Biz eleştirel görüş ve önerileriniz için Wobus laboratuar üyelerine teşekkür. CEW ve laboratuvarda çalışma Michigan Üniversitesi, Biyo-Savunma Mükemmeliyet NIH / NIAID Bölgesel Merkezi ve Gelişmekte Olan Bulaşıcı Hastalıklar Araştırma (RCE) Programı, Bölge V &#39;Büyük bir kariyer geliştirme hibe start-up fonları tarafından finanse edildi Göller RCE (NIH ödülü 1-U54-AI-057153) ve NIH R01 AI080611. MBG-H. Michigan Üniversitesi Deneysel İmmünoloji (NIH T32 A1007413-16) ve Mikrobiyal Patogenezinde Moleküler Mekanizmalar (NIH T32 A1007528) eğitim hibeleri tarafından finanse edildi. JBC Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de nivel Superior (Pelerin), Brasilia, Brezilya tarafından finanse edildi.

1. 264.7 RAW Makrofaj Hücre Hattı ekimi <ol><li> % 10 (v / v) düşük-endotoksin fetal bovin serumu (&lt;10 EU / ml) ile yüksek glikoz DMEM oluşur DMEM-10 ortamı içinde RAW 264.7 hücreleri (ATCC, katalog # TIB-71), 10 mM HEPES bakımı , 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin, 1 mM, temel olmayan amino asitler, 2 mM L-glutamin. Hücreler tipik olarak şişesi başına ortam 35 ml içeren 175 cm2 doku kültürü şişeleri içinde muhafaza edilmekte ve 37 ° C&#39;de inkübe edilir ve% 5 bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde CO2. Ancak, herhangi bir boyut şişenin şişenin boyutu için uygun bir ortam hacmi ile de kullanılabilir. </li><li> Hücreleri ayırmak için: eski medya kapalı aspire hücrelere taze DMEM-10 ortamı 10 ml eklenir, sonra bir hücre kazıyıcı kullanarak, şişenin alt hücreler kazıma. Sonra, bir 10 ml pipet içine hücreleri çizerek homojen bir çözelti içine hücreleri tekrar süspansiyon ve zorla pipet pr hücreleri sıkmaşişenin dibine Essed. En az 3 kez hücreler artık yığın birlikte böylece bu işlemi tekrarlayın. Tek bir hücre süspansiyonu elde edildiği ışık mikroskobu ile kontrol edin. Yeni bir 175 cm 2 şişesine hücre süspansiyonu 2 ml (1:5 seyreltme veya ~ 2x10 7 hücreleri), ve medya son hacim kadar getirmek - Sonra 1 ml (1:10 seyreltme veya ~ 1x10 7 hücreleri) aktarmak 35 ml. </li><li> Bölünmüş hücreleri (~ 1x10 8 hücreleri total/175 cm 2 matara) neredeyse konfluent zaman: 1:5 seyreltme ile başlayan eğer 1:10 seyreltme, ya da her iki gün ile başlayan üç günde eğer. Yarma hücreleri önce hücre morfolojisi kontrol etmek için ışık mikroskobu kullanın. Hücrelerin çoğu yuvarlak bakmak ve aktif olmamalıdır. Aktif hücreler cılız morfolojisi ekleri ile, granül ve / veya genişletilmiş var. Bu hücreleri genellikle plak yok gibi hücrelerin sarmak izin vermeyin. Geçit sayısı takip edin ve sık sık hücrelerin bir alt geçit kısım eritilmesi ile başlamak. (Biz bir cut-off olarak geçit 30 kullanın). </li></ol> 2. MNV İnokulum RAW 264.7 Hücreleri Infect <ol><li> Tohum RAW 264.7 1x10 6 canlı hücre / DMEM-10 ortamı içinde ml &#39;lik bir yoğunlukta 6 oyuklu plakalar (3.5 cm çapında) içine hücreleri, ve her bir kuyu için bu süspansiyon 2 ml ekleyin. Bu el en az 10 kat plakaları sallama ile ya da yaklaşık 10 dakika için bir sallanan tertibatım kullanarak ya da eşit bir şekilde kuyu hücrelere yaymak için önemlidir. Girdap plakaları bu kuyunun merkezinde küme hücreleri neden olur gibi yapmayın. Sıra plakalar bir doku kültürü kuluçka makinesi içine (37 ° C ve% 5 CO2). Hücreler 37 ° C de bir gece boyunca ya da en azından 4 saat için takmak için izin Hücreler 60 olmalı -% 80 plak tahlil için birleşik ve iyi boyunca eşit olarak dağıtılır. </li><li> Ertesi gün, doku kültüründe MNV-enfekte hücreleri veya MNV-enfekte farelerde Homojenize dokularda veya dışkı örneklerinden olabilir virüs inokulum hazırlamak. doku örnekleri kullanılarak, bezelye büyüklüğünde pidoku eces bir doku homojenleştirici (; Roche örneğin MagnaLyser) kullanılarak DMEM-10, 1 ml steril silis boncukları ihtiva eden 2 ml vidalı kapak tüp içinde homojenize edilir. Dışkı numuneleri için, en fazla 3 fare pislikleri 1 ml ortam içinde homojen hale getirilmelidir. Tüm numuneler sonra dondurulan (-80 ° C&#39;de) ve plak tahlil yapmadan önce bir kez çözdürülmelidir edilir. </li><li> DMEM / yüksek glukozlu,% 5 (v / v) düşük-endotoksin fetal bovin serumu (&lt;10 EU / ml), 10 mM HEPES, 100 oluşan tam bir DMEM-5 ortam içinde virüs inokulum 10 kat dilüe U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin, 1 mM, temel olmayan amino asitler, 2 mM L-glutamin. </li><li> On-kat seri seyreltiler, 24 oyuklu plakalar olarak hazırlanmıştır: Bir yükseltici pipet çoklu kuyu içine 1.35 ml ortam dağıtmak için kullanılır, 10 -1 seyreltme ortamı 1.35 ml, virüs ihtiva eden numune 0.15 mL karıştırılması ile yapılmıştır ve daha sonra 10 -1 seyreltme 0.15 mi 10 -2 dilutio etmek için ortam 1.35 ml ilave edilirn ve böyle devam eder. Bu ipuçları yeni bir seyreltme yapmak her zaman değiştirmek için önemlidir. Bir çok kanallı bir pipet kuyu başına 0,15 ml &#39;lik bir toplam hacim (Şekil 3A bakın) transfer eden bir 24-kuyulu plakanın iyi birine uygun iki uç ile aynı anda birden fazla numune seyreltmeler yapmak için kullanılabilir. </li><li> Doku homojenatlarında ve fekal içerik için tipik bir seyreltme aralığı 10 -1 10 -3 olduğunu. Bununla birlikte, bu örneklerden doku kültür plakları örnekleri ile karşılaştırıldığında daha küçük olma eğilimindedir. Ayrıca, bazı durumlarda, dışkı örnekleri, 1:100 dilüsyon böylece plaklar saymak için engellemektedir, yeterli derecede tek tabakalı hücre bozabilir dışkı herhangi bir zehirli bileşenleri sulandırmak için gereklidir. Doku kültürü lizatları seyreltme aralığı virüs ömrü çevrimi esnasında ilgi zaman noktasına bağlıdır. 10 -9 kadar gitmek Dilüsyonlar enfeksiyon zirvesinde gerekli olabilir. </li><li> Seri dilüsyonları hazırlandıktan sonra, 6-well plakasındas örnek adını ve kaplama olmak dilüsyonları ile RAW 264.7 mono tabakaları (bölüm 2.1) içeren. Bir seferde bir tabak, dışarı Flicking veya aspire tüm ortamı çıkarın. Hemen ardından bir seyreltilmiş örnek 0,5 ml ekleyin, iyi, sonra bir sonraki seyreltme geçmeden önce, yinelenen bir de tekrarlayın. Tüm 3 dilüsyonları tüm hücreleriyle kaplanmış oylandı sağlamak için elle ileri geri bir plaka, eğim plaka eklenir sonra. Hücrelerin kurumasına olmayacak emin olmak için bir kerede bir tabak tutun. </li><li> Her bir kuyucuğa seyreltmeler ve 0,5 ml eklendikten sonra, dikey plakaları üst üste ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca kuluçkaya onları. Hacim, her bir oyuğa ilave tamamen tek tabakalı karşılamak için yeterli olmadığı için, plakalar nazikçe yandan her 10-15 dakikada tarafından ileri geri hareket ettirildiğinde veya bir sallama cihazı (dakika başına ~ 18 salınım) üzerine yerleştirilmesi gerekir. Bu kurumasını hücrelerini engeller. </li></ol> 3. Düşük Erime Noktası Agaroz (SeaPlaque) Overlay Hazırlık <ol><li> 1 saat inkübasyon işlemi tamamlanmadan önce levha toplam hacim için gereken kaplama miktarını hesaplar. Gerekli hacim / de veya 12 ml/6-well plakası 2 ml. Agaroz (bkz. bölüm 3.2) ve ayrıca medya (bkz. bölüm 3.3) hazırlayın. </li><li> Agaroz hazırlamak için, bir cam şişe içinde, damıtılmış su (% 3 w / v) ve 100 ml &#39;lik bir toplam hacim içinde SeaPlaque agaroz 3 g askıya. 20-30 dakika süreyle otoklav. (Agaroz zaten mikrodalga yeniden erime agaroz-elden önce hazırlanan varsa.) Bu agaroz çok sıcak ise ° C Kullanmadan önce bir su banyosunda, bu hücreleri öldürecek çünkü 42 SeaPlaque agaroz dengelenmesi önemlidir. Su seviyesi istenmeyen katılaşma önlemek için agaroz düzeyine eşit veya üzerinde olduğundan emin olun. </li><li> Ortam hazırlamak için: oluşur 2x MEM medya, 100 ml olun2x MEM,% 10 (v / v) düşük-endotoksin fetal bovin serumu (&lt;10 EU / ml), 10 mM HEPES, 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin, 4 mM L-glutamin. ° C su banyosunda 37 medya dengelenmesi. </li><li> Enfekte hücre mono tabakaları üzerine yayılmış hemen önce, bir 1:1 oranında SeaPlaque agaroz ve bir steril şişe içinde bir araya 2x MEM ortam hem de karıştırılır. Fazla 200 ml paylaşımı gerekiyorsa, bölünmüş çok sayıda şişe içine hacmi ve 37 tutmak ° C su banyosunda kullanıma hazır oluncaya kadar. </li><li> 1 saat inkübasyon (bölüm 2.7 &#39;e bakınız) sonunda her kuyunun inokulum kapalı aspire. Yavaş yavaş her çukurun duvarına pipet koyarak her bir kuyunun kenarına bindirme 2 ml ekleyin. En fazla 5 plakalarına hücrelerin kurumasına fırsat vermeden aynı anda işlenebilir. </li><li> Bindirme doku kültürü inkübatör içine dik plakaları koymadan önce oda sıcaklığında yaklaşık 10 dakika katılaşmasını bekleyin. % 5 CO2 içinde 37 ° C &#39;de 48 saat boyunca levhalar inkübe edin. </li><li> Sonrakuluçka dönemi, plaklar çıplak gözle belli belirsiz görünür, bu yüzden plak varlığı için boyanmamış plakaları kontrol edin. Plak yok görünmüyorsa, ek 4 saat boyunca inkübe ve tekrar kontrol edin. Bununla birlikte, en fazla 72 saat inkübasyon süresi geçmemelidir. </li></ol> 4. Neutral Red Boyama tarafından Plaketlerinin Görselleştirme <ol><li> , - 1 x PBS, 97 ml (doku kültürü derecesi, Mg 2 + etmek; plaklar görselleştirmek için, nötr kırmızı boyama çözeltisi nötr kırmızı, 3 ml (Sigma, katalog # N2889 DPBS içinde% 0.33 w / v) ilave edilmesi ile hazırlanır Ca 2 + - ücretsiz; Gibco, katalog # 10010). 12 ml nötr kırmızı boyama çözeltisi her bir 6-plaka için gereklidir: deney için gerekli olan nötür kırmızı boyama çözeltisinin hacmi hesaplayın. Ardından, her bir kuyucuğa 2 ml ekleyin. Bazı plak tahlil protokolleri agaroz fişi kuyulardan çıkarılması gerektirmesine rağmen, bu protokolde nötral kırmızı boyama çözüm bindirme doğrudan eklenir. </li><li> Bir saat sonra birplaklar hala kuyularda nötral kırmızı boyama çözeltisi ile görünür durumdaysa 37 ° C&#39;de cubation, kontrol edin. Plaklar kolaylıkla görünür değil iseniz, boyama başka bir saat boyunca devam etmesine izin verin. Plaklar görebilir kadar kuluçka devam edin. (Not:. Fazla 3 saat boyunca Boyama optimal değildir ve hiçbir plaklar boyanma 3 saat sonra pozitif kontrol örneği görünür ise, plak tahlil düzgün çalışmadı) boyama tamamlandıktan sonra, nötral kırmızı boyama çözüm aspire , agaroz fiş sağlanması rahatsız ve sonra plaklar sayma devam edilmez. </li><li> Bir ışık kutusu üzerinde baş aşağı plakası yerleştirerek ve yinelenen sayar önlemek için sayılır plaklar üzerinde bir nokta işaretleyerek plaklar sayın. (Birlikte plaklar füzyon hiçbir görsel kanıtlar yani) plaklar açıkça ayrılır kuyularda plaklar saymak için seyreltme seçin. Eğer mümkünse, iki dilüsyonlarda plaklar sayılır. O plak boyutu MNV suşları, virüs inokulum arasında değişebilir dikkat etmek önemlidir, ve bağlıdırplak tahlil sırasında RAW 264.7 hücreleri koşulu. </li><li> Plak yok, iyi görünür, her iki numune içinde mevcut herhangi bir virüs ya da virüs miktarı plak tahlil saptama sınırının altında olduğunu olsaydı. Bu durumda, diğer plaka kuyuları içeren kuyu olarak benzer bir kırmızı renk ile leke. Belirli bir seyrelti içinde mevcut çok sayıda viral partiküller olduğunda Alternatif olarak, plak yokluğunda da görülmektedir. Bu tüm monolayer parçalanma yol açar ve kuyular rengi sarı / turuncu görünür. </li><li> Viral titreleri hesaplayın. Tek bir dilüsyon kuyularda hem plakların sayısını ekleyin ve seyreltme faktörü (yani 1 ml 2 kuyu 0,5 ml ile enfekte olup olmadığını) ile çarpın. Bu 1 ml sizin inokülum hacminin plak oluşturan birim miktarı (PFU) verecektir. Örneğin, 10 -2 seyreltme de Şekil 4 &#39;, iyi bir (&quot;II&quot; işaretli) 14 plaklar vardır ve diğer iyi (&quot;V&quot; işaretli) 17 plaklar vardır. Böylece, viral titresi 14 olacakx10 17x10 2 + 2 = 3.100 (3.1x10 3) pfu / ml. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar Bulaşıcı MNV-1 parçacıklar Şekil 1 &#39;de şematik olarak belirtildiği gibi bir plak deneyi kullanılarak ölçülebilir. Şekil 2A hemen önce enfeksiyon, RAW 264.7 hücreleri, bir tek tabaka ile iyi göstermektedir, Şekil 2B, I, II, roman numaraları ile gösterilen üç görünür plaklar gösterirken Bir kuyu içinde ve III. Testin bireysel adımları Şekil tasvir edilmektedir F. Şekil 3A ile 3A, bir virüs içeren bir örnek, 10-kat inceltilmiş serileri hazırlanması gösterilmektedir. Şekil 3B, bir 6-kuyulu plakanın kuyularının çoğaltmak için dilüsyonları transferi gösterir. Şekil 3C 1 saat için oda sıcaklığında inokulum ile RAW 264.7 hücreleri inkübe etmek için kullanılan cihaz sallanan gösteren Şekil 3B hücreleri SeaPlaque ile kaplanmış olan gösterir:. MEMŞekil 3F hücreler daha sonra bir% 0.01 nötral kırmızı solüsyon 48 saat ile boyanmış olan gösterirken, bir karışım. Şekil 3E, kaplama katılaşmasını sağlamak için oda sıcaklığında bir plaka göstermektedir. 1-3 saat boyunca boyanan hücrelerin ve nötral kırmızı boyama çözüm aspire sonra, plaklar görebilir ve (Şekil 4) sayılabilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4297/4297fig1.jpg" /> Şekil 1. MNV plak tahlil protokolü şematik. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/4297/4297fig2.jpg" /> Şekil 2. Enfeksiyon öncesi ve plak oluşumundan sonra bir tek tabakalı bir iyi Temsilcisi görüntüler. A) RAW 264.7 hücreleri 20x büyütmede ışık mikroskobu altında geceleme ve görüntülü kültüre edildi. B) Hücreler 48 saat sonra 0,01% nötral kırmızı çözeltisi ile boyandıenfeksiyon r ve 4x büyütmede ışık mikroskobu altında görüntülendi. Romen rakamları I, II ve III üç görünür plaklar göstermektedir. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4297/4297fig3.jpg" /> Şekil 3. Farklı plak tahlil adımlar Temsilcisi görüntüler. A) MNV-1 inokulum 10-kat dilüsyonu hazırlanır. B) Aşı, yinelenen bir kuyu içinde hücre mono tabakaları eklenir. C) hücreleri ile inokulum, oda sıcaklığında 1 saat boyunca sallanan ile inkübe edilir. D) hücreler SeaPlaque agaroz ve 2x MEM ortam bir 1:1 karışımı ile üst üste. E) Levhalar kaplama katılaştırmak için izin vermek üzere oda sıcaklığında 10 dakika süreyle kuluçkaya bırakıldı. Nötral kırmızı boyama çözüm 48 saat sonrası enfeksiyon hücrelerin F) Boyama. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/4297/4297fig4.jpg" /> Hücre monol Şekil 4. MNV-1 formları plaklarayers. Burada gösterilenler inkübasyon 1 saat sonra nötral kırmızı boyama çözüm lekeli plaklar gösteren, 48 saat sonrası enfeksiyon temsili bir plak tahlil plakadır. Plakası üç 10 kat dilüsyonlarının yinelenen kuyuları gösterir. I ve IV 10-1 seyreltme karşılık roman numaraları ile etiketlenmiş Wells, II ve V 10-2 seyreltme karşılıktır; III ve VI 10-3 seyreltme karşılık gelir. Numunenin viral titresi (hesaplama ayrıntıları için bakınız Bölüm 4.5) aşağıda belirtilmiştir.

<ol>
	<li>Wobus, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+Norovirus+in+cell+culture+reveals+a+tropism+for+dendritic+cells+and+macrophages.">Replication of Norovirus in cell culture reveals a tropism for dendritic cells and macrophages.</a> PLoS Biol. 2, e432 (2004).</li><li>Wobus, C. E., Thackray, L. B., Virgin, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+norovirus:+a+model+system+to+study+norovirus+biology+and+pathogenesis.">Murine norovirus: a model system to study norovirus biology and pathogenesis.</a> Journal of virology. 80, 5104-5112 (2006).</li><li>Condit, R. C., Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+2.">Ch. 2.</a> Fields Virology. 1, 25-58 (2007).</li><li>Thackray, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+noroviruses+comprising+a+single+genogroup+exhibit+biological+diversity+despite+limited+sequence+divergence.">Murine noroviruses comprising a single genogroup exhibit biological diversity despite limited sequence divergence.</a> Journal of virology. 81, 10460-10473 (2007).</li><li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+estimating+50%+endpoints.">A simple method for estimating 50% endpoints.</a> American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1932).</li><li>Chachu, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+is+critical+for+the+clearance+of+murine+norovirus+infection.">Antibody is critical for the clearance of murine norovirus infection.</a> Journal of virology. 82, 6610-6617 (2008).</li><li>Barron, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+murine+norovirus+strains+isolated+from+asymptomatic+mice+of+different+genetic+backgrounds+within+a+single+U.S.+research+institute.">Diversity of murine norovirus strains isolated from asymptomatic mice of different genetic backgrounds within a single U.S. research institute.</a> PLoS ONE. 6, e21435 (2011).</li><li>Cox, C., Cao, S., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+detection+and+study+of+murine+norovirus-1+using+a+more+efficient+microglial+cell+line.">Enhanced detection and study of murine norovirus-1 using a more efficient microglial cell line.</a> Virology journal. 6, 196 (2009).</li><li>Cooper, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plaque+assay+of+animal+viruses.">The plaque assay of animal viruses.</a> Adv. Virus Res. 8, 319-378 (1961).</li><li>Hyde, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+norovirus+replication+is+associated+with+virus-induced+vesicle+clusters+originating+from+membranes+derived+from+the+secretory+pathway.">Mouse norovirus replication is associated with virus-induced vesicle clusters originating from membranes derived from the secretory pathway.</a> Journal of virology. 83, 9709-9719 (2009).</li><li>Simmonds, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinformatic+and+functional+analysis+of+RNA+secondary+structure+elements+among+different+genera+of+human+and+animal+caliciviruses.">Bioinformatic and functional analysis of RNA secondary structure elements among different genera of human and animal caliciviruses.</a> Nucleic acids research. 36, 2530-2546 (2008).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada sunulan MNV-1 için plak metodu bulaşıcı MNV parçacıkların miktarının bir yoludur. Şekil 3&#39;de gösterilen tahlil adımı takip ederek, tekrar üretilebilir bir viral titreler elde edebilir. Testin tespit limiti kullanılan başlangıç ​​seyreltme bağlıdır. Yukarıda açıklandığı gibi örnek bir 1:10 seyreltme ile başlarken, plak testin saptama sınırının 10 pfu (yani, 10 -1 seyreltme görülebilir 1 plak) &#39;dir. Her bir plak tek bir virüs temsil ettiği için, plak deneyi, izole plaklar çekme ve bunları daha önce tarif 1 yayarak MNV klonal popülasyonları saflaştırmak için kullanılabilir. Buna ek olarak, plak saflandırma da karışık virüs popülasyonlarının tek başına bir virüs popülasyonunun ayırmak için de kullanılabilir. MNV enfeksiyonun tespiti için bir plak tahlil kullanarak bir sınırlaması tüm MNV suşların plaklar 4 oluştururlar olmasıdır. Bununla birlikte, inabili üstesinden gelmek mümkündürseri doku kültürü 7 bu virüsler pasajlanmasını tarafından plak oluşturan hayvanlardan izole edilen bazı suşları MNV, ve ty. Plak tahlil alternatif TCID 50 tekniği 3, 4 ile bulaşıcı partikülleri ölçmektir. Bu tahlil, uç nokta seyreltmeleri ile MNV 4-tamamlanması 1 hafta sürer aşağıdaki aşılanmış doku kültür hücreleri,% 50 CPE üretmek için gerekli olan virüs miktarı miktarını belirler. Bir plak deneyi daha yavaş olmasına ek olarak, TCID 50 tahlil ayrıca şu şekilde duyarlı değildir (tespit limiti = 200 TCID 50 / ml), RAW 264.7 hücreleri, 4 doku örneklerinin toksisite nedeniyle. Protokolü içerisindeki kritik adımlar protokol boyunca tarif edilmiş olmasına rağmen, aşağıdaki bölümde sorun giderme kolaylaştırmak için bir özet sunar. Protokolde en kritik adım RAW 264.7 hücreleri virüs çoğaltması desteklemek için test boyunca canlı kalmasını sağlamaktır. Bu canışık mikroskobu ile testin her aşamasında izlenecektir. Hücre canlılığı, iki yolla sağlanır. Birincisi, bakım plakaları tutarken hücrelerin kurumasına izin vermeyin alınmalıdır. Böylece, plakaları, bir defada bir aşılanmış enfeksiyon döneminde sarsan ve onlar ele edilmemesi zaman kalır kapalı olmalıdır edilmektedir. İkinci olarak, çözeltiler hücrelerin üzerine ilave ~ 37 ° C &#39;ye dengelenmiş olmalıdır Bundan başka, hücrelerin aktivasyonu sınırlayan düşük endotoksin serum (&lt;10 EU / ml) içeren ortam içinde bakımı için de RAW 264.7 hücreleri genel sağlığı için hayati önem taşır. Pasaj 30 ya da daha yüksek bir ikinci hücreleri kullanılarak Buna ek olarak, plak deneyi daha yüksek bir başarısızlık oranı gözlemledik. Bu büyük olasılıkla laboratuvardan laboratuvara değişir rağmen, yüksek geçit RAW 264.7 hücreleri kullanarak, özellikle tekrarlanabilir titreleri sağlamak için (örneğin, bilinen bir viral titreye sahip bir örnek) bir pozitif kontrol dahil etmek önemlidir. Yüksek geçit hücrelerin kullanımını sınırlamak için, erken passa şişeleri dondurmak tavsiye edilirRAW 264.7 hücrelerin alınması ve sıklıkla dondurulmuş flakonlarından yeni bir kültür başlamak üzerine ge hücreleri. Hücreleri değişmiş gibi, hücre morfolojisi değişiklikler uymak (örneğin yuvarlak çırpı ve yaymak) başarısızlık gibi özellikler, veya mikoplazma kirlenme tespit edildiğinde sergilemek zaman düşük geçişi hücre kültürleri üzerinde başlayarak da yararlı olacaktır. Dikkat etmek önemli bir nokta da pipet uçları örnekleri arasında ve dilüsyonları sırasında değiştirilen sağlamaktır. Bu doğru seri dilüsyonları sağlamak ve örnekler arasında çapraz bulaşmayı önlemek olacaktır. Aynı örnek seri dilüsyonları kuyucuklara ilave edilmesi ile aynı pipet ucu tekrar kullanılabilir protokol içinde bir adımdır. Bu durumda, bir çok seyreltilmiş inokulum den az başlar ve yeni bir seyreltme çizerken şiddetle aşağı yukarı pipetle etmelidir. Plak tahlil protokolü bazı modifikasyonlar iyileştirilebilir. T yapılabilir bir modifikasyonuburada iki kopya halinde kuyu inokülasyon için yeterli hücre olmayan her bir seyreltme için sadece tek bir iyi aşılamak için. Inokulum hacmi 0.5 ml olan Bununla beraber, plaklar sayı daha sonra pfu / ml &#39;ye normalleştirmek için 2 faktör ile çarpılır gerekmektedir. Plak tahlil da MNV replikasyon desteklemek mümkün olan herhangi bir diğer yapışık hücre hattı ile kullanım için adapte edilebilir, ve bu fare mikroglial BV-2 hücre dizisi 8 için tarif edilmiştir. Uygulanabilir diğer değişiklikler diğer virüsler için geliştirilen plak tahlil protokolleri için tarif edilmiştir uyarlamalar vardır. MNV halinde, aşağıdaki modifikasyonlar önceden başarılı bir şekilde uygulanmıştır; metil yerine Deniz Plak selüloz agaroz 9, ve kristal mor ya da yerine nötr kırmızı 10, 11 ve metilen mavisi ile boyanması hücrelerin kullanımı. Diğer plak oluşturan virüs ölçmek için gerekli ya da oth için kullanılır Genel olarak, bu protokol kolayca adapte edilebilirgenel olarak bulaşıcı viral parçacıkların ölçmek için yararlı bir araç yapma, RAW 264.7 hücrelerinde litik enfeksiyonlara neden er virüsler.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> DMEM / Yüksek glukoz </td><td> Hyclone </td><td> SH30243.02 </td></tr><tr><td> 2x MEM </td><td> Gibco </td><td> 11935 </td></tr><tr><td> 100x Penisilin ve streptomisin </td><td> Hyclone </td><td> SV30010 </td></tr><tr><td> 10 mM olmayan esansiyel amino asitler </td><td> Hyclone </td><td> SH30238.01 </td></tr><tr><td> 1M Hepes </td><td> Hyclone </td><td> SH30237.01 </td></tr><tr><td> 200 mM (100x) L-glutamin </td><td> Hyclone </td><td> SH30034.01 </td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum </td><td> Gibco, Hyclone </td><td> 10437, SH30070.02 </td></tr><tr><td> Deniz Plak Agaroz </td><td> Lonza </td><td> 50100 </td></tr><tr><td> Nötr Kırmızı 0.33% </td><td> Sigma </td><td&gt; N2889 </td></tr><tr><td> 1x PBS </td><td> Gibco </td><td> 10010 </td></tr><tr><td> 1,0 mm Zirkonya / Silika boncuk </td><td> BioSpec Ürünler </td><td> 11079110z </td></tr><tr><td> Model 35 Hız Rocker </td><td> Labnet </td><td> S2035 </td></tr><tr><td> Magna Lyser Enstrüman </td><td> Roche </td><td> 03358968001 </td></tr><tr><td> Ham 264.7 hücre hattı </td><td> ATCC </td><td> TİB-71 </td></tr><tr><td> Doku kültürü inkübatör </td><td> Sanyo </td><td> MCO-18AIC </td></tr></tbody></table>

plaque assay for murine norovirus

Mürin norovirusa (MNV) verimli doku kültürü 1, 2 yetişir Norovirüs cinsinin tek üyesidir. Hücre parçalama ve sitopatik etki (CPE) fare dendritik hücreler veya makrofajlar 1 MNV-1 enfeksiyonu sırasında görülür. MNV-1 Bu özellik, bir plak deneyi 1 gerçekleştirerek, belirli bir örnek içinde bulaşıcı maddelerin sayısını ölçmek için kullanılabilir. Plak tahlil olmuş akyuvarlar ve plaklar 3 olarak adlandırılan bir birleşik hücre monolayer, delik oluşturmak için MNV-1 yatmaktadır. Birden çok doku kültürü teknikleri, hasat edilmiş doku, klinik, çevre örneklerde viral enfeksiyonların tespit etmek için kullanılır, fakat hepsi değil ölçü bulaşıcı parçacıklar (örn. qRT-PCR). Edilebilir Bulaşıcı virüs parçacıkları ölçmek için bir yolu, aşağıda daha detaylı olarak tarif edilecektir bir plak deneyi 3, gerçekleştirilmesidir. MNV plak tahlil bir varyasyonu flor olduğunuMNV antijen hücre mono tabakaları 4 immunohistokimyasal edilir escent odak tahlil. Viral antijen ekspresyonu plak oluşumu önündeki tarihi Bu testte, daha hızlı olabilir. Aynı zamanda, plak oluşturan yapamaz virüs titrasyonu için yararlıdır. Ancak, floresan odak tahlil gibi antikorlar ve odak oluşturan birim saymak için bir mikroskop gibi plak testin ötesinde ek kaynaklar gerektirir. Bulaşıcı MNV ayrıca% 50 Doku Kültürü Enfektif Doz (TCID 50) 3 belirlenerek ölçülebilir. Bu tahlil, uç 5 ile titrasyon aşılanmış doku kültür hücreleri,% 50 CPE üretmek için gerekli olan virüs miktarını ölçer. Ancak, algılama sınırına bir plak tahlil 4 ile karşılaştırıldığında daha yüksektir. Bu yazıda, etkili biyolojik ya da çevresel numuneler 1, 4, 6 mevcut bulaşıcı MNV parçacıkların sayısını belirlemek için kullanılabilecek bir plak tahlil protokol açıklar. Bu yöntem olup baizin veren hücreler (RAW 264.7 mürin makrofaj hücreleri) bir tek tabaka aşılamak için kullanılır MNV ihtiva eden numuneler, 10-kat seri seyreltiler hazırlanması sed. Virüs zaman belirli bir süre için hücre mono tabakasında bağlanmasına izin verilir ve daha sonra agaroz ve hücre kültür ortamı bir karışımı hücreleri kapsayan önce aspire edilir. Soğuk bir şekilde yer alan hücrelere yaymak sınırlandırarak agar komşu hücreler, viral soy yayılmasını sağlar. Sonuç olarak, enfekte olmuş hücreler lize ve mono tabakasında deliklerin şekil plaklar olarak bilinir. Virüsün yeterli yayılması üzerine, plaklar nötr kırmızı, metilen mavisi veya kristal viyole gibi boyalar ile hücrelerin görünür aşağıdaki boyama olur. Düşük dilüsyonları, her plak komşu hücrelere yayılmış tek bir bulaşıcı viral partikül ve döl, kaynaklanır. Böylece, plakların sayısını sayma biri seyreltilmemiş numune 3 mevcut plak oluşturan birim (PFU) hesaplamak için izin verir.

Watch this Scientific Journal Video about Plaque Assay for Murine Norovirus at JoVE.com

Plaque Assay for Murine Norovirus

Burada etkin hücre kültüründe çoğaltır yalnızca norovirusa olduğunu murin norovirusa (MNV), infeksiyöz partikül ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Plak tahlil murin makrofajlar için MNV en tropizm yararlanır ve MNV içeren biyolojik veya çevresel numuneler ile kullanım için adapte edilebilir.

Mürin Norovirüs için Plak Testi

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

54.5K Görüntüleme.  University of Michigan, Ann Arbor. Burada etkin hücre kültüründe çoğaltır yalnızca norovirusa olduğunu murin norovirusa (MNV), infeksiyöz partikül ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Plak tahlil murin makrofajlar için MNV en tropizm yararlanır ve MNV içeren biyolojik veya çevresel numuneler ile kullanım için adapte edilebilir.

Video: Plaque Assay for Murine Norovirus

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a standardized method for use in multiple analytical laboratories during monitoring period 3 of the Unregulated Contaminant Monitoring Rule. Herein we present the protocol for extraction of viral ribonucleic acid (RNA) from water sample concentrates and for quantitatively measuring enterovirus and norovirus concentrations using reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR). Virus concentrations for the molecular assay are calculated in terms of genomic copies of viral RNA per liter based upon a standard curve. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. The method has been evaluated by examining virus recovery from ground and reagent grade waters seeded with poliovirus type 3 and murine norovirus as a surrogate for human noroviruses. Mean poliovirus recoveries were 20% in groundwaters and 44% in reagent grade water. Mean murine norovirus recoveries with the RT-qPCR assay were 30% in groundwaters and 4% in reagent grade water.

Here we present a procedure to quantify enterovirus and norovirus in environmental and drinking waters using reverse transcription-quantitative PCR. Mean virus recovery from groundwater with this standardized procedure from EPA Method 1615 was 20% for poliovirus and 30% for murine norovirus.

Enterovirüs Kültür ve RT-qPCR Su Norovirus Oluşum EPA Method 1615 Ölçümü. Bölüm III. RT-qPCR Virüs Algılama

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

Çevre

Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close person-to-person contact cannot be avoided 1, 2. During the last few years an increase in the incidence of outbreaks in hospitals has been reported, causing significant disruptions to their operational capacity as well as large economic losses. The identification of new antiviral approaches has been limited due to the inability of human noroviruses to complete a productive infection in cell culture 3. The recent isolation of a murine norovirus (MNV), closely related to human norovirus 4 but which can be propagated in cells 5 has opened new avenues for the investigation of these pathogens 6, 7. 
MNV replication results in the synthesis of new positive sense genomic and subgenomic RNA molecules, the latter of which corresponds to the last third of the viral genome (Figure 1). MNV contains four different open reading frames (ORFs), of which ORF1 occupies most of the genome and encodes seven non-structural proteins (NS1-7) released from a polyprotein precursor. ORF2 and ORF3 are contained within the subgenomic RNA region and encode the capsid proteins (VP1 and VP2, respectively) (Figure 1). Recently, we have identified that additional ORF4 overlapping ORF2 but in a different reading frame is functional and encodes for a mitochondrial localised virulence factor (VF1) 8.
Replication for positive sense RNA viruses, including noroviruses, takes place in the cytoplasm resulting in the synthesis of new uncapped RNA genomes. To promote viral translation, viruses exploit different strategies aimed at recruiting the cellular protein synthesis machinery 9-11. Interestingly, norovirus translation is driven by the multifunctional viral protein-primer VPg covalently linked to the 5' end of both genomic and subgenomic RNAs 12-14. This sophisticated mechanism of translation is likely to be a major factor in the limited efficiency of viral recovery by conventional reverse genetics approaches. 
Here we report two different strategies based on the generation of murine norovirus-1 (referred to as MNV herewith) transcripts capped at the 5' end. One of the methods involves both in vitro synthesis and capping of viral RNA, whereas the second approach entails the transcription of MNV cDNA in cells expressing T7 RNA polymerase. The availability of these reverse genetics systems for the study of MNV and a small animal model has provided an unprecedented ability to dissect the role of viral sequences in replication and pathogenesis 15-17.

Noroviruses are a major cause of gastroenteritis yet molecular techniques for their characterisation are still relatively new. Here we report two different reverse genetics approaches for the efficient recovery of murine norovirus (MNV), the only member of this genus which can be propagated in cell culture.

Bulaşıcı Mürin Norovirüs Ters Genetik Aracılı Kurtarma

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of discrete plaques (infectious units and cellular dead zones) in cell culture. Here we demonstrate how to perform a basic plaque assay, and how differing overlays and techniques can affect plaque formation and production. Typically solid or semisolid overlay substrates, such as agarose or carboxymethyl cellulose, have been used to restrict viral spread, preventing indiscriminate infection through the liquid growth medium. Immobilized overlays restrict cellular infection to the immediately surrounding monolayer, allowing the formation of discrete countable foci and subsequent plaque formation. To overcome the difficulties inherent in using traditional overlays, a novel liquid overlay utilizing microcrystalline cellulose and carboxymethyl cellulose sodium has been increasingly used as a replacement in the standard plaque assay. Liquid overlay plaque assays can be readily performed in either standard 6 or 12 well plate formats as per traditional techniques and require no special equipment. Due to its liquid state and subsequent ease of application and removal, microculture plate formats may alternatively be utilized as a rapid, accurate and high throughput alternative to larger scale viral titrations. Use of a non heated viscous liquid polymer offers the opportunity to streamline work, conserves reagents, incubator space, and increases operational safety when used in traditional or high containment labs as no reagent heating or glassware are required. Liquid overlays may also prove more sensitive than traditional&#160;overlays for certain heat labile viruses.

Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

Kullanımı Geleneksel Hikaye ve Roman Yerleşimi Sistemleri: Plak Tahliller sayesinde viral Konsantrasyon Tayini

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.

This study describes an imaging-based micro-neutralization assay to analyze the antigenic relationships between viruses. The protocol employs a flatbed scanner and has four steps, including titration, titration quantitation, neutralization, and neutralization quantitation. The assay works well with current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses.

Bir Kantitatif Mikro-nötralizasyon Testi optimizasyonu

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

Yüzeyler İnsan Norovirus Tespiti sürüntü Örnekleme Yöntemi

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine detection of the virus. The current detection and quantification techniques, which rely primarily on nucleic acid amplification, do not discriminate infectious from non-infectious viral particles. The purpose of this article is to present specific details on recent advances in techniques used together in order to acquire further information on the infectivity status of viral particles. One technique involves assessing binding of a norovirus ssDNA aptamer to capsids. Aptamers have the advantage of being easily synthesized and modified, and are inexpensive and stable. Another technique, dynamic light scattering (DLS), has the advantage of observing capsid behavior in solution. Electron microscopy allows for visualization of the structural integrity of the viral capsids. Although promising, there are some drawbacks to each technique, such as non-specific aptamer binding to positively-charged molecules from sample matrices, requirement of purified capsid for DLS, and poor sensitivity for electron microscopy. Nonetheless, when these techniques are used in combination, the body of data produced provides more comprehensive information on norovirus capsid integrity that can be used to infer infectivity, information which is essential for accurate evaluation of inactivation methods or interpretation of virus detection. This article provides protocols for using these methods to discriminate infectious human norovirus particles.

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Routine detection methods utilizing viral genome amplification are limited by their inability to discriminate infectious from non-infectious particles. The purpose of this article is to provide detailed protocols for alternative methods to aid in discrimination of infectious norovirus particles using aptamer binding, dynamic light scattering, and transmission electron microscopy.

Viral kapsid yapısal bütünlük belirlenmesi için alternatif Vitro yöntemleri

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine ...

Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus

Rotavirus is the main etiological factor for infantile diarrhea. It is a double-stranded (ds) RNA virus and forms a genetically diverse population, known as quasispecies, owing to their high mutation rate. Here, we describe how to measure the specific growth rate and the cell-binding ability of rotavirus as its phenotypes. Rotavirus is treated with trypsin to recognize the cell receptor and then inoculated into MA104 cell culture. The supernatant, including viral progenies, is collected intermittently. The plaque assay is used to confirm the virus titer (plaque-forming unit: pfu) of each collected supernatant. The specific growth rate is estimated by fitting time-course data of pfu/mL to the modified Gompertz model. In the assay of cell-binding, MA104 cells in a 24-well plate are infected with rotavirus and incubated for 90 min at 4 &#176;C for rotavirus adsorption to cell receptors. A low temperature restrains rotavirus from invading the host cell. After washing to remove unbound virions, RNA is extracted from virions attached to cell receptors followed by cDNA synthesis and reverse-transcription quantitative PCR (RT-qPCR). These protocols can be applied for investigating the phenotypic differences among viral strains.

Here we present two protocols, one for measuring the specific growth rate and the other for the cell-binding ability of rotavirus using the plaque assay and RT-qPCR. These protocols are available for confirming the differences in phenotypes between rotavirus strains.

Belirli büyüme oranı ve hücre-bağlama yeteneği Rotavirüs deneyleri

Rotavirus is the main etiological factor for infantile diarrhea. It is a double-stranded (ds) RNA virus and forms a genetically diverse population, known ...

Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Commensal Bacteria Using Flow Cytometry

Commensal bacteria are well established to impact infection of eukaryotic viruses. Direct binding between the pathogen and the host microbiome is responsible for altering infection for many of these viruses. Thus, characterizing the nature of virus-bacteria binding is a foundational step needed for elucidating the mechanism(s) by which bacteria alter viral infection. For human norovirus, commensal bacteria enhance B cell infection. The virus directly binds to these bacteria, indicating that this direct interaction is involved in the mechanism of infection enhancement. A variety of techniques can be used to quantify interactions between bacteria and viruses including scintillation counting of radiolabeled viruses and polymerase chain reaction (PCR). Both methods require the use of live virus, which may need to be generated in the laboratory. Currently, none of the established in vitro culture systems available for human norovirus are robust enough to allow for generation of highly concentrated viral stocks. In lieu of live virus, virus-like particles (VLPs) have been used to characterize the interactions between norovirus and bacteria. Herein a flow cytometry method is described with uses virus specific antibodies to quantify VLP binding to gram-negative and gram-positive bacteria. Inclusion of both bacteria only and isotype controls allowed for optimization of the assay to reduce background antibody binding and accurate quantification of VLP attachment to the bacteria tested. High VLP:bacterium ratios result in VLPs binding to large percentages of the bacterial population. However, when VLP quantities are decreased, the percent of bacteria bound also decreases. Ultimately, this method can be employed in future experiments elucidating the specific conditions and structural components that regulate norovirus:bacterial interactions.

The goal of this protocol is to quantify binding of the eukaryotic pathogen human norovirus to bacteria. After performing an initial virus-bacterium attachment assay, flow cytometry is used to detect virally-bound bacteria within the population.

Akış Sitometrikullanarak Commensal Bakterilere Bağlanan İnsan Norovirüs Benzeri Partiküllerin Ölçülmesi

Commensal bacteria are well established to impact infection of eukaryotic viruses. Direct binding between the pathogen and the host microbiome is ...

Plaque Assay: A Method to Determine Viral Titer as Plaque Forming Units (PFU)

Source: Tilde Andersson1, Rolf Lood1 
1 Department of Clinical Sciences Lund, Division of Infection Medicine, Biomedical Center, Lund University, 221 00 Lund, Sweden
Viruses that infect prokaryotic organisms, called bacteriophages or simply phages, were identified in the early 20th century by Twort (1) and d&#39;H&#233;relle (2) independently. Phages have since been widely recognized for their therapeutic value (3) and their influence on human (4), as well as global, ecosystems (5). Current concerns have fueled a renewed interest in the use of phages as an alternative to modern antibiotics in treatment of infectious disease (6). Essentially all phage research relies on the ability to purify and quantify viruses, also known as a viral titer. Initially described in 1952, this was the purpose of the plaque assay (7). Decades and multiple technological advancements later, the plaque assay remains one of the most reliable methods for determination of viral titer (8).
Bacteriophages subsist by injecting their genetic material into host cells, hijacking the machineries for production of new phage particles, and eventually causing the host to release numerous progeny virions through cell lysis. Because of their minute size, bacteriophages cannot be observed using solely light microscopy; therefore, scanning electron microscopy is required (Figure 1). Additionally, phages cannot be cultivated on nutritional agar plates like bacteria, as they need host cells to prey on.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10514/10514fig1.jpg" /> 
Figure 1: The morphology of a bacteriophage, here exemplified by an E. coli phage, can be studied using scanning electron microscopy. Most bacteriophages belong to Caudovirales (tailed bacteriophages). This particular phage has a very short tail structure and an icosahedral head, placing it in the family of Podoviruses.
The plaque assay (Figure 2) is based on incorporation of host cells, preferentially in log-phase growth, into the medium. This creates a dense, turbid layer of bacteria able to sustain viral growth. An isolated phage can subsequently infect, replicate within, and lyse one cell. With each lysed cell, multiple adjacent ones become immediately infected. Several cycles in, a clear zone (a plaque) can be observed in the otherwise turbid plate (Figure 2B/Figure 3A), indicating the presence of what was initially a single bacteriophage particle. The number of plaque forming units per volume (i.e. PFU/mL) of a sample, can thus be determined from the number of plaques generated.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10514/10514fig2.jpg" /> 
Figure 2: Testing for plaque forming units (PFU) is a common method for determining the number of bacteriophages in a sample. (A) The base of a sterile Petri dish is covered with an appropriate solid nutrient medium, followed by a mixture of soft media, susceptible host cells and a dilution of the original bacteriophage sample. Note that the phage-suspension could, in some cases, also be evenly spread-out across the surface of already solidified soft agar. (B) Growth of the host bacteria forms a lawn of cells in the top agar layer. Bacteriophage replication generates clear zones, or plaques, caused by host cell lysis.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10514/10514fig3.jpg" /> 
Figure 3: Results from PFU-testing show multiple plaques generated by bacteriophages. Due to lysis of susceptible host cells, plaques can be seen as clearing zones in the bacterial lawn, either with (A) full clearance, or (B) partial re-growth caused by generation of resistant bacteria (or possibly by temperate phages in the lysogenic cycle).
Certain temperate phages can adopt what is referred to as a lysogenic lifecycle, in addition to the formerly described lytic growth. In lysogeny, the virus assumes a latent state through incorporation of its genetic material into the genome of the host cell (9), often conferring resistance to further phage infections. This is sometimes revealed through a slight clouding of the plaque (Figure 3B). It is worth noting however, that plaques can also appear blurred due to re-growth of bacteria that have evolved resistance to the phage independent of previous phage infections.
Viruses can attach, or adsorb, to only a limited range of host bacteria (10). Host ranges are further limited by intracellular anti-viral strategies such as the CRISPR-Cas system (11). The resistance/sensitivity towards specific phages displayed by bacterial subgroups has historically been used to categorize bacterial strains into different phage types (Figure 4). Although the effectiveness of this method has now been surpassed by novel sequencing techniques, phage typing can still provide valuable information about bacteria-phage interactions, for instance, facilitating the design of a phage cocktail for clinical usage.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10514/10514fig4.jpg" /> 
Figure 4: Phage sensitivity of different bacterial strains. Soft agar plates with Cutibacterium acnes strain (A) AD27 and (B) AD35, were spotted with 21 different C. acnes bacteriophages. Only phage 11 were able to infect and kill AD27 while strain AD35 showed sensitivity towards all phages. This technique, termed phage typing, can be used to divide bacterial species and strains into different subgroups based on phage susceptibility.

Determining Viral Titer as Plaque Forming Units PFU

Source: Tilde Andersson1, Rolf Lood1
1 Department of Clinical Sciences Lund, Division of Infection Medicine, Biomedical Center, Lund University, 221 00 ...

Education

JoVE Science Education

İleri Biyoloji

Mikrobiyoloji

An Assay to Quantify the Binding of Human Norovirus VLPs to Intestinal Bacteria

Source: Madrigal, J. L., et al. <a href="https://app.jove.com/v/61048">Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Commensal Bacteria Using Flow Cytometry.</a> J. Vis. Exp. (2020).
This video demonstrates an assay for quantifying human norovirus virus-like particles (VLPs) binding to human intestinal bacteria. The bacterial suspensions are mixed with the VLPs and incubated to allow the formation of VLP-bacteria complexes. The complexes are then labeled with fluorophore-tagged VLP-specific antibodies, followed by flow cytometry-based visualization and quantification to identify the percentage of VLP-bound bacteria.

İnsan Norovirüs VLP'lerinin Bağırsak Bakterilerine Bağlanmasını Ölçmek İçin Bir Test

1. VLP-bacteria Attachment Assay
CAUTION: Human norovirus VLPs are a biosafety level (BSL)-2 hazard, and all work involving VLPs should be performed in a ...