Bu araştırma Ian Goodfellow ve Armando Arias verilen Marie Curie Avrupa İçi Bursu (7.ÇP Avrupa Araştırma Konseyi) verilen bir Wellcome Trust Kıdemli Kardeşliği tarafından finanse edildi. Biz, bize onların Agilent bioanalyser kullanma izni veren ve RNA örnekleri çalışan yardım için Io Hong Cheong, Dr Rebecca Robey ve Dr Mike Skinner teşekkür etmek istiyorum.

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outbreaks+of+gastroenteritis+associated+with+noroviruses+on+cruise+ships--United+States.">Outbreaks of gastroenteritis associated with noroviruses on cruise ships--United States.</a> MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep. 51, 1112-1115 (2002).</li><li>Lopman, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+and+cost+of+nosocomial+gastroenteritis,+Avon,+England,+2002-2003.">Epidemiology and cost of nosocomial gastroenteritis, Avon, England, 2002-2003.</a> Emerg. Infect. Dis. 10, 2002-2003 (2004).</li><li>Duizer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+efforts+to+cultivate+noroviruses.">Laboratory efforts to cultivate noroviruses.</a> J. Gen. Virol. 85, 79-87 (2004).</li><li>Karst, S. M., Wobus, C. E., Lay, M., Davidson, J., Virgin, H. W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT1-dependent+innate+immunity+to+a+Norwalk-like+virus.">STAT1-dependent innate immunity to a Norwalk-like virus.</a> Science. 299, 1575-1575 (2003).</li><li>Wobus, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+Norovirus+in+cell+culture+reveals+a+tropism+for+dendritic+cells+and+macrophages.">Replication of Norovirus in cell culture reveals a tropism for dendritic cells and macrophages.</a> PLoS Biol. 2, e432 (2004).</li><li>Bok, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+norovirus+replication+by+morpholino+oligomers+targeting+the+5'-end+of+the+genome.">Inhibition of norovirus replication by morpholino oligomers targeting the 5'-end of the genome.</a> Virology. 380, 328-337 (2008).</li><li>Kim, Y., Thapa, M., Hua, D. H., Chang, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+nanogels+for+oral+delivery+of+interferon+for+norovirus+infection.">Biodegradable nanogels for oral delivery of interferon for norovirus infection.</a> Antiviral Res. 89, 165-173 (2011).</li><li>McFadden, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norovirus+Regulation+of+the+Innate+Immune+Response+and+Apoptosis+Occurs+via+the+Product+of+the+Alternative+Open+Reading+Frame+4.">Norovirus Regulation of the Innate Immune Response and Apoptosis Occurs via the Product of the Alternative Open Reading Frame 4.</a> PLoS Pathog. 7, e1002413 (2011).</li><li>Kormelink, R., van Poelwijk, F., Peters, D., Goldbach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-viral+heterogeneous+sequences+at+the+5'+ends+of+tomato+spotted+wilt+virus+mRNAs.">Non-viral heterogeneous sequences at the 5' ends of tomato spotted wilt virus mRNAs.</a> J. Gen. Virol. 73, 2125-2128 (1992).</li><li>Shuman, S., Hurwitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+mRNA+capping+by+vaccinia+virus+guanylyltransferase:+characterization+of+an+enzyme--guanylate+intermediate.">Mechanism of mRNA capping by vaccinia virus guanylyltransferase: characterization of an enzyme--guanylate intermediate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78, 187-191 (1981).</li><li>Jang, S. K., Pestova, T. V., Hellen, C. U., Witherell, G. W., Wimmer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap-independent+translation+of+picornavirus+RNAs:+structure+and+function+of+the+internal+ribosomal+entry+site.">Cap-independent translation of picornavirus RNAs: structure and function of the internal ribosomal entry site.</a> Enzyme. 44, 292-309 (1990).</li><li>Chaudhry, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caliciviruses+differ+in+their+functional+requirements+for+eIF4F+components.">Caliciviruses differ in their functional requirements for eIF4F components.</a> J. Biol. Chem. 281, 25315-25325 (2006).</li><li>Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calicivirus+translation+initiation+requires+an+interaction+between+VPg+and+eIF+4.">Calicivirus translation initiation requires an interaction between VPg and eIF 4.</a> E. EMBO Rep. 6, 968-972 (2005).</li><li>Herbert, T. P., Brierley, I., Brown, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+protein+linked+to+the+genomic+and+subgenomic+mRNAs+of+feline+calicivirus+and+its+role+in+translation.">Identification of a protein linked to the genomic and subgenomic mRNAs of feline calicivirus and its role in translation.</a> J. Gen. Virol. 78 ( Pt5 ), 1033-1040 (1997).</li><li>Chaudhry, Y., Skinner, M. A., Goodfellow, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+genetically+defined+murine+norovirus+in+tissue+culture+by+using+a+fowlpox+virus+expressing+T7+RNA+polymerase.">Recovery of genetically defined murine norovirus in tissue culture by using a fowlpox virus expressing T7 RNA polymerase.</a> J. Gen. Virol. 88, 2091-20100 (2007).</li><li>Ward, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+infectious+murine+norovirus+using+pol+II-driven+expression+of+full-length+cDNA.">Recovery of infectious murine norovirus using pol II-driven expression of full-length cDNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 11050-11055 (2007).</li><li>Yunus, M. A., Chung, L. M., Chaudhry, Y., Bailey, D., Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+optimized+RNA-based+murine+norovirus+reverse+genetics+system.">Development of an optimized RNA-based murine norovirus reverse genetics system.</a> J. Virol. Methods. 169, 112-118 (2010).</li><li>Arias, A., Perales, C., Escarmis, C., Domingo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+mutants+of+VPg+reveal+new+cytopathology+determinants+in+a+picornavirus.">Deletion mutants of VPg reveal new cytopathology determinants in a picornavirus.</a> PLoS One. 5, e10735 (2010).</li><li>Werf, S. v. a. n. d. e. r., Bradley, J., Wimmer, E., Studier, F. W., Dunn, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+infectious+poliovirus+RNA+by+purified+T7+RNA+polymerase.">Synthesis of infectious poliovirus RNA by purified T7 RNA polymerase.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 2330-2334 (1986).</li><li>Bailey, D., Thackray, L. B., Goodfellow, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+amino+acid+substitution+in+the+murine+norovirus+capsid+protein+is+sufficient+for+attenuation+in+vivo.">A single amino acid substitution in the murine norovirus capsid protein is sufficient for attenuation in vivo.</a> J. Virol. 82, 7725-7728 (2008).</li><li>Bailey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+RNA+structures+present+at+the+3'+extremity+of+the+murine+norovirus+genome:+the+variable+polypyrimidine+tract+plays+a+role+in+viral+virulence.">Functional analysis of RNA structures present at the 3' extremity of the murine norovirus genome: the variable polypyrimidine tract plays a role in viral virulence.</a> J. Virol. 84, 2859-2870 (2010).</li></ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Burada hücre kültüründe enfeksiyon MNV iyileşme sağlayan iki farklı ters genetik yaklaşımlar gösterdik. Etkili bir şekilde daha sonra hücresel ribozom tarafından tanınan kapaklı MNV transkriptlerin üretimi ile viral RNA genomu 5 &#39;ucuna VPG arasında kovalan bağlantı için kaçınılmaz bir gerekliliktir bypass yaklaşır hem. Enzimatik kapaklama takiben in vitro transkripsiyonu sonucunda da daha etkili olduğunu transkriptlerin FPV kapaklama enzimleri ile kaplı edilebildiği T7 RNA polimeraz, Salgılayan hücrelerin enfeksiyöz plasmidlerin transkripsiyon daha bulaşıcı MNV geri kazanımı. Bu karşıt genetik sistem ile geri kazanılan virüs titreleri enfekte hücre kültürlerinde 17 (Şekil 5) ile saflaştırılmış viral VPG-bağlı RNA transfeksiyon ile elde edilen bu gibidir. Müsamahakar Raw264.7 hücrelere kapaklı MNV RNA transfeksiyonundan transfectio içeren deneyler ile kıyaslandığında sadece 1-log daha düşük bir virüs titre vermektedirn viral VPG-bağlı RNA (Şekil 5) içeren enfekte olmuş hücreler elde edilen toplam RNA. Bu gerçek, bu sistem tarafından üretilen transkriptlerin 5 &#39;ucuna bir VPG molekülün Ayrıca VPG ilişkili hücrelerinde MNV enfektivite yatan işlevsel yönlerini ortaya çıkarabilir artış virüsü verimleri ile sonuçlanabilir olup olmadığını belirlemek için daha ileri araştırmalar teşvik eder. Diğer RNA virüsleri ile karşılaştırılabilir bir yüksek verimli bir genetik sistemleri şu anda in vitro transkripsiyon RNA virionlar 19, 20 gerçek enfeksiyonları daha sadece 10-100 düşük titreleri kurtarma olanak sağlayan kullanılan ters olarak Bununla birlikte, bu ters genetik sistem görüyoruz. Genel olarak, mevcut metodolojiler norovirüs moleküler biyoloji alanında önemli bir adım oluşturan ve norovirüs genomlarında proteinler ve korunmuş RNA motiflerin fonksiyonel rolleri araştırmak için araçlar bize. Bu yaklaşımlar zaten c ile kombine edilmiştir10 günden daha kısa 4, 21 farelerde - urrent fare modelinde kullanılabilir ve MNV bulaşıcı cDNA&#39;dan geri göstermiştir ki,&gt;% 80 STAT1-/ öldürücü enfeksiyonunun yol edebilmektedir. Biz kapsid protein ve in vivo 21, 22 biraz zayıflatılmış fenotipleri gösterilecek farklı konakçı faktörleri (PTB ve PCBP) bağlayıcı karışan polypyrimidine yollarının uygulanabilir murin norovirüs mutantlar iyileşti bu sistemin kullanılması. Buna ek olarak, son zamanlarda yeniden hücre kültürü içinde etkin bir şekilde çoğaltmak ORF4 gelen VF1 proteini ifade etme yeteneğine ancak yoksun virüsler WT MNV 8 ile ilgili olarak, farelerde virülans azaltılmış olduğunu göstermiştir. Bu çalışmalar bize potansiyel aşı adayı olarak incelenebilir MNV çalışmalara dayalı insan noroviruses zayıflatılmış sürümleri tasarlamak için teşvik ediyoruz.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Lityum klorür yağış çözüm </td><td> Ambion </td><td> AM9480 </td></tr><tr><td> RNA depolama çözümü </td><td> Ambion </td><td> AM7000 </td></tr><tr><td> MEGAscript T7 komut </td><td> Ambion </td><td> AM1333 </td></tr><tr><td> ScriptCap m7G Sistemi Kapatma </td><td> Epicentre Biyoteknoloji </td><td> SCCE0610 </td></tr><tr><td> Neon transfeksiyon sistemi </td><td> Invitrogen </td><td> MPK5000 </td></tr><tr><td> Neon transfeksiyon sistemi kiti </td><td> Invitrogen </td><td> MPK1025 </td></tr><tr><td> Opti-MEM I </td><td> Invitrogen </td><td> 31985070 </td></tr><tr><td> Lipofektamin 2000 Transfeksiyon Reaktif </td><td> Invitrogen </td><td> 11668-027 </td></tr><tr><td> Agilent RNA 600 Nano kiti </td><td> Agilent </td><td> 5067-1511 </td></tr><tr><td> Agilent 2100 bioanalyzer </td><td> Agilent </td><td> G2939AA </td></tr><tr><td> Misal GFX PCR DNA ve Jel Band izolasyon kiti </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-9034-70 </td></tr><tr><td> RiboMAX Büyük Ölçekli RNA Üretim Sistemi-T7 </td><td> Promega </td><td> P1300 </td></tr></tbody></table>

reverse genetics mediated recovery of infectious murine norovirus

İnsan noroviruses insan gastroenterit (GE), dünya çapında çoğu sorumludur ve yakın kişiden kişiye temas 1, 2, kaçınılması mümkün olmayan ortamlarda tekrarlayan bir sorundur. Son yıllarda hastanelerde salgınların görülme sıklığında artış operasyonel kapasitesinin yanı sıra büyük ekonomik kayıpları önemli aksamalar neden bildirilmiştir. Yeni antiviral yaklaşımların belirlenmesi hücre kültürü 3 üretken bir enfeksiyon tamamlamak için insan noroviruses yetersizlik nedeniyle sınırlı kalmıştır. Yakın insan norovirüs 4 fakat ilgili bir kemirgen norovirüs (MNV), son dönemde izolasyon hücrelerine 5 yayılır edilebilir bu patojenler 6, 7 ve soruşturma için yeni yollar açtı. Yeni pozitif anlamda genomik ve alt genomik RNA moleküllerinin senteziyle in MNV replikasyon sonuçlar, bu sonuncusu son thi tekabülviral genomun rd (Şekil 1). MNV ORF1 genomunun en kaplar ve bir poliproteini prekürsör salınan yedi yapısal olmayan protein (NS1-7) kodlayan olan dört farklı açık okuma çerçeveleri (Orfs) içerir. ORF2 ve ORF3 alt genomik RNA bölge içinde ihtiva edilen ve kapsid proteinler (sırasıyla VP1 ve VP2), (Şekil 1) kodlayan edilir. Son zamanlarda, ORF2 örtüşen ek ORF4 belirlendi ancak farklı bir okuma çerçeve içinde fonksiyonel ve bir mitokondrial lokalize virulans faktörü (VF1) 8 kodlar var. Noroviruses dahil olmak üzere pozitif anlamda RNA virüsleri, çoğaltma için yeni bir kapağını açıp RNA genomu ile senteziyle sonuçlanır sitoplazması içinde yer alır. Viral çeviri teşvik etmek, virüsler hücresel protein sentezi makine 9-11 işe yönelik farklı stratejiler istifade eder. İlginçtir, norovirüs çeviri çok fonksiyonlu viral protein-astar VPG tarafından tahrik edilirkovalent genomik ve alt genomik RNA&#39;lar 12-14 hem 5 &#39;ucuna bağlanmış. Çeviri Bu sofistike mekanizması konvansiyonel ters genetik yaklaşımlarla viral toparlanmanın sınırlı verimliliği önemli bir faktör olması muhtemeldir. Burada mürin norovirüs-1&#39;in kuşak (ilişikte MNV olarak anılacaktır) 5 &#39;ucunda kapatılmış transkriptlerin göre iki değişik stratejiler rapor etmektedir. Ikinci yaklaşımın T7 RNA polimeraz ifade eden hücrelerdeki cDNA MNV transkripsiyonunu gerektirir, oysa yöntemlerden biri, in vitro ve in sentezi viral RNA&#39;nın kapaklama hem içerir. MNV çalışma ve küçük bir hayvan modeli için bu ters genetik sistemlerin kullanılabilirliği çoğaltma ve patogenezi 15-17 viral dizilerin rolünü incelemek için eşi görülmemiş bir yetenek sağlamıştır.

Watch this Scientific Journal Video about Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus at JoVE.com

Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus

Noroviruses karakterizasyonu için gastroenterit henüz moleküler tekniklerin önemli bir nedeni vardır hala nispeten yeni. Burada fare norovirüs (MNV), hücre kültürü içinde yayılır edilebilir bu cinsin tek üyesi etkin kurtarma için iki farklı ters genetik yaklaşımlar rapor.

Bulaşıcı Mürin Norovirüs Ters Genetik Aracılı Kurtarma

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close ...

reverse-genetics-mediated-recovery-of-infectious-murine-norovirus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.5K Görüntüleme.  Imperial College London. Noroviruses karakterizasyonu için gastroenterit henüz moleküler tekniklerin önemli bir nedeni vardır hala nispeten yeni. Burada fare norovirüs (MNV), hücre kültürü içinde yayılır edilebilir bu cinsin tek üyesi etkin kurtarma için iki farklı ters genetik yaklaşımlar rapor.