Biz CTP hücrelerin kullanımı konusundaki anlayış ve geri besleme için Dr Devin Gary teşekkür etmek istiyorum.

Giriş Bu protokolü biz E13 fare fetusların omurilikten glial kısıtlı öncüsü (CTP) hücreleri, ayıklamak seçin ve plaka nasıl gösterir. Bu hücreler oligodendrocytic ve astrositik hücre soyları içindeki erken öncüleri olan ve A2B5 bunların ifadesi tarafından tanımlanır. FGF-2 ile takviye CTP ortamda, A2B5 + GRP erken oligodendrocytic soy işaretleri PDGFαR ve NG2 1,2 ifade başlayacak. Bu oligodendrosit soyu hücreleri, ayrı fenotipik aşamaları, morfolojik değişimler, aynı zamanda belirli bir gelişme aşamasına belirteçlerinin ifadesi ile karakterize edilen, her biri bir dizi geçer. Bu öncül hücreler henüz multipl skleroz, lökodistrofiler ve periventriküler lökomalazi (PVL) 3,4,5,6 dahil olmak üzere merkezi sinir sistemi beyaz cevher hastalıklarında hücre tabanlı tedavi yaklaşımları için potansiyel bir kaynak olarak çalışılmaktadır </s&gt; kadar. Oligodendrosit soy öncüleri edilen insan beyni kullanılarak yapılan çalışmalar shiverer fare dysmyelination modeli beyinlerinde yanı sıra demyelinated omurilik kemirgen modelleri 6,7,8,9 başarılı remiyelinizasyon bildirdin. Bunlar, glial prekürsör hücreleri gibi omurilik hasarı ve kas erimesiyle ilgili lateral skleroz 10,11,12,13 gibi diğer beyaz madde hastalığı modellerinin çalışmalarda da kullanılmıştır. Laboratuvarımız biz PVL, serebral palsi 14,15,16 önde gelen nedeni bir restoratif yaklaşım olarak CTP türetilen bu hücrelerin omurilik etkinliğini değerlendiren hangi bir erken postnatal hipoksi-iskemi fare modeli geliştirmiştir. CTP hücreleri astrositik yolunun 17 içine ayırt etmek için bir eğilim var bu yana yaygın olarak beyaz cevher hasarı incelemek için kullanılmış olan OPC modeli edilen bir kemirgen beyin de var. OPC fenotip zaten oligodendrosit soy yolu, irreve görünüyor bir fenomen girdirsible. Ancak, GRP ve hatta E10.5 de elde NEP dahil oligodendrosit öncüllerinden daha geniş bir spektrum yanıtı değerlendirirken ilgileniyorlar. Bu nedenle yaptığımız işi için omurilik edilen CTP modelini benimsedik. Hücre değiştirilmesi için GRP kullanımı yanı sıra, beyaz madde hastalıkların vahşi tip ve transjenik kemirgen modellerden bu hücrelerin in vitro türetilmesi ortamda bir normal ve hastalık koşullar altında glial farklılaşma içine daha fazla çalışma sağlar. Önceki yayınlar olgunlaşma bağımlı glutamat eksitotoksik, oksidatif stres ve nöro-inflamasyonu 18,19 karıştığı seçin faktörler gibi çeşitli dış stresörlere oligodendrocytic soy öncü hücrelerin seçici açığına delil göstermek. Çalışmalarımız hücrelerin duyarlılığını değerlendirerek, bu beyaz madde yaralanmaların gelişiminin arkasındaki hücresel ve moleküler mekanizmasının anlaşılması üzerine odaklanmıştıroligodendrosit soy spektrum olası tedavi yaklaşımları analiz yanı sıra hakaret etmek. Malzemeler Hayvanlar ile ilgili tüm prosedürleri PHS politikası ve JHU IACUC uygundur. Tüm işlemler aseptik koşullarda sürdürmek için bir laminer akış kaputu yapılmalıdır. Genellikle diseksiyonlar yatay bir akış kaput ve dikey akış kaput in vitro çalışmalar yapılmaktadır. Tüm medya diseksiyonlar esnasında soğuk kullanılır. Çalışmamızda kullanılan fareler vahşi tip CD-1 suşu ve bir C57/BL6 arka planda bir transgenik GFP vardır. Bir CD-1 fare baraj genellikle tohum 1-2 T25 şişeler için yeterlidir 10 + fetus verir. Genellikle, iki baraj başına 1 T25 şişe içine toplanmış ve kaplama bir zaman ve fetal omurilik kurban edilir. Bir kez hücrelerin genişledi ve daha sonraki çalışmalar için in vitro karakterize edilebilir elde edilmiştir. 1. Medya ve şişeler hazırlanması <ul type="disc"><li> CTP stok; N2 (100X; Invitrogen) ve Takviyeler Bovine Serum Albumin (BSA;% 0.5 w / v) DMEM / F12 01:01 (Invitrogen) + B27 (Invitrogen 50x): orta Diseksiyon ortam olarak kullanılır. </li><li> Çözülme orta: diseksiyon orta aynıdır. </li><li> Kültür ortamı: CTP stoku orta + FGF-2 (10-20 ng / ml; Invitrogen) ve heparin (1 mcg / ml; Sigma). </li><li> PLL / laminin kaplı 75 cm 2 veya 25 cm 2 şişe (T75 veya T25). </li><li> Daha sonra aspire 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe damıtılmış H2O içerisinde; doku kültür şişeleri (75 cm 2, Falcon) 15-20μg/ml poli-L-lisin (Sigma PLL) ile kaplandı. Şişeler PBS sonra sonra aspire ve hücreleri kaplama olmaya hazır olana kadar taze PBS veya medya eklendi, 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de 15-20 mcg / ml PBS içinde Laminin (Sigma) ile kaplı olan 1X yıkanır. Kaplama ardından, matara kurumasına asla izin verilmemeli, ancak 4 de PBS veya medya tutulabilir kullanımdan önce kısa dönemler için ° C. </li></ul> 2. Araçlar ve Diğer Material <ul type="disc"><li> Petri: 4 başına baraj: diseksiyon için 3 Petri (75 mm), hasat omurilik toplamak için bir 20 mm çanak. </li><li> Büyük makaslar (43 mm Çalışma makas, Roboz) ve baraj s karnın açılması için doku Forseps. </li><li> Rahim Anatomi ve fetus (15 mm Micro Kesme Makas, Roboz) kaldırılması için küçük makas. </li><li> Mikro Kesme yay makas (6 mm) fetusların omurilik incelemek. </li><li> Mikro cerrahi sırasında baraj ve fetal vücut demirleme ve daha sonra bir kez maruz omurilik kaldırılması için açılı Forseps Dissecting. </li><li> 40 veya kaplama öncesi hücre enkaz kaldırma için 70 mikrometre hücre süzgecinden. </li><li> % 0.05 tripsin 37 ° C&#39;ye kadar önceden ısıtılmış </li><li> 10, bir 100X stoğu olarak hazırlanmıştır mg / ml DNAz 1 (Sigma), (1 g / ml). </li><li> Hayvan cesetleri için Bio-tehlike çantası. </li><li> Işlenmesi için 15 ve 50 ml&#39;lik bir santrifüj tüpü omurilik ekstre edilmiştir. </li></ul> 3. Zamanlı Pr Belirlenmesiegnancy Hamile fare barajlar ya embriyonik gün E12 ya da in-house tespit fetal gelişim veya gebelik E13 teslim belirterek ticari kaynaklardan sıralanır. Kısaca, iki kadın öğleden sonra bir erkek ile birlikte konur ve birlikte bir gecede terk etti. Ertesi gün kadın vajinal bulunan mukus tıkacın varlığı gözleniyor. Mukus tıkacın hayvanlar sonradan kilo artış oranı izlemek için günlük tartılır böylece çiftleşme oluştu sadece bir göstergesidir. Mukus plug görülmektedir günlük embriyonik günde bir (E1) olarak tanımlanır. 4. Doku Derivasyon <ol><li> Aseptik koşullarda korumak için yatay bir akış başlık altında çalışın. </li><li> % 70 etanol ile kaput ve çalışma alanının aşağı püskürtün. </li><li> Otoklav aletleri veya% 70 etanol ile bolca sprey. </li><li> Aletleri, medya ve kullanım için mikroskop hazırlayın. </li><li> Steril Petri di içine soğuk diseksiyon orta 20 ml dökünsh. </li><li> Servikal çıkık ya decapitation takiben intraperitonal (IP) tatbik kloral hidrat (500 mg / kg) ile anestezi hayvan. </li><li> % 70-90 etanol (dezenfeksiyon) ile baraj karın bölgesine Sprey </li><li> Büyük makas ve forseps ile karın açın. <ol type="a"><li> CD1 ve C57/BL6 suşlarında: Genellikle 8 ila 14 fetusun rahim içinde olacaktır. Fetusların sayısı suşu bağlıdır. </li></ol></li><li> Fetus kan ve doku artıkları yıkamak için temiz bir petri taze soğuk diseksiyon orta yavrular ve yer de dahil olmak üzere fare rahim ayıklayın. </li><li> Uterin boynuz her fetus ayıklayın ve küçük makas kullanarak embriyonik kese ve plasenta ayırmak. Yeni bir Petri kabındaki taze diseksiyon ortama çıkarılan fetus aktarın. <ol type="a"><li> Diseksiyon orta metabolik aktivitesi düşük ve elde edilen hücrelerin canlılığını korumak için düşük sıcaklıkta olmalıdır. </li><li> İki forseps ile şu andan itibaren Çalışma vemikro yay makas diseksiyon. </li></ol></li><li> Diseksiyon mikroskobu altında çalışan, mikro cerrahi makas ve omurilik maruz geri kabuğu ile spinal kord boyunca cilt kesti. </li><li> Yaklaşık C1 azından mikrocerrahi makasla ve kuyruk başında spinal kord transect. </li><li> , Künt forseps ile omurilik çıkarın tüm kemik ve kıkırdak çıkarıldığından emin olmak ve orta diseksiyon 3 üncü Petri transfer. </li><li> Sonraki hücre kültürlerinde meningeal doku büyümesi önlemek için omurilikten mümkün olduğunca menenjlerin kadar çıkarmaya çalışın. Doğmakta olan çıkıntılı periferik sinirleri nedeniyle bu ayıklanır serebrum gelen meningeal dokusunun çıkartılması daha zordur. </li><li> Bir kez meninksler kaldırılmış, 20 mm petri için omurilik aktarmak </li><li> Iyice% 70-90 etanol ile alana püskürterek temizleyin. </li><li> Ayrışma için aşağıdaki adımları korumak için hızlı bir şekilde yapılmalıdırspinal kord türetilmiş bir doku yüksek yaşayabilirliği. </li></ol> 5.. Kültür Kuruluşu <ol><li> Tripsin, bir 37 ° CH2, O-banyosu içinde, en azından 30 dakika süreyle ön ısıtılmış edilmelidir. Uygun bir kısım sıcaklık dalgalanmalarına stokunun maruz azaltmak için stok çıkarılmalıdır. </li><li> 10ml önceden ısıtılmış tripsin (% 0.05; Kalite Biologicals) içeren 50 ml&#39;lik bir santrifüj tüpüne hasat omurilik aktarılır ve 100 ul DNAz (10 mg / ml) ve kısa bir süre için öğütmek. </li><li> 37 inkübe ° 10 dakika CH 2 O-banyo. </li><li> Ezip toz haline getirmek ve başka bir 10 dakika süreyle inkübe edilir. </li><li> 5 ml CTP ortamı (yukarıda tanımlandığı gibi) ve 1000 rpm&#39;de 5 dakika boyunca santrifüj ekleyin. </li><li> 10 ml CTP orta süpernatan ve Pastör pipetiyle pelet aspire ve DNAz-1 (10 mg / ml; Sigma) ekleyin. </li><li> 37 inkübe ° 10 dakika CH 2 O-banyo. </li><li> 1000 RPM az 5 dakika santrifüjleyin ve supernatant aspire. </li><li> Fre ile Pastör pipetiyle pelet40 ile sh CTP orta ardından filtre enkaz - 70 mikron hücre süzgecinden. </li><li> PLL / laminin kaplı 25 cm 2 şişe (T25) ve 37 inkübe ° C,% 95 nem ve% 5 CO 2 Plate. </li><li> % 100 medya gününü takip eden on değiştirin. </li><li> Bu noktada, GRP bağlı ve süreçleri uzanan başladı. </li></ol> 6. CTP Nüfus Immunopanning <ol><li> Matara kadar PLL / laminin kaplı şişelerde Plaka spinal kord dokusunda% 85-90 konfluent ya da bir hafta ilgili. </li><li> Lastik bir polis memuru ile veya% 0.05 tripsin ile şişesi sıyırarak Hasat hücreleri iyice çiğnemek fakat nazikçe, 3 ml CTP orta ile 5 dakika iyice Pastör pipetiyle pelet için 1000 RPM hızında santrifüj. </li><li> 3 T25 matara veya 3 ml 1 T75 şişeyi tamamen hücreleri kapak ve şişeler% 80-90 izdiham ulaşmasını sağlayacak orta uygun hacim eklemek için 1 ml her aktarın. </li><li> Her gün medya değiştirin, er orta çabuk bitmesine neden varsa. </li><li> Coat Bakteriyolojik Pe4 &#39;de bir gece tri tabaklar (75 mm) °, bir anti-fare IgG antikoru ile birlikte C (Southern Biotech), 10 ug / ml PBS içerisinde. </li><li> Aşırı tampon aspire ve PBS ile 3x Petri yıkayın. </li><li> 5 ug / oda sıcaklığında (RT), 1 saat boyunca inkübe ve PBS ile seyreltilerek ml &#39;lik bir konsantrasyonda A2B5 antikoru (Millipore) eklenir. </li><li> Daha sonra plakası kurumasını önlemek için CTP orta 8 ml eklemek PBS ile tekrar 3x plakaları yıkayın. </li><li> Tüm hücreleri ayırmak için kauçuk bir polis memuru ile matara sıyırarak Petri ve hasat CTP hücrelerinden CTP orta 5 ml transfer </li><li> Kümeleri parçalamak ve A2B5 kaplı bakteriyolojik Petri için 5ml hücre süspansiyonu aktarmak için kısaca hücre süspansiyonu öğütmek. </li><li> Çalkalama olmadan, oda sıcaklığında 1 saat inkübe. </li><li> 1 saat aspirat medya ve PBS ile 8x tabaklarını yıkıyorum sonra. </li><li> Yavaşça sonra CTP orta uygun hacmi ile PLL / laminin kaplamalı plakalar veya balonları aktarmak 2 ml CTP medyada bir lastik polis memuru ile hücreleri kazıyın. </li&gt; </ol> 7. Türetilmiş Hücre Dondurma ve Depolama <ol><li> Hücreler 2 ml% 0.05 tripsin ile% 85-90 konfluent T25 veya T75 şişesi hasat edilir. </li><li> Tripsin seyreltilmiş ve inaktive 8ml CTP stoku orta ve 5 dk için 1000 RPM santrifüj edilir. </li><li> T25 şişeler gelen pelet 1 ml CTP donma ortamı, (CTP stoku orta 10% (v / v) DMSO ve isteğe bağlı olarak,% 20 FBS ile desteklenmiş) içinde tekrar süspanse edilir. T75 şişelerinden alınmış daha büyük peletler iki misli seyreltilir. </li><li> 1.5 hücre süspansiyonları - 3 x 10 10,11,12,13 hücre kriyojenik flakon (Nalgene) aktarılır ve ° C gece boyunca yavaş yavaş dondurma -80 az izopropanol içeren bir kriyojenik konteyner (Nalgene) geceleme saklanır. </li><li> Gece donma hücreleri ardından dondurucu kutuları aktarılarak -80 az 6 ay ile 1 yıl saklanır N ° C veya daha uzun süreli (l). Çözülmüş hücreleri, genellikle PLL / laminin kaplama kalitesine bağlı olarak büyük ölçüde uygun bir% 60-80 vardır. </li></ol&gt; 8. Temsilcisi Sonuçlar CO 2, çünkü cenin ve sonuçta elde edilen hücre canlılığı üzerindeki olası aşağı etkisi hayvan anestezi için kullanılmaz. Ayrıca, tamamen türev işlem sırasında omurilikten meninksler çıkarmak çok zor olacak ama CTP orta ve immunopanning kombinasyonu bu hızlı büyüyen hücreleri ortadan kaldıracaktır. Aynı şekilde, tüm spinal kord onun ventral spinal kord menşeli ve dorsal 20 geçiş nedeniyle CTP nüfusun daha büyük bir ventral konsantrasyonu rağmen hasat edilir. Ancak CTP orta CTP fenotip için seçer ve bu nüfusun A2B5 immunopanning en üst seviyeye ulaşır. Spinal kord dokular kaplama sonra, in vitro kültürler, iki ya da bölümler için bir hafta inkübe edilir. Kültüründe 2 gün sonra, farklı morfolojiye hücreleri hetero gösteren doku kültür şişeleri görülebilirnüfusun ancak CTP orta geneity CTP fenotip için seçer. Bu hücreler A2B5 bir kombinasyonu + CTP, E-NCAM + nöronal kısıtlı öncüleri (NRP) ve nestin +, A2B5-nöroepitelyal hücreleri ve muhtemelen fibronektin + meningeal hücrelerdir. Buna ek olarak, daha olgun fenotipleri başlangıç ​​heterojen havuzu (Şekil 1A) bir çok CTP zenginleştirilmiş nüfusu arttırmak için doublekortin ve nöronal soyu için Tuj1, astrositler için GFAP ve oligo soyu için PDGFaR ve GALC dahil olmak üzere mevcut ifade göstergeleri olabilir, hücreleri olabilir hücre yoğunluğu T75 şişelerde konfluense 85-90 yaklaşık% artmıştır kez A2B5 için seçim ardından E-NCAM + hücreleri + CTP nüfus seçin ve ortadan kaldırmak için çift immunopanned olabilir. Bunlar, CTP hücreleri daha sonra A2B5 immunopanning bir zenginleştirilmiş CTP nüfusu korumak için gerekli olabilir böylece oligodendrosit fenotip için seçer bir ortamda olmasına rağmen astrositler olma yetenekleri korur. Immunopanning homomüttefiki verimleri% 95 A2B5 + hücrelerine çok daha fazla verim için A2B5 konjuge manyetik bilye (Miltenyi Biotec A.Ş.) kadar% 97 bir verim sağlamak için kullanılabilir. Böyle düzenli ortam değişiklikleri gibi bakım CTP kültürlerde Teyakkuz olmayan CTP hücre tipinin çoğalması en aza indirecektir. Hatta yokluğunda BMP-4 astrositler hala bulunamadı ve boşalmış olabilir, özellikle medyanın bir astrositik fenotipi farklılaşma yol gibi görünüyor. B27 takviyesi tri-iodothyronine hormonu (T3) içerse de, bu olay meydana gelmez T3 yüksek düzeyde orta eklenir sadece, CTP nüfus oligodendrosit içine ayırt etmek için hiçbir gözlenen eğilim oldu. Olgun oligodendrosit (Şekil 1B) ile kontaminasyon için bir endişe varsa Ancak, serbest T3 B27 takviyesi ikame edilebilir. Bu CTP hücreleri kolayca 2 veya 3 kısa süreçler küçük soma kendi morfolojisi ile ancak diğer hücre tipleri mevcut olabilir, im için ekrana tespit edilebilirmunocytochemistry önceden adlı ortak gelişim ve hücre tipi özel belirteçler için yapılabilir. Yaygın nöroepitelyal (NEP) ve CTP veya NRP ya haline yeteneğine sahiptirler A2B5-hücrelerinin, küçük bir kalıcı nüfusu olacaktır. Neyse ki, artık hücreleri orta CTP fenotip için seçecektir olasılığı daha düşüktür CTP ortamda tutulur. <img alt="Şekil 1.." src="/files/ftp_upload/3462/3462fig1.jpg" /> Şekil 1. A) heterojen morfoloji Kaplama omurilikte hücreler kültürde 2 gün sonra görülür. B) Immunopanning başlangıç ​​heterojen havuzundan çok GRP zenginleştirilmiş nüfus en üst düzeye çıkarır.

<ol>
	<li>Kalyani, A., Hobson, K., Rao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroepithelial+stem+cells+from+the+embryonic+spinal+cord:+isolation,+characterization,+and+clonal+analysis.">Neuroepithelial stem cells from the embryonic spinal cord: isolation, characterization, and clonal analysis.</a> Developmental biology. 186, 202-202 (1997).</li><li>Rao, M. S., Mayer-Proschel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial-restricted+precursors+are+derived+from+multipotent+neuroepithelial+stem+cells.">Glial-restricted precursors are derived from multipotent neuroepithelial stem cells.</a> Developmental biology. 188, 48-48 (1997).</li><li>Goldman, S. A., Lang, J., Roy, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progenitor+cell-based+myelination+as+a+model+for+cell-based+therapy+of+the+central+nervous+system.">Progenitor cell-based myelination as a model for cell-based therapy of the central nervous system.</a> Ernst Schering Research Foundation workshop. (60), 195-195 (2006).</li><li>Goldman, S. A., Schanz, S., Windrem, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-based+strategies+for+treating+pediatric+disorders+of+myelin.">Stem cell-based strategies for treating pediatric disorders of myelin.</a> Human molecular genetics. 17, 76-76 (2008).</li><li>Goldman, S. A., Windrem, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+replacement+therapy+in+neurological+disease.">Cell replacement therapy in neurological disease.</a> Philosophical transactions of the Royal Society of London. 361, 1463-1463 (2006).</li><li>Walczak, P., All, A. H., Rumpal, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+glial-restricted+progenitors+survive,+proliferate,+and+preserve+electrophysiological+function+in+rats+with+focal+inflammatory+spinal+cord+demyelination.">Human glial-restricted progenitors survive, proliferate, and preserve electrophysiological function in rats with focal inflammatory spinal cord demyelination.</a> Glia. 59, 499-499 (2011).</li><li>Liu, S., Qu, Y., Stewart, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cells+differentiate+into+oligodendrocytes+and+myelinate+in+culture+and+after+spinal+cord+transplantation.">Embryonic stem cells differentiate into oligodendrocytes and myelinate in culture and after spinal cord transplantation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 6126-6126 (2000).</li><li>Windrem, M. S., Schanz, S. J., Guo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+chimerization+with+human+glial+progenitor+cells+can+both+remyelinate+and+rescue+the+otherwise+lethally+hypomyelinated+shiverer+mouse.">Neonatal chimerization with human glial progenitor cells can both remyelinate and rescue the otherwise lethally hypomyelinated shiverer mouse.</a> Cell stem cell. 2, 553-553 (2008).</li><li>Groves, A. K., Barnett, S. C., Franklin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+demyelinated+lesions+by+transplantation+of+purified+O-2A+progenitor+cells.">Repair of demyelinated lesions by transplantation of purified O-2A progenitor cells.</a> Nature. 362, 453-453 (1993).</li><li>Back, S. A., Han, B. H., Luo, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+vulnerability+of+late+oligodendrocyte+progenitors+to+hypoxia-ischemia.">Selective vulnerability of late oligodendrocyte progenitors to hypoxia-ischemia.</a> J. Neurosci. 22, 455-45 (2002).</li><li>Johnston, M. V., Trescher, W. H., Ishida, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurobiology+of+hypoxic-ischemic+injury+in+the+developing+brain.">Neurobiology of hypoxic-ischemic injury in the developing brain.</a> Pediatric research. 49, 735-735 (2001).</li><li>Lepore, A. C., Han, S. S., Tyler-Polsz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+fate+of+multipotent+and+lineage-restricted+neural+precursors+following+transplantation+into+the+adult+CNS.">Differential fate of multipotent and lineage-restricted neural precursors following transplantation into the adult CNS.</a> Neuron glia biology. 1, 113-113 (2004).</li><li>Rothstein, J. D., Dykes-Hoberg, M., Pardo, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockout+of+glutamate+transporters+reveals+a+major+role+for+astroglial+transport+in+excitotoxicity+and+clearance+of+glutamate.">Knockout of glutamate transporters reveals a major role for astroglial transport in excitotoxicity and clearance of glutamate.</a> Neuron. 16, 675-675 (1996).</li><li>Johnston, M. V., Ferriero, D. M., Vannucci, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+cerebral+palsy:+which+ones+are+best.">Models of cerebral palsy: which ones are best.</a> Journal of child neurology. 20, 984-98 (2005).</li><li>Comi, A. M., Johnston, M. V., Wilson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain+variability,+injury+distribution,+and+seizure+onset+in+a+mouse+model+of+stroke+in+the+immature+brain.">Strain variability, injury distribution, and seizure onset in a mouse model of stroke in the immature brain.</a> Developmental neuroscience. 27, 127-127 (2005).</li><li>Comi, A. M., Weisz, C. J., Highet, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+model+of+stroke+and+ischemic+seizures+in+the+immature+mouse.">A new model of stroke and ischemic seizures in the immature mouse.</a> Pediatric neurology. 31, 254-254 (2004).</li><li>Dietrich, J., Noble, M., Mayer-Proschel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+A2B5++glial+precursor+cells+from+cryopreserved+human+fetal+brain+progenitor+cells.">Characterization of A2B5+ glial precursor cells from cryopreserved human fetal brain progenitor cells.</a> Glia. 40, (2002).</li><li>Alberdi, E., Sanchez-Gomez, M. V., Marino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(2+)+influx+through+AMPA+or+kainate+receptors+alone+is+sufficient+to+initiate+excitotoxicity+in+cultured+oligodendrocytes.">Ca(2+) influx through AMPA or kainate receptors alone is sufficient to initiate excitotoxicity in cultured oligodendrocytes.</a> Neurobiology of disease. 9, 234-234 (2002).</li><li>Volpe, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+injury+in+premature+infants:+a+complex+amalgam+of+destructive+and+developmental+disturbances.">Brain injury in premature infants: a complex amalgam of destructive and developmental disturbances.</a> Lancet neurology. 8, 110-110 (2009).</li><li>Warf, B. C., Fok-Seang, J., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+the+ventral+origin+of+oligodendrocyte+precursors+in+the+rat+spinal+cord.">Evidence for the ventral origin of oligodendrocyte precursors in the rat spinal cord.</a> J. Neurosci. 11, 2477-2477 (1991).</li><li>Deng, W., Poretz, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendroglia+in+developmental+neurotoxicity.">Oligodendroglia in developmental neurotoxicity.</a> Neurotoxicology. 24, 161-161 (2003).</li><li>Deng, W., Rosenberg, P. A., Volpe, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-permeable+AMPA/kainate+receptors+mediate+toxicity+and+preconditioning+by+oxygen-glucose+deprivation+in+oligodendrocyte+precursors.">Calcium-permeable AMPA/kainate receptors mediate toxicity and preconditioning by oxygen-glucose deprivation in oligodendrocyte precursors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 6801-6801 (2003).</li><li>Karadottir, R., Cavelier, P., Bergersen, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptors+are+expressed+in+oligodendrocytes+and+activated+in+ischaemia.">NMDA receptors are expressed in oligodendrocytes and activated in ischaemia.</a> Nature. 438, 1162-1162 (2005).</li><li>Pleasure, D., Soulika, A., Singh, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+in+white+matter:+clinical+and+pathophysiological+aspects.">Inflammation in white matter: clinical and pathophysiological aspects.</a> Mental retardation and developmental disabilities research reviews. 12, 141-141 (2006).</li><li>Gregori, N., Proschel, C., Noble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tripotential+glial-restricted+precursor+(GRP)+cell+and+glial+development+in+the+spinal+cord:+generation+of+bipotential+oligodendrocyte-type-2+astrocyte+progenitor+cells+and+dorsal-ventral+differences+in+GRP+cell+function.">The tripotential glial-restricted precursor (GRP) cell and glial development in the spinal cord: generation of bipotential oligodendrocyte-type-2 astrocyte progenitor cells and dorsal-ventral differences in GRP cell function.</a> J. Neurosci. 22, 248-248 (2002).</li><li>Rao, M. S., Noble, M., Mayer-Proschel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tripotential+glial+precursor+cell+is+present+in+the+developing+spinal+cord.">A tripotential glial precursor cell is present in the developing spinal cord.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 3996-3996 (1998).</li><li>Raff, M. C., Miller, R. H., Noble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glial+progenitor+cell+that+develops+in+vitro+into+an+astrocyte+or+an+oligodendrocyte+depending+on+culture+medium.">A glial progenitor cell that develops in vitro into an astrocyte or an oligodendrocyte depending on culture medium.</a> Nature. 303, 390-390 (1983).</li><li>Strathmann, F. G., Wang, X., Mayer-Proschel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+two+novel+glial-restricted+cell+populations+in+the+embryonic+telencephalon+arising+from+unique+origins.">Identification of two novel glial-restricted cell populations in the embryonic telencephalon arising from unique origins.</a> BMC developmental biology. 7, 33-33 (2007).</li><li>Nunes, M. C., Roy, N. S., Keyoung, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+isolation+of+multipotential+neural+progenitor+cells+from+the+subcortical+white+matter+of+the+adult+human+brain.">Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain.</a> Nature. 9, 439-439 (2003).</li><li>Roy, N. S., Wang, S., Harrison-Restelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification,+isolation,+and+promoter-defined+separation+of+mitotic+oligodendrocyte+progenitor+cells+from+the+adult+human+subcortical+white+matter.">Identification, isolation, and promoter-defined separation of mitotic oligodendrocyte progenitor cells from the adult human subcortical white matter.</a> J. Neurosci. 19, 9986-9986 (1999).</li><li>Chen, Y., Balasubramaniyan, V., Peng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+rat+and+mouse+oligodendrocyte+precursor+cells.">Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells.</a> Nature protocols. 2, 1044-1044 (2007).</li></ol>

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüsü [NICHD P30HD024061 (AWP), NINDS K08NS063956 (AF) ve R01NS028208 (MVJ)] ve Çocuk Nörolojisi Vakfı tarafından finanse edildi. Bu raporun içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüsü, DHHS resmi görüşlerini temsil etmemektedir. Yazarlar bu çalışma ile ilgili Çıkar çatışması var.

<p class="jove_content"Merkezi sinir sistemi beyaz bir madde&gt; Bozuklukların genetik, enflamatuar iskemik ve toksik nedenler de dahil olmak üzere nedenlere bağlı olarak çok sayıda içerir<sup&gt; 19,21,22,23,24</sup&gt;. Multipl skleroz ve damar hastalığı erişkinlerde beyaz cevher hastalığı önde gelen nedeni iken, prematüre ile ilişkili periventriküler lökomalazi çocukluk nüfus beyaz cevher hasarı en sık nedenidir. Daha da büyük ölçüde hastalığın mekanizmaları perinatal hakarettir etkilenen hücreler ofoligodendrocytic soyu, daha da çalışma tasvir amacıyla gereklidir. GRP kemirgen embriyonik omurilik izole ve oligodendrosit ve iki ayrı astrosit nüfus sebebiyet veren, doğada tripotential olduğu gösterilmiştir, ancak nöron içine ayırmayız edildi<sup&gt; 2,25,26</sup&gt;. Aynı şekilde, sıçan optik sinir ve geç embriyonik veya erken postnatal sıçan beyin türetilen oligodendrosit öncül hücrelerin (OPC) uygun ortam koşullarında işleyen oligodendrosit içine olgun bulunduğu gösterilmiştir<sup&gt; 27,28</sup&gt;. Ayrıca, fetal veya yetişkin alınan insan OPC daha daha olgun oligodendrosit fenotipleri içine manipüle edilmiş<sup&gt; 29,30</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; CTP hücreleri spinal E13.5 sıçanların kablosu ve farelerde E12-13.5 hem de izole edilmiştir. Sıçan farklılıkları ventral kaynaklı GRP daha olgun fenotipleri içine ayırt etmek için daha büyük bir eğilim sergileyen oligodendrosit veya astrositlerin nesil teşvik koşullarına tepki olarak dorsal ve ventral kökenli CTP hücreleri arasında bildirilmiştir<sup&gt; 25,26,28</sup&gt;. Bu farklılaşma ipuçlarını daha az alıcı olabilir doğmakta olan CTP hücreleri, dorsal göç ventral bağlı olabilir olduğunu. Immunopanning izole ve kültür bakım için alınacak A2B5 ifade subpopülasyonu sağlar.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Bizim fare CTP kültürleri CTP hücrelerin kimyasal (orta) ve antikor bazlı teknikler seçilir hangi hücrelerin heterojen, toplanmış nüfus verir total spinal kord dokusu elde edilir. Çalışmalarımız omurilik edilen fare CTP hücreleri yararlanmakta iken, daha yakın zamanda olgun oligodendrosit dönüşme yeteneğine sahip beyin kaynaklı fare oligodendrosit progenitör hücrelerin derivasyon bildirilmiştir<sup&gt; 31</sup&gt;. Burada elde edilen hücreler başlangıçta uygun kültür ortamı kullanılarak zenginleştirilmiş PDGFαR +, OPC nüfusu içine manipüle olduğunu oligospheres olarak kültürlenmiştir<sup&gt; 31</sup&gt;. Çalışmalarımız A2B5 gelen +, PDGFαR-CTP öncüleri miyelin bazik protein (MBP +) olgun oligodendrosit ifade etmek oligodendrosit soy spektrum hücreleri üzerinde hipoksik iskemik hasara bizim modelinin etkisi üzerine yoğunlaşmıştır. Nitekim bizim<em&gt; In vitro</em&gt; Karakterizasyonu monokültürler veya kortikal nöronlar ile eş-kültürlerinde ya MBP Salgılayan hücrelerin içine bu olgunlaşmamış CTP hücreleri olgun göstermiştir. Bu hücreler perinatal beyaz cevher hasarı ile ilgili mekanizmalar eğitim için belirli bir farklılaşma yolları içine kültüründe manipüle edilebilir. Oligodendrosit soy ve bu nüfusun durumu hücreleri içeren beyaz cevher hastalıkların çeşitli fare modelleri yaralanma yanı sıra olası hücre tedavi seçeneklerinin yararlılığını keşfetmek için neden mekanizmalarına ayrıntılı bir soruşturma için izin vardır.</p

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th></tr><tr><td> DMEM / F12 01:01 </td><td> Invitrogen </td><td> 11320033 </td></tr><tr><td> B27 </td><td> Invitrogen </td><td> 17504044 </td></tr><tr><td> N2 </td><td> Invitrogen </td><td> 17502048 </td></tr><tr><td> rH-FGF-temel </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0026 </td></tr><tr><td> Tripsin (% 0.05) EDTA </td><td> Kalite Biyolojik, Inc </td><td> 118-087-721 </td></tr><tr><td> Poli-L-Lizin HBr </td><td> Sigma </td><td> P1274-25mg </td></tr><tr><td> Laminin </td><td> Sigma </td><td> L2020-1MG </td></tr><tr><td> Dnaz 1 </td><td> Sigma </td><td> DN25 </td></tr></tbody></table>

derivation of glial restricted precursors from e13 mice

Bu E13 fare fetusların omurilikten glial kısıtlı öncüsü (CTP) hücreleri türetilmesi için bir protokoldür. Bu hücreler oligodendrocytic hücre soyu içinde erken öncüleri vardır. Son zamanlarda, bu hücreler beyaz cevher hastalıklarında restoratif tedaviler için potansiyel kaynak olarak ele alınmıştır. Periventriküler lökomalazi (PVL), çocukluk çağında olmayan genetik beyaz cevher hastalığı önde gelen nedenidir ve çok erken doğan bebeklerin% 50 etkiler. Veri hipoksi-iskemi gelişen beyin, oksidatif stres ve seçici doğmakta olan beyaz cevher hedefleyen eksitotoksisite yükseltilmiş bir duyarlılık göstermektedir. Glial kısıtlı öncüleri (CTP), oligodendrosit progenitör hücrelerin (OPC) ve olgunlaşmamış oligodendrosit (preOL) PVL gelişiminde anahtar oyuncular olacak gibi görünüyor ve sürekli çalışmalar tabidir. Ayrıca, önceki çalışmalar gibi eksitotoksisite Glutamat duyarlılık artmıştır MSS dokusu bir alt belirledikBu duyarlılık için gelişimsel bir desen de. Laboratuvarımız şu anda gelişim aşamasında CTP PVL ve kullanım hücrelerinde oligodendrosit progenitörlerin rolünü araştırıyor. Biz PVL ile tutarlı gerilmelerin seçmek için tepkilerini test etmek için bir çok deneysel paradigmalar bu elde edilen CTP hücreleri kullanır. CTP hücreleri fare modelleri ile PVL ve hipoksi-iskemi dahil olmak üzere PVL gibi hakaretlerle vitro model nakli deneyler için OPC ve preOL içine in vitro manipüle edilebilir. Kültür hücreleri kullanılarak ve in vitro çalışmalar verilerin yorumlanması kolaylaştırır deneyler arasında değişkenlik azalacaktır By. Olmayan CTP fenotip hücreleri kirletici etkisini en aza indirirken Kültür hücreleri de CTP nüfusun zenginleşmesine olanak sağlar.

Watch this Scientific Journal Video about Derivation of Glial Restricted Precursors from E13 mice at JoVE.com

Derivation of Glial Restricted Precursors from E13 mice

Bu protokol, fetal spinal kablolarından Glial Yasak Öncüleri derivasyon özetliyor ve transplantasyon için veya oligodendrocytic soyunun çalışma için ya in vitro korunmuştur.

E13 farelerin Glial Yasak Öncüleri türetilmesi

This is a protocol for derivation of glial restricted precursor (GRP) cells from the spinal cord of E13 mouse fetuses. These cells are early precursors ...

derivation-of-glial-restricted-precursors-from-e13-mice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.2K Görüntüleme.  Johns Hopkins University. Bu protokol, fetal spinal kablolarından Glial Yasak Öncüleri derivasyon özetliyor ve transplantasyon için veya oligodendrocytic soyunun çalışma için ya in vitro korunmuştur.

Video: Derivation of Glial Restricted Precursors from E13 mice

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system (CNS) structure and circuitry in today's healthcare industry. Cell-based therapies hold great promise to restore the lost nerve tissue and function for CNS disorders. However, cell therapies based on CNS-derived neural stem cells have encountered supply restriction and difficulty to use in the clinical setting due to their limited expansion ability in culture and failing plasticity after extensive passaging1-3. Despite some beneficial outcomes, the CNS-derived human neural stem cells (hNSCs) appear to exert their therapeutic effects primarily by their non-neuronal progenies through producing trophic and neuroprotective molecules to rescue the endogenous cells1-3. Alternatively, pluripotent human embryonic stem cells (hESCs) proffer cures for a wide range of neurological disorders by supplying the diversity of human neuronal cell types in the developing CNS for regeneration1,4-7. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity7-10. In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic11-13. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules14 (please see a schematic in Fig. 1). Retinoic acid (RA) does not induce neuronal differentiation of undifferentiated hESCs maintained on feeders1, 14. And unlike mouse ESCs, treating hESC-differentiated embryoid bodies (EBs) only slightly increases the low yield of neurons1, 14, 15. However, after screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered retinoic acid (RA) sufficient to induce the specification of neuroectoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to neuroblasts that generated human neuronal progenitors and neurons in the developing CNS with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of neuroblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human neuronal cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of neuroblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human neuronal progenitors and neuronal cell types in the developing CNS for neural repair.

Küçük Molekül İndüksiyon Pluripotent İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İnsan Nöronal atalarıdır ve Nöronlar Verimli türetilmesi

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Nörobilim

Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications for understanding the pathogenesis of demyelinating diseases such as Multiple Sclerosis (MS). Cellular development is commonly studied with primary cell culture models. Primary cell culture facilitates the evaluation of a given cell type by providing a controlled environment, free of the extraneous variables that are present in vivo. While OL cultures derived from rats have provided a vast amount of insight into OL biology, similar efforts at establishing OL cultures from mice has been met with major obstacles. Developing methods to culture murine primary OLs is imperative in order to take advantage of the available transgenic mouse lines. 
Multiple methods for extraction of OPCs from rodent tissue have been described, ranging from neurosphere derivation, differential adhesion purification and immunopurification 1-3. While many methods offer success, most require extensive culture times and/or costly equipment/reagents. To circumvent this, purifying OPCs from murine tissue with an adaptation of the method originally described by McCarthy &amp; 
de Vellis 2 is preferred. This method involves physically separating OPCs from a mixed glial culture derived from neonatal rodent cortices. The result is a purified OPC population that can be differentiated into an OL-enriched culture. This approach is appealing due to its relatively short culture time and the unnecessary requirement for growth factors or immunopanning antibodies. 
While exploring the mechanisms of OL development in a purified culture is informative, it does not provide the most physiologically relevant environment for assessing myelin sheath formation. Co-culturing OLs with neurons would lend insight into the molecular underpinnings regulating OL-mediated myelination of axons. For many OL/neuron co-culture studies, dorsal root ganglion neurons (DRGNs) have proven to be the neuron type of choice. They are ideal for co-culture with OLs due to their ease of extraction, minimal amount of contaminating cells, and formation of dense neurite beds. While studies using rat/mouse myelinating xenocultures have been published 4-6, a method for the derivation of such OL/DRGN myelinating co-cultures from post-natal murine tissue has not been described. Here we present detailed methods on how to effectively produce such cultures, along with examples of expected results. These methods are useful for addressing questions relevant to OL development/myelinating function, and are useful tools in the field of neuroscience.

This article describes methods to derive enriched populations of murine oligodendrocyte precursor cells (OPCs) in primary culture, which differentiate to produce mature oligodendrocytes (OLs). In addition, this report describes techniques to produce murine myelinating co-cultures by seeding mouse OPCs onto a neurite bed of mouse dorsal root ganglion neurons (DRGNs).

Post-natal murin Dokular Co-kültürler Myelinating zenginleştirilmiş oligodendrosit Kültürleri ve oligodendrosit / Nöron türetilmesi

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual neurons, researchers are able to analyze properties related to cellular trafficking, cellular structure and individual protein localization using a variety of biochemical techniques. Results from such experiments are critical for testing theories addressing the neural basis of memory and learning. However, unambiguous results from these forms of experiments are predicated on the ability to grow neuronal cultures with minimum contamination by other brain cell types. In this protocol, we use specific media designed for neuron growth and careful dissection of embryonic hippocampal tissue to optimize growth of healthy neurons while minimizing contaminating cell types (i.e. astrocytes). Embryonic mouse hippocampal tissue can be more difficult to isolate than similar rodent tissue due to the size of the sample for dissection. We show detailed dissection techniques of hippocampus from embryonic day 19 (E19) mouse pups. Once hippocampal tissue is isolated, gentle dissociation of neuronal cells is achieved with a dilute concentration of trypsin and mechanical disruption designed to separate cells from connective tissue while providing minimum damage to individual cells. A detailed description of how to prepare pipettes to be used in the disruption is included. Optimal plating densities are provided for immuno-fluorescence protocols to maximize successful cell culture. The protocol provides a fast (approximately 2 hr) and efficient technique for the culture of neuronal cells from mouse hippocampal tissue.

We provide a protocol for the culture of highly purified hippocampal neurons from prenatal mouse brains without the use of a feeder glial cell layer.

Prenatal Fareler gelen Hipokampal Nöronlar izolasyonu ve Kültürü

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

Nöronal Ateşleme Oranlarının Manipülasyon tarafından Astrositik reseptörleri Plastisite Inducing

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a source of transplantable cells for regenerative applications after disease or accidents. Neural crest (NC) cells are the precursors for a large variety of adult somatic cells, such as cells from the peripheral nervous system and glia, melanocytes and mesenchymal cells. They are a valuable source of cells to study aspects of human embryonic development, including cell fate specification and migration. Further differentiation of NC progenitor cells into terminally differentiated cell types offers the possibility to model human diseases in vitro, investigate disease mechanisms and generate cells for regenerative medicine. This article presents the adaptation of a currently available in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs. This new protocol requires 18 days of differentiation, is feeder-free, easily scalable and highly reproducible among human embryonic stem cell (hESC) lines as well as human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. Both old and new protocols yield NC cells of equal identity.

Neural crest (NC) cells derived from human pluripotent stem cells (hPSC) have great potential for modeling human development and disease and for cell replacement therapies. Here, a feeder-free adaptation of the currently widely used in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs is presented.

İnsan Pluripotent dan Sinir Crest Progenitör Hücreler besleyici ücretsiz Derivasyon Kök Hücre

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information regarding glial activities at the cellular and molecular levels has been obtained through in vitro cell culture systems. The in vitro systems utilized, mainly include primary glia derived from neonatal brain cortical tissue and immortalized cell lines. However, these systems may not reflect the characteristics of spinal cord glial cells in vivo. In order to further investigate the roles of spinal cord glial cells in the development of peripheral nerve injury-induced neuropathic pain using a culture system that better reflects the in vivo condition, our laboratory has developed a method to establish primary spinal cord mixed glial cultures from adult mice. Briefly, spinal cords are collected from adult mice and processed through papain digestion followed by myelin removal with a density-gradient medium. Single cell suspensions are cultured in complete Dulbecco&#39;s modified Eagle media (cDMEM) supplemented with 2-mercaptoethanol (2-ME) at 35.9 oC. These culture conditions were optimized specifically for the growth of mixed glial cells. Under these conditions, cells are ready to be used for experimentation between 12 - 14 d&#160;(cells are usually in log phase during this time) after the establishment of the culture (D 0) and can be kept in culture conditions up to D 21. This culture system can be used to investigate the responses of spinal cord glial cells upon stimulation with various substances and agents. Besides neuropathic pain, this system can be used to study glial responses in other diseases that involve pathological changes of spinal cord glial cells.

The development of neuropathic pain involves pathological changes of spinal cord glial cells. A reliable glial culture system derived from adult spinal cord tissue and designed for studying these cells in vitro is lacking. Therefore, we show here how&#160;to establish primary mixed glial cultures from adult mouse spinal cord tissue.

Yetişkin Fare Omurilik Doku İlköğretim Karışık glial Kültürler hazırlanması

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

Derivation of Leptomeninges Explant Cultures from Postmortem Human Brain Donors

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of Parkinson&#39;s disease is not pathologically confirmed in up to 25% of clinically diagnosed Parkinson&#39;s disease. Therefore, tissue collected from clinically diagnosed patients with idiopathic Parkinson&#39;s disease can have a high rate of misdiagnosis; hence in vitro studies from such tissues to study Parkinson&#39;s disease as a preclinical model can become futile.
By collecting postmortem human leptomeninges with a confirmed neuropathological diagnosis of Parkinson&#39;s disease and characterized by nigrostriatal cell loss and intracellular protein inclusions called Lewy bodies, one can be certain that clinically observed parkinsonism is not caused by another underlying disease process (e.g. tumor, arteriosclerosis).
This protocol presents the dissection and preparation of postmortem human leptomeninges for derivation of a meningeal fibroblast culture. This procedure is robust and has a high success rate. The challenge of the culture is sterility as the brain procurement is generally not performed under sterile conditions. Therefore, it is important to supplement the culture media with a cocktail of penicillin, streptomycin, and amphotericin B.
The derivation of meningeal fibroblasts from autopsy-confirmed cases with Parkinson&#39;s disease provides the foundation for in vitro modeling of Parkinson&#39;s disease. Meningeal fibroblasts appear 3-9 days after sample preparation and about 20-30 million cells can be cryopreserved in 6-8 weeks. The meningeal fibroblast culture is homogenous and the cells express fibronectin, a commonly used marker to identify meninges.

The leptomeninges explant culture protocol from human postmortem brain is a technically robust and simple way to derive fibronectin-positive meningeal fibroblasts within 6-8 weeks and cryopreserve approximately 20-30 million cells.

Otopsi İnsan beyni Donörleri gelen leptomeninkslerde Eksplantasyon Kültürlerin türetilmesi

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on postnatal day 1-3. A mouse litter, usually 4-10 pups born from one breeding pair, is gathered for one experiment, and spinal cords are collected individually from each mouse after euthanasia with isoflurane. The spinal column is dissected out and then the spinal cord is released from the column. The spinal cords are then minced to increase the surface area of delivery for an enzymatic protease that allows for the neurons and other cells to be released from the tissue. Trituration is then used to release the cells into solution. This solution is subsequently fractionated in a density gradient to separate the various cells in solution, allowing for neurons to be isolated. Approximately 1-2.5 x 106 neurons can be isolated from one litter group. The neurons are then seeded onto wells coated with adhesive factors that allow for proper growth and maturation. The neurons take approximately 7 days to reach maturity in the growth and culture medium and can be used thereafter for treatment and analysis.

This study presents a technique for the isolation of neurons from WT neonatal mice. It requires the careful dissection of the spinal cord from the neonatal mouse, followed by the separation of neurons from the spinal cord tissue through mechanical and enzymatic cleavage.

Yenidoğan Faresinden İzole Edilen Spinal Kord Nöronları İzolasyonu ve Kültürü

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons as well as synchronizing the outputs of pyramidal neuron ensembles. Deficits in interneuron function have been implicated in a variety of neuropsychiatric disorders, including schizophrenia, autism, and epilepsy. The derivation of cortical interneurons from embryonic stem cells not only allows for the study of their development and function, but provides insight into the molecular mechanisms underlying the pathogenesis of cortical interneuron-related disorders. Interneurons also have the remarkable capacity to survive, migrate, and integrate into host cortical circuitry post-transplantation, making them ideal candidates for use in cell-based therapies. Here, we present a scalable, highly efficient, modified embryoid body-to-monolayer method for the derivation of Nkx2.1-expressing interneuron progenitors and their progeny from mouse embryonic stem cells (mESCs). Using a Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual reporter mESC line, Nkx2.1 progenitors or their Lhx6-expressing post-mitotic progeny can be isolated via fluorescence-activated cell sorting (FACS) and subsequently used in a number of downstream applications. We also provide methods to enrich for parvalbumin (PV) or somatostatin (SST) interneuron subgroups, which may be helpful for studying aspects of fate determination or for use in therapeutic applications that would benefit from interneuron subgroup-enriched transplantations.

This protocol describes a method for generating cortical interneuron progenitors and post-mitotic interneuron precursors from mouse embryonic stem cells using a modified embryoid body-to-monolayer method. These progenitors/precursors can be used in vitro or fluorescently sorted and transplanted into neonatal neocortex for studying fate determination, or used in therapeutic applications.

Fare embriyonik kök hücre farklılaşma içine kortikal Interneuron Kara filmin tarih öncesi

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons ...

Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents

Cisterna magna cannulation (CMc) is a straightforward procedure that enables direct access to the cerebrospinal fluid (CSF) without operative damage to the skull or the brain parenchyma. In anesthetized rodents, the exposure of the dura mater by blunt dissection of the neck muscles allows the insertion of a cannula into the cisterna magna (CM). The cannula, composed either by a fine beveled needle or borosilicate capillary, is attached via a polyethylene (PE) tube to a syringe. Using a syringe pump, molecules can then be injected at controlled rates directly into the CM, which is continuous with the subarachnoid space. From the subarachnoid space, we can trace CSF fluxes by convective flow into the perivascular space around penetrating arterioles, where solute exchange with the interstitial fluid (ISF) occurs. CMc can be performed for acute injections immediately following the surgery, or for chronic implantation, with later injection in anesthetized or awake, freely moving rodents. Quantitation of tracer distribution in the brain parenchyma can be performed by epifluorescence, 2-photon microscopy, and magnetic resonance imaging (MRI), depending on the physico-chemical properties of the injected molecules. Thus, CMc in conjunction with various imaging techniques offers a powerful tool for assessment of the glymphatic system and CSF dynamics and function. Furthermore, CMc can be utilized as a conduit for fast, brain-wide delivery of signaling molecules and metabolic substrates that could not otherwise cross the blood brain barrier (BBB).

Here we describe a protocol to perform cisterna magna cannulation (CMc), a minimally invasive way to deliver tracers, substrates and signaling molecules into the cerebrospinal fluid (CSF). Combined with different imaging modalities, CMc enables glymphatic system and CSF dynamics assessment, as well as brain-wide delivery of various compounds.

Kanül implantasyon Sisterna Magna kemirgenler içine

Cisterna magna cannulation (CMc) is a straightforward procedure that enables direct access to the cerebrospinal fluid (CSF) without operative damage to ...