저자는 DNA 정화와 관련하여 도움이 데이터 수집 및 모니카 Pillon 동안 도움을 NSLS (브룩 헤이븐 국립 연구소)에서 PXRR 직원을 감사하고 싶습니다. 이 작품은 건강 연구의 캐나다 연구소 (걸레 67189)에 의해 지원되었다.

1. 단백질 정제 연결 유연 링커 N-(oligomerization)와 C-터미널 (DNA 바인딩) SeqA 에이즈 DNA에 1-3 회전으로 ​​구분 hemimethylated GATC 반복의 인식 도메인입니다. 본 연구의 경우, 우리는 더 oligomerization과에 의해 독점적으로 구분 직렬 GATC에게 구속력 DNA 반복을 제한 단축 링커을 방지 N-터미널 도메인의 점 돌연변이로 SeqA의 dimeric 변종 (SeqAΔ (41-59) A25R)를 사용 DNA 하나 턴 (그림 1) 2,8. <ol><li> T7 프로모터의 제어 아래에있는 플라스미드 인코딩 SeqA와 BL21 (DE3) 세포를 변환, </li><li> 판 100 μg / ML 암피실린 등의 LB-한천 플레이트의 변환 반응 </li><li> 소규모 밤 문화를 예방하기 위해 혼합 식민지를 선택 (LB 미디어를 100 μg / ML 암피실린과) </li><li> 다음날 아침은 overni의 1:100 희석을 사용하여 미디어 1 L의 예방ght 문화, </li><li> ~ 0.7의 OD 600 세포를 성장, 1 mm의 최종 농도에 이소 프로필 β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)의 추가에 의해 단백질 생산을 유도, </li><li> , 궤도는 떨고으로 37 ° C에서 3 시간에 부화를 계속하고 원심 분리 (3,300그램 10 분)하여 세포를 수확 </li><li> 정화 버퍼에있는 셀 펠렛을 Resuspend하고 sonication에 의해 lyse, </li><li> 원심 분리 (39,000그램에서 40 분)에 의해 lysate를 지우고 정화 버퍼와 equilibrated 헤파린 열로 표면에 뜨는로드, </li><li> Elute SeqA는 1 M NaCl (~ 0.7 M NaCl에서 SeqA elutes)에 선형 그라디언트를 사용하여 </li><li> 함께 수영장 SeqA 함유 분수를 정화 버퍼와 equilibrated 양이온 교환 크로마토 그래피 칼럼으로 이온 샘플의 강도와 하중을 낮출 희석, </li><li> 선형 소금 그라디언트를 사용하여 순수한 SeqA은 ~ 0.4 M NaCl에서 elutes </li><li> 함께 수영장 SeqA 함유 분수를 concentrat전자 (3 MG / ML) 및 스토리지 버퍼에 저장. </li></ol> 2. DNA의 정제 <ol><li> 좋아하는 회사의 주문 보완 unmethylated과 methylated oligonucleotides, </li><li> , autoclaved ddH 2 O, 소용돌이 800 μl의 각 동결 건조 된 단일 스트랜드 DNA의 1 μmol를 해산하고 10-20 분 동안 앉아 보자 </li><li> 각 oligonucleotide에 preheated 2X 로딩 버퍼 800 μl를 추가 </li><li> 20-30 세포핵 긴 oligonucleotides를 들어, 대형 10% denaturing 젤 (160 x 250 크기 × 1 ㎜) 준비 : * 잘 10 % PAGE 믹스, 80 μl TEMED와 젤 당 800 μl 암모늄 persulfate의 80 ML을 섞어서 부어, * 일단 polymerized, 빗을 제거하고 ddH 2 O 철저으로 우물을 헹굼 * 냉각 판 등의 겔 캐스트에 젤을 조립하고 (​​1X TBE) 버퍼를 실행으로 상단과 하단 저수지를 작성, * 55 ° C에 젤을 따뜻하게 700-750 V에 젤을 미리 실행 * 실행을 중지하고 우물 thoro 씻어ughly 버퍼를 실행으로. </li><li> 90 oligonucleotides를 가열 ° C를 2 분 동안 </li><li> 소용돌이와 샘플을 스핀 즉시 젤을로드하기 전에, </li><li> ~ 700 V에서 젤을 실행하여 oligonucleotide 중간 마이그레이션되면 그만 해요. (10 % polyacrylamide 젤에서 bromophenol 파란색 ~ 60 염기 길이와 ~ 20 염기 길이 크실렌 cyanol FF oligonucleotides와 공동 마이그레이션합니다) </li><li> 젤 중지, 젤 상자에서 분해하고 스페이서를 제거 </li><li> 평평한 표면에 하나의 유리 플레이트를 제거하고 랩으로 젤을 커버 </li><li> , 젤을 돌려서 다른 유리 플레이트를 제거하고 랩으로 커버 </li><li> , DNA의 그림자를 볼 수 젤 뒤에 UV 빛과 형광 플레이트를 사용하여 밴드를 선택 </li><li> 작은 조각으로 면도날로 밴드를 잘라 멸균 15 ML 튜브에 넣어 전송 </li><li> 용출 버퍼 9 ML을 추가하고 교반으로 37 ° C에서 하룻밤 elute, </li><li> 조심스럽게 솔루션을 전송전송 아크릴 아미드의 조각을 방지하고 pH를 7 3 M의 아세트산 나트륨 (1시 10분 희석) 1 ML 플러스 차가운 100 % 에탄올 (2.5 권)의 25 ML을 추가하려면 젤 로딩 피펫 팁을 사용하여 autoclaved 원심 분리기 튜브까지, </li><li> 적어도 3 시간에 -20 ° C에서 알을 품다, </li><li> , 스핀 다운, 별도의 튜브로 표면에 뜨는 전송 </li><li> 중간 불로 속도-VAC에서 펠렛을 건조, </li><li> autoclaved ddH 2 O 400 μl의 펠렛을 Resuspend하고 신선한 튜브로 전송, </li><li> 산도 7 3 M의 아세트산 나트륨 및 100 % 에탄올 1 ML의 40 μl 추가, 잘 혼합 (소용돌이)와 실온에서 30 분 배양는 -20에서 30 분 ° C, 다음 </li><li> 18,000그램 15 분 동안 회전하고 표면에 뜨는을 취소, </li><li> 18,000그램의 6 분의 펠릿과 스핀에서 잔류 소금을 제거 70 % 감기에 에탄올 100 μl로 펠릿을 씻어. , 에탄올을 무시하고 속도 VAC에서 펠릿 건조 </li><li> autoclaved ddH 100 μl의 총 펠릿을 Resuspend <sub&gt; 2 O. , oligonucleotide의 농도를 측정 </li><li> hemimethylated DNA의 duplexes을 단련하기 위해 그들에게 물을 욕조 안에 실내 온도로 서서히 냉각 해 다음 보완 한 가닥 몰 농도를 혼합 ° C 5 분을위한 물 목욕에 95 혼합물을 가열합니다. </li></ol> 3. 단백질 DNA 복합체 형성과 분석 <ol><li> 정화 SeqAΔ의 동등한 볼륨 (41-59) - 대답 25 (81 μM)와 hemimethylated DNA (81 μM)을 혼합 </li><li> 4에 15 분 및 매장 동안 실온에서 배양 ° C 당신은을 사용 할 준비가 될 때까지, </li><li> 상업 스파 스 매트릭스 스크린을 사용하여 결정화 조건 스크린, </li><li> 초기 결정화 리드가 확인 된 후, 회절 품질 결정을 성장 조건을 최적화 </li><li> 중 25 % 최종 농도 (로 결정 솔루션에 PEG 400 현재의 양을 증가하여 발생하는 SeqA-DNA의 결정을 CryoprotectV / V) 또는 결정화 솔루션에 20 % 글리세롤 (V / V)를 추가 </li><li> 나일론 루프와 개인의 결정을 퍼 담아 액체 질소에서 그들을 플래시 동결, </li><li> 100 K. 각 크리스탈의 회절 한계를 테스트 </li></ol> 4. 대표 결과 hemimethylated GATC 서열 사이의 분리 (I), 이중의 (II) 길이하며, (iii) : hemimethylated DNA에 바인딩 SeqAΔ (41-59) A25R의 결정 구조를 얻으려면, 우리는 연속적으로 DNA에 세 매개 변수를 최적화 부재 / 5 &#39;overhangs의 존재. 전기 이동성 교대 assays는 SeqAΔ (41-59) - A25R은 우선적으로 9-10 기본 쌍 (그림 1)로 구분 GATC 반복 바인딩을 나타냅니다. 따라서, 우리는 처음에 긴 9 또는 10 bps에 의해 두 개의 hemimethylated GATC 시퀀스를 포함하는 (bps) duplexes에게 23-24 기본 쌍 검사를 실시했습니다. 세 duplexes가 잘 모양의 크리스털을 (그림 2) 굴복. 알높은 해상도 diffracted 결정 중 어느 것도, 23 9 bps의 GATC 분리가 결정에 대한 선호 것을 나타내는 나머지보다 더 X-선 diffracted 9 bps로 구분하여 두 GATC 사이트와 긴 양면을 bps하지 찬사를 보냅니다. 따라서 이후의 모든 화면 9 bps로 간 GATC 간격을 고정. 여러 DNA 분자가 결정 구에서 B-DNA 연속을 형성하기 위해 머리 - 투 - 꼬리를 쌓을 수 있기 때문에 일반적으로 DNA의 결정은 정확한 나선형 회전에 대응하는 이중 길이에 대한 선호된다. 따라서, 우리는 21 bps (즉,이 나선형 회전)에 duplexes의 전체 길이를 단축. 무딘 끝으로 21 bps 복층 아파트 회절 품질 결정 (데이터가 게재되지 않음), 크리스털를 얻을 수 않았습니다 양쪽 끝에서 염기 하나 5 &#39;오버행과 21 bps 이중 우리의 가정 원본에있는 5로 diffracted.를 얻을 수 없습니다 않았지만 회절 한계에 개선 엔드 - 투 - 엔드 이중 협회가 실제로 선호 것을 제안ING 크리스탈 포장. SeqA는 DNA의 동일한 얼굴에있는 GATC 서열과 상호 작용 때문에, DNA의 이중의 반대 얼굴은 용매에 노출되어야합니다. 더 복잡한의 결정을 개선하기 위해, 우리는 다음 이중의 반대 얼굴을 통해 크리스탈에 인접한 DNA 분자와 그루브 - 백본 상호 작용을 촉진하는 두 GATC 사이트 간의 CG의 다이 뉴클레오타이드, 방법을 포함하도록 이중의 순서를 수정 그는 지난 10 DNA의 결정을 향상하는 데 사용되었습니다. 그러나, CG - 포함 이중으로 성장 결정의 회절 제한이 CG의 다이 뉴클레오타이드 (그림 3)을 포함하지 않은 비슷한 DNA의 이중과 함께 성장 동일했다. 이 결과는 그루브 - 백본 상호 작용이 경우에 중요하지이라고 지적했다. 우리는 이후 각에 두 개의 추가 세포핵을 가진 DNA의 이중과 재배 결정을 비교하여 overhangs의 길이를 최적화5 &#39;끝. 이 변경 사항은 수정 형태에 큰 영향을 미쳤다뿐만 아니라, 회절 한계는 추가 염기가 극적으로 분자 연락처 및 강화 크리스탈 조직 (그림 3) 변경을 나타냅니다. SeqAΔ (41-59) - A25R의 결정 구조는 DNA의 이중의 자유로운 얼굴 크리스탈 주소록에 관여하지 않는 것으로 확인이 마지막 DNA의 이중에 바인딩 같은 CG-다이 뉴클레오타이드를 도입의 제한된 효과 기대. 단백질과 DNA의 상대적인 크기에도 불구하고, 대칭 친구 사이의 대부분의 상호 작용은 단백질 단백질과 단백질 DNA 상호 작용 (그림 4)에 의해 중재됩니다. 흥미롭게도,이 특정 경우에, 5 &#39;다이 뉴클레오타이드의 오버행의 유익한 효과는 의사 연속 DNA의 형성으로 인해하지 않습니다. 대신 5 &#39;거리 DNA 축에서 methylated 스트랜드 프로젝트의 끝과 왜 두 세포핵에게 w를 설명, 단지의 근위 SeqA 분자와 상호 작용<html> 오히려 엄격하게 8,11 포장 크리스탈을 변경해야합니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4266/4266fig1.jpg" /> 1 그림. hemimethylated DNA에 SeqAΔ (41-59) - A25R의 바인딩. SeqA의 도메인 (A) 개략도 중재 단백질 oligomerization과 DNA 바인딩이. 기본 쌍의 증가 (을 사이에두고 두 개의 hemimethylated GATC 서열을 포함하는 DNAs과 SeqAΔ (41-59) A25R의 (B) 전기 영동 이동 분석 X). 가장 왼쪽 차선은 (공백 표시) SeqAΔ의 부재 (41-59)의 두 GATC 시퀀스 사이의 몰 5 DNAs의 혼합물, 7, 12, 21, 25, 34 기본 쌍을 포함 - A25R. (C) 다이어그램 회절 품질 결정을 얻기 위해 DNA의 duplexes에 최적화 된 세 가지 변수를 묘사. upload/4266/4266fig2.jpg &quot;강한 : 콘텐츠 폭 =&quot;6in &quot;강한 : SRC =&quot;/ files/ftp_upload/4266/4266fig2highres.jpg &quot;/&gt; 그림 2. 9 또는 10 기본 쌍을 사이에두고 두 개의 hemimethylated GATC 사이트를 포함하는 23-24 BP 긴 duplexes로 얻은 사용 oligonucleotides와 크리스탈의 상호 GATC 거리에 있습니다. 요약 다양한 효과. 결정의 모든 사진은 같은 배율로 촬영하고 규모 바는 100 μm을 나타냅니다되었습니다. 각 SeqAΔ의 해상도 제한 (41-59) A25R-DNA는 결정은 Rigaku RU-300 X-선 발생기 시스템에서 수집 된 회절 이미지를 기준으로합니다. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4266/4266fig2large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4266/4266fig3.jpg" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4266/4266fig3highres.jpg" /> 그림 3. t의 DNA를 변화의 효과가 끝납니다. 요약21 bps 긴 duplexes 9 기본 쌍을 사이에두고 두 개의 hemimethylated GATC 사이트를 포함하고 0, 1 또는 2 염기 5 &#39;최종 overhangs을 포함와 그 oligonucleotides는 사용 결정 냈다. 결정의 모든 사진은 같은 배율로 촬영하고 규모 바는 100 μm을 나타냅니다되었습니다. 각 SeqAΔ의 해상도 제한 (41-59)은-A25R-DNA 크리스탈은 (NSLS, BNL) X12C와 X29 beamlines에서 수집 회절 이미지를 기준으로합니다. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4266/4266fig3large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/4266/4266fig4.jpg" /> 4 그림. SeqAΔ의 맑고 포장 (41-59) - A25R는 다이 뉴클레오타이드의 오버행과 DNA에 바인딩 : (A) 상단과 측면 (B)에서 본. 비대칭 단위는 두 SeqAΔ (41-59)를-A25R-DNA의 DNA가 주황색으로 표시되는 동안 단백질은 회색으로 표시됩니다 단지가 들어 있습니다. Symmet보시지 관련 SeqAΔ (41-59) A25R-DNA 분자는 단백질과 DNA에 노란색에 흰색으로 표시됩니다. 이 수치는 PyMOL 12를 사용하여 준비되었습니다. 이 수치는 영화 일에 관련된 것은. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4266/4266fig4large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . 영화는 1. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4266/4266movie1.avi" target="_blank">동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> .

<ol>
	<li>Campbell, J. L., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E.+coli+oriC+and+the+dnaA+gene+promoter+are+sequestered+from+dam+methyltransferase+following+the+passage+of+the+chromosomal+replication+fork.">E. coli oriC and the dnaA gene promoter are sequestered from dam methyltransferase following the passage of the chromosomal replication fork.</a> Cell. 62, 967-979 (1990).</li><li>Guarn&#233;, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+SeqA-N+filament:+implications+for+DNA+replication+and+chromosome+organization.">Crystal structure of a SeqA-N filament: implications for DNA replication and chromosome organization.</a> Embo. J. 24, 1502-1511 (2005).</li><li>Brendler, T., Austin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+SeqA+protein+to+DNA+requires+interaction+between+two+or+more+complexes+bound+to+separate+hemimethylated+GATC+sequences.">Binding of SeqA protein to DNA requires interaction between two or more complexes bound to separate hemimethylated GATC sequences.</a> Embo. J. 18, 2304-2310 (1999).</li><li>Jordan, S. R., Whitcombe, T. V., Berg, J. M., Pabo, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+variation+in+DNA+length+yields+highly+ordered+repressor-operator+cocrystals.">Systematic variation in DNA length yields highly ordered repressor-operator cocrystals.</a> Science. 230, 1383-1385 (1985).</li><li>Tan, S., Hunziker, Y., Pellegrini, L., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+the+yeast+MATalpha2/MCM1/DNA+ternary+complex:+general+methods+and+principles+for+protein/DNA+cocrystallization.">Crystallization of the yeast MATalpha2/MCM1/DNA ternary complex: general methods and principles for protein/DNA cocrystallization.</a> J. Mol. Biol. 297, 947-959 (2000).</li><li>Rice, P. A., Yang, S., Mizuuchi, K., Nash, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+an+IHF-DNA+complex:+a+protein-induced+DNA+U-turn.">Crystal structure of an IHF-DNA complex: a protein-induced DNA U-turn.</a> Cell. 87, 1295-1306 (1996).</li><li>Yang, W., Steitz, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+site-specific+recombinase+gamma+delta+resolvase+complexed+with+a+34+bp+cleavage+site.">Crystal structure of the site-specific recombinase gamma delta resolvase complexed with a 34 bp cleavage site.</a> Cell. 82, 193-207 (1995).</li><li>Chung, Y. S., Brendler, T., Austin, S., Guarne, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+cooperative+binding+of+SeqA+to+a+tandem+GATC+repeat.">Structural insights into the cooperative binding of SeqA to a tandem GATC repeat.</a> Nucleic Acids Res. , (2009).</li><li>Anderson, J., Ptashne, M., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cocrystals+of+the+DNA-binding+domain+of+phage+434+repressor+and+a+synthetic+phage+434+operator.">Cocrystals of the DNA-binding domain of phage 434 repressor and a synthetic phage 434 operator.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 1307-1311 (1984).</li><li>Timsit, Y., Moras, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+self-fitting:+the+double+helix+directs+the+geometry+of+its+supramolecular+assembly.">DNA self-fitting: the double helix directs the geometry of its supramolecular assembly.</a> Embo J. 13, 2737-2746 (1994).</li><li>Chung, Y. S., Guarne, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+X-ray+diffraction+analysis+of+SeqA+bound+to+a+pair+of+hemimethylated+GATC+sites.">Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of SeqA bound to a pair of hemimethylated GATC sites.</a> Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 64, 567-571 (2008).</li><li>DeLano, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The PyMOL Molecular Graphic Systems. , (2002).</li></ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

macromolecular X-선 결정학에서 가장 큰 도전 중 하나는 회절 품질 결정을 획득하고 있습니다. 단백질 또는 단백질 DNA 단지의 경우,이 도전은 최적화되어야합니다 추가 변수로 인해 악화됩니다. 그것은 널리 DNA의 길이와 끈적 overhangs의 존재가 더 이상 가상 이중의 주요 매개 변수를 최적화하는 것입니다에 인접한 DNA 분자의 연결을 강화하기 졌다고합니다. 그러나, 우리는 이러한 overhangs의 특성과 길?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 # </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> 트리스 </td><td> Bioshop </td><td> TRS003.5 </td><td></td></tr><tr><td> Ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)) </td><td> 피셔 과학 </td><td> E478-500 </td><td></td></tr><tr><td> Dithiotheitrol (DTT) </td><td> 바이오 기본 주식회사 </td><td> DB0058 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Bioshop </td><td> SOD002.10 </td><td></td></tr><tr><td> 글리세린 </td><td> Caledon </td><td> 5350-1 </td><td></td></tr><tr><td> 자당 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> S5016-500G </td><td></td></tr><tr><td> 나트륨 dodecyl 황산 (SDS) </td><td> Bioshop </td><td> SDS001.500 </td><td></td></tr><tr><td> 요소 </td><td> Bioshop </td><td> URE001.5 </td><td></td></tr><tr><td> 40% 29:1 BIS / 아크릴 아미드 </td><td> 바이오 기본 주식회사 </td><td> A0007-500ml </td><td> 4에 저장 ° C </td></tr><tr><td> 붕산 </td><td> EMD </td><td> BX0865-1 </td><td></td></tr><tr><td> 크실렌 cyanol FF </td><td> 바이오 RAD </td><td> 161-0423 </td><td></td></tr><tr><td> Bromophenol 블루 </td><td> Bioshop </td><td> BR0222 </td><td></td></tr><tr><td> 이중 조절 수직 젤 시스템 </td><td> CBC 과학 회사 주식회사 </td><td> DASG-250 </td><td></td></tr><tr><td> 인덱스 결정화 화면 </td><td> 햄튼 연구 </td><td> HR2-144 </td><td> 4에 저장 ° C </td></tr><tr><td> 마법사 I의 결정 화면 </td><td> 에메랄드 BioSystems </td><td> EBS-마법사-1 </td><td> 4에 저장 ° C </td></tr><tr><td> 마법사 II의 결정 화면 </td><td&gt; 에메랄드 BioSystems </td><td> EBS-마법사-2 </td><td> 4에 저장 ° C </td></tr><tr><td> 클래식 결정 화면 </td><td> Qiagen </td><td> 130701 </td><td> 4에 저장 ° C </td></tr><tr><td> Intelliplate 트레이 </td><td> 예술 로빈스 악기 </td><td> 102-0001-00 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 솔루션 단백질 정화 버퍼 : 100 MM 트리스 산도 8, 2 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 2 MM DTT와 5 % 글리세롤. 단백질 저장 버퍼 : 20 MM 트리스 산도 8, 150 MM NaCl, 5 MM DTT, 0.5 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 및 5 % 글리세롤. 젤 로딩 믹스 : autoclaved ddH 2 O.의 70 ML에 자당의 20g, bromophenol 파란색의 25 밀리그램, 크실렌 cyanol FF의 25 밀리그램, 10 % w / V SDS의 1 ML과 10X TBE의 10 ML을 추가 자당이 용해 될 때까지 약한 난방 저어 및 최종을 조절볼륨 100 autoclaved ddH 2 O.있는 ML 4 ° C.에 저장 2X로드 버퍼 : 젤 로딩 믹스의 10 ML에 요소의 11g을 추가합니다. 요소가 해소 될 때까지 뜨거운 접시에 젓는다. 4 2 ML 튜브 및 매장에서 나누어지는 ° C. 10X PAGE 믹스 : 믹스 요소의 420.4 g, 10X TBE의 100 ML (autoclaved), 40 % 250 ML 29:1 ddH 2 O.에서 BIS / 아크릴 아미드 완전히 용해 될 때까지 저어 및 1리터에 볼륨을 조정할 수 있습니다. 4 ° C.에서 어두운 병에 저장 10X TBE : 디졸브 108g 트리스, ddH 2 O. 1 리터에 붕산의 55g과 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 9.3 g의 상온에서 압력솥 및 매장. 용출 버퍼 : ddH 2 O. 200 ML 5 M NaCl, 1 M 트리스 산도 7.5, 0.5 M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 산도 8 0.4 ML 2 ML의 희석 8 ML 상온에서 압력솥 및 매장. </td></tr></tbody></tab르&gt;

iterative optimization of dna duplexes for crystallization of seqa-dna complexes

에스 케리 키아 대장균 SeqA 복제 1의 기원에서 sequestering hemimethylated GATC 클러스터의 조기 reinitiation 이벤트를 방지 DNA 복제의 부정적인 레귤레이터입니다. 원산지 외에도 SeqA은 복제 포크, 그것이 높은 명령 구조로 새로 복제 된 DNA를 구성 2 발견됩니다. SeqA 동료는 약하게 하나의 GATC 시퀀스로하지만, 여러 GATC 사이트를 포함하는 DNA의 duplexes 높은 친화 단지를 형성한다. SeqA의 최소한의 기능 및 구조 단위는이를 hemimethylated DNA 3 고친 화성 단지를 ​​형성하는 적어도 두 개의 GATC 시퀀스의 요구 사항을 설명하고, 이량 체입니다. 또한, oligomerization과 유연한 링커로 구분하여 DNA 결합 도메인 SeqA 아키텍처, 3 나선형 회전까지로 구분 GATC 반복에 바인딩 할 수 있습니다. 따라서, 분자 수준에서 SeqA의 기능을 이해하는 것은 구조적 아나가 필요합니다SeqA의 용해는 여러 GATC 시퀀스에 바인딩. 단백질 DNA의 결정에서 DNA는 단백질과 DNA의 상대적인 크기와 건축에 따라 포장의 상호 작용에 탁월한 효과 하나도 없다. 단백질은 DNA 나 발자국 DNA의 대부분을보다 큰 경우, 크리스탈 포장은 주로 단백질 단백질 상호 작용에 의해 중재됩니다. 반대로, 단백질이 DNA보다 같은 크기 또는 작은 또는 만 DNA, DNA-DNA 및 DNA-단백질 상호 작용의 일부를 포함 할 때 크리스탈 포장을 지배. 따라서, 단백질 DNA 단지의 결정은 DNA의 길이 4 DNA 종료 (둔기 나 오버행) 5-7의 체계적인 심사가 필요합니다. 이 보고서에서, 우리는 설계, 최적화, 정화 및 구조 결정에 적합한 결정을 얻을 수 SeqA의 dimeric 변형 (SeqAΔ (41-59) - A25R)으로 단지에 나란히 GATC 반복을 포함 hemimethylated의 DNA duplexes을 결정화하는 방법에 대해 설명합니다.

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Iterative Optimization of DNA Duplexes for Crystallization of SeqA-DNA Complexes

단백질 DNA 단지의 결정 구조는 단백질 기능, 메커니즘뿐만 아니라, 특정 상호 작용의 성격에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 여기, 우리는 함께 공동 결정의 길이, 순서 및 이중 DNA의 끝을 최적화하는 방법을보고<em&gt; 대장균</em&gt; SeqA, 복제 개시의 네거티브 레귤레이터.

SeqA-DNA 단지의 결정에 대한 DNA의 Duplexes의 최적화를 반복

Escherichia coli SeqA is a negative regulator of DNA replication that prevents premature reinitiation events by sequestering hemimethylated GATC clusters ...

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Research

JoVE Journal

Biology

9.9K 조회수.  McMaster University. 단백질 DNA 단지의 결정 구조는 단백질 기능, 메커니즘뿐만 아니라, 특정 상호 작용의 성격에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 여기, 우리는 함께 공동 결정의 길이, 순서 및 이중 DNA의 끝을 최적화하는 방법을보고 대장균 SeqA, 복제 개시의 네거티브 레귤레이터.

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Combining Wet and Dry Lab Techniques to Guide the Crystallization of Large Coiled-coil Containing Proteins

Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are found throughout nature, however, because of their physical properties and tendency to aggregate, they are traditionally viewed as being especially difficult to crystallize. Here, we utilize a variety of quick and simple techniques designed to identify a series of possible domain boundaries for a given coiled-coil protein, and then quickly characterize the behavior of these proteins in solution. With the addition of a strongly fluorescent tag (mRuby2), protein characterization is simple and straightforward. The target protein can be readily visualized under normal lighting and can be quantified with the use of an appropriate imager. The goal is to quickly identify candidates that can be removed from the crystallization pipeline because they are unlikely to succeed, affording more time for the best candidates and fewer funds expended on proteins that do not produce crystals. This process can be iterated to incorporate information gained from initial screening efforts, can be adapted for high-throughput expression and purification procedures, and is augmented by robotic screening for crystallization.

We describe a framework incorporating straightforward biochemical and computational analysis to guide the characterization and crystallization of large coiled-coil domains. This framework can be adapted for globular proteins or extended to incorporate a variety of high-throughput techniques.

습식 및 건식 연구소의 기술을 결합하면 대형 코일 코일 포함하는 단백질의 결정화를 안내합니다

Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are ...

연구

생화학

Self-assembly of Complex Two-dimensional Shapes from Single-stranded DNA Tiles

Current methods in DNA nano-architecture have successfully engineered a variety of 2D and 3D structures using principles of self-assembly. In this article, we describe detailed protocols on how to fabricate sophisticated 2D shapes through the self-assembly of uniquely addressable single-stranded DNA tiles which act as molecular pixels on a molecular canvas. Each single-stranded tile (SST) is a 42-nucleotide DNA strand composed of four concatenated modular domains which bind to four neighbors during self-assembly. The molecular canvas is a rectangle structure self-assembled from SSTs. A prescribed complex 2D shape is formed by selecting the constituent molecular pixels (SSTs) from a 310-pixel molecular canvas and then subjecting the corresponding strands to one-pot annealing. Due to the modular nature of the SST approach we demonstrate the scalability, versatility and robustness of this method. Compared with alternative methods, the SST method enables a wider selection of information polymers and sequences through the use of de novo designed and synthesized short DNA strands.

DNA tiling is an effective approach to make programmable nanostructures. We describe the protocols to construct complex two-dimensional shapes by the self-assembly of single-stranded DNA tiles.

단일 가닥 DNA 타일에서 단지 두 차원 모양의 자기 조립 (self-assembly)

Current methods in DNA nano-architecture have successfully engineered a variety of 2D and 3D structures using principles of self-assembly. In this ...

화학

Stable DNA Motifs, 1D and 2D Nanostructures Constructed from Small Circular DNA Molecules

This article presents a detailed protocol for synthesis of small circular DNA molecules, annealing of circular DNA motifs, and construction of 1D and 2D DNA nanostructures. Over decades, the rapid development of DNA nanotechnology is attributed to the use of linear DNAs as the source materials. For example, the DAO (double crossover, antiparallel, odd half-turns) tile is well-known as a building block for construction of 2D DNA lattices; the core structure of DAO is made from two linear single-stranded (ss) oligonucleotides, like two ropes making a right hand granny&#160;knot. Herein, a new type of DNA tiles called cDAO (coupled DAO) are built using a small circular ss-DNA of c64nt or c84nt (circular 64 or 84 nucleotides) as the scaffold strand and several linear ss-DNAs as the staple strands. Perfect 1D and 2D nanostructures are assembled from cDAO tiles: infinite nanowires, nanospirals, nanotubes, nanoribbons; and finite nano-rectangles. Detailed protocols are described: 1) preparation by T4 ligase and purification by denaturing PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis) of small circular oligonucleotides, 2) annealing of stable circular tiles, followed by native PAGE analysis, 3) assembling of infinite 1D nanowires, nanorings, nanospirals, infinite 2D lattices of nanotubes and nanoribbons, and finite 2D nano-rectangles, followed by AFM (Atomic Force Microscopy) imaging. The method is simple, robust, and affordable for most labs.

This article presents a detailed protocol for T4 ligation and denaturing PAGE purification of small circular DNA molecules, annealing and native PAGE analysis of circular tiles, assembling and AFM imaging of 1D and 2D DNA nanostructures, as well as agarose gel electrophoresis and centrifugation purification of finite DNA nanostructures.

안정적인 DNA 모티프, 1d와 2D Nanostructures 작은 원형 DNA 분자에서 건설

This article presents a detailed protocol for synthesis of small circular DNA molecules, annealing of circular DNA motifs, and construction of 1D and 2D ...

Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial crystallography experiments at both synchrotrons and XFELs. The method is based upon an understanding of the protein crystal phase diagram, and how that knowledge can be utilized. The method is divided into three stages: (1) optimizing crystal morphology, (2) transitioning to batch, and (3) scaling. Stage 1 involves finding well diffracting, single crystals, hopefully but not necessarily, presenting in a cube-like morphology. In Stage 2, the Stage 1 condition is optimized by crystal growth time. This strategy can transform crystals grown by vapor diffusion to batch. Once crystal growth can occur within approximately 24 h, a morphogram of the protein and precipitant mixture can be plotted and used as the basis for a scaling strategy (Stage 3). When crystals can be grown in batch, scaling can be attempted, and the crystal size and concentration optimized as the volume is increased. Endothiapepsin has been used as a demonstration protein for this protocol. Some of the decisions presented are specific to endothiapepsin. However, it is hoped that the way they have been applied will inspire a way of thinking about this procedure that others can adapt to their own projects.

The aim of this article is to give the viewer a solid understanding of how to transform their small-volume, vapor-diffusion protocol, for growing large, single protein crystals, into a large-volume batch micro-crystallization method for serial crystallography.

연속 결정학 실험을 위한 Endothiapepsin 결정의 성장 최적화

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent advancements in CD spectroscopy have enabled the study of DNA-protein interactions and conformational dynamics of DNA in different microenvironments in detail for a better understanding of transcriptional regulation in vivo. The area around a potential transcription zone needs to be unwound for transcription to occur. This is a complex process requiring the coordination of histone modifications, binding of the transcription factor to DNA, and other chromatin remodeling activities. Using CD spectroscopy, it is possible to study conformational changes in the promoter region caused by regulatory proteins, such as ATP-dependent chromatin remodelers, to promote transcription. The conformational changes occurring in the protein can also be monitored. In addition, queries regarding the affinity of the protein towards its target DNA and sequence specificity can be addressed by incorporating mutations in the target DNA. In short, the unique understanding of this sensitive and inexpensive method can predict changes in chromatin dynamics, thereby improving the understanding of transcriptional regulation.

The interaction of an ATP-dependent chromatin remodeler with a DNA ligand is described using CD spectroscopy. The induced conformational changes on a gene promoter analyzed by the peaks generated can be used to understand the mechanism of transcriptional regulation.

DNA 단백질 상호 작용을 연구하는 CD 분광법

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The availability of atomic resolution structures provides a deep and unique understanding of protein function, and helps to unravel the inner workings of the living cell. To date, 86% of the Protein Data Bank (rcsb-PDB) entries are macromolecular structures that were determined using X-ray crystallography.
To obtain crystals suitable for crystallographic studies, the macromolecule (e.g. protein, nucleic acid, protein-protein complex or protein-nucleic acid complex) must be purified to homogeneity, or as close as possible to homogeneity. The homogeneity of the preparation is a key factor in obtaining crystals that diffract to high resolution (Bergfors, 1999; McPherson, 1999).
Crystallization requires bringing the macromolecule to supersaturation. The sample should therefore be concentrated to the highest possible concentration without causing aggregation or precipitation of the macromolecule (usually 2-50 mg/ mL). Introducing the sample to precipitating agent can promote the nucleation of protein crystals in the solution, which can result in large three-dimensional crystals growing from the solution. There are two main techniques to obtain crystals: vapor diffusion and batch crystallization. In vapor diffusion, a drop containing a mixture of precipitant and protein solutions is sealed in a chamber with pure precipitant. Water vapor then diffuses out of the drop until the osmolarity of the drop and the precipitant are equal (Figure 1A). The dehydration of the drop causes a slow concentration of both protein and precipitant until equilibrium is achieved, ideally in the crystal nucleation zone of the phase diagram. The batch method relies on bringing the protein directly into the nucleation zone by mixing protein with the appropriate amount of precipitant (Figure 1B). This method is usually performed under a paraffin/mineral oil mixture to prevent the diffusion of water out of the drop.
Here we will demonstrate two kinds of experimental setup for vapor diffusion, hanging drop and sitting drop, in addition to batch crystallization under oil.

The 3-D structure of a molecule provides a unique understanding of how the molecule functions. The principal method for structure determination at near-atomic resolution is X-ray crystallography. Here, we demonstrate the current methods for obtaining three-dimensional crystals of any given macromolecule that are suitable for structure determination by X-ray crystallography.

X - 선 Crystallography에 대한 단백질 결정화

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

생물학

Design and Synthesis of a Reconfigurable DNA Accordion Rack

DNA nanostructure-based mechanical systems or DNA nanomachines, which produce complex nanoscale motion in 2D and 3D in the nanometer to &#229;ngstr&#246;m resolution, show great potential in various fields of nanotechnology such as the molecular reactors, drug delivery, and nanoplasmonic systems. The reconfigurable DNA accordion rack, which can collectively manipulate a 2D or 3D nanoscale network of elements, in multiple stages in response to the DNA inputs, is described. The platform has potential to increase the number of elements that DNA nanomachines can control from a few elements to a network scale with multiple stages of reconfiguration.
In this protocol, we describe the entire experimental process of the reconfigurable DNA accordion rack of 6 by 6 meshes. The protocol includes a design rule and simulation procedure of the structures and a wet-lab experiment for synthesis and reconfiguration. In addition, analysis of the structure using TEM (transmission electron microscopy) and FRET (fluorescence resonance energy transfer) is included in the protocol. The novel design and simulation methods covered in this protocol will assist researchers to use the DNA accordion rack for further applications.

We describe the detailed protocol for design, simulation, wet-lab experiments, and analysis for a reconfigurable DNA accordion rack of 6 by 6 meshes.

재구성 가능한 DNA 아코디언 랙의 설계 및 합성

DNA nanostructure-based mechanical systems or DNA nanomachines, which produce complex nanoscale motion in 2D and 3D in the nanometer to &#229;ngstr&#246;m ...

생체공학

Analyzing and Building Nucleic Acid Structures with 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures. Protocol 1 lists the set of instructions needed to download and install the software. This is followed, in Protocol 2, by the analysis of a nucleic acid structure, including the assignment of base pairs and the determination of rigid-body parameters that describe the structure and, in Protocol 3, by a description of the reconstruction of an atomic model of a structure from its rigid-body parameters. The most recent version of 3DNA, version 2.1, has new features for the analysis and manipulation of ensembles of structures, such as those deduced from nuclear magnetic resonance (NMR) measurements and molecular dynamic (MD) simulations; these features are presented in Protocols 4 and 5. In addition to the 3DNA stand-alone software package, the w3DNA web server, located at <a href="http://w3dna.rutgers.edu" target="_blank">http://w3dna.rutgers.edu</a>, provides a user-friendly interface to selected features of the software. Protocol 6 demonstrates a novel feature of the site for building models of long DNA molecules decorated with bound proteins at user-specified locations.

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures.

3DNA과 핵산의 구조를 분석하고 구축

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic ...

양친매성 DNA 나노스타 또는 C-스타의 다용도 생체 분자 응축물

Synthetic Condensates and Cell-Like Architectures from Amphiphilic DNA Nanostructures

Synthetic droplets and condensates are becoming increasingly common constituents of advanced biomimetic systems and synthetic cells, where they can be used to establish compartmentalization and sustain life-like responses. Synthetic DNA nanostructures have demonstrated significant potential as condensate-forming building blocks owing to their programmable shape, chemical functionalization, and self-assembly behavior. We have recently demonstrated that amphiphilic DNA "nanostars", obtained by labeling DNA junctions with hydrophobic moieties, constitute a particularly robust and versatile solution. The resulting amphiphilic DNA condensates can be programmed to display complex, multi-compartment internal architectures, structurally respond to various external stimuli, synthesize macromolecules, capture and release payloads, undergo morphological transformations, and interact with live cells. Here, we demonstrate protocols for preparing amphiphilic DNA condensates starting from constituent DNA oligonucleotides. We will address (i) single-component systems forming uniform condensates, (ii) two-component systems forming core-shell condensates, and (iii) systems in which the condensates are modified to support in vitro transcription of RNA nanostructures.

저자 스포트라이트: 프로그래밍 가능한 양친매성 DNA 나노 구조에서 합성 세포 개발

We present a protocol for preparing synthetic biomolecular condensates consisting of amphiphilic DNA nanostars starting from their constituent DNA oligonucleotides. Condensates are produced from either a single nanostar component or two components and are modified to sustain in vitro transcription of RNA from an embedded DNA template.

양친매성 DNA 나노 구조의 합성 응축물 및 세포와 같은 구조

Synthetic droplets and condensates are becoming increasingly common constituents of advanced biomimetic systems and synthetic cells, where they can be ...

SeqA-DNA 단지의 결정에 대한 DNA의 Duplexes의 최적화를 반복

요약

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습식 및 건식 연구소의 기술을 결합하면 대형 코일 코일 포함하는 단백질의 결정화를 안내합니다

단일 가닥 DNA 타일에서 단지 두 차원 모양의 자기 조립 (self-assembly)

안정적인 DNA 모티프, 1d와 2D Nanostructures 작은 원형 DNA 분자에서 건설

연속 결정학 실험을 위한 Endothiapepsin 결정의 성장 최적화

DNA 단백질 상호 작용을 연구하는 CD 분광법

X - 선 Crystallography에 대한 단백질 결정화

재구성 가능한 DNA 아코디언 랙의 설계 및 합성

3DNA과 핵산의 구조를 분석하고 구축

양친매성 DNA 나노 구조의 합성 응축물 및 세포와 같은 구조

양친매성 DNA 나노 구조의 합성 응축물 및 세포와 같은 구조