Die Autoren möchten die PXRR Mitarbeiter an der NSLS (Brookhaven National Laboratory) danken für die Unterstützung während der Datensammlung und Monica Pillon für die Hilfe bei DNA-Aufreinigung. Diese Arbeit wurde von der kanadischen Institutes of Health Research (MOP 67.189) unterstützt.

Ein. Protein Purification Der flexible Linker, das N-(Oligomerisierung) und C-terminalen (DNA Bindung) Domänen von SeqA Hilfsmittel die Erkennung hemimethylierte GATC Repeats durch ein bis drei Windungen auf der DNA getrennt. Für diese Studie verwendeten wir eine dimere Variante SeqA (SeqAΔ (41-59)-A25R) mit einer Punktmutation in der N-terminalen Domäne, die weitere Oligomerisierung und eine verkürzte DNA Linkers, der die Bindung an GATC Tandem wiederholt ausschließlich durch abgetrennt einschränkt verhindert eine Umdrehung auf der DNA (Abbildung 1) 2,8. <ol><li> Transformieren BL21 (DE3)-Zellen mit dem Plasmid kodiert SeqA unter der Kontrolle des T7-Promotors, </li><li> Platte die Transformationsreaktion in LB-Agarplatten mit 100 ug / ml Ampicillin, </li><li> Wählen gemischten Kolonien eine kleine Nacht angeimpft (LB-Medium mit 100 ug / ml Ampicillin) </li><li> Am nächsten Morgen inokulieren einen 1 l Medium mit einer 1:100 Verdünnung der overnight Kultur, </li><li> Wachsen die Zellen bis zu einer OD 600 von ~ 0,7 und induzieren Proteinproduktion durch Zugabe von Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) zu einer Endkonzentration von 1 mM, </li><li> Fahren Sie mit der Inkubation für 3 Stunden bei 37 ° C unter kreisförmigem Schütteln und dann ernten die Zellen durch Zentrifugation (10 min bei 3.300 g), </li><li> Zellpellet in Reinigungspuffer A und durch Beschallung lysiert, </li><li> Deaktivieren des Lysats durch Zentrifugation (40 min bei 39.000 g) und Laden des Überstands auf eine Säule mit Heparin Reinigungspuffer, </li><li> Eluieren SeqA Verwendung eines linearen Gradienten bis 1 M NaCl (SeqA eluiert bei ~ 0,7 M NaCl), </li><li> Pool die SeqA enthaltenden Fraktionen zusammen, verdünnen, um die Ionenstärke der Probe und Last in eine Kationenaustauschchromatographie-Säule, äquilibriert mit Reinigungspuffer abzusenken, </li><li> Verwendung eines linearen Salzgradienten eluiert reinen SeqA bei ~ 0,4 M NaCl, </li><li> Pool die SeqA-haltigen Fraktionen zusammen, konzentrierte (3 mg / ml) und abspeichern im Pufferspeicher. </li></ol> 2. DNA Purification <ol><li> Bestellen komplementäre methylierten und methylierten Oligonukleotide aus Ihrem Lieblings-Unternehmen, </li><li> Lösen Sie 1 umol jedes lyophilisierten Einzelstrang-DNA in 800 ul autoklaviert ddH 2 O, Wirbel und lassen Sie es für 10-20 min zu sitzen, </li><li> Fügen Sie 800 ul vorgeheizten 2X Ladepuffer jedem Oligonukleotid, </li><li> Für 20-30 Nukleotide lange Oligonukleotide, bereiten eine große 10% denaturierenden Gel (160 x 250 x 1 mm): * Gut mischen 80 ml 10% PAGE-Mix, 80 ul TEMED und 800 ul Ammoniumpersulfat pro Gel und gießen, * Sobald polymerisiert, nehmen Sie den Kamm und spülen Sie die Vertiefungen mit ddH 2 O gründlich, * Setzen Sie die Gele auf Gel-Besetzung einschließlich Kühlplatte und füllen Sie dann die oberen und unteren Reservoirs mit Laufpuffer (1X TBE), * Vorlauf des Gels bei 700-750 V, um das Gel erwärmen bis zu 55 ° C, * Halten Sie den Lauf und spülen Sie den Brunnen thoroughly mit Laufpuffer. </li><li> Erhitzen der Oligonukleotide auf 90 ° C für 2 min, </li><li> Vortex und drehen Sie die Proben und unmittelbar vor dem Laden des Gels, </li><li> Führen Sie das Gel bei ~ 700 V und stoppen Sie ihn, sobald Ihr Oligonukleotid halbwegs migriert wurde. (Man beachte, dass auf einem 10% Polyacrylamidgel Bromphenolblau wandert Zusammenarbeit mit Oligonukleotiden ~ 20 Basen lang und Xylencyanol FF mit ~ 60 Basen lang), </li><li> Stoppen Sie das Gel, zerlegen sie aus dem Gel und entfernen Sie die Abstandshalter, </li><li> Auf einer ebenen Fläche, entfernen Sie eine Glasplatte und decken das Gel mit Plastikverpackung, </li><li> Schalten Sie das Gel um, entfernen Sie die andere Glasplatte und bedecken Sie es mit Plastikverpackung, </li><li> Die Bänder mit UV-Licht und eine fluoreszierende Platte hinter dem Gel, um die DNA Schatten sehen </li><li> Schneiden Sie das Band mit einer Rasierklinge in kleine Stücke und übertragen sie in einem sterilen 15 ml Tube, </li><li> 9 ml Elutionspuffer und eluieren Nacht bei 37 ° C unter Rühren, </li><li> Transferieren es vorsichtig in die Lösungzu einem autoklavierten Zentrifugenröhrchen mit einem Gel-loading Pipettenspitze Übertragung Acrylamid Stücke zu vermeiden und 1 ml 3 M Natriumacetat bei pH 7 (1:10 Verdünnung) plus 25 ml gekühlt 100% Ethanol (2,5 Bände), </li><li> Inkubation bei -20 ° C für mindestens 3 Stunden, </li><li> Spin-down und übertragen den Überstand in ein separates Rohr, </li><li> Trocknen Sie die Pellets auf dem Speed-Vac bei mittlerer Hitze, </li><li> Das Pellet in 400 ul autoklaviert ddH 2 O und übertragen in ein frisches Röhrchen, </li><li> Fügen Sie 40 ul 3 M Natriumacetat bei pH 7 und 1 ml 100% Ethanol; gut mischen (Vortex) und inkubieren 30 min bei Raumtemperatur, gefolgt von 30 min bei -20 ° C, </li><li> Spin für 15 min bei 18.000 g und den Überstand verwerfen, </li><li> Spülen Sie das Pellet mit 100 ul 70% kaltem Ethanol, um das restliche Salz aus dem Pellet und Spin zu entfernen für 6 min bei 18.000 g. Entsorgen Sie das Ethanol und Trocknen des Pellets auf Speed-Vac, </li><li> Das Pellet in einer Gesamtmenge von 100 ul autoklaviertem ddH <sub&gt; 2 O. Messung der Konzentration des Oligonukleotids, </li><li> Die DNA-Duplexe hemimethylierte annealen, mischen äquimolaren Konzentrationen der komplementären Einzelstränge und erhitzen die Mischungen auf 95 ° C im Wasserbad 5 min und dann abkühlen lassen langsam auf Raumtemperatur innerhalb der Wasserbad. </li></ol> 3. Protein-DNA-Komplex Bildung und Analyse <ol><li> Mix gleichen Volumina an gereinigtem SeqAΔ (41-59)-A25 (81 uM) und hemimethylierte DNA (81 &amp;mgr; M) </li><li> Inkubation bei Raumtemperatur für 15 min und bei 4 ° C bis Sie bereit sind, es zu benutzen, </li><li> Screen für Kristallisationsbedingungen mit kommerziellen Sparse-Matrix-Bildschirme, </li><li> Nach dem ersten Kristallisation führt identifiziert wurden, optimieren die Bedingungen der Beugung Qualität Kristalle wachsen, </li><li> Cryoprotect die resultierenden Kristalle SeqA-DNA entweder durch Erhöhung der Menge an PEG 400 in der Kristallisationslösung auf eine Endkonzentration von 25% (v / v) oder Zugabe von 20% Glycerin (Vol / Vol) zu der Kristallisationslösung, </li><li> Scoop einzelnen Kristalle mit einem Nylon-Schleife, und Flash-frieren sie in flüssigem Stickstoff </li><li> Testen der Beugungsgrenze jedes Kristalls bei 100 K. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Die Kristallstruktur der SeqAΔ (41-59)-A25R gebunden hemimethylierte DNA zu erhalten, man nacheinander drei Parameter optimiert auf der DNA: (i) Trennung zwischen hemimethylierte GATC-Sequenzen, (ii) Länge des Duplexes, und (iii) das Fehlen / Vorhandensein 5&#39;-Überhänge. Electro Mobility-Shift-Assays zeigen, dass SeqAΔ (41-59)-A25R bindet bevorzugt GATC Wiederholungen von 9-10 Basenpaare (Abbildung 1) getrennt. Deshalb haben wir zunächst abgeschirmt Duplexe 23-24 Basenpaaren (bps) lang mit zwei hemimethylierte GATC-Sequenzen entweder 9 oder 10 bps getrennt. Drei Duplexe ergab schön geformten Kristalle (Abbildung 2). Alobwohl keiner von den Kristallen gebeugt, um hochauflösende, Basenpaare der 23 langen Duplex mit den beiden GATC Seiten um 9 Basispunkte gebeugten Röntgenstrahlen besser als der Rest abgetrennt, was darauf hinweist, dass ein GATC Trennung von 9 bps für die Kristallisation bevorzugt wurde. Daher haben wir die inter-GATC Abstand bis 9 bps für alle nachfolgenden Bildschirmen. Im Allgemeinen wird DNA Kristallisation für Duplex Längen entsprechend genaue Wendelgänge begünstigt, da mehrere DNA-Moleküle Kopf-Schwanz-stapeln kann, um einen kontinuierlichen B-DNA innerhalb des Kristalls 9 zu bilden. Daher wir die Gesamtlänge der Duplexe zu 21 bps (dh zwei Wendelgänge) verkürzt. Während eine 21 bps Duplex mit stumpfen Enden nicht nachgeben Beugungsqualität Kristalle (Daten nicht gezeigt), einen 21 bps Duplex mit einem einzelnen 5&#39;-Überhang an jedem Ende Nucleotid hat Kristalle zu ergeben, dass gebeugtes bis 5 Å im Hause Quelle. Die Verbesserung gegenüber der Beugungsgrenze vorgeschlagen, dass Ende-zu-Ende-Duplex Assoziation wurde tatsächlich begünstigenten Kristallpackung. Da SeqA interagiert mit GATC-Sequenzen, die auf der gleichen Fläche der DNA sind, sollte die gegenüberliegende Fläche des DNA-Duplex zu dem Lösungsmittel ausgesetzt werden. Zur weiteren Verbesserung der Kristalle des Komplexes, dann wir die Sequenz des Duplex modifiziert, um eine CG-Dinukleotid zwischen den beiden Seiten zu GATC rillenförmigen Backbone Wechselwirkungen mit benachbarten DNA-Moleküle in der Kristallstruktur zu fördern, durch die gegenüberliegende Seite des Duplex, ein Verfahren beinhalten Das wurde verwendet, um DNA Kristallisation in den letzten 10 verbessern. Jedoch war die Beugungsgrenze der Kristalle mit dem CG-enthaltenden Duplex gezüchtet identisch zu denen mit einer ähnlichen DNA-Duplex, der nicht enthielt das CG Dinucleotid (Abbildung 3) aufgewachsen. Dieses Ergebnis zeigt, dass die Nut-Rückgrat-Wechselwirkungen waren nicht in diesem Fall wichtig. Wir anschließend optimiert die Länge der Überhänge durch Vergleichen der Kristalle mit einem DNA-Doppelstrang, der zwei zusätzliche Nukleotide an jeder hatte gezüchtet5&#39;-Ende. Diese Veränderung hatte eine drastische Wirkung auf Kristallmorphologie, sowie, was anzeigt, dass die Beugungsgrenze zusätzliches Nukleotid dramatisch die molekularen Kontakte und verstärkter Kristallorientierung Organisation (Abbildung 3) verändert. Die Kristallstruktur von SeqAΔ (41-59)-A25R zu dieser letzten DNA-Duplex bestätigt, dass die freie Fläche der DNA-Doppelstrang nicht in Kristallkontakte eingreifen gebunden, wie aus der begrenzten Wirkung des Einführens eines CG-Dinukleotid erwartet. Trotz der relativen Größe der Protein-und DNA, sind die meisten Wechselwirkungen zwischen Symmetrieverknüpfungen durch Protein-Protein-und Protein-DNA-Wechselwirkungen (Fig. 4) vermittelt. Interessanterweise sind in diesem speziellen Fall ist die vorteilhafte Wirkung von einer 5&#39;-Überhang Dinucleotid nicht durch die Bildung eines pseudo-kontinuierliche DNA. Stattdessen wirkt das 5&#39;-Ende der methylierten Strang wegragt aus den DNA-Achsen und mit dem proximalen SeqA Molekül des Komplexes, zu erklären, warum zwei Nucleotide w<html> ere unbedingt erforderlich, um die Kristallpackung 8,11 ändern. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/4266/4266fig1.jpg" /> Abbildung 1. Bindung SeqAΔ (41-59)-A25R um hemimethylierte DNA. (A) Schematische Darstellung der Domänen SeqA, die den viralen Protein Oligomerisierung und DNA-Bindung. (B) Elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assay von SeqAΔ (41-59)-A25R mit DNAs mit zwei hemimethylierte GATC-Sequenzen von einer zunehmenden Zahl von Basenpaaren getrennt ( X). Die äußerst linken Spur (beschriftet Blank) eine äquimolare Mischung von DNAs mit 5, 7, 12, 21, 25 und 34 Basenpaare zwischen den beiden GATC Sequenzen in Abwesenheit von SeqAΔ (41-59)-A25R. (C) Schema der drei Variablen auf die DNA-Duplexe optimiert Beugungsqualität Kristalle zu erhalten. upload/4266/4266fig2.jpg &quot;fo: content-width =&quot; 6in &quot;fo: src =&quot; / files/ftp_upload/4266/4266fig2highres.jpg &quot;/&gt; Abbildung 2. Wirkung der Variation der inter-GATC erreichbar. Zusammenfassung der verwendeten Oligonukleotide und Kristalle mit 23-24 bp langen Duplexe mit zwei hemimethylierte GATC Websites von 9 oder 10 Basenpaare getrennt erhalten. Alle Bilder von Kristallen wurden bei der gleichen Vergrößerung aufgenommen und die Waage zeigt an 100 um. Die Auflösungsgrenze der einzelnen SeqAΔ (41-59)-A25R-DNA-Kristall auf der Beugung von Bildern auf einem Rigaku RU-300 X-ray-Generator-System gesammelt wurden. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4266/4266fig2large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> . <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4266/4266fig3.jpg" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4266/4266fig3highres.jpg" /> Abbildung 3. Effekt der Variation der DNA-Enden. Zusammenfassung von ter verwendeten Oligonukleotide und Kristalle mit 21 bps langen Duplexe mit zwei hemimethylierte GATC Stellen durch 9 Basenpaare getrennte und einschließlich 0, 1 oder 2 Nukleotid 5&#39;-Ende Überhänge. Alle Bilder von Kristallen wurden bei der gleichen Vergrößerung aufgenommen und die Waage zeigt an 100 um. Die Auflösungsgrenze der einzelnen SeqAΔ (41-59)-A25R-DNA-Kristall auf Beugungsbilder an Strahlführungen X12C und X29 (NSLS, BNL) gesammelt wurden. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4266/4266fig3large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> . <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/4266/4266fig4.jpg" /> Abbildung 4. Kristallpackung SeqAΔ (41-59)-A25R DNA mit Dinukleotid Überhang gebunden: Gesehen von der (A) nach oben und von der Seite (B). Die asymmetrische Einheit enthält zwei SeqAΔ (41-59)-A25R-DNA-Komplexe, wo das Protein in grau dargestellt wird, während die DNA in orange dargestellt. Symry verwandten SeqAΔ (41-59)-A25R-DNA-Moleküle sind in weiß für das Protein und Gelb für die DNA dargestellt. Diese Zahl wurde unter Verwendung PyMOL 12. Diese Zahl wird auf Movie 1 verwandt. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4266/4266fig4large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> . Movie 1. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4266/4266movie1.avi" target="_blank">Klicken Sie hier, um Film anzusehen</a> .

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	<li>Campbell, J. L., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E.+coli+oriC+and+the+dnaA+gene+promoter+are+sequestered+from+dam+methyltransferase+following+the+passage+of+the+chromosomal+replication+fork.">E. coli oriC and the dnaA gene promoter are sequestered from dam methyltransferase following the passage of the chromosomal replication fork.</a> Cell. 62, 967-979 (1990).</li><li>Guarn&#233;, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+SeqA-N+filament:+implications+for+DNA+replication+and+chromosome+organization.">Crystal structure of a SeqA-N filament: implications for DNA replication and chromosome organization.</a> Embo. J. 24, 1502-1511 (2005).</li><li>Brendler, T., Austin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+SeqA+protein+to+DNA+requires+interaction+between+two+or+more+complexes+bound+to+separate+hemimethylated+GATC+sequences.">Binding of SeqA protein to DNA requires interaction between two or more complexes bound to separate hemimethylated GATC sequences.</a> Embo. J. 18, 2304-2310 (1999).</li><li>Jordan, S. R., Whitcombe, T. V., Berg, J. M., Pabo, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+variation+in+DNA+length+yields+highly+ordered+repressor-operator+cocrystals.">Systematic variation in DNA length yields highly ordered repressor-operator cocrystals.</a> Science. 230, 1383-1385 (1985).</li><li>Tan, S., Hunziker, Y., Pellegrini, L., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+the+yeast+MATalpha2/MCM1/DNA+ternary+complex:+general+methods+and+principles+for+protein/DNA+cocrystallization.">Crystallization of the yeast MATalpha2/MCM1/DNA ternary complex: general methods and principles for protein/DNA cocrystallization.</a> J. Mol. Biol. 297, 947-959 (2000).</li><li>Rice, P. A., Yang, S., Mizuuchi, K., Nash, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+an+IHF-DNA+complex:+a+protein-induced+DNA+U-turn.">Crystal structure of an IHF-DNA complex: a protein-induced DNA U-turn.</a> Cell. 87, 1295-1306 (1996).</li><li>Yang, W., Steitz, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+site-specific+recombinase+gamma+delta+resolvase+complexed+with+a+34+bp+cleavage+site.">Crystal structure of the site-specific recombinase gamma delta resolvase complexed with a 34 bp cleavage site.</a> Cell. 82, 193-207 (1995).</li><li>Chung, Y. S., Brendler, T., Austin, S., Guarne, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+cooperative+binding+of+SeqA+to+a+tandem+GATC+repeat.">Structural insights into the cooperative binding of SeqA to a tandem GATC repeat.</a> Nucleic Acids Res. , (2009).</li><li>Anderson, J., Ptashne, M., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cocrystals+of+the+DNA-binding+domain+of+phage+434+repressor+and+a+synthetic+phage+434+operator.">Cocrystals of the DNA-binding domain of phage 434 repressor and a synthetic phage 434 operator.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 1307-1311 (1984).</li><li>Timsit, Y., Moras, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+self-fitting:+the+double+helix+directs+the+geometry+of+its+supramolecular+assembly.">DNA self-fitting: the double helix directs the geometry of its supramolecular assembly.</a> Embo J. 13, 2737-2746 (1994).</li><li>Chung, Y. S., Guarne, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+X-ray+diffraction+analysis+of+SeqA+bound+to+a+pair+of+hemimethylated+GATC+sites.">Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of SeqA bound to a pair of hemimethylated GATC sites.</a> Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 64, 567-571 (2008).</li><li>DeLano, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The PyMOL Molecular Graphic Systems. , (2002).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Eine der größten Herausforderungen in der makromolekularen Röntgenkristallographie ist der Erhalt Beugungsqualität Kristalle. Im Falle von Protein-oder Protein-DNA-Komplexe, wird diese Herausforderung verschärft durch die zusätzlichen Variablen optimiert werden müssen. Es wird allgemein angenommen, dass die Länge der DNA und die Anwesenheit von klebrigen Überhänge zur Vereinigung von benachbarten DNA-Moleküle in einer längeren Pseudo-Duplex werden die wesentlichen Parameter zur Optimierung verbessern. Wir ha...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog # </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> TRIS </td><td> Bioshop </td><td> TRS003.5 </td><td></td></tr><tr><td> Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) </td><td> Fisher Scientific </td><td> E478-500 </td><td></td></tr><tr><td> Dithiotheitrol (DTT) </td><td> Bio Grundlegende Inc. </td><td> DB0058 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Bioshop </td><td> SOD002.10 </td><td></td></tr><tr><td> Glycerol </td><td> Caledon </td><td> 5350-1 </td><td></td></tr><tr><td> Saccharose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5016-500G </td><td></td></tr><tr><td> Natriumdodecylsulfat (SDS) </td><td> Bioshop </td><td> SDS001.500 </td><td></td></tr><tr><td> Harnstoff </td><td> Bioshop </td><td> URE001.5 </td><td></td></tr><tr><td> 40% 29:1 Bis / Acrylamid </td><td> Bio Grundlegende Inc. </td><td> A0007-500ml </td><td> Lagerung bei 4 ° C </td></tr><tr><td> Borsäure </td><td> EMD </td><td> BX0865-1 </td><td></td></tr><tr><td> Xylencyanol FF </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0423 </td><td></td></tr><tr><td> Bromphenolblau </td><td> Bioshop </td><td> BR0222 </td><td></td></tr><tr><td> Dual Adjustable Vertical Gel System </td><td> CBC Scientific Company Inc. </td><td> DASG-250 </td><td></td></tr><tr><td> Index Kristallisation Bildschirm </td><td> Hampton Research </td><td> HR2-144 </td><td> Lagerung bei 4 ° C </td></tr><tr><td> Wizard I Kristallisation Bildschirm </td><td> Smaragd BioSystems </td><td> EBS-WIZ-1 </td><td> Lagerung bei 4 ° C </td></tr><tr><td> Wizard II Kristallisation Bildschirm </td><td&gt; Emerald BioSystems </td><td> EBS-WIZ-2 </td><td> Lagerung bei 4 ° C </td></tr><tr><td> Classics Kristallisation Bildschirm </td><td> Qiagen </td><td> 130701 </td><td> Lagerung bei 4 ° C </td></tr><tr><td> Intelliplate Trays </td><td> Art Robbins Instruments </td><td> 102-0001-00 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Lösungen Proteinreinigung Puffer: 100 mM TRIS pH 8, 2 mM EDTA, 2 mM DTT und 5% Glycerin. Protein Lagerungspuffer: 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl, 5 mM DTT, 0,5 mM EDTA und 5% Glycerin. Gelbeladung Mix: 20 g Saccharose, 25 mg Bromphenolblau, 25 mg Xylencyanol FF, 1 ml von 10% w / v SDS und 10 ml 10X TBE bis 70 ml autoklaviertem ddH 2 O. Rühren Sie mit leichtem Erwärmen bis Saccharose aufgelöst und stellen die endgültigeVolumen auf 100 ml mit autoklaviertem ddH 2 O. Lagerung bei 4 ° C. 2X Ladepuffer: In 11 g Harnstoff in 10 ml Gelbeladung Mix. Stir auf einer Heizplatte bis Harnstoff auflöst. Aliquot in 2 ml Röhrchen und bei 4 ° C. 10X PAGE-Mix: Mix 420,4 g Harnstoff, 100 ml 10X TBE (autoklaviert), 250 ml von 40% 29:1 Bis / Acrylamid in ddH 2 O. Rühren, bis vollständig gelöst und die Lautstärke auf 1 Liter. Bewahren Sie in dunklen Flaschen bei 4 ° C. 10X TBE: auflösen 108 g TRIS, 55 g Borsäure und 9,3 g EDTA in 1 Liter ddH 2 O. Autoklaven und bei Raumtemperatur lagern. Elutionspuffer: Verdünnen 8 ml 5 M NaCl, 2 ml 1 M Tris pH 7,5, 0,4 ml 0,5 M EDTA pH 8 auf 200 ml ddH 2 O. Autoklaven und bei Raumtemperatur lagern. </td></tr></tbody></table&gt;

iterative optimization of dna duplexes for crystallization of seqa-dna complexes

Escherichia coli SeqA ist ein negativer Regulator der DNA-Replikation, die vorzeitige Reinitiation Ereignisse durch Maskierungsmittel hemimethylierte GATC Cluster verhindert innerhalb der Replikationsursprung ein. Jenseits der Herkunft, wird SeqA an den Replikationsgabeln, wo es neu replizierte DNA organisiert in höhere geordneten Strukturen 2 gefunden. SeqA Mitarbeiter nur schwach mit einzelnen GATC-Sequenzen, aber es bildet eine hohe Affinität Komplexe mit DNA-Duplexe mit mehreren GATC Seiten. Die minimale funktionelle und strukturelle Einheit SeqA ein Dimer, wodurch Erläuterung der Anforderung von wenigstens zwei GATC-Sequenzen, um eine hohe Affinität Komplex mit DNA hemimethylierte 3 zu bilden. Zusätzlich erlaubt die SeqA Architektur, mit der Oligomerisierung und DNA-bindenden Domänen durch einen flexiblen Linker getrennt sind, die Bindung an GATC Repeats durch bis zu drei Wendelgänge getrennt. Daher Verständnis der Funktion SeqA auf molekularer Ebene erfordert die strukturelle anaLyse SeqA mehrere GATC Sequenzen gebunden. In Protein-DNA Kristallisation kann DNA keine haben eine außergewöhnliche Wirkung auf die Verpackung Wechselwirkungen in Abhängigkeit von den relativen Größen und Architektur des Proteins und der DNA. Wenn das Protein größer ist als die DNA oder Fußabdrücke meisten der DNA wird die Kristallpackung primär durch Protein-Protein-Wechselwirkungen vermittelt. Umgekehrt, wenn das Protein die gleiche Größe oder kleiner als der DNA ist, oder es deckt nur einen Teil der DNA-, DNA-DNA-und DNA-Protein-Wechselwirkungen Kristallpackung dominieren. Daher erfordert Kristallisation von Protein-DNA-Komplexe die systematische Screening von DNA-Länge 4 und DNA-Enden (blunt oder Überhang) 5-7. In diesem Bericht beschreiben wir, wie zu entwerfen, zu optimieren, zu reinigen und zu kristallisieren hemimethylierte DNA-Duplexe mit Tandem-GATC Wiederholungen im Komplex mit einem dimeren Variante SeqA (SeqAΔ (41-59)-A25R), um geeignete Kristalle für die Strukturaufklärung erhalten.

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Iterative Optimization of DNA Duplexes for Crystallization of SeqA-DNA Complexes

Kristallstruktur von Protein-DNA-Komplexe können Einblick in Proteinfunktion, Mechanismus, sowie, die Natur der spezifischen Wechselwirkung bereitzustellen. Hier berichten wir, wie die Länge, Sequenz und Enden der DNA-Doppelstrang für Co-Kristallisation zu optimieren mit<em&gt; Escherichia coli</em&gt; SeqA, ein negativer Regulator der Replikation Initiation.

Iterative Optimierung der DNA-Duplexes für Kristallisation von SeqA-DNA-Komplexen

Escherichia coli SeqA is a negative regulator of DNA replication that prevents premature reinitiation events by sequestering hemimethylated GATC clusters ...

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9.9K Aufrufe.  McMaster University. Kristallstruktur von Protein-DNA-Komplexe können Einblick in Proteinfunktion, Mechanismus, sowie, die Natur der spezifischen Wechselwirkung bereitzustellen. Hier berichten wir, wie die Länge, Sequenz und Enden der DNA-Doppelstrang für Co-Kristallisation zu optimieren mit Escherichia coli SeqA, ein negativer Regulator der Replikation Initiation.

Serie: Iterative Optimization of DNA Duplexes for Crystallization of SeqA-DNA Complexes

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The availability of atomic resolution structures provides a deep and unique understanding of protein function, and helps to unravel the inner workings of the living cell. To date, 86% of the Protein Data Bank (rcsb-PDB) entries are macromolecular structures that were determined using X-ray crystallography.
To obtain crystals suitable for crystallographic studies, the macromolecule (e.g. protein, nucleic acid, protein-protein complex or protein-nucleic acid complex) must be purified to homogeneity, or as close as possible to homogeneity. The homogeneity of the preparation is a key factor in obtaining crystals that diffract to high resolution (Bergfors, 1999; McPherson, 1999).
Crystallization requires bringing the macromolecule to supersaturation. The sample should therefore be concentrated to the highest possible concentration without causing aggregation or precipitation of the macromolecule (usually 2-50 mg/ mL). Introducing the sample to precipitating agent can promote the nucleation of protein crystals in the solution, which can result in large three-dimensional crystals growing from the solution. There are two main techniques to obtain crystals: vapor diffusion and batch crystallization. In vapor diffusion, a drop containing a mixture of precipitant and protein solutions is sealed in a chamber with pure precipitant. Water vapor then diffuses out of the drop until the osmolarity of the drop and the precipitant are equal (Figure 1A). The dehydration of the drop causes a slow concentration of both protein and precipitant until equilibrium is achieved, ideally in the crystal nucleation zone of the phase diagram. The batch method relies on bringing the protein directly into the nucleation zone by mixing protein with the appropriate amount of precipitant (Figure 1B). This method is usually performed under a paraffin/mineral oil mixture to prevent the diffusion of water out of the drop.
Here we will demonstrate two kinds of experimental setup for vapor diffusion, hanging drop and sitting drop, in addition to batch crystallization under oil.

The 3-D structure of a molecule provides a unique understanding of how the molecule functions. The principal method for structure determination at near-atomic resolution is X-ray crystallography. Here, we demonstrate the current methods for obtaining three-dimensional crystals of any given macromolecule that are suitable for structure determination by X-ray crystallography.

Proteinkristallisation für X-ray Crystallography

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

Forschung

Biologie

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

Die Kristallisation von Membranproteinen in Lipidische Mesophasen

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

High-Throughput-Kristallisation von Membranproteinen mit dem Lipidische Bicellen Methode

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

Einsatz eines Roboters für High-Throughput-Kristallisation von Membranproteinen in Lipidische Mesophasen

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short period of time. However, this technology is only just beginning to be applied to large-scale production as many technological obstacles to scale up are now being overcome. Here, we demonstrate a simple and reproducible method for industrial-scale transient protein production based on vacuum infiltration of Nicotiana plants with Agrobacteria carrying launch vectors. Optimization of Agrobacterium cultivation in AB medium allows direct dilution of the bacterial culture in Milli-Q water, simplifying the infiltration process. Among three tested species of Nicotiana, N. excelsiana (N. benthamiana &#215; N. excelsior) was selected as the most promising host due to the ease of infiltration, high level of reporter protein production, and about two-fold higher biomass production under controlled environmental conditions. Induction of Agrobacterium harboring pBID4-GFP (Tobacco mosaic virus-based) using chemicals such as acetosyringone and monosaccharide had no effect on the protein production level. Infiltrating plant under 50 to 100 mbar for 30 or 60 sec resulted in about 95% infiltration of plant leaf tissues. Infiltration with Agrobacterium laboratory strain GV3101 showed the highest protein production compared to Agrobacteria laboratory strains LBA4404 and C58C1 and wild-type Agrobacteria strains at6, at10, at77 and A4. Co-expression of a viral RNA silencing suppressor, p23 or p19, in N. benthamiana resulted in earlier accumulation and increased production (15-25%) of target protein (influenza virus hemagglutinin).

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Transient protein production in Nicotiana plants based on vacuum infiltration with Agrobacteria carrying launch vectors (Tobacco mosaic virus-based) is a rapid and economic approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins. We simplified the procedure and improved target accumulation by optimizing conditions of bacteria cultivation, selecting host species, and co-introducing RNA silencing suppressors.

Optimierung und Nutzung von<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Transient-vermittelte Proteinproduktion in<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) micro/nano-indentations, for a JPK&#160;AFM. Specifically, in this protocol we measure the apparent Young&#8217;s modulus of cell walls at subcellular resolutions across regions of up to 100 &#181;m&#160;x 100 &#181;m in floral meristems, hypocotyls, and roots. This requires careful preparation of the sample, the correct selection of micro-indenters and indentation depths. To account for cell wall properties only, measurements are performed in highly concentrated solutions of mannitol in order to plasmolyze the cells and thus remove the contribution of cell turgor pressure.
In contrast to other extant techniques, by using different indenters and indentation depths, this method allows simultaneous multiscale measurements, i.e. at subcellular resolutions and across hundreds of cells comprising a tissue. This means that it is now possible&#160;to spatially-temporally characterize the changes that take place in the mechanical properties of cell walls during development, enabling these changes to be correlated with growth and differentiation. This represents a key step to understand how coordinated microscopic cellular changes bring about macroscopic morphogenetic events.
However, several limitations remain: the method can only be used on fairly small samples (around 100 &#181;m in diameter) and only on external tissues; the method is sensitive to tissue topography; it measures only certain aspects of the tissue&#8217;s complex mechanical properties. The technique is being developed rapidly and it is likely that most of these limitations will be resolved in the near future.

We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.

AFM-basierte Mapping der elastischen Eigenschaften der Zellwände: auf der Tissue-, Handy-und subzellulärer Beschlüsse

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

Echtzeit-Bildgebung von Einzel Engineered RNA-Transkripte in lebenden Zellen Mit Ratiometrische Bimolekulare Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes

INO80 chromatin remodeling complexes regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Human INO80 complexes consist of 14 protein subunits including Ino80, a SNF2-like ATPase, which serves both as the catalytic subunit and the scaffold for assembly of the complexes. Functions of the other subunits and the mechanisms by which they contribute to the INO80 complex&#39;s chromatin remodeling activity remain poorly understood, in part due to the challenge of generating INO80 subassemblies in human cells or heterologous expression systems. This JOVE protocol describes a procedure that allows purification of human INO80 chromatin remodeling subcomplexes that are lacking a subunit or a subset of subunits. N-terminally FLAG epitope tagged Ino80 cDNA are stably introduced into human embryonic kidney (HEK) 293 cell lines using Flp-mediated recombination. In the event that a subset of subunits of the INO80 complex is to be deleted, one expresses instead mutant Ino80 proteins that lack the platform needed for assembly of those subunits. In the event an individual subunit is to be depleted, one transfects siRNAs targeting this subunit into an HEK 293 cell line stably expressing FLAG tagged Ino80 ATPase. Nuclear extracts are prepared, and FLAG immunoprecipitation is performed to enrich protein fractions containing Ino80 derivatives. The compositions of purified INO80 subcomplexes can then be analyzed using methods such as immunoblotting, silver staining, and mass spectrometry. The INO80 and INO80 subcomplexes generated according to this protocol can be further analyzed using various biochemical assays, which are described in the accompanying JOVE protocol. The methods described here can be adapted for studies of the structural and functional properties of any mammalian multi-subunit chromatin remodeling and modifying complexes.

This protocol describes a procedure for generating and purifying wild type and mutant versions of the human INO80 chromatin remodeling complex. Epitope tagged versions of INO80 subunits are stably expressed in HEK293 cells, and complete complexes and complexes lacking specific sets of subunits are purified by immunoaffinity chromatography.

Generation und Reinigung von Menschen INO80 Chromatin Remodeling Komplexe und Subkomplexe

INO80 chromatin remodeling complexes regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Human INO80 ...

Efficient Mammalian Cell Expression and Single-step Purification of Extracellular Glycoproteins for Crystallization

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time and cost efficient protocol for secreted protein expression in mammalian cells and one step purification using nickel affinity chromatography. The system is based on large scale transient transfection of mammalian cells in suspension, which greatly decreases the time to produce protein, as it eliminates steps, such as developing expression viruses or generating stable expressing cell lines. This protocol utilizes cheap transfection agents, which can be easily made by simple chemical modification, or moderately priced transfection agents, which increase yield through increased transfection efficiency and decreased cytotoxicity. Careful monitoring and maintaining of media glucose levels increases protein yield. Controlling the maturation of native glycans at the expression step increases the final yield of properly folded and functional mammalian proteins, which are ideal properties to pursue X-ray crystallography. In some cases, single step purification produces protein of sufficient purity for crystallization, which is demonstrated here as an example case.

This is a quick, cost-efficient protocol for the production of secreted, glycosylated mammalian proteins and subsequent single-step purification with sufficient yields of homogenous protein for X-ray crystallography and other biophysical studies.

Effiziente Mammalian Cell Expression und Single-step Reinigung der extrazellulären Glykoproteinen für die Kristallisation

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Amplification, Next-Generation-Sequenzierung und genomischer DNA Mapping von Retrovirale Integration Seiten

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...