Yazarlar DNA saflaştırılması ile ilgili yardım için veri toplama ve Monica Pillon sırasında yardım için NSLS (Brookhaven Ulusal Laboratuvarı) da PXRR personel teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Sağlık Araştırması Kanada Enstitüleri (MOP 67189) tarafından desteklenmiştir.

1. Protein Saflaştırma Bağlayan esnek bağlayıcı N-(oligomerizasyonun) ve C-terminal (DNA bağlayıcı) SeqA yardımları DNA üzerinde 1-3 tur ayırarak hemimethylated GAİK tekrarlarının tanınması etki. Bu çalışma için, biz daha oligomerizasyonun ve tarafından özel olarak ayrılmış tandem GAİK için bağlayıcı DNA tekrarlar kısıtlayan kısaltılmış bir bağlayıcı engeller N-terminal etki alanındaki bir nokta mutasyonu ile SeqA bir dimerik varyantı (SeqAΔ (41-59)-A25R) kullanılır DNA üzerindeki bir dönüş (Şekil 1) 2,8. <ol><li> T7 promotörü kontrolü altında kodlama plazmid SeqA ile BL21 (DE3) hücreleri Transform </li><li> Levha 100 ug / ml ampisilin içeren LB agar plakaları içinde dönüşüm reaksiyonu </li><li> Küçük ölçekli bir gecede kültürü aşılamak için karışık koloniler seçin (LB ortamı 100 mg / ml ampisilin ile), </li><li> Ertesi sabah overni bir 1:100 dilüsyon kullanarak bir ortam 1 L aşılamakGHT kültür, </li><li> ~ 0.7 bir OD 600 hücrelerinin büyümesini ve 1 mM nihai bir konsantrasyona izopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) ilavesiyle protein üretimi indükleyebilir </li><li> , Orbital sallama ile 37 ° C &#39;de 3 saat boyunca inkübasyon devam edilmesi ve daha sonra santrifüjle (3,300 g, 10 dakika) ile hücreler hasat </li><li> Saflaştırma tampon A hücre pelletini tekrar ve sonication tarafından lyse, </li><li> Santrifüj (39,000 g hızında 40 dakika) ile temizleyin ve lizat arıtma tamponu ile dengelenmiş bir sütun üzerine heparin süpernatant yük, </li><li> Zehir SeqA, 1 M NaCl (~ 0.7 M NaCl SeqA elutes) bir doğrusal gradyan kullanılarak </li><li> Havuz bir arada SeqA içeren fraksiyonları, saflaştırma tamponu ile dengelenmiş bir katyon-değişim kromatografisi kolon içine iyonik gücü ve örnek yükünü azaltmak için seyreltin </li><li> Doğrusal bir tuz degrade kullanarak, saf SeqA, ~ 0.4 M NaCl elutes </li><li> Birlikte Havuz SeqA içeren fraksiyonları, concentratE (3 mg / ml) ve depolama tampon içinde saklayın. </li></ol> 2. DNA Saflaştırma <ol><li> Favori şirket Sipariş tamamlayıcı unmethylated ve metil oligonükleotidler </li><li> , Otoklavlanmış GKD 2 O, vorteks 800 ul Her liyofilize tek iplikli DNA 1 mmol çözülür ve 10-20 dakika bekletin </li><li> Her oligonükleotid için ısıtılmış 2X yükleme tampon 800 ul ekleyin, </li><li> 20-30 nükleotid uzunluğunda oligonükleotidler, büyük bir% 10 denatüre edici jel kolonu (160 x 250 x 1 mm) hazırlanması: * Iyi% 10 SAYFA karışımı, 80 ul TEMED ve jel başına 800 ul amonyum persülfat 80 ml karıştırın ve dökün, * Bir kez polimerize, tarak kaldırmak ve GKD 2 O iyice ile kuyu durulayın * Soğutma plakası içeren jel dökme üzerine jeller birleştirin ve sonra (1X TBE) tamponu ile çalışan üst ve alt rezervuarları doldurmak, * 55 ° C jel ısınmak için 700-750 V jel önceden çalıştırın, * Run durdurun ve kuyular THORO durulamaughly tampon çalışan. </li><li> 90 oligonükleotidler ısıtılır ° C&#39;de 2 dakika süreyle, </li><li> Vortex ve örnekleri spin ve hemen jel yüklemeden önce, </li><li> ~ 700 V jel çalıştırın ve oligonükleotid yarıya göç etmiş bir kez bunu durdurmak. (% 10 poliakrilamid jel üzerinde bromofenol mavi ~ 60 üsleri uzun ~ 20 üsleri uzun ve ksilen cyanol FF oligonükleotidler ile işbirliği geçirir unutmayın) </li><li> Jel durdurun, jel kutusundan sökmeye ve pullar çıkarın </li><li> Düz bir yüzey üzerinde, bir cam plaka kaldırmak ve plastik wrap ile jel kapağı </li><li> , Jel Dönün diğer cam plaka kaldırmak ve plastik ile ortun </li><li> , DNA gölge görmek için jel arkasındaki UV ışığı ve floresan plaka kullanarak bantları işaretleyin </li><li> Küçük parçalar halinde bir jilet ile bant kesin ve steril bir 15 ml tüp içine aktarın, </li><li> Elüsyon tampon 9 ml ekleyin ve ajitasyon ile 37 ° C gecede Zehir, </li><li> Dikkatle çözümü aktarmakaktarımı akrilamid parçalar önlemek ve pH 7&#39;de 3 M sodyum asetat (1:10 seyreltme) 1 ml artı soğutulmuş% 100 etanol (2.5 hacim) ve 25 ml eklemek için bir jel yükleme pipet ucu kullanılarak bir otoklav santrifüj tüpüne, </li><li> En azından 3 saat boyunca -20 ° C&#39;de inkübe </li><li> , Aşağı spin ve ayrı bir tüpe supernatant aktarın </li><li> Orta ısıda hız amfi üzerine pelet kurulayın, </li><li> Otoklavlanmış GKD 2 O 400 ul pelletini tekrar ve yeni bir tüp aktarmak, </li><li> PH 7&#39;de 3 M sodyum asetat ve% 100 etanol ve 1 mL, 40 ul ekle; iyi karışımı (vorteks) ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir, 30 dakika -20 ° C&#39;de, ardından </li><li> 18.000 g&#39;de 15 dakika boyunca santrifüj ve süpernatant atmak </li><li> 18.000 g, 6 dakika için pelet ve dönüş sonrası kalan tuz çıkarmak için% 70 etanol soğuk 100 ul ile pelet durulayın. , Etanol atın ve hız-amfi üzerine pelet kuru </li><li> Otoklavlanmış GKD 100 ul olmak üzere toplam pelet yeniden süspanse edin <sub&gt; 2 O. , Oligonükleotid konsantrasyonunu ölçmek </li><li> Hemimethylated DNA dubleksler tavlama için, onlara su banyosu içinde yavaş yavaş oda sıcaklığına soğumaya bırakın daha sonra tamamlayıcı tek iplikçikleri ekimolar konsantrasyonları karıştırıp ° C de 5 dakika su banyosunda 95 karışımlarının ısı ve. </li></ol> 3. Protein-DNA Kompleks Oluşumu ve Analizi <ol><li> Saflaştırılmış SeqAΔ eşit hacimde (41-59)-A25 (81 uM) ve hemimethylated DNA (81 uM), Mix </li><li> 4 az 15 dakika ve mağaza için oda sıcaklığında inkübe ° C bunu kullanmaya hazır oluncaya kadar, </li><li> Ticari seyrek matris ekranları kullanarak kristalizasyon koşulları için Ekran, </li><li> İlk kristalizasyon kabloları tespit edildikten sonra, kırınım kalite kristalleri büyümeye koşulları optimize </li><li> Ya da% 25&#39;lik bir nihai konsantrasyona (göre kristallendirme çözeltisi içinde mevcut PEG 400 miktarı artırılarak edilen SeqA-DNA kristaller Cryoprotectv / v) ya da, kristalleşme çözeltisine% 20 gliserol (v / v) eklendikten </li><li> Naylon bir döngü ile bireysel kristaller Scoop, ve sıvı azot içinde onları flaş dondurma, </li><li> 100 K &#39;de her bir kristal bir kırınım limit test </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Hemimethylated GAİK dizileri arasındaki mesafeyi (i); dubleks (ii) uzunluğunda ve (iii): hemimethylated DNA&#39;ya bağlandığı SeqAΔ (41-59)-A25R kristal yapısı elde etmek için, ardışık DNA üzerindeki üç parametre optimize yokluğu / 5 &#39;çıkıntılarının varlığı. Elektro-mobilite kayma deneyleri SeqAΔ (41-59)-A25R tercihen 9-10 baz çifti (Şekil 1) ile ayrılır GAİK tekrarlar bağlandığını göstermektedir. Bu nedenle, başlangıçta uzun 9 ya da 10 bps ile ayrılmış iki hemimethylated GAİK dizileri içeren (bps) dubleksler 23-24 baz çifti gösterildi. Üç dubleksler güzel şekilli kristaller (Şekil 2) vermiştir. Alyüksek çözünürlüklü kırınan kristaller hiçbiri, 23 9 bps GAİK ayrılması kristalizasyon için tercih edildi belirten diğerlerinden daha iyi X-ışınları kırınım 9 baz puan ile ayrılan iki GAİK siteleri ile uzun dubleks bps olsa. Bu nedenle, sonraki tüm ekranlar için 9 bps arası GAİK boşluk giderilmiştir. Birden fazla DNA molekülleri kristal 9 içindeki B-DNA sürekli oluşturmak için baş-kuyruk yığını olabilir çünkü genellikle DNA kristalizasyon tam sarmal dönüşler karşılık dubleks uzunlukları için tercih edilmektedir. Bu nedenle, 21 bps (yani iki sarmal dönüşler) için dubleksler toplam uzunluğu kısalır. Künt uçlu bir 21 bps duplex kırınım kaliteli kristaller (veriler gösterilmemiştir), kristaller verim vermedi her iki ucundaki nükleotid tek bir 5 &#39;çıkıntı ile 21 bps duplex bizim evde kaynağındaki 5 Å için kırınan. Verim almazken Kırınım sınırı üzerinde iyileştirme uçtan uca dubleks dernek gerçekten lehine olduğunu öne sürdüing kristal paketleme. SeqA DNA aynı yüzü üzerinde GAİK dizileri ile etkileşime girer, DNA dubleks bir ters yüz çözücü maruz olmalıdır. Daha da karmaşık ve kristaller iyileştirmek için, daha sonra çift yönlü ters yüz yoluyla kristal içinde bitişik DNA molekülleri ile oluk-omurga etkileşimi teşvik etmek için iki GAİK siteleri arasında bir CG dinükleotid, bir yöntem dahil etmek için çift yönlü dizisini değiştirilmiş Bu son 10 içinde DNA kristalleşme geliştirmek için kullanılmıştır. Bununla birlikte, CG-içeren çift yönlü ile Büyüyen kristallerin kırınım sınırı CG dinükleotid (Şekil 3) içermiyordu benzer bir dupleks DNA ile büyümüş olan ile aynıydı. Bu sonuç oluk omurgası etkileşimleri bu durumda önemli olmadığını belirtti. Bu daha sonra her iki adet ek nükleotid olan bir dubleks DNA ile Büyüyen kristallerin karşılaştırarak çıkmalarla uzunluğu optimize5 &#39;ucu. Bu değişiklik, kristal morfoloji üzerinde önemli bir etkisi olduğu gibi, sınır kırınım ek nükleotid büyük ölçüde moleküler temas ve gelişmiş kristal organizasyon (Şekil 3) değiştiğini göstermektedir. SeqAΔ (41-59)-A25R kristal yapısı DNA&#39;nın çift yönlü ücretsiz yüz kristal arasındaki temaslara olmadığını doğruladı bu son DNA dubleks bağlı olarak bir CG-dinükleotid tanıtılması sınırlı etkisi bekleniyor. Protein ve DNA göreceli büyüklüğüne rağmen, simetri arkadaşları arasındaki en etkileşimleri protein-protein ve protein-DNA etkileşmeleri (Şekil 4) aracılık eder. İlginç bir şekilde, bu özel durumda, bir 5 &#39;çıkıntı dinükleotid yararlı etkisi olan bir sözde-sürekli DNA oluşumuna bağlı değildir. Bunun yerine, 5 &#39;uzak DNA eksenleri gelen metile iplikçik projelerin sonu ve neden iki nükleotidler w açıklayan karmaşık proksimal SeqA molekülü ile etkileşime<html> ere kesinlikle 8,11 ambalaj kristal değiştirmek için gereklidir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4266/4266fig1.jpg" /> Şekil 1. Hemimethylated DNA ile SeqAΔ (41-59)-A25R bağlanması. SeqA bir etki (A) şematik aracılık protein oligomerizasyonun ve DNA bağlayıcı olduğunu. Baz çiftlerinin giderek artan sayıda (ile ayrılmış iki hemimethylated GAİK dizileri içeren DNA&#39;lar ile SeqAΔ (41-59)-A25R (B) Elektroforetik Devingenlik Değişimi Analizi X). En soldaki şerit (Boş etiketli) SeqAΔ yokluğunda (41-59) olarak iki GAİK sekanslar arasında bir ekimolar 5 ile DNA karışımı, 7, 12, 21, 25 ve 34 baz çiftini içermektedir-A25R. (C) Diyagram kırınım kaliteli kristaller elde DNA dubleksler üzerine optimize edilmiş üç değişken tasvir. upload/4266/4266fig2.jpg &quot;fo: content-width =&quot; 6in &quot;fo: src =&quot; / files/ftp_upload/4266/4266fig2highres.jpg &quot;/&gt; Şekil 2. 9 ya da 10 baz çifti ile ayrılmış iki hemimethylated GAİK bölgelerini içeren bir 23-24 bp uzunluğunda dupleksler ile elde kullanılan oligonükleotidler ve kristaller arası mesafe GAİK. Özeti değişen etkisi. Kristallerin Tüm resimler aynı büyütme düzeyinde alınan ve ölçek çubuğu 100 mikron gösterir edildi. Her SeqAΔ ve çözünürlük sınırı (41-59)-A25R-DNA kristal bir RIGAKU RU-300 X-ışını jeneratörü sistemi üzerinde toplanan kırınım görüntüleri dayanmaktadır. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4266/4266fig2large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4266/4266fig3.jpg" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4266/4266fig3highres.jpg" /> Şekil 3,. T DNA değişen etkisi sona erer. Özeti21 baz uzunluğunda dupleksler 9 baz çifti ile ayrılmış iki hemimethylated GAİK siteleri içeren ve 0, 1 ya da 2 nükleotid 5 &#39;ucunu içeren çıkıntılar ile o oligonükleotidler kullanılır ve kristaller elde edilmiştir. Kristallerin Tüm resimler aynı büyütme düzeyinde alınan ve ölçek çubuğu 100 mikron gösterir edildi. Her SeqAΔ ve çözünürlük sınırı (41-59)-A25R-DNA kristal (NSLS, BNL) X12C ve X29 beamlines toplanan kırınım görüntüleri dayanmaktadır. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4266/4266fig3large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/4266/4266fig4.jpg" /> Şekil 4. SeqAΔ Crystal ambalaj (41-59)-A25R dinükleotid çıkıntı ile DNA bağlı: (A) üst ve yan (B) Baktı. Asimetrik birim iki SeqAΔ (41-59)-A25R-DNA, DNA turuncu gösterilen sırasında protein gri gösterilmiştir kompleksleri içerir. SimetrikRy ilgili SeqAΔ (41-59)-A25R-DNA moleküllerinin protein ve DNA sarı için beyaz gösterilmiştir. Bu şekil, PyMOL 12 kullanılarak hazırlanmıştır. Bu rakam Movie 1 ile ilgilidir. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4266/4266fig4large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . Film 1. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4266/4266movie1.avi" target="_blank">filmi görmek için buraya tıklayın</a> .

<ol>
	<li>Campbell, J. L., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E.+coli+oriC+and+the+dnaA+gene+promoter+are+sequestered+from+dam+methyltransferase+following+the+passage+of+the+chromosomal+replication+fork.">E. coli oriC and the dnaA gene promoter are sequestered from dam methyltransferase following the passage of the chromosomal replication fork.</a> Cell. 62, 967-979 (1990).</li><li>Guarn&#233;, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+SeqA-N+filament:+implications+for+DNA+replication+and+chromosome+organization.">Crystal structure of a SeqA-N filament: implications for DNA replication and chromosome organization.</a> Embo. J. 24, 1502-1511 (2005).</li><li>Brendler, T., Austin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+SeqA+protein+to+DNA+requires+interaction+between+two+or+more+complexes+bound+to+separate+hemimethylated+GATC+sequences.">Binding of SeqA protein to DNA requires interaction between two or more complexes bound to separate hemimethylated GATC sequences.</a> Embo. J. 18, 2304-2310 (1999).</li><li>Jordan, S. R., Whitcombe, T. V., Berg, J. M., Pabo, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+variation+in+DNA+length+yields+highly+ordered+repressor-operator+cocrystals.">Systematic variation in DNA length yields highly ordered repressor-operator cocrystals.</a> Science. 230, 1383-1385 (1985).</li><li>Tan, S., Hunziker, Y., Pellegrini, L., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+the+yeast+MATalpha2/MCM1/DNA+ternary+complex:+general+methods+and+principles+for+protein/DNA+cocrystallization.">Crystallization of the yeast MATalpha2/MCM1/DNA ternary complex: general methods and principles for protein/DNA cocrystallization.</a> J. Mol. Biol. 297, 947-959 (2000).</li><li>Rice, P. A., Yang, S., Mizuuchi, K., Nash, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+an+IHF-DNA+complex:+a+protein-induced+DNA+U-turn.">Crystal structure of an IHF-DNA complex: a protein-induced DNA U-turn.</a> Cell. 87, 1295-1306 (1996).</li><li>Yang, W., Steitz, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+site-specific+recombinase+gamma+delta+resolvase+complexed+with+a+34+bp+cleavage+site.">Crystal structure of the site-specific recombinase gamma delta resolvase complexed with a 34 bp cleavage site.</a> Cell. 82, 193-207 (1995).</li><li>Chung, Y. S., Brendler, T., Austin, S., Guarne, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+cooperative+binding+of+SeqA+to+a+tandem+GATC+repeat.">Structural insights into the cooperative binding of SeqA to a tandem GATC repeat.</a> Nucleic Acids Res. , (2009).</li><li>Anderson, J., Ptashne, M., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cocrystals+of+the+DNA-binding+domain+of+phage+434+repressor+and+a+synthetic+phage+434+operator.">Cocrystals of the DNA-binding domain of phage 434 repressor and a synthetic phage 434 operator.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 1307-1311 (1984).</li><li>Timsit, Y., Moras, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+self-fitting:+the+double+helix+directs+the+geometry+of+its+supramolecular+assembly.">DNA self-fitting: the double helix directs the geometry of its supramolecular assembly.</a> Embo J. 13, 2737-2746 (1994).</li><li>Chung, Y. S., Guarne, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+X-ray+diffraction+analysis+of+SeqA+bound+to+a+pair+of+hemimethylated+GATC+sites.">Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of SeqA bound to a pair of hemimethylated GATC sites.</a> Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 64, 567-571 (2008).</li><li>DeLano, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The PyMOL Molecular Graphic Systems. , (2002).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Makromoleküler X-ışını kristalografisi en büyük zorluklardan biri difraksiyon kaliteli kristaller elde edilir. Protein veya protein-DNA kompleksleri halinde, bu sorun optimize edilmesi gerekmektedir ilave değişkenlere bağlı olarak daha da artmaktadır. Bu yaygın DNA uzunluğu ve yapışkan çıkıntılar varlığında daha uzun bir yarı-ana dubleks parametrelerini optimize etmek için olan komşu DNA moleküllerinin ilişki artırmak için düşünülmektedir. Bununla birlikte, bu çıkıntılar doğası ve...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog # </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> TRIS </td><td> Bioshop </td><td> TRS003.5 </td><td></td></tr><tr><td> Etilendiamintetraasetik asit (EDTA) </td><td> Fisher Scientific </td><td> E478-500 </td><td></td></tr><tr><td> Dithiotheitrol (DTT) </td><td> Bio Basic Inc </td><td> DB0058 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Bioshop </td><td> SOD002.10 </td><td></td></tr><tr><td> Gliserin </td><td> Caledon </td><td> 5350-1 </td><td></td></tr><tr><td> Sakaroz </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5016-500G </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum dodesil sülfat (SDS) </td><td> Bioshop </td><td> SDS001.500 </td><td></td></tr><tr><td> Üre </td><td> Bioshop </td><td> URE001.5 </td><td></td></tr><tr><td> 40% 29:1 Bis / akrilamit </td><td> Bio Basic Inc </td><td> A0007-500ml </td><td> 4 ° C&#39;de saklayın </td></tr><tr><td> Asit borik </td><td> EMD </td><td> BX0865-1 </td><td></td></tr><tr><td> Ksilen cyanol FF </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0423 </td><td></td></tr><tr><td> Bromophenol Mavi </td><td> Bioshop </td><td> BR0222 </td><td></td></tr><tr><td> Çift Ayarlanabilir Dikey Jel Sistemi </td><td> CBC Bilimsel Company Inc </td><td> DASG-250 </td><td></td></tr><tr><td> Endeks kristalizasyon ekranı </td><td> Hampton Araştırma </td><td> HR2-144 </td><td> 4 ° C&#39;de saklayın </td></tr><tr><td> Sihirbazı Ben kristalizasyon ekranı </td><td> Zümrüt BioSystems </td><td> EBS-WIZ-1 </td><td> 4 ° C&#39;de saklayın </td></tr><tr><td> Wizard II kristalizasyon ekranı </td><td&gt; Zümrüt BioSystems </td><td> EBS-WIZ-2 </td><td> 4 ° C&#39;de saklayın </td></tr><tr><td> Klasikler kristalizasyon ekranı </td><td> Qiagen </td><td> 130701 </td><td> 4 ° C&#39;de saklayın </td></tr><tr><td> Intelliplate tepsileri </td><td> Sanat Robbins Aletleri </td><td> 102-0001-00 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Çözümler Protein saflaştırma tamponu: 100 mM Tris pH 8, 2 mM EDTA, 2 mM DTT,% 5 gliserol. Protein saklama tamponu: 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl, 5 mM DTT, 0.5 mM EDTA,% 5 gliserol. Jel yükleme karışımı: otoklavlanmış GKD 2 O. 70 ml kadar sakaroz ve 20 g, bromofenol mavi 25 mg, ksilen cyanol FF 25 mg,% 10 w / v SDS, 1 ml ve 10X TBE 10 ml Sukroz eriyene kadar hafif ısıtma ile karıştırın ve nihai ayarlayınhacmi 100 otoklavlanmış GKD 2 O. ml 4 ° C&#39;de depolayın 2X yükleme tamponu: jel yükleme karışımı 10 ml üre, 11 g ekleyin. Üre eriyinceye kadar sıcak tabakta karıştırın. 4 az 2 ml tüpler ve mağaza kısım ° C. 10X PAGE karışımı: Karışım üre 420,4 g, 10X TBE 100 ml (otoklavlanmış),% 40, 250 ml 29:1 GKD 2 O. Bis / akrilamid Tamamen çözülene kadar karıştırın ve 1 litrelik hacim ayarlayın. 4 ° C&#39;de karanlıkta şişelerde saklayın 10X TBE: eritilir 108 g TRIS, GKD 2 O. 1 litre borik asit ve 55 g EDTA ve 9.3 g Otoklav oda sıcaklığında depolanır. Elüsyon tamponu: GKD 2 O. 200 ml 5 M NaCI, 1 M Tris, pH 7.5, 0.5 M EDTA, pH 8, 0,4 ml, 2 ml seyreltik 8 ml Otoklav oda sıcaklığında depolanır. </td></tr></tbody></table&gt;

iterative optimization of dna duplexes for crystallization of seqa-dna complexes

Escherichia coli SeqA çoğaltma 1 kökeni olan iyon hemimethylated GAİK kümelere göre prematüre reinitiation olayları önler DNA replikasyonunun negatif düzenleyicisidir. Kökeni ötesinde, SeqA çoğaltma çatal, daha yüksek sıralı yapılarına yeni çoğaltılmış DNA düzenlemektedir 2 de bulunur. SeqA ortakları yalnızca zayıf tek GAİK dizilerine sahip, ancak birden çok GAİK siteleri içeren DNA dubleksler yüksek afinite kompleksleri oluşturur. SeqA arasında en az işlevsel ve yapısal birim böylece hemimethylated DNA 3 ile yüksek afiniteli kompleks oluşumu için en az iki GAİK dizileri ihtiyacını açıklayan bir dimer. Ayrıca, oligomerizasyonun ve esnek bir bağlayıcı ile ayrılmış DNA-bağlayıcı etki ile SeqA mimarisi, üç helisel tur kadar ayrılmış GAİK tekrarlar için bağlayıcı sağlar. Bu nedenle, bir moleküler düzeyde SeqA fonksiyonu anlama yapısal ana gerektirirSeqA parçalanma birden GAİK dizileri bağlanmıştır. Protein-DNA kristalizasyon DNA, protein ve DNA göreceli boyutları ve mimariye bağlı olarak ambalaj etkileşimleri üzerinde olağanüstü bir etkisi yok olabilir. Protein veya DNA izleri, DNA&#39;nın çoğu daha büyük ise, kristal paketleme öncelikle protein-protein etkileşimleri aracılığı ile ortaya çıkmaktadır. Tersine, protein DNA ile aynı büyüklükte veya daha az olduğu veya sadece DNA, DNA-DNA, DNA-protein etkileşimlerinin bir kısmını kapsayan zaman kristal paketleme hakim. Bu nedenle, protein-DNA kompleksleri kristalleşme DNA uzunluğu 4 ile DNA uçları (küt çıkıntı veya) 5-7 sistematik olarak tarama gerektirir. Bu yazıda, tasarımı optimize, arındırmak ve yapı tayini için uygundur kristaller elde SeqA bir dimerik varyantı (SeqAΔ (41-59)-A25R) ile kompleks içinde tandem GAİK tekrarlar içeren hemimethylated DNA dubleksler kristalize nasıl açıklar.

Watch this Scientific Journal Video about Iterative Optimization of DNA Duplexes for Crystallization of SeqA-DNA Complexes at JoVE.com

Iterative Optimization of DNA Duplexes for Crystallization of SeqA-DNA Complexes

Protein-DNA kompleksleri Kristal yapısı, protein işlevi, etki mekanizması, aynı zamanda, belirli bir etkileşimin doğasını ilişkin bilgi sağlayabilir. Burada ile birlikte kristalleşme için uzunluk, sekans ve dupleks DNA uçları optimize etmek için rapor<em&gt; Escherichia coli</em&gt; SeqA, çoğaltma inisiyasyon negatif regülatörü.

SeqA-DNA kompleksleri kristalleşmesi için DNA dupleksler optimizasyonu İteratif

Escherichia coli SeqA is a negative regulator of DNA replication that prevents premature reinitiation events by sequestering hemimethylated GATC clusters ...

iterative-optimization-dna-duplexes-for-crystallization-seqa-dna

Research

JoVE Journal

Biology

9.9K Görüntüleme.  McMaster University. Protein-DNA kompleksleri Kristal yapısı, protein işlevi, etki mekanizması, aynı zamanda, belirli bir etkileşimin doğasını ilişkin bilgi sağlayabilir. Burada ile birlikte kristalleşme için uzunluk, sekans ve dupleks DNA uçları optimize etmek için rapor Escherichia coli SeqA, çoğaltma inisiyasyon negatif regülatörü.

Video: Iterative Optimization of DNA Duplexes for Crystallization of SeqA-DNA Complexes

Combining Wet and Dry Lab Techniques to Guide the Crystallization of Large Coiled-coil Containing Proteins

Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are found throughout nature, however, because of their physical properties and tendency to aggregate, they are traditionally viewed as being especially difficult to crystallize. Here, we utilize a variety of quick and simple techniques designed to identify a series of possible domain boundaries for a given coiled-coil protein, and then quickly characterize the behavior of these proteins in solution. With the addition of a strongly fluorescent tag (mRuby2), protein characterization is simple and straightforward. The target protein can be readily visualized under normal lighting and can be quantified with the use of an appropriate imager. The goal is to quickly identify candidates that can be removed from the crystallization pipeline because they are unlikely to succeed, affording more time for the best candidates and fewer funds expended on proteins that do not produce crystals. This process can be iterated to incorporate information gained from initial screening efforts, can be adapted for high-throughput expression and purification procedures, and is augmented by robotic screening for crystallization.

We describe a framework incorporating straightforward biochemical and computational analysis to guide the characterization and crystallization of large coiled-coil domains. This framework can be adapted for globular proteins or extended to incorporate a variety of high-throughput techniques.

Islak ve kuru Lab Teknikleri birleştiren Büyük Spiral-coil İçeren Proteinler kristalleşmesini Kılavuzu

Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are ...

Biyokimya

Self-assembly of Complex Two-dimensional Shapes from Single-stranded DNA Tiles

Current methods in DNA nano-architecture have successfully engineered a variety of 2D and 3D structures using principles of self-assembly. In this article, we describe detailed protocols on how to fabricate sophisticated 2D shapes through the self-assembly of uniquely addressable single-stranded DNA tiles which act as molecular pixels on a molecular canvas. Each single-stranded tile (SST) is a 42-nucleotide DNA strand composed of four concatenated modular domains which bind to four neighbors during self-assembly. The molecular canvas is a rectangle structure self-assembled from SSTs. A prescribed complex 2D shape is formed by selecting the constituent molecular pixels (SSTs) from a 310-pixel molecular canvas and then subjecting the corresponding strands to one-pot annealing. Due to the modular nature of the SST approach we demonstrate the scalability, versatility and robustness of this method. Compared with alternative methods, the SST method enables a wider selection of information polymers and sequences through the use of de novo designed and synthesized short DNA strands.

DNA tiling is an effective approach to make programmable nanostructures. We describe the protocols to construct complex two-dimensional shapes by the self-assembly of single-stranded DNA tiles.

Tek iplikli DNA Fayans Complex iki boyutlu şekiller Self-montaj

Current methods in DNA nano-architecture have successfully engineered a variety of 2D and 3D structures using principles of self-assembly. In this ...

Kimya

Stable DNA Motifs, 1D and 2D Nanostructures Constructed from Small Circular DNA Molecules

This article presents a detailed protocol for synthesis of small circular DNA molecules, annealing of circular DNA motifs, and construction of 1D and 2D DNA nanostructures. Over decades, the rapid development of DNA nanotechnology is attributed to the use of linear DNAs as the source materials. For example, the DAO (double crossover, antiparallel, odd half-turns) tile is well-known as a building block for construction of 2D DNA lattices; the core structure of DAO is made from two linear single-stranded (ss) oligonucleotides, like two ropes making a right hand granny&#160;knot. Herein, a new type of DNA tiles called cDAO (coupled DAO) are built using a small circular ss-DNA of c64nt or c84nt (circular 64 or 84 nucleotides) as the scaffold strand and several linear ss-DNAs as the staple strands. Perfect 1D and 2D nanostructures are assembled from cDAO tiles: infinite nanowires, nanospirals, nanotubes, nanoribbons; and finite nano-rectangles. Detailed protocols are described: 1) preparation by T4 ligase and purification by denaturing PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis) of small circular oligonucleotides, 2) annealing of stable circular tiles, followed by native PAGE analysis, 3) assembling of infinite 1D nanowires, nanorings, nanospirals, infinite 2D lattices of nanotubes and nanoribbons, and finite 2D nano-rectangles, followed by AFM (Atomic Force Microscopy) imaging. The method is simple, robust, and affordable for most labs.

This article presents a detailed protocol for T4 ligation and denaturing PAGE purification of small circular DNA molecules, annealing and native PAGE analysis of circular tiles, assembling and AFM imaging of 1D and 2D DNA nanostructures, as well as agarose gel electrophoresis and centrifugation purification of finite DNA nanostructures.

İstikrarlı DNA motifleri, 1D ve 2D nanoyapıların küçük dairesel DNA molekülleri inşa

This article presents a detailed protocol for synthesis of small circular DNA molecules, annealing of circular DNA motifs, and construction of 1D and 2D ...

Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial crystallography experiments at both synchrotrons and XFELs. The method is based upon an understanding of the protein crystal phase diagram, and how that knowledge can be utilized. The method is divided into three stages: (1) optimizing crystal morphology, (2) transitioning to batch, and (3) scaling. Stage 1 involves finding well diffracting, single crystals, hopefully but not necessarily, presenting in a cube-like morphology. In Stage 2, the Stage 1 condition is optimized by crystal growth time. This strategy can transform crystals grown by vapor diffusion to batch. Once crystal growth can occur within approximately 24 h, a morphogram of the protein and precipitant mixture can be plotted and used as the basis for a scaling strategy (Stage 3). When crystals can be grown in batch, scaling can be attempted, and the crystal size and concentration optimized as the volume is increased. Endothiapepsin has been used as a demonstration protein for this protocol. Some of the decisions presented are specific to endothiapepsin. However, it is hoped that the way they have been applied will inspire a way of thinking about this procedure that others can adapt to their own projects.

The aim of this article is to give the viewer a solid understanding of how to transform their small-volume, vapor-diffusion protocol, for growing large, single protein crystals, into a large-volume batch micro-crystallization method for serial crystallography.

Seri Kristalografi Deneyleri için Endotiapepsin Kristallerinin Büyümesini Optimize Etme

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

CD Spectroscopy to Study DNA-Protein Interactions

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent advancements in CD spectroscopy have enabled the study of DNA-protein interactions and conformational dynamics of DNA in different microenvironments in detail for a better understanding of transcriptional regulation in vivo. The area around a potential transcription zone needs to be unwound for transcription to occur. This is a complex process requiring the coordination of histone modifications, binding of the transcription factor to DNA, and other chromatin remodeling activities. Using CD spectroscopy, it is possible to study conformational changes in the promoter region caused by regulatory proteins, such as ATP-dependent chromatin remodelers, to promote transcription. The conformational changes occurring in the protein can also be monitored. In addition, queries regarding the affinity of the protein towards its target DNA and sequence specificity can be addressed by incorporating mutations in the target DNA. In short, the unique understanding of this sensitive and inexpensive method can predict changes in chromatin dynamics, thereby improving the understanding of transcriptional regulation.

The interaction of an ATP-dependent chromatin remodeler with a DNA ligand is described using CD spectroscopy. The induced conformational changes on a gene promoter analyzed by the peaks generated can be used to understand the mechanism of transcriptional regulation.

DNA-Protein Etkileşimlerini İncelemek için CD Spektroskopisi

Circular dichroism (CD) spectroscopy is a simple and convenient method to investigate the secondary structure and interactions of biomolecules. Recent ...

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The availability of atomic resolution structures provides a deep and unique understanding of protein function, and helps to unravel the inner workings of the living cell. To date, 86% of the Protein Data Bank (rcsb-PDB) entries are macromolecular structures that were determined using X-ray crystallography.
To obtain crystals suitable for crystallographic studies, the macromolecule (e.g. protein, nucleic acid, protein-protein complex or protein-nucleic acid complex) must be purified to homogeneity, or as close as possible to homogeneity. The homogeneity of the preparation is a key factor in obtaining crystals that diffract to high resolution (Bergfors, 1999; McPherson, 1999).
Crystallization requires bringing the macromolecule to supersaturation. The sample should therefore be concentrated to the highest possible concentration without causing aggregation or precipitation of the macromolecule (usually 2-50 mg/ mL). Introducing the sample to precipitating agent can promote the nucleation of protein crystals in the solution, which can result in large three-dimensional crystals growing from the solution. There are two main techniques to obtain crystals: vapor diffusion and batch crystallization. In vapor diffusion, a drop containing a mixture of precipitant and protein solutions is sealed in a chamber with pure precipitant. Water vapor then diffuses out of the drop until the osmolarity of the drop and the precipitant are equal (Figure 1A). The dehydration of the drop causes a slow concentration of both protein and precipitant until equilibrium is achieved, ideally in the crystal nucleation zone of the phase diagram. The batch method relies on bringing the protein directly into the nucleation zone by mixing protein with the appropriate amount of precipitant (Figure 1B). This method is usually performed under a paraffin/mineral oil mixture to prevent the diffusion of water out of the drop.
Here we will demonstrate two kinds of experimental setup for vapor diffusion, hanging drop and sitting drop, in addition to batch crystallization under oil.

The 3-D structure of a molecule provides a unique understanding of how the molecule functions. The principal method for structure determination at near-atomic resolution is X-ray crystallography. Here, we demonstrate the current methods for obtaining three-dimensional crystals of any given macromolecule that are suitable for structure determination by X-ray crystallography.

X-ray Kristalografi Protein Kristalizasyon

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

Biyoloji

Design and Synthesis of a Reconfigurable DNA Accordion Rack

DNA nanostructure-based mechanical systems or DNA nanomachines, which produce complex nanoscale motion in 2D and 3D in the nanometer to &#229;ngstr&#246;m resolution, show great potential in various fields of nanotechnology such as the molecular reactors, drug delivery, and nanoplasmonic systems. The reconfigurable DNA accordion rack, which can collectively manipulate a 2D or 3D nanoscale network of elements, in multiple stages in response to the DNA inputs, is described. The platform has potential to increase the number of elements that DNA nanomachines can control from a few elements to a network scale with multiple stages of reconfiguration.
In this protocol, we describe the entire experimental process of the reconfigurable DNA accordion rack of 6 by 6 meshes. The protocol includes a design rule and simulation procedure of the structures and a wet-lab experiment for synthesis and reconfiguration. In addition, analysis of the structure using TEM (transmission electron microscopy) and FRET (fluorescence resonance energy transfer) is included in the protocol. The novel design and simulation methods covered in this protocol will assist researchers to use the DNA accordion rack for further applications.

We describe the detailed protocol for design, simulation, wet-lab experiments, and analysis for a reconfigurable DNA accordion rack of 6 by 6 meshes.

Tasarım ve Reconfigurable DNA akordeon raf sentezi

DNA nanostructure-based mechanical systems or DNA nanomachines, which produce complex nanoscale motion in 2D and 3D in the nanometer to &#229;ngstr&#246;m ...

Biyomühendislik

Analyzing and Building Nucleic Acid Structures with 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures. Protocol 1 lists the set of instructions needed to download and install the software. This is followed, in Protocol 2, by the analysis of a nucleic acid structure, including the assignment of base pairs and the determination of rigid-body parameters that describe the structure and, in Protocol 3, by a description of the reconstruction of an atomic model of a structure from its rigid-body parameters. The most recent version of 3DNA, version 2.1, has new features for the analysis and manipulation of ensembles of structures, such as those deduced from nuclear magnetic resonance (NMR) measurements and molecular dynamic (MD) simulations; these features are presented in Protocols 4 and 5. In addition to the 3DNA stand-alone software package, the w3DNA web server, located at <a href="http://w3dna.rutgers.edu" target="_blank">http://w3dna.rutgers.edu</a>, provides a user-friendly interface to selected features of the software. Protocol 6 demonstrates a novel feature of the site for building models of long DNA molecules decorated with bound proteins at user-specified locations.

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures.

3DNA ile Nükleik Asit Yapıları analiz ve Yapı

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic ...

Amfifilik DNA Nanoyıldızlarından veya C-Yıldızlarından Çok Yönlü Biyomoleküler Kondensatlar

Synthetic Condensates and Cell-Like Architectures from Amphiphilic DNA Nanostructures

Synthetic droplets and condensates are becoming increasingly common constituents of advanced biomimetic systems and synthetic cells, where they can be used to establish compartmentalization and sustain life-like responses. Synthetic DNA nanostructures have demonstrated significant potential as condensate-forming building blocks owing to their programmable shape, chemical functionalization, and self-assembly behavior. We have recently demonstrated that amphiphilic DNA "nanostars", obtained by labeling DNA junctions with hydrophobic moieties, constitute a particularly robust and versatile solution. The resulting amphiphilic DNA condensates can be programmed to display complex, multi-compartment internal architectures, structurally respond to various external stimuli, synthesize macromolecules, capture and release payloads, undergo morphological transformations, and interact with live cells. Here, we demonstrate protocols for preparing amphiphilic DNA condensates starting from constituent DNA oligonucleotides. We will address (i) single-component systems forming uniform condensates, (ii) two-component systems forming core-shell condensates, and (iii) systems in which the condensates are modified to support in vitro transcription of RNA nanostructures.

Yazar Spotlight: Programlanabilir Amfifilik DNA Nanoyapılarından Sentetik Hücreler Geliştirme

We present a protocol for preparing synthetic biomolecular condensates consisting of amphiphilic DNA nanostars starting from their constituent DNA oligonucleotides. Condensates are produced from either a single nanostar component or two components and are modified to sustain in vitro transcription of RNA from an embedded DNA template.

Amfifilik DNA Nanoyapılarından Sentetik Kondensatlar ve Hücre Benzeri Mimariler

Synthetic droplets and condensates are becoming increasingly common constituents of advanced biomimetic systems and synthetic cells, where they can be ...

SeqA-DNA kompleksleri kristalleşmesi için DNA dupleksler optimizasyonu İteratif

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Islak ve kuru Lab Teknikleri birleştiren Büyük Spiral-coil İçeren Proteinler kristalleşmesini Kılavuzu

Tek iplikli DNA Fayans Complex iki boyutlu şekiller Self-montaj

İstikrarlı DNA motifleri, 1D ve 2D nanoyapıların küçük dairesel DNA molekülleri inşa

Seri Kristalografi Deneyleri için Endotiapepsin Kristallerinin Büyümesini Optimize Etme

DNA-Protein Etkileşimlerini İncelemek için CD Spektroskopisi

X-ray Kristalografi Protein Kristalizasyon

Tasarım ve Reconfigurable DNA akordeon raf sentezi

3DNA ile Nükleik Asit Yapıları analiz ve Yapı

Amfifilik DNA Nanoyapılarından Sentetik Kondensatlar ve Hücre Benzeri Mimariler

Amfifilik DNA Nanoyapılarından Sentetik Kondensatlar ve Hücre Benzeri Mimariler