Bu araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri, NINDS de İntramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir. Yazarlar düzenleme ile yardım için mikroskop ve Pamela C. Eleme ile yardım için Moleküler Tıp ve Nörobilim, Rick Dreyfuss ve Laboratuvar tüm üyelerine teşekkür etmek istiyorum.

Not: öncül ve nöral oligodendrocytic soy hücreleri rutin kültürü için inkübasyon 37 ° C&#39;de nemlendirilmiş bir% 5 CO2 atmosfer içinde gerçekleştirilir. Her 2 gün, kültür ortamı% 40-70 oranında konfluent ise taze aracı madde içinde 50 ila% 100 kullanılarak değiştirilir. Yakınlarındaki confluency sırasında, kültürler genellikle bir haftalık çalışma programı üzerinde 2-2.5e6/T75 şişeyi de geçişli edilmektedir. 1. Kaplı Flask hazırlanması <ol><li> Kaplanmış şişeler daha sonra deiyonize su (DI-su) ile ceket T75 şişeleri, 100 ml poli-D-lizin (PDL) ve 5 mg seyreltik hazırlamak için, 50 mg / karanlık içinde oda sıcaklığında (RT) PDL ml. 1 ½ saat sonra, PDL aspire ve DI-su ile bir kez durulama şişeler. Hücrelerine bağlanır (Tablo 1) tohumlu önce kuru şişeler izin verin. </li></ol> 2. Progenitör türetilmiş Oligodentrositler (PDO) içine Sinir progenitör hücreleri farklanma Başlangıç Için protokolİnsan MSS progenitör hücrelerin Olate önceki bir yayında açıklanan ve bu protokolün 1 parçası değildir. İnsan MSS progenitör hücrelerin NIH kurallara uygun olarak elde edilen bir 8 haftalık gebe fetal beynin telencephalon izole edilmiştir. <ol><li> 25 ng / ml bFGF ve 20 ng / ml, epidermal büyüme faktörü (EGF) (Şekil 1A) ile takviye neurobasal ortamda PDL kaplanmış şişeler üzerinde sinir projenitör hücrelerin multipotential nüfus büyütün. Geçişi 11 (p11) daha yüksek ise bunları kullanmayın. </li><li> Kültür yaklaşık% 70 birleşik olduğunda nöral progenitör hücrelerin ayırt başlayın. </li><li> Sığır serum albumin, L-glutamin, gentamisin, N2 bileşenleri, T3, Şşş, NT-3, bFGF ve PDGF-AA (Tablo 1) ile desteklenmiş serumsuz DMEM / HAMS F12 01:01 orta kullanarak tam farklılaşma oligodendrosit orta Yap . Bu ortam, büyüme faktörleri (oligo orta + GF) ile oligo ortamı olarak tanımlanır. </li><li> Progen kaldırşişelerinden alınmış itor ortamı ile bir kez durulama hücreler fosfat-tamponlu salin (PBS) ile, daha sonra oligo orta eklemek + GF oligodendrosit farklılaşma başlatmak için (2.3 anlatılan ayrıntılar). Oligodendrocytic soy taahhüt Sadece hücrelerinin (Şekil 1B) artacak. 3 hafta için bu ortam içinde kültür hücreleri. </li><li> Her hafta, hücreler% 90-95 izdiham, geçit onları tripsin (% 0.05)-EDTA (% 0.1) (a T75 şişesi için 4 ml) kullanarak olduğunda. 50 ml&#39;lik bir konik tüpe pasajlanmağa devam edilmesi için hücrelerin tüm orta aktarma; bu şartlı ortam tripsin gidermek için kullanılır. Hücrelerin kurumasına değil emin olun. Sonra tripsin ekleyin. </li><li> Nazikçe hücre ayırma yardımcı olmak için şişeye birkaç kez dokunarak, oda sıcaklığında 5 dakika için hücreler tripsin ile inkübe edin. </li><li> Müstakil hücreleri ile şişeye şartlı ortam 4-5 ml ilave edilerek tripsin dindir. </li><li> Aynı 50 ml konik bir tüp için orta ve hücre transfer edin. 1.200 rpm (~ azından orta ve hücreler santrifüje300 xg) RT az 5 dakika. </li><li> Süpernatan aspire tüpü yavaşça devrilmesi, hücre pelet tekrar süspansiyon ve daha sonra taze ortam oligo + GF ekleyin. Yavaşça pipet orta ve hücreler yukarı ve aşağı bir üniforma hücre süspansiyonu yapmak. </li><li> Her bir yeni PDL-kaplı T75 şişeye hücreleri, ve transfer 2.5e6 sayın. </li></ol> 3. Oligodentrositler Arasındaki Farklılığın Nihai Adım <ol><li> Oligo orta + GF, hücrelerin% 70-80 izdiham olan kültür 3 hafta sonra, farklılaşma son işlem (Şekil 1C) başlatın. </li><li> Oligo orta + GF olduğu gibi aynı şekilde, ama dört GF ilave edilmeden orta hazırlayın: Shh, NT-3, bFGF ve PDGF-AA. GF - dört GF olmadan Bu orta oligo ortamı olarak tanımlanır. </li><li> Şişesi oligo orta + GF aspire, bir kez PBS ile yıkayın ve daha sonra ortam 16 ml toplam hacim eklemek, oligo aracı olan ¾ (12 ml) - GF ve ¼ (4 ml) bir PDN şartlı ortam olduğu için, 6-10 Gün). PDN şartlandırılmış ortam kullanılması da farklılaşma için ya da hücrelerin hayatta kalması için kritik değildir. Biz aslında ko-kültür deneyleri PDN hücreleri ile PDO yalnızca doğrudan temas PDO hayatta kalma süresine bir etkisinin olmadığı görülmüştür. Oligo orta sağkalım süresi - PDO hücreleri PDN hücreleri ile birlikte kültüre eğer GF iki veya üç hafta uzatılabilir olabilir. PDN içine insan nöral progenitör hücrelerin ayırt etmek için protokolü önceki bir yayında açıklanan ve bu protokolün 1 parçası değildir. Çoklu süreçleri (Şekil 1D) ile hücrelerin giderek farklılaşmış kültür kültür ortamı sonuçları Büyüme faktörü çekilmesi. </li></ol> 4. Akış Sitometri Assay Flow sitometri testi kendi ebeveyn nüfusun olanlarla ilişki içinde farklılaşma sürecinde oligodendrosit belirteçlerin edinimi karşılaştırır. <ol><li> Nöral pro kullanınkontrol olarak genitörleridir. Oligo orta + GF poli-D-lizin ile kaplı iki T75 şişeler 2.5x10 6 hücrelerini Tohum PDO hücreleri. </li><li> GF - Diğer matara oligo orta varken Bir hafta sonra, hücre canlılığı için bir kontrol kültürü olarak matara taze oligo orta + GF ile orta değiştirin. </li><li> Hem medya PDO hücreleri ayırmak için 20 U / papain ml tripsin kullanılması uygun değildir. Papain hücre morfolojisini koruyan ayrışma sırasında hücreler üzerinde yumuşak bir etkiye sahip olmasıdır. </li><li> Papain bir şişeye Earle Dengeli Tuz Çözeltisi (EBSS) 5 ml ilave edilir. 10 dakika için ya da papain tamamen çözündürüldü ve çözelti berrak görünene kadar, 37 ° C &#39;de şişe yerleştirin. Bu hücreler ayrıştırmak için kullanılan papain çözümdür. </li><li> Bir deoksiribonükleaz I (Dnase) şişenin (Tablo 1) ile EBSS 0.5 ml ilave edilir. Yavaşça karıştırın. Çözünmüş papain şişeye bu çözeltinin 0.25 ml ilave edilir. Bu karışım yaklaşık olarak 20 U / ml, papain ve 0 olan bir nihai konsantrasyonda içerir.005% DNaz. </li><li> 15-30 dakika için 37 ° C sıcaklıkta inkübe hücreleri ve üzerinde yer papain çözelti (yukarıda açıklandığı gibi), bir mikroskop kullanılarak hücrelerin ayrılması izler. Ile ya da 7 dakika boyunca 1,200 rpm&#39;de santrifüj ile GF olmadan ortam 5 ml reaksiyon durdurun. </li><li> İki farklı 5 ml polipropilen tüplere içine de şişelerinden alınmış hücre peletleri aktarın ve normal fizyolojik ortam (UÖM: 145 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 10 mM HEPES ve 10 mM glukoz) ile yıkayınız 1 mg / ml ile takviye sığır serum albümin (YKY + BSA). </li><li> Yüzey 4&#39;te immün gerçekleştirme ° GalC (Tablo 2), A2B5, O4 için spesifik ve uygun bir şekilde titre birincil antikor kullanılarak 20 dakika için C&#39;dir. </li><li> 5 dk için 4 ° C sıcaklıkta NPM + BSA ile yıkayın hücrelerini ve 20 dakika (tablo 2) için 4 ° C sıcaklıkta belirli sekonder antikor ile inkübe edilir. </li><li> Nestin, glial fibriler asidik protein (GFAP), sınıf III ve olmaya da dahil intraselüler antijenlere leke içinta,-tubulin, ve miyelin bazik protein (MBP) (Tablo 2), oda sıcaklığında 20 dakika boyunca% 2 paraformaldehid (PFA) hücreleri düzeltmek ve -20 ° C &#39;de 15 dakika süreyle soğuk% 70 etanol ile geçirgen </li><li> 1x PBS ile hücreleri yıkayın ve spesifik sekonder antikor (Tablo 2) ile inkübe edin. </li><li> Flow sitometri analizi sırasında sağlam hücre ve hücre içi moloz arasında ayrımcılık için, 4,6-diamidino-2-phenyllindole, dihidroklorür (DAPI) (Life Technologies, Grand Island, NY) ile hücreler leke. </li><li> Yukarıdaki protokol optimize, biz her immunoreagent özgünlüğünü doğrulamak için tüm uygun kontrol deneyleri yapılmaktadır. Kısaca, direkt olarak etiketlenen antikorlar için, uygun negatif kontrol birincil antikor (örneğin, izotip kontrol) ile aynı izotip immünoglobulin sınıfı (ya da alt sınıfı) ile florokrom konjugat bir direkt olarak konjuge antikor idi. Primer antikor indirekt immün, uygun negatif kontrol w içinözellikle birincil antikor oluşturulduğu ana immünoglobulin sınıfı (ya da alt sınıfı) hedeflenen ki ilgi florokrom ile konjuge sekonder antikor olarak. Birden çok konaklardan (fare, tavşan, tavuk) primer antikorları birlikte kullanıldığı zaman, genellikle en aza indirmek için çapraz diğer bilgisayarlardan gelen immünoglobulinler karşı çapraz adsorblanmıştır kullanılan her ana ve her sekonder antikor primer antikor hedefleyen ikincil antikor kullanılır immunreaktivitesi barındırabilir. Pozitif kontroller bu antijenlere spesifik primer antikorlar ile doğrudan veya dolaylı immunoreactions kullanarak ilgi antijenleri ifade bilinen hücre hazırlıkları doğrudan veya dolaylı immün dahildir. Yukarıdaki optimizasyon yöntemleri immüno-deney her türü için bir kez yapılmıştır. Kontrol immunoreactions birincil ve ikincil antikorlar arasında anlamlı çapraz epitopu immünreaktivitesi saptandı. Flow sitometri düzgün yapıldı488 nm, 647 nm ayarlı uyarma dalgaboyu sağlayan üç lazer ile donatılmış bir FACVantage SE hücre sıralayıcı (BD Biosciences, San Jose, CA), ve geniş bir UV (351-364 nm) (Şekil 2) kullanılarak askıya floresan etiketli hücreleri . </li></ol> 5. İmmünofloresan Assay Not: immünofloresan denemeleri için PDO oligo orta + GF veya oligo orta kaplanıyor - PDL ile kaplı 6 kuyucuğu içinde 2.5e5 de GF. Hücre büyüme faktörlerinin çekilmesinden sonra çeşitli zaman noktalarında% 2 PFA ile tespit edilir. Leke antikor Plastik 6 kuyucuğu yerine cam lameller üzerine yapılır. <ol><li> Ortamı çıkarın ve% 2 PFA ekleyin. Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edilir. PFA atın. PBS, 5 dakika süre ile her hücreler 3 kez yıka. Hücrelerin kurumasına için dikkatli olun. </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS içinde% 0.25 triton çözeltisi kullanılarak hücre içi belirteçler için hücreler geçirgenliği. </li><li> Spesifik olmayan bağlanma, blok hücreleri önlemek için, fya da HHG (1 mM, HEPES tamponu,% 2 at serumu, ve Hanks &#39;dengelenmiş tuz çözeltisi içinde% 10 keçi serumu) ile 10 dak. HHG içinde önceden belirlenmiş bir yoğunlaşma ile spesifik primer antikorlar (Tablo 2) seyreltilir. Hücreleri üzerine sulandırılmış antikor yerleştirin. Karıştırma cihazı üzerinde, ya da 4 ° C&#39;da gece boyunca oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. </li><li> 5 dk her zaman için, hücreler PBS ile 3 kez yıka. HHG içinde önceden belirlenmiş bir konsantrasyon ile bir florokrom ile birlikte uygun bir ikincil antikor (Tablo 2) seyreltilir. Hücreler üzerine seyreltilmiş sekonder antikor karışımı yerleştirin. Karanlıkta bir çalkalayıcı üzerinde RT inkübe 1 saat. </li><li> 5 dk her zaman için, hücreler PBS ile 3 kez yıka. </li><li> Photobleaching önlemek için hücrelere DAPI ile Altın Prolong ve bunların üstüne bir cam lamel yerleştirin 10 ul ekleyin. Bir Axiovert 200M floresans mikroskobu (Zeiss, Thornwood, NY) (Şekil 3) kullanılarak etiketli hücreler gözünüzde canlandırın. </li></ol>

<ol>
	<li>Messam, C. A., Hou, J., Gronostajski, R. M., Major, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+pathway+of+human+brain+progenitor+cells+identified+by+JC+virus+susceptibility.">Lineage pathway of human brain progenitor cells identified by JC virus susceptibility.</a> Ann. Neurol. 53, 636-646 (2003).</li><li>Vescovi, A. L., Reynolds, B. A., Fraser, D. D., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=bFGF+regulates+the+proliferative+fate+of+unipotent+(neuronal)+and+bipotent+(neuronal/astroglial)+EGF-generated+CNS+progenitor+cells.">bFGF regulates the proliferative fate of unipotent (neuronal) and bipotent (neuronal/astroglial) EGF-generated CNS progenitor cells.</a> Neuron. 11, 951-966 (1993).</li><li>Johe, K. K., Hazel, T. G., Muller, T., Dugich-Djordjevic, M. M., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+factors+direct+the+differentiation+of+stem+cells+from+the+fetal+and+adult+central+nervous+system.">Single factors direct the differentiation of stem cells from the fetal and adult central nervous system.</a> Genes Dev. 10, 3129-3140 (1996).</li><li>McKay, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+in+the+central+nervous+system.">Stem cells in the central nervous system.</a> Science. 276, 66-71 (1997).</li><li>Belachew, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+NG2+proteoglycan-expressing+progenitor+cells+are+intrinsically+multipotent+and+generate+functional+neurons.">Postnatal NG2 proteoglycan-expressing progenitor cells are intrinsically multipotent and generate functional neurons.</a> J. Cell Biol. 161, 169-186 (2003).</li><li>Almazan, G., McKay, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+oligodendrocyte+precursor+cell+line+from+rat+optic+nerve.">An oligodendrocyte precursor cell line from rat optic nerve.</a> Brain Res. 579, 234-245 (1992).</li><li>Filipovic, R., Zecevic, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+role+of+minocycline+in+co-cultures+of+human+fetal+neurons+and+microglia.">Neuroprotective role of minocycline in co-cultures of human fetal neurons and microglia.</a> Exp. Neurol. 211, 41-51 (2008).</li><li>Goldman, S. A., Natesan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+niche-defying+feat:+induced+oligoneogenesis+in+the+adult+dentate+gyrus.">A niche-defying feat: induced oligoneogenesis in the adult dentate gyrus.</a> Cell Stem Cell. 3, 125-126 (2008).</li><li>Nunes, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+isolation+of+multipotential+neural+progenitor+cells+from+the+subcortical+white+matter+of+the+adult+human+brain.">Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain.</a> Nat. Med. 9, 439-447 (2003).</li><li>Lyssiotis, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+histone+deacetylase+activity+induces+developmental+plasticity+in+oligodendrocyte+precursor+cells.">Inhibition of histone deacetylase activity induces developmental plasticity in oligodendrocyte precursor cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 14982-14987 (2007).</li><li>Sim, F. J., Goldman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=White+matter+progenitor+cells+reside+in+an+oligodendrogenic+niche.">White matter progenitor cells reside in an oligodendrogenic niche.</a> Ernst Schering Res. Found Workshop. , 61-81 (2005).</li><li>Raff, M. C., Miller, R. H., Noble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glial+progenitor+cell+that+develops+in+vitro+into+an+astrocyte+or+an+oligodendrocyte+depending+on+culture+medium.">A glial progenitor cell that develops in vitro into an astrocyte or an oligodendrocyte depending on culture medium.</a> Nature. 303, 390-396 (1983).</li><li>Windrem, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progenitor+cells+derived+from+the+adult+human+subcortical+white+matter+disperse+and+differentiate+as+oligodendrocytes+within+demyelinated+lesions+of+the+rat+brain.">Progenitor cells derived from the adult human subcortical white matter disperse and differentiate as oligodendrocytes within demyelinated lesions of the rat brain.</a> J. Neurosci. Res. 69, 966-975 (2002).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+rat+and+mouse+oligodendrocyte+precursor+cells.">Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells.</a> Nat. Protoc. 2, 1044-1051 (2007).</li><li>Armstrong, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+immature+oligodendrocyte+lineage+cells.">Isolation and characterization of immature oligodendrocyte lineage cells.</a> Methods. 16, 282-292 (1998).</li><li>Hu, B. Y., Du, Z. W., Li, X. J., Ayala, M., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+oligodendrocytes+from+embryonic+stem+cells:+conserved+SHH+signaling+networks+and+divergent+FGF+effects.">Human oligodendrocytes from embryonic stem cells: conserved SHH signaling networks and divergent FGF effects.</a> Development. 136, 1443-1452 (2009).</li><li>Gard, A. L., Williams, W. C., Burrell, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendroblasts+distinguished+from+O-2A+glial+progenitors+by+surface+phenotype+(O4+GalC-)+and+response+to+cytokines+using+signal+transducer+LIFR+beta.">Oligodendroblasts distinguished from O-2A glial progenitors by surface phenotype (O4+GalC-) and response to cytokines using signal transducer LIFR beta.</a> Dev. Biol. 167, 596-608 (1995).</li><li>Hu, B. Y., Du, Z. W., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+oligodendrocytes+from+pluripotent+stem+cells.">Differentiation of human oligodendrocytes from pluripotent stem cells.</a> Nat. Protoc. 4, 1614-1622 (2009).</li><li>Reubinoff, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+progenitors+from+human+embryonic+stem+cells.">Neural progenitors from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 19, 1134-1140 (2001).</li><li>Pfeiffer, S. E., Warrington, A. E., Bansal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+oligodendrocyte+and+its+many+cellular+processes.">The oligodendrocyte and its many cellular processes.</a> Trends Cell Biol. 3, 191-197 (1993).</li><li>Zhang, S. C., Ge, B., Duncan, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+human+oligodendroglial+development+in+vitro.">Tracing human oligodendroglial development in vitro.</a> J. Neurosci. Res. 59, 421-429 (2000).</li><li>Bradl, M., Lassmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocytes:+biology+and+pathology.">Oligodendrocytes: biology and pathology.</a> Acta Neuropathol. 119, 37-53 (2010).</li><li>Chong, S. Y., Chan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tapping+into+the+glial+reservoir:+cells+committed+to+remaining+uncommitted.">Tapping into the glial reservoir: cells committed to remaining uncommitted.</a> J. Cell Biol. 188, 305-312 (2010).</li><li>Jakovcevski, I., Filipovic, R., Mo, Z., Rakic, S., Zecevic, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte+development+and+the+onset+of+myelination+in+the+human+fetal+brain.">Oligodendrocyte development and the onset of myelination in the human fetal brain.</a> Front Neuroanat. 3, 5 (2009).</li><li>Rao, R. C., Boyd, J., Padmanabhan, R., Chenoweth, J. G., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+serum-free+derivation+of+oligodendrocyte+precursors+from+neural+stem+cell-enriched+cultures.">Efficient serum-free derivation of oligodendrocyte precursors from neural stem cell-enriched cultures.</a> Stem Cells. 27, 116-125 (2009).</li><li>D'Intino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triiodothyronine+administration+ameliorates+the+demyelination/remyelination+ratio+in+a+non-human+primate+model+of+multiple+sclerosis+by+correcting+tissue+hypothyroidism.">Triiodothyronine administration ameliorates the demyelination/remyelination ratio in a non-human primate model of multiple sclerosis by correcting tissue hypothyroidism.</a> J. Neuroendocrinol. 23, 778-790 (2011).</li><li>Cui, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+fetal+oligodendrocyte+progenitor+cells+from+different+gestational+stages+exhibit+substantially+different+potential+to+myelinate.">Human fetal oligodendrocyte progenitor cells from different gestational stages exhibit substantially different potential to myelinate.</a> Stem Cells Dev. , (2012).</li><li>Messam, C. A., Hou, J., Major, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coexpression+of+nestin+in+neural+and+glial+cells+in+the+developing+human+CNS+defined+by+a+human-specific+anti-nestin+antibody.">Coexpression of nestin in neural and glial cells in the developing human CNS defined by a human-specific anti-nestin antibody.</a> Exp. Neurol. 161, 585-596 (2000).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu protokol, birincil insan nöral progenitör hücrelerin fetal oligodendrosit türetmek ve flow sitometri ve immünfloresan boyama kullanarak hem kendi fenotip karakterize açıklamaktadır. Fetal CNS sinir progenitörlerinin genişleme ve büyüme çok iyi 1-4 tarif edilmiştir. Erişkin insan beyaz madde 5-13 glial öncüleri tanımlamak ve ayırmak mümkün olsa bile Ancak, in vitro deneyler için yeterli insan oligodendrosit elde, zor kalır. Oligodendrosit 14-21 üreten m...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Nihai konsantrasyon </td></tr><tr><td> DME / HAMS F12 01:01 </td><td> Omega Scientist </td><td> DM-251 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> Albumin Sığır </td><td> Sigma </td><td> A9418 </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> Gentamisin </td><td> Kalite Biyolojik </td><td> 120-098-031 </td><td> 50 mg / ml </td></tr><tr><td> L-Glutamine </td><td> Kalite Biyolojik </td><td> 118-084-061 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> T3 </td><td> Sigma </td><td> T2877 </td><td> 3 nM </td></tr><tr><td> N2 Bileşenleri </td><td> Gibco BRL </td><td> 17502 </td><td> 1:100 </td></tr><tr><td> NT-3, </td><td> PeproTech A.Ş. </td><td> 450-03 </td><td> 2 ng / ml </td></tr><tr><td> Şşş </td><td> Ar-Ge Sistemi </td><td> 1314-SH/CF </td><td> 2 ng / ml </td></tr><tr><td> bFGF </td><td> PeproTech A.Ş. </td><td> 100-18B </td><td> 20 ng / ml </td></tr><tr><td> PDGF-AA </td><td> PeproTech A.Ş. </td><td> 100-13A </td><td> 10 ng / ml &#39; </td></tr><tr><td> PDL </td><td> Sigma </td><td> P6407 </td><td> 50 mg / m </td></tr><tr><td> PFA </td><td> Elektron Mikroskopi Bilimleri </td><td> 15712 </td><td> % 2 </td></tr><tr><td> Tripsin </td><td> Kalite Biyolojik </td><td> 118-087-721 </td><td></td></tr><tr><td> Papain </td><td> Worthington </td><td> LK003178 </td><td> 20 U / ml </td></tr><tr><td> DNaz şişeleri </td><td> Worthington </td><td> LK003172 </td><td> 0.005% </td></tr><tr><td> EBSS </td><td> Worthington </td><td> LK003188 </td><td></td></tr><tr><td> Altın uzatmak ileDAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P36931 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tablo 1. Reaktifler. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> Birincil Abs (tüm 1 mg / ml) </td><td></td><td> Türler İzotip </td><td> Kaynak </td><td> İkincil Abs </td></tr><tr><td colspan="5"> Akış Sitometri </td></tr><tr><td> A2B5-Biotin </td><td> Fare </td><td> IgM </td><td> Hediye J. Nielson </td><td> Streptavidin PETR, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td> O4FITC </td><td> Fare </td><td> IgM </td><td> J. Nielson dan Hediye </td><td></td></tr><tr><td> A2B5 </td><td> Fare </td><td> IgM </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgM-FITC, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td> O4 </td><td> Fare </td><td> IgM </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgM-FITC, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td> GalC </td><td> Fare </td><td> IgG 3 </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgG 3-PE, Güney Biotech, AL </td></tr><tr><td> MBP </td><td> Tavuk </td><td> IGY </td><td> Millipore, MA </td><td> dαck IGY-AMCA, Jackson İmmünoreaktif., PA </td></tr><tr><td> Nestin </td><td> Fare </td><td> IgG 1 </td><td> Messam ve ark. 2000 28 </td><td> gαm IgG 1-PECy5, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td> GFAP </td><td> Tavşan </td><td> IgG </td><td> Millipore, MA </td><td> gαrb IgG-PE, Jackson İmmünoreaktif, PA </td></tr><tr><td> βIII tubulin </td><td> Fare </td><td> IgG 2 </td><td> Covance, CA </td><td> gαm IgG 2-PETR, Invitrogen, CA </td></tr><tr><td colspan="6"> İmmünositokimya </td></tr><tr><td> βIII tubulin (1:1,500) </td><td> Fare </td><td> IgG 2a </td><td> Covance, CA </td><td> gαm IgG 2a-FITC, Invitrogen, CA (1:1,000) </td></tr><tr><td> GFAP (1:1,000) </td><td> Tavşan </td><td> IgG </td><td> Millipore, MA </td><td> gαrb IgG-FITC, Jackson İmmünoreaktif, PA (1:500) </td></tr><tr><td> MBP (1:50) </td><td> Tavuk </td><td> IGY </td><td> Millipore, MA </td><td> dαck IGY-FITC, Jackson İmmünoreaktif, PA (1:100) </td></tr><tr><td> O4 (1:100) </td><td> Fare </td><td> IgM </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgM-AF546, Invitrogen, CA (1: 100) </td></tr><tr><td> GalC (1:10) </td><td> Tavşan </td><td> IgG </td><td> Millipore, MA </td><td> gαm IgM-AF750, Invitrogen, CA (1:100) </td></tr></tbody></table> . Flow sitometri ve immünsitokimya deneyleri için kullanılan Tablo 2 Antikorlar (Abs) Antikor konjugatları: PE, fikoeritrin; PETR, fikoeritrin Texas Red, AMCA, amino-metil-kumarin asetat; Cy, cyanine; FITC, floresein izotiyosiyanat Ig:. Immünoglobulin. . AF: Alexa Fluor; gαm: keçi anti-fare; gαrb: keçi anti-tavşan; dαck: eşek anti-tavuk. </td></tr></tbody></table>

progenitor-derived oligodendrocyte culture system from human fetal brain

Nöronal ve glial hücre tipleri içine insan nöral ataları Farklılaşma nöral hücre soyu gelişmenin moleküler düzenlenmesi incelemek ve karşılaştırmak için bir model sunuyor. Fetal MSS dokusu nöral progenitörlerinin vitro genişlemesi de karakterize edilmiştir. In vitro deneyler için yeterli insan oligodendrosit edinme miyelin üreten oligodentrositlere fetal nöral ataları, doğrudan farklılaşma çeşitli kültür şartlarının yetişkin insan subkortikal beyaz cevher ve geliştirme glial progenitörlerin tespiti ve izolasyonu rağmen zor kalır. Galactocerebroside + (GalC) ve O4 Farklılaşma + oligodendrosit habercisi veya nöral prekürsör hücrelerden progenitör hücrelerin (OPC) ikinci trimesterde fetal beyin kullanarak rapor edilmiştir. Ancak, bu hücreler astrositler ve nöronlar da dahil olmak üzere destek hücrelerin yokluğunda çoğalırlar yok, ve kültür zaman içinde hızla kaybolur. Gerek in vitro deneyler için uygun soy oligodendrosit hücreleri üretmek için bir kültür sistemi için devam etmektedir. Primer oligodendrosit insan kültürü, örneğin, in vivo olarak bu hücreleri enfekte eden insan polyomavirus, JCV gibi nörotropik bulaşıcı ajanların patogenezine incelemek için yararlı bir model olabilir. Bu kültür hücreleri aynı zamanda merkezi sinir sistemi (MSS) diğer demiyelinizan hastalıkların modelleri sağlayabilir. Nöronlar (progenitör türetilmiş nöronlar, PDN) ve astrositler (progenitör türetilmiş astrositler, PDA) Bu çalışmada nöral ataları ikna edilebilmesi göstermektedir içine ayırt etmek için kapasitesini koruyarak İlköğretim, insan fetal beyin-türevli, multipotential nöral progenitör hücrelerin in vitro prolifere oligodendrocytic soy geliştirme aşamaları (progenitör türetilmiş oligodendrosit, PDO) birçok yoluyla ayırt etmek. DMEM-F12 serum serbest medya Biz kültür nöral progenitör hücrelerin suptemel fibroblast büyüme faktörü (bFGF), trombosit kaynaklı büyüme faktörü (PDGF-AA), Sonic kirpi (Sus), nörotrofik faktör 3 (NT-3), N-2 ve triiyodotironin (T3) ile yürütülecek. Kültürlü hücreler yaklaşık her yedi günde 75cm matara başına 2.5e6 hücrelerini pasajlanmağa edilmektedir. Bu koşullar kullanılarak, kültürdeki hücrelerin çoğunluğunun az süreçleri ve bu gibi A2B5 ve O-4 gibi ön-oligodendrosit hücreleri, açık belirteçleri ile karakterize edilen bir morfoloji korumak. Biz dört büyüme faktörleri (GF) (bFGF, PDGF-AA, Şşş, NT-3) çıkarın ve PDN şartlandırılmış ortam eklerken, hücreler gibi GalC ve myelin oligodendrosit farklılaşma belirli daha süreçleri ve ekspres belirteçler, elde başlar bazik protein (MBP). Biz oligodendrosit eşsiz belirteçler tanımlamak amacıyla renkli akım sitometri kullanılarak fenotipik karakterizasyonu gerçekleştirilmiştir.

Bu 70% -80% konfluent nöral progenitör hücre kültürü (Şekil 1A) gelen farklılaşma sürecini başlatmak için çok önemlidir. Birçok hücreler spesifik büyüme faktörleri içeren yana progenitör gelen oligo orta kültür ortamı değiştirdikten sonra ölecek. Bu oligodendrocytic fenotipi vermeyenleri nöral progenitör hücrelerin büyüme yeni orta (Şekil 1B) tarafından desteklenen olmayacağını belirtir. Bir hafta boyunca oligo orta + GF Kuluçka dar bir, iki kutuplu...

Watch this Scientific Journal Video about Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain at JoVE.com

Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain

İlköğretim, insan fetal beyin-türevli, multipotential progenitör hücreler çoğalmaya<em&gt; In vitro</em&gt; Nöron ve astrosit içine ayırt etmek için kapasitesini koruyarak. Bu çalışma nöral ataları select büyüme faktörleri ile klima tarafından oligodendrocytic soy aşamalarında farklılaştırmak için ikna edilebilmesi gösterir.

İnsan Fetal Beyin gelen Progenitör-türetilmiş Oligodendrosit Kültür Sistemi

Differentiation of human neural progenitors into neuronal and glial cell types offers a model to study and compare molecular regulation of neural cell ...

progenitor-derived-oligodendrocyte-culture-system-from-human-fetal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.8K Görüntüleme.  National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health. İlköğretim, insan fetal beyin-türevli, multipotential progenitör hücreler çoğalmaya In vitro Nöron ve astrosit içine ayırt etmek için kapasitesini koruyarak. Bu çalışma nöral ataları select büyüme faktörleri ile klima tarafından oligodendrocytic soy aşamalarında farklılaştırmak için ikna edilebilmesi gösterir.

Video: Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ultimately give rise to intermediate progenitors and later, the various neuronal and glial cell subtypes that form the cerebral cortex. The capacity to generate and expand human NSCs (so called neurospheres) from discarded normal fetal tissue provides a means with which to directly study the functional aspects of normal human NSC development 1-5. This approach can also be directed toward the generation of NSCs from known neurological disorders, thereby affording the opportunity to identify disease processes that alter progenitor proliferation, migration and differentiation 6-9. We have focused on identifying pathological mechanisms in human Down syndrome NSCs that might contribute to the accelerated Alzheimer's disease phenotype 10,11. Neither in vivo nor in vitro mouse models can replicate the identical repertoire of genes located on human chromosome 21. 
Here we use a simple and reliable method to isolate Down syndrome NSCs from aborted human fetal cortices and grow them in culture. The methodology provides specific aspects of harvesting the tissue, dissection with limited anatomical landmarks, cell sorting, plating and passaging of human NSCs. We also provide some basic protocols for inducing differentiation of human NSCs into more selective cell subtypes.

A simple and reliable method on isolation and culture of neural stem cells from discarded human fetal cortical tissue is described. Cultures derived from known human neurological disorders can be used for characterization of pathological cellular and molecular processes, as well as provide a platform to assess pharmacological efficacy.

Atılan İnsan Fetal Kortikal Doku Sinir Kök Hücre Üretimi

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

Nörobilim

Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications for understanding the pathogenesis of demyelinating diseases such as Multiple Sclerosis (MS). Cellular development is commonly studied with primary cell culture models. Primary cell culture facilitates the evaluation of a given cell type by providing a controlled environment, free of the extraneous variables that are present in vivo. While OL cultures derived from rats have provided a vast amount of insight into OL biology, similar efforts at establishing OL cultures from mice has been met with major obstacles. Developing methods to culture murine primary OLs is imperative in order to take advantage of the available transgenic mouse lines. 
Multiple methods for extraction of OPCs from rodent tissue have been described, ranging from neurosphere derivation, differential adhesion purification and immunopurification 1-3. While many methods offer success, most require extensive culture times and/or costly equipment/reagents. To circumvent this, purifying OPCs from murine tissue with an adaptation of the method originally described by McCarthy &amp; 
de Vellis 2 is preferred. This method involves physically separating OPCs from a mixed glial culture derived from neonatal rodent cortices. The result is a purified OPC population that can be differentiated into an OL-enriched culture. This approach is appealing due to its relatively short culture time and the unnecessary requirement for growth factors or immunopanning antibodies. 
While exploring the mechanisms of OL development in a purified culture is informative, it does not provide the most physiologically relevant environment for assessing myelin sheath formation. Co-culturing OLs with neurons would lend insight into the molecular underpinnings regulating OL-mediated myelination of axons. For many OL/neuron co-culture studies, dorsal root ganglion neurons (DRGNs) have proven to be the neuron type of choice. They are ideal for co-culture with OLs due to their ease of extraction, minimal amount of contaminating cells, and formation of dense neurite beds. While studies using rat/mouse myelinating xenocultures have been published 4-6, a method for the derivation of such OL/DRGN myelinating co-cultures from post-natal murine tissue has not been described. Here we present detailed methods on how to effectively produce such cultures, along with examples of expected results. These methods are useful for addressing questions relevant to OL development/myelinating function, and are useful tools in the field of neuroscience.

This article describes methods to derive enriched populations of murine oligodendrocyte precursor cells (OPCs) in primary culture, which differentiate to produce mature oligodendrocytes (OLs). In addition, this report describes techniques to produce murine myelinating co-cultures by seeding mouse OPCs onto a neurite bed of mouse dorsal root ganglion neurons (DRGNs).

Post-natal murin Dokular Co-kültürler Myelinating zenginleştirilmiş oligodendrosit Kültürleri ve oligodendrosit / Nöron türetilmesi

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two vascular networks of the embryonic forebrain, pial and periventricular, are spatially distinctive and have different origins and growth patterns. Endothelial cells from the pial and periventricular vascular networks have unique gene expression profiles and functions. Here we present a step-by-step protocol for isolation, culture, and verification of pure populations of endothelial cells from the periventricular vascular network (PVECs) of the embryonic forebrain (telencephalon). In this approach, telencephalon devoid of pial membrane obtained from embryonic day 15 mice is minced, digested with collagenase/dispase, and dispersed mechanically into a single cell suspension. PVECs are purified from cell suspension using positive selection with anti-CD-31/PECAM-1 antibody conjugated to MicroBeads using a strong magnetic separation method. Purified cells are cultured on collagen 1&#160;coated culture dishes in endothelial cell culture medium until they become confluent and further subcultured. PVECs obtained with this protocol exhibit cobblestone and spindle shaped phenotypes, as visualized by phase-contrast light microscopy and fluorescence microscopy. Purity of PVEC cultures was established with endothelial cell markers. In our hands, this method reliably and consistently yields pure populations of PVECs. This protocol will benefit studies aimed at gaining mechanistic insights into forebrain angiogenesis, understanding PVEC interactions, and cross-talks with neuronal cell types and holds tremendous potential for therapeutic angiogenesis.

This video demonstrates an easy and reliable strategy for preparation of pure cultures of endothelial cells from the embryonic forebrain within 10-12 days and will be useful for research focused on many aspects of cerebral angiogenesis.

Embriyonik ön beyin gelen Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültürü

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the stem cell community. Many current expansion methods are laborious and costly, and those involving complete dissociation may cause several stem and progenitor cell types to undergo differentiation or early senescence. To overcome these problems, we have developed an automated mechanical passaging method referred to as &#8220;chopping&#8221; that is simple and inexpensive. This technique avoids chemical or enzymatic dissociation into single cells and instead allows for the large-scale expansion of suspended, spheroid cultures that maintain constant cell/cell contact. The chopping method has primarily been used for fetal brain-derived neural progenitor cells or neurospheres, and has recently been published for use with neural stem cells derived from embryonic and induced pluripotent stem cells. The procedure involves seeding neurospheres onto a tissue culture Petri dish and subsequently passing a sharp, sterile blade through the cells effectively automating the tedious process of manually mechanically dissociating each sphere. Suspending cells in culture provides a favorable surface area-to-volume ratio; as over 500,000 cells can be grown within a single neurosphere of less than 0.5 mm in diameter. In one T175 flask, over 50 million cells can grow in suspension cultures compared to only 15 million in adherent cultures. Importantly, the chopping procedure has been used under current good manufacturing practice (cGMP), permitting mass quantity production of clinical-grade cell products.

This protocol describes a novel mechanical chopping method that allows the expansion of spherical neural stem and progenitor cell aggregates without dissociation to a single cell suspension.&#160; Maintaining cell/cell contact allows rapid and stable growth for over 40 passages.

İnsan Nöral Agregalarının bir cGMP uygulanabilir Açılım Yöntemi kök hücrelerin pluripotent kök hücreleri veya Fetal Beyin dokusundan türetilen

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or postmitotic neurons. Later, some progenitors switch to a gliogenic fate, adding to the astrocyte and oligodendrocyte populations. Using time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cell cultures, it is possible to study the cellular and molecular mechanisms controlling the mode of cell division and cell cycle parameters of progenitor cells. Similarly, the fate of postmitotic cells can be examined using cell-specific fluorescent reporter proteins or post-imaging immunocytochemistry. More importantly, all these features can be analyzed at the single-cell level, allowing the identification of progenitors committed to the generation of specific cell types. Manipulation of gene expression can also be performed using viral-mediated transfection, allowing the study of cell-autonomous and non-cell-autonomous phenomena. Finally, the use of fusion fluorescent proteins allows the study of symmetric and asymmetric distribution of selected proteins during division and the correlation with daughter cells fate. Here, we describe the time-lapse video-microscopy method to image primary cerebral cortex murine cells for up to several days and analyze the mode of cell division, cell cycle length and fate of newly generated cells. We also describe a simple method to transfect progenitor cells, which can be applied to manipulate genes of interest or simply label cells with reporter proteins.

Live imaging is a powerful tool to study cellular behaviors in real time. Here, we describe a protocol for time-lapse video-microscopy of primary cerebral cortex cells that allows a detailed examination of the phases enacted during the lineage progression from primary neural stem cells to differentiated neurons and glia.

Primer serebral korteks hücre bir 2D kültür sistemi kullanarak görüntüleme yaşamak

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily accessible. Through this route, mature neurons can be obtained in a matter of a few weeks. Here, we describe a straightforward and rapid one-step protocol to obtain iNs from dermal fibroblasts obtained through biopsy samples from adult human donors. We explain each step of the process, including the maintenance of the dermal fibroblasts, the freezing procedure to build a stock of the cell line, seeding of the cells for reprogramming, as well as the culture conditions during the conversion process. In addition, we describe the preparation of glass coverslips for electrophysiological recordings, long-term coating conditions, and fluorescence activated cell sorting (FACS). We also illustrate examples of the results to be expected. The protocol described here is easy to perform and can be applied to human fibroblasts derived from human skin biopsies from patients with various different diagnoses and ages. This protocol generates a sufficient amount of iNs which can be used for a wide array of biomedical applications, including disease modeling, drug screening, and target validation.

Direct neuronal reprogramming generates neurons that maintain the age of the starting somatic cell. Here, we describe a single vector-based method to generate induced neurons from dermal fibroblasts obtained from adult human donors.

İnsan yetişkin cilt fibroblastlar indüklenen Neurons yüksek verimli kültürünün basit üretimi

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials through saltatory conduction. Moreover, an increasing number of reports suggest that oligodendrocytes interact with neurons beyond myelination, notably through the secretion of soluble factors. Here, we present a detailed protocol allowing purification of oligodendroglial lineage cells from glial cell cultures also containing astrocytes and microglial cells. The method relies on overnight shaking at 37 &#176;C, which allows selective detachment of the overlying oligodendroglial cells and microglial cells, and the elimination of microglia by differential adhesion. We then describe the culture of oligodendrocytes and production of oligodendrocyte-conditioned medium (OCM). We also provide the kinetics of OCM treatment or oligodendrocytes addition to purified hippocampal neurons in co-culture experiments, studying oligodendrocyte-neuron interactions.

Herein, we display an efficient method for the purification of oligodendrocytes and production of oligodendrocyte-conditioned medium that can be used for co-culture experiments.

Oligodendrocytes ve Oligodendrocyte-Ko-Kültür Deneyleri için Şartlı Orta Üretimi

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials ...

Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine neonates for the isolation of glial subpopulations. The purpose of the procedure is to dissociate microglia, oligodendrocyte progenitor cells (OPCs), and astrocytes from cortical, cerebellar, brainstem, and spinal cord tissue to facilitate further in vitro analysis. The CNS region isolation procedures allow for the determination of regional heterogeneity among glia in multiple cell culture systems. Rapid CNS region isolation is performed, followed by the mechanical removal of meninges to prevent meningeal cell contamination of glia. This protocol combines gentle tissue dissociation and plating on a specified matrix designed to preserve cell integrity and adherence. Isolating mixed glia from multiple CNS regions provides a comprehensive analysis of potentially heterogenous glia while maximizing the use of individual experimental animals. Additionally, following dissociation of regional tissue, mixed glia are further divided into multiple cell types including microglia, OPCs, and astrocytes for use in either single cell type, cell culture plate inserts, or co-culture systems. Overall, the demonstrated techniques provide a comprehensive protocol of broad applicability for careful dissection of four individual CNS regions from murine neonates and includes methods for the isolation of three individual glia cell types to examine regional heterogeneity in any number of in vitro cell culture systems or assays.

Here we present a protocol for in vitro isolation of multiple glial cell populations from a mouse CNS. This method allows for the segregation of regional microglia, oligodendrocyte precursor cells, and astrocytes to study the phenotypes of each in a variety of culture systems.

Murine glia'nın Multipl Merkezi Sinir Sistemi Bölgelerinden Diseksiyonu ve İzolasyonu

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine ...

Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining homeostasis, and during infection or injury. Several independent research groups have highlighted the central role that microglia play in autoimmune diseases, autoinflammatory syndromes and cancers. The activation of microglia in some neurological diseases may directly participate in pathogenic processes. Primary microglia are a powerful tool to understand the immune responses in the brain, cell-cell interactions and dysregulated microglia phenotypes in disease. Primary microglia mimic in vivo microglial properties better than immortalized microglial cell lines. Human adult microglia exhibit distinct properties as compared to human fetal and rodent microglia. This protocol provides an efficient method for isolation of primary microglia from adult human brain. Studying these microglia can provide critical insights into cell-cell interactions between microglia and other resident cellular populations in the CNS including, oligodendrocytes, neurons and astrocytes. Additionally, microglia from different human brains may be cultured for characterization of unique immune responses for personalized medicine and a myriad of therapeutic applications.

This protocol is an efficient, cost effective and robust method of isolating primary microglia from live, adult, human brain tissue. Isolated primary human microglia can serve as a tool for studying cellular processes in homeostasis and disease.

Yetişkin İnsan Beyin Dokusundan İnsan Mikroglia elde

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining ...

Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it contributes to disease development and progression, particularly in the gray matter of the brain, remains largely unknown. The dysfunction of oligodendrocyte lineage cells is hallmarked by deficiencies in myelination and impaired self-renewal of oligodendrocyte precursor cells (OPCs). These two defects are caused at least in part by the disruption of interactions between neuron and oligodendrocytes along the buildup of pathology. OPCs give rise to myelinating oligodendrocytes during CNS development. In the mature brain cortex, OPCs are the major proliferative cells (comprising ~5% of total brain cells) and control new myelin formation in a neural activity-dependent manner. Such neuron-to-oligodendrocyte communications are significantly understudied, especially in the context of neurodegenerative conditions such as AD, due to the lack of appropriate tools. In recent years, our group and others have made significant progress to improve currently available protocols to generate functional neurons and oligodendrocytes individually from human pluripotent stem cells. In this manuscript, we describe our optimized procedures, including the establishment of a co-culture system to model the neuron-oligodendrocyte connections. Our illustrative results suggest an unexpected contribution from OPCs/oligodendrocytes to the brain amyloidosis and synapse integrity and highlight the utility of this methodology for AD research. This reductionist approach is a powerful tool to dissect the specific hetero-cellular interactions out of the inherent complexity inside the brain. The protocols we describe here are expected to facilitate future studies on oligodendroglial defects in the pathogenesis of neurodegeneration.

The neuron-glial interactions in neurodegeneration are not well understood due to inadequate tools and methods. Here, we describe optimized protocols to obtain induced neurons, oligodendrocyte precursor cells, and oligodendrocytes from human pluripotent stem cells and provide examples of the values of these methods in understanding cell-type-specific contributions in Alzheimer&#8217;s disease.

Nöron-Oligodendrosit Etkileşimlerini Modellemek için Pluripotent Kök Hücrelerden İnsan Nöronlarının ve Oligodendrositlerin Üretilmesi

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it ...