reaksiyon hacmini tüm reaksiyonlarda 300 mikrolitrede tutun. CD spektrumunu kaydetmek için, 1,5 mililitre santrifüj tüpünde birer birer toplam beş deneysel reaksiyon ayarlayın. Taramayı kaydetmek için gazı açın ve CD spektrometresini açın.
10 ila 15 dakika sonra lambayı kapatın, su banyoyu kapatın ve tutucu sıcaklığını 37 santigrat dereceye ayarlayın. Ardından, CD spektrum yazılımını açın ve sıcaklığı 37 santigrat dereceye, dalga boyu aralığını 180 ila 300 nanometreye, nokta başına süreyi 0,5 saniyeye ve tarama numarasını beşe ayarlayın, ardından pro veri görüntüleyiciye tıklayın, yeni bir dosya yapın ve deneyin ayrıntıları ve tarihle yeniden adlandırın. Daha sonra, taban çizgisini ve deneysel reaksiyonları pipetleme ile karıştırın ve reaksiyon karışımlarını tek tek cuvette'e dikkatlice aktarın, böylece hava kabarcıkları olmamasını sağlayın.
Bir zaman kursu deneyi yapıyorsanız, reaksiyonları gerekli süre boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın, ardından taramayı yapın. ATP hidrolizi durdurmak için DNA, ATP, magnezyum ve protein içeren tampona EDTA ekleyin. ATPase aktivitesini tamamen engellemek için EDTA konsantrasyonunu ve kuluçka süresini artırın.
Yazılımdaki karşılık gelen reaksiyonlardan taban çizgilerini çıkarın ve CD spektrum yazılımındaki veya veri çizim yazılımındaki verileri yumuşatın, ardından ortalama kalıntı eliptikliğine karşı bir dalga boyu grafiği çizin ve zirveleri analiz edin. M-kıvrımları, MYC DNA'sının her iki ipliğinin de kök halka benzeri bir yapı oluşturabileceğini gösterdi. İlerinin M-kat yapıları ve G dörtgen GECE'yi içeren ters DNA dizisi burada gösterilmiştir.
ATP ve ADAAD'ın yokluğunda ve varlığında hızlı soğutulmuş GECE'nin CD spektrumu, ADAAD'ın biri 258 nanometrede, diğeri 210 nanometrede olmak üzere iki pozitif zirveye neden olduğunu gösterdi. EDTA'nın eklenmesi bu konformasyonsal değişimi bozmaktadır. CD spektrumları artık negatif 210 nanometre zirvesine ve 230 ve 250 nanometrede zirveleri olan geniş bir pozitif banda sahiptir.
QGRS haritalayıcı ve M-fold analizi, DROSHA, DGCR8 ve DICER'in promotör bölgelerinin G dörtgeni ve kök benzeri yapılar oluşturma potansiyeline sahip olduğunu gösterdi. DROSHA çift beş'in CD spektrumu, ADAAD'ın 210 nanometrede negatif bir zirveye ve 260 nanometrede pozitif bir zirveye neden olduğunu gösterdi. Bu spektrum ADNA'nın bir özelliğidir.
DGCR8 pair one'ın CD spektrumu 210 nanometrede pozitif bir zirve ve 260 nanometrede geniş bir negatif zirve gösterdi. Bu spektrum B'den X'e geçişin karakteristiğidir. DGCR8 çifti yedi için 210 ve 270 nanometrede güçlü pozitif zirveler ve 250 nanometrede negatif zirve görüldü.
Bu spektrum paralel G dörtgen DNA yapılarının karakteristiğidir. Son olarak, Dicer çifti için biri 210 nanometrede pozitif zirve ve biri 230 nanometrede diğeri 260 nanometrede olmak üzere iki negatif zirve gözlendi. Bu tepeler A'dan X'e DNA geçişinin karakteristiğidir.
DNA ve protein saflığının% 99 veya daha fazla olduğundan emin olun. Cuvette temiz olmalı ve taban çizgisi bir milidegreden az olmalıdır. Tüm reaktifler saf olmalıdır, böylece arka plan bir milidegreden azdır.
