We would like to thank FMC BioPolymer USA for product samples of Avicel. This work was supported through the Defense Threat Reduction Agency grant HDTRA1-13-1-0005 to KK and the NIH research grant 1R15AI100001-01A1to KK.

Hücreler ve Reaktiflerin hazırlanması 1. <ol><li> % 100 konfluansa - bir gün önce, söz konusu virüs için tahlil, levha, uygun konakçı hücrelerde (Tablo 1 ve 2) kullanılarak, 90 için. </li><li> DH 2 O% 10 formaldehit tespit solüsyonu hazırlayın Örnekte, 14.44 ml damıtılmış H2O (DH 2 O) ile% 36 stok formaldehid 5.56 ml karıştırın. NOT: Uygun güvenli kullanım uygulamaları ve havalandırma formaldehit kullanılarak. </li><li> Kristal mor leke hazırlayın:% 1 Crystal Violet (CV)% 20 etanol ve dH 2 O </li><li> 2x plak ortam (2x konsantrasyonda bağımlı hücre tipi, Tablo 2 ye bakınız) hazırlayın. Herhangi reaktifler steril değilse 0.2 mikron filtre kullanarak filtre. </li><li> Hareketsizleştirir bindirmeleri hazırlanması (Tablo 3) <ol><li> Sıvı bindirmeleri için, dH 2 O Avicel&#39;e bir steril% 2.4 solüsyonu yapmak Kümeleşmesini önlemek üzere, inci su ihtiva eden bir şişeye tozu ilavehızlı bir karıştırma çubuğuna sahip olan karıştırma ile, yavaş yavaş Avicel dökün ve oda sıcaklığında (RT) hızlı bir şekilde karıştırıldı. Çözelti bir karıştırma çubuğu homojenize etmek için çok viskoz kaldığı zaman bile homojenleştirilme yoğun çalkalama ile&gt; 30 dakika boyunca bir şişeye bir karıştırıcı geçin. Not: stok çözeltileri daha düşük konsantrasyonlarda yapılabilir, fakat solüsyonlar ayrı olabilir ve homojen hale getirilmesini sağlamak için karıştırılmalıdır gerekecektir. Avicel çalışma solüsyonları 0.6-3% arasında değişen kullanılabilir. </li><li> Homojenizasyon sonra, oda sıcaklığında kapalı çözüm ve mağaza otoklav. </li><li> Agaroz ve karboksimetil selüloz (CMC), şablon için, dH 2% 2 CMC ya da% 0.6 agaroz O içinde bir stok çözelti hazırlayın. Çözüm haline getirmek için bir karıştırma çubuğu ve otoklav veya mikrodalga ile karıştırın. </li></ol></li></ol> 2. Seyreltmeler ve Enfeksiyonlar <ol><li> Günlük kuluçkadan sonra görsel olarak Deneye başlamadan önce, hücrelerin birleşik duruma ve yaşayabilirliğini de kontrol edin. Standart hücresel morfoloji a sağlamaknd ~% 90 sık tek tabaka mevcuttur. </li><li> Bulaşıcı örneklerin on kat seri seyreltme gerçekleştirin. Seyreltici (Tablo 2) gibi viral çoğalma için bir hücresel büyüme ortamı kullanın. Söz konusu virüsün beklenen titresi dayalı gerekli seyreltilerin sayısını Vary, ve her zaman bağımsız plak kimlik hücresel canlılığı ve yardım sağlamak için bir bulaşmamış kontrol örneği kullanın. </li><li> Seri seyreltiler kaynaktan, 1 saat karıştırıldı (Tablo 1) 45 dakika boyunca hücreleri enfekte etmektedir. Mümkün olduğu kadar düşük bir hacmini tutan tek tabaka (Tablo 4), viral temasını maksimize etmek için ise, hücreleri kapsayacak şekilde aşı yeterli bir hacmi kullanın. Yavaşça kaya plakaları her 20 dk kapsama hatta sağlamak ve kuruma hücresel tek tabaka önlemek için. </li><li> 2x plak medya ve Hareketsizleştirme 1 karışımını: Enfeksiyondan sonra, 1 kullanılarak (Tablo 2) &#39;de mikroorganizma doğrudan ortam hareketsiz uygun bir hacim kaplamasıseçim kaplamasını ing (CMC, agaroz ya da Avicel®). Hafifçe karıştırın sallayın. <ol><li> 0,6-1,2% Avicel bindirme orta çalışan bir çözüm elde etmek için% 2.4 RT stok Avicel&#39;e - ısındı 2x plak medya ve 1.2 ile 1: Sıvı paylaşımları, 1 karıştırın. </li><li> 0.3 nihai bir agaroz / katlamalı konsantrasyonu elde sıcaklığına dengelenmeye 30 dakika için 56 ° C su banyosu içinde ısıtıldı 2x plak ortam 1 karışımını ısıtıldı% 0.6 agaroz içinde bir stok çözeltisi, yeri: bir agaroz bindirme için, 1 kullanın %. </li><li> CMC için, bir% 2 stok solüsyonu hazırlanır ve agaroz bindirme için tarif edildiği gibi muamele. </li><li> Tabakasına bindirme uygularken, her zaman tek tabaka zarar görmesini önlemek için 56 ° C su sıcak agarozun veya CMC dengelenmesi. Solüsyon sıcak olduğundan emin olun, ancak hücre ölümü ve düşük viral titreleri önlemek için dokunulmayacak kadar sıcak değil. En agaroz bindirmeleri, 42 ° C&#39;nin altında katılaşmaya başlar hızlı çalışır ve / veya taşıma sırasında katılaşma önlemek için küçük gruplar halinde hazırlayacaktır. </li></ol></li><li> Kaplamanın ilave edildikten sonra, açıkça sayılabilir olan ayrı plaklar üretmek üzere inkübe edin. Plak oluşumu, virüse bağlı olarak 2-14 gün analiz ediliyor Tablo 1 alabilir. NOT: Sıvı Kaplanmış plakalar inkübatör konduğunda, onları hareket yok. Kuluçka süresi boyunca sıvı bindirmeleri hareket smear istilanın neden olur. Agaroz ve CMC bindirmeleri yarı katı ve taşınır veya plak gelişimini izlemek için bir ışık mikroskobu altında periyodik olarak kontrol edilebilir. </li></ol> 3. Tespit ve Boyama Hücreler <ol><li> , Hücrelerin tespit edilmeleri dökülür ya da Avicel bindirme havalandırın, ve (6 delikli plaka için &lt;1 mi, her bir kuyucuk) bir karışımı, 30 dakika boyunca% 10 formaldehid çözeltisi kullanılarak hücreleri düzeltmek için. <ol><li> Agaroz veya CMC için, doğrudan 1 saat gecede için bindirme için formaldehit çözüm ekleyin. NOT: Örnekler sabitleştirici uzun süre muhafaza edilebilir yapar sağlananbuharlaşması ve bu tek tabaka bozabilir gibi kurumaz. </li></ol></li><li> Önceki boyama ve tespit sonrasında, formaldehit atmak ve bir spatula ile manuel akan su ya da biriyle agaroz ve CMC&#39;nin yarı katı fişlerini çıkarın. Boyamadan önce bakiye katlamalı / fiksatif çıkartılması için su ile Avicel® plaklar durulayın. </li><li> Boyama için, ~ 15 dakika boyunca kristal menekşe renkli çözelti bir az miktarda hücreleri kapsar. Rock plates gerekirse bile kapsama sağlamak. </li><li> Yavaşça su ile kristal mor leke yıkayın. Bir kez, sabit, lekeli ve gelecek analizi için süresiz, mağaza plaklar kurutulmuştur. </li></ol> 4. viral titreleri belirlenmesi <ol><li> Aynı seyreltme teknik kopya için ortalaması alınarak, herbir göz içindeki plaklar sayın. Büyük levha formatları için, 100 plaklardan çok daha 5 daha az veya daha büyük indirim kuyu. Plak boyutu ve morfolojisi not alın. Negatif kontrol düzgün bir tek tabaka olmalıdır vebir referans kontrol olarak kullanılabilir. </li><li> Bir seyreltme ve toplam seyreltme faktörü ters için plakların ortalama sayısı dikkate alınarak bir stok örneğinden viral titresi belirlenir. </li></ol><img alt="Denklem 1" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52065/52065eq1.jpg" width="300" /> NOT: Bir örnek olarak, 30 ve 32 plaklar, 1 x 10 -7 seyreltme [31 (ortalama) / 10 -7 (dilüsyon) x 0.4 mi (inokulum)] 7,75 arasında bir titreye oluşacaktır 8 x 10 pfu tekrarlar için sayılan / ml olmuştur.

<ol>
	<li>Cooper, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plaque+assay+of+animal+viruses.">The plaque assay of animal viruses.</a> Adv. Virus Res. 8, 319-378 (1961).</li><li>Dulbecco, R., Vogt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+problems+of+animal+virology+as+studied+by+the+plaque+technique.">Some problems of animal virology as studied by the plaque technique.</a> Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 18, 273-279 (1953).</li><li>Hartley, J. W., Rowe, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+culture+cytopathic+and+plaque+assays+for+mouse+hepatitis+viruses.">Tissue culture cytopathic and plaque assays for mouse hepatitis viruses.</a> Proc. Soc. Exp. Biol. Med. Soc. Exp. Biol. Med. N. Y. 113, 403-406 (1963).</li><li>Juarez, D., Long, K. C., Aguilar, P., Kochel, T. J., Halsey, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+plaque+assay+methods+for+alphaviruses.">Assessment of plaque assay methods for alphaviruses.</a> J. Virol. Methods. 187, 185-189 (2013).</li><li>Shurtleff, A., Keuhne, A., Biggins, J., Keeney, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+alternative+overlays+in+plaque+assays.">Use of alternative overlays in plaque assays.</a> , (2011).</li><li>Shurtleff, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+the+Filovirus+Plaque+Assay+for+Use+in+Preclinical+Studies.">Standardization of the Filovirus Plaque Assay for Use in Preclinical Studies.</a> Viruses. 4, 3511-3530 (2012).</li><li>Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+low-viscosity+overlay+medium+for+viral+plaque+assays.">New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays.</a> Virol. J. 3, 63 (2006).</li><li>Klebe, R. J., Harriss, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+technically+simple+&#8216;non-lethal&#8217;+vital+staining+procedure+for+viral+plaque+and+cell+transformation+assays.">A technically simple &#8216;non-lethal&#8217; vital staining procedure for viral plaque and cell transformation assays.</a> Arch. Virol. 81, 359-362 (1984).</li><li>Gaush, C. R., Smith, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+and+plaque+assay+of+influenza+virus+in+an+established+line+of+canine+kidney+cells.">Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells.</a> Appl. Microbiol. 16, 588-594 (1968).</li><li>Abiko, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outbreak+of+Human+Metapneumovirus+Detected+by+Use+of+the+Vero+E6+Cell+Line+in+Isolates+Collected+in+Yamagata,+Japan,+in+2004+and+2005.">Outbreak of Human Metapneumovirus Detected by Use of the Vero E6 Cell Line in Isolates Collected in Yamagata, Japan, in 2004 and 2005.</a> J. Clin. Microbiol. 45, 1912-1919 (2004).</li><li>Baer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+DNA+damage+signaling+upon+Rift+Valley+fever+virus+infection+results+in+cell+cycle+arrest+and+increased+viral+replication.">Induction of DNA damage signaling upon Rift Valley fever virus infection results in cell cycle arrest and increased viral replication.</a> J. Biol. Chem. 287, 7399-7410 (2012).</li><li>Austin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+Activation+following+Rift+Valley+Fever+Virus+Infection+Contributes+to+Cell+Death+and+Viral+Production.">p53 Activation following Rift Valley Fever Virus Infection Contributes to Cell Death and Viral Production.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li><li>B&#246;ttcher-Friebertsh&#228;user, E., Stein, D. A., Klenk, H. -. D., Garten, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+influenza+virus+infection+in+human+airway+cell+cultures+by+an+antisense+peptide-conjugated+morpholino+oligomer+targeting+the+hemagglutinin-activating+protease+TMPRSS2.">Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptide-conjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2.</a> J. Virol. 85, 1554-1562 (2011).</li><li>Youil, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+influenza+virus+replication+in+Vero+and+MDCK+cell+lines.">Comparative study of influenza virus replication in Vero and MDCK cell lines.</a> J. Virol. Methods. 120, 23-31 (2004).</li><li>Tobita, K., Sugiura, A., Enomoto, C., Furuyama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plaque+assay+and+primary+isolation+of+influenza+a+viruses+in+an+established+line+of+canine+kidney+cells+(MDCK)+in+the+presence+of+trypsin.">Plaque assay and primary isolation of influenza a viruses in an established line of canine kidney cells (MDCK) in the presence of trypsin.</a> Med. Microbiol. Immunol. (Berl.). 162, 9-14 (1975).</li></ol>

The authors have nothing to disclose and no competing or financial interests in the protocol or products described.

Koşulları önemli ölçüde değişebilir gibi başarılı bir plak tahlili için en kritik faktör söz belirli viral kültür için protokol optimizasyon yatıyor. Dikkate almak temel noktalar şunlardır: açıkça plaklar farklılaştırmak için söz konusu virüs, uygun viral büyüme koşulları, yeterli seyreltme aralıkları ile hücresel uyumluluk ev sahipliği, ve söz konusu hücreler ve virüs için doğru bindirme seçimi ve boyama. VEEV ve RVFV hem aynı konak hücre tiplerinin çok kullanan çok benzer koşullar altında büyürken, plak morfolojisi ve büyüme kinetiği farklılıklar büyük ölçüde değişmektedir. Geleneksel hemorajik ateş virüsleri ve alfavirüsler bir yayılım ve endikatör hücre hattı olarak kullanılmıştır Plak analizi için, Vero hücreleri kullanıldığında, tipik haliyle VEEV RVFV daha yüksek titrelere kadar büyür ve 48 HPI 4 de büyük düzgün plaklar, geliştirme, çoğaltma kinetik artış ortaya koyduğunu, 10-12. VEEV aksine, RVFV 72 HPI gerektirir ve tipik olarak boyut olarak daha küçük ve değişken olan plaklar gösterir. RVFV karşı ve VEEV olarak, influenza virüsü yüksek konakçı hücre spesifiktir ve doku kültürü yoluyla yaymak için zor olabilir. Grip virüsü için viral giriş ve füzyon normal olarak ev sahibi hücrenin α-sialik asit yüzey reseptörüne bağlanma yoluyla hedef hücreye girişini aracılık viral glikoprotein hamagglutinin (HA) ile hücre yüzey reseptörünün bağlanması ile başlatılır. HA tüm influenza virüsleri membran zarfı içinde mevcut olan ve spesifik bir konakçı hücre proteazı ile alt birimi HA1 ve HA2 bölünme gerektirir trimerik glikoproteinidir. Ayrıca sorunu karmaşık hale getirmektedir, bu bölünme siteleri genellikle viral suşlar 13 arasında değişebilir. Belirli bir doku ile sınırlı olduğunu HA bölebilen proteazların ekspresyonu gibi, ar proteazlarE, genellikle, seçilen konakçı hücrede 13 viral füzyonu ve girişi kolaylaştırmak için, hücre kültür ortamına ilave edildi. Viral HA 14,15 proteolitik aktivasyonu ile (herhangi bir tripsin inaktive serum yokluğunda) çoklu-döngü replikasyonu kolaylaştıran: deneme için TPCK-tripsin MDCK ve Vero hücreleri hem de hücre kültüründe kullanıldığı yaygın olarak kullanılan bir proteazın bir örnektir. Bu çalışma ve diğerlerinin de gösterildiği gibi, virüs yaşam döngüsünün farklılıklar farklı sınıfları ve virüsleri türler arasında büyük farklılıklar göstermek üzere katlamalı seçimleri, levha biçimleri ve toplama süreleri etkileyebilir. Bizim çalışmamızda, agaroz kaplamaları virüs ve hücre tiplerinin geniş bir yelpazede arasında yararını takviye edici, CMC ya da RVFV ve grip B virüsü, hem sıvı, şablon ya da daha yüksek titrelerde açık plaklar gösterdi. Büyük ölçüde katı fişleri ve basitleştirilmiş lekelenmeye giderilmesinde destekli agaroz düşük bir nihai konsantrasyon kullanma. CMC Genel p gösterdiİnfluenza B virüsü için her üç test virüsler ve üretilen çok küçük ve belirsiz plaklar için bir kaplama olarak oorest etkinlik. Genel CMC, en az arzu edilen özellikleri göstermesine rağmen, hızla büyüyen ve titresi sadece minimal bir azalma ile plak boyutunu azaltmak için görünür olduğu gibi son derece öldürücü virüsler, avantajlı olabilecek kullanımı. Sıvı kaplama bunun kullanım kolaylığı artan hazırlamak son derece basit olduğunu en çok yönlü olduğunu kanıtladı, ve seçilen virüslerin tamamında agarosa karşılaştırılabilir. Daha yüksek geçirimli bir 96 kuyucuklu bir plaka biçiminde, uygulama ve çıkarmaya geleneksel bindirmeleri ile olduğu gibi, katılaşma nedeniyle engellenmiştir, doğru ve tutarlı sonuçlar verilmemiştir. Plakalar daha önce karakterize çoğaltma kinetik olan virüslere bu uyarlamayı sınırlayıcı, toplama noktasına kadar hareket olamaz gibi sıvı bindirmeleri kullanan bir göz opak renk ve plak oluşumunu izlemek için yetersizlik yatıyor. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; plak deney koşullarında küçük değişiklikler sonuçlar önemli ölçüde değiştirebilir ve herhangi bir yeni sistem veya teknik değerlendirme ve performans her zaman garanti edilir. Optimize edilmiş ve standardize plak tahlil protokolü her durum için mevcut değil iken daha fazla kullanıcı değişiklikler için yeterli altyapıya sağlarken, bizim rapor, çok yönlülük ve geleneksel kullanım yanı sıra plak deneyleri için yeni sıvı bindirmeleri kolaylığı göstermek.

Canlı viral örneklerin doğru izolasyon ve miktar tutarlı viroloji devam eden bir araştırma hedefi olmuştur. İlk 1,2 geliştirilen bir araç nicelik ve nitelik hayvan viral titreleri hesaplamak için 1952 yılında plak denemesinin gelişiyle kadar değildi. Bu teknik ilk olarak adapte ve daha önce bitki biyolojisi 1,2 stok bakteriyofajların titreleri hesaplamak için kullanılır olmuştu faj deneyleri, modifiye edildi. Viral tayini için alternatif vasıtalar bu yana bu tür bağışıklık, floresans ve transmisyon elektron mikroskopisi, ayarlanabilir darbe dirençli algılama (TRPS) olarak geliştirilmiş ve adapte edilmiş olmakla beraber, sitometrisi yeniden birleşmiş muhbir sistemleri, akış ve kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) bu yöntemler, kopyelemeye yetkin Virionlar 1,3 tanımlama ve miktarını belirlemede başarısız olur. Teknolojiler ve teknikler gelişmeler rafine ve görünümünü değiştirecek devam ederken; plaque deneyleri bulaşıcı litik Virionlar 1,4 viral konsantrasyonlarını belirlemede altın standardı temsil etmeye devam. Bir plak deneyi esnasında, konakçı hücrelerinin konfluent tek tabaka seri 5-100 virionlann arasında tipik haliyle, bir sayılabilir dizi seyreltildikten bilinmeyen bir konsantrasyonda bir litik virüs ile enfekte edilir. Enfekte tek tabakalar daha sonra gelişigüzel virüs yayılması sırasında, sıvı ortamın mekanik ya da konveksiyon akımı ya da yayılan viral enfeksiyonunu önlemek için bir hareketsizleştirme katlamalı ortamı ile kaplıdır. Örneğin agaroz, metil selüloz ya da karboksimetil selüloz (CMC) gibi katı veya yarı-katı kaplamalar geleneksel olarak kullanılmış olsa da, sıvı kaplamalar, Avicel 5 ila 7 olarak yararlı olan yeni bir sıvı bindirmeleri gelişmesiyle giderek daha çekici bir alternatif haline gelmiştir. Bindirme olabilir gibi geleneksel bindirmeleri karşı sıvı kullanan plaka tahlilleri appl çeşitli avantajları vardırOda sıcaklığında, ve uygulama ve boşaltılması esnasında ied önemli ölçüde daha kolaydır. Sıvı bindirmeleri ısınma gerekmez gibi, hassas ve ısıya dayanıksız virüsler de plak daha kolay ortaya çıkabilir. Ilk enfeksiyon ve hareketsizleştirici yerleşimi, tek tek plaklar veya hücre ölümü bölgeleri uygulanmasından sonra, viral enfeksiyon ve replikasyon çevreleyen tek tabaka ile sınırlı olan geliştirmeye başlar. Enfekte hücreler, replikasyon parçalama Enfeksiyondan döngüsü devam ayrıca artan bir ayrı ve farklı plaklar ile sonuçlanan, enfeksiyon ilerleyen olacaktır. Kullanılan viral büyüme kinetikleri ve konakçı hücreye bağlı olarak, görünür bir leke, normal olarak 2-14 gün içinde oluşturacaktır. Hücresel monokatmanlar kolayca çıplak gözle plaklar tanımlamak için daha sonra standart bir aydınlık alan mikroskobu ile sayılabilir, ya da daha tipik nötr kırmızı veya şiddet kristal sabit ve zıt olabilir. Mevcut plak karşı lekeleri çok çeşitli, her sunan inci varEIR özgü avantajları ve dezavantajları. Kristal viyole tipik haliyle karışım yapısındaki mevcut olduğu zaman, çok küçük plaklar belirlenmesine izin veren bir hızlı ve farklı karşı leke sağlayan toplama noktasında ve bindirmenin sabitleme / çıkarılmasından sonra ilave edilir. Nötr kırmızı, bilinmeyen bir virüs ya da çoğaltma kinetiği ile çalışırken yararlıdır plak oluşumu, özellikle gelişmekte olan canlı izlenmesi için izin erken uygulanması ve bir kaplama ile sürekli temas avantajına sahiptir. Biz ancak nötr kırmızı ile lekeleme, tipik bir biçimde farklı olmadığını bulduk. Sarı renkli boya lekeler koyu mavi ve viral plaklar kaplamanın kaldırılması gibi olmadan sayılabilir hücrelerin canlı olarak 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazolyum bromürde (MTT), birkaç avantaj sunar nötr kırmızı. MTT ile elde canlı ve ölü hücreleri arasındaki yüksek kontrastlı, daha erken bir zaman noktası, enfeksiyondan sonraki küçük plaklar tespit edilmesine izin verir, Depolama hala bindirme 8 çıkarılmasını gerektirecek olsa da. Kristal mor basit olarak su ve alkol çözeltisi yapılmış ve karışık Plak için yüksek bir hassasiyet derecesi içerir üzere protokol biz de çok sayıda yapı kullanılarak olarak gösterdi sağlamak için, tercih edilen ve basitleştirilmiş karşı leke olarak seçti özelliği virüsleri bulunmaktadır. Enfekte hücresel mono-katman, sabitleme ve boyama sonrasında, plakalar mililitre başına plak oluşturucu birim (pfu) cinsinden viral stok numuneleri titre etmek için sayılmıştır. 5-100, plaklar bir referans olarak kullanılan bir negatif kontrol grubuna, sayılan arasında bir günlük damla, plaka boyutuna bağlı olarak, seri seyreltileri ile not edilmelidir. İstatistiksel örnekleri örnek karşılaştırarak 3 çoğaltır sayılır, her 100 plaklar için% 10 oranında değişir. Viral titreleri belirlemek için plak tahliller kullanılarak avantajı ağırlık Bulaşıcı viral parçacıkların fiili sayısı miktarını belirlemek için kendi yatmaktadırörnek ithin. Birden çok virionları ve potansiyel olarak tek bir hücre enfekte olabilir zamanda, Virionlar karşı birimleri terminolojisi plak titrasyonu ya da 1,2 sırasında kullanılır. Plak önemli ölçüde farklı gelişim koşulları altında ve viral türler arasında değişebilir. Onlar söz konusu virüsün büyüme ve virülans faktörleri hakkında değerli bilgiler sağlayabilir olarak plak boyut, berraklık, sınır tanımı ve dağıtım tüm unutulmamalıdır. Temel plak deneyi ilkelerin aynı zamanda uyarlanmış ve fokus oluşturucu tahlillerde (SYA) olarak kullanılmasında olduğu gibi, farklı şekillerde, bir dizi modifiye edilebilir. SYA&#39;leri plak oluşumunu tespit etmek için hücre erimesi ve counterstaining güveniyor değil, doğrudan doğruya etiketli antikorlar aracılığıyla hücre içi viral proteinleri tespit teknikleri immünboyama istihdam yok. Artan hassasiyet, en önemlisi litik olmayan virüsleri, her farklı olan miktarını belirlemek için yeteneği, enfeksiyondan sonra bir bekleme süresi azalmış veavantajlar SYAleri kullanıldığında. Yaygın olarak kullanılmakla beraber, geleneksel bir plak deneyi kıyasla FFAs olarak kritik sınırlayıcı faktörler, uygun antikorlar için ihtiyaç ve fiili enfeksiyon Virionlar 4 karşısında virüs protein alt-birimleri, yalnızca sondaya yatmaktadır. Bu çalışmanın amacı sağlamak için, klasik Plak analizi için kısıtlayacağız ve yeni sıvı mikrokristal selüloz bindirmeleri ile birlikte geleneksel katı ve yan katı bindirmeleri (agaroz CMC) kullanımını tarif etmektedir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="692">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:127px;">Company</td>
			<td style="width:129px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">6-well CellStar plate for tissue culture</td>
			<td style="width:127px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:129px;">658 160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">12-well CellStar plate for tissue culture</td>
			<td style="width:127px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:129px;">665 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">96-well CellStar plate for tissue culture</td>
			<td style="width:127px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:129px;">655 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">96-2ml deep well plate</td>
			<td style="width:127px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:129px;">C15046314</td>
			<td>For serial dilutions</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">DMEM</td>
			<td style="width:127px;">Quality Biologicals</td>
			<td style="width:129px;">112 013 101</td>
			<td>Cell Media/Diluent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">2X EMEM for plaques</td>
			<td style="width:127px;">Quality Biologicals</td>
			<td style="width:129px;">115 073 101</td>
			<td>Warm to 37 oC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">MEM 100X&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Cellgro</td>
			<td style="width:129px;">25 025 Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Sodium Pyruvate&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Cellgro</td>
			<td style="width:129px;">25 000 Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Penicillin Streptomycin</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:129px;">15140 122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:129px;">25030 081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:269px;">HyClone FBS&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:129px;">SH30910.03</td>
			<td>Heat inactivate before use at 62 oC for 30 min</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:127px;">Sigma Aldritch</td>
			<td style="width:129px;">A7030-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Trypsin TPCK</td>
			<td style="width:127px;">Sigma Aldritch</td>
			<td style="width:129px;">T1426-50mg</td>
			<td>Make aliquots/Avoid freeze thawing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">HEPES&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:129px;">15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">DEAE-Dextran</td>
			<td style="width:127px;">Sigma Aldritch</td>
			<td style="width:129px;">D9885-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Crystal Violet</td>
			<td style="width:127px;">Sigma Aldritch</td>
			<td style="width:129px;">C3886-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Formaldehyde Solution</td>
			<td style="width:127px;">Sigma Aldritch</td>
			<td style="width:129px;">F8775-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Ethanol denatured Reagent Grade</td>
			<td style="width:127px;">Sigma Aldritch</td>
			<td>362808-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Avicel RC-591 NF</td>
			<td style="width:127px;">FMC BioPolymer USA</td>
			<td style="width:129px;">RC-591 NF</td>
			<td>Shake vigorously when reconsitiuting&#160; for &#62;30 min to homogenize</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">UltraPure Agarose&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:129px;">16500-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Carboxymethyl cellulose, Sodium Salt Medium Viscosity&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:129px;">C4888</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems

Plak deneyleri, hücre kültüründe ayrı plaklar (bulaşıcı birimleri ve hücresel ölü bölgeler) olarak sayma ile bulaşıcı Virionlar ve antiviral maddelerin doğrudan ölçümü için en doğru yöntemlerden biri olmaya devam etmektedir. Burada biz bir temel plak deneyi gerçekleştirmek için nasıl göstermek, ve ayrılan bindirmeleri ve teknikleri plak oluşumunu ve üretimini etkileyebilir nasıl. Tipik haliyle, örneğin agaroz ya da karboksimetil selüloz gibi bir katı veya yarı-katı katlamalı alt-tabakalar, likit büyüme ortam içinden geçerek gelişigüzel enfeksiyonun önlenmesi, viral yayılmayı sınırlandırmak için kullanılmaktadır. Hareketsizleştirilmiş kaplamalar ayrık sayılabilir odakları ve daha sonra, plak oluşumunun oluşumuna izin hemen saran tek tabaka hücresel enfeksiyonu kısıtlar. Geleneksel kapaklar kullanıldığında doğasında zorlukların üstesinden gelmek için, mikrokristalin selüloz ve karboksimetil selüloz sodyum kullanan yeni bir sıvı kaplama artan standart bir yedek olarak kullanılmaktadırplak deneyi. Sıvı bindirme plak tahlilleri kolayca geleneksel tekniklerine göre standart 6 veya 12 sıra plaka biçimlerinden birinde yapılan ve hiçbir özel ekipman gerektirmez edilebilir. Nedeniyle sıvı bir halde ve uygulanması ve kaldırılması daha sonra çok kolay olduğu için mikro-plak formatlarını alternatif büyük ölçekli bir viral titrasyon için, doğru, hızlı ve yüksek kapasiteli bir alternatif olarak kullanılabilir. Isıtılmayan viskoz sıvı polimer kullanımı, çalışmalarını düzene fırsatı sunuyor reaktifleri, kuluçka alanı, ve hiçbir reaktif ısıtma veya cam gibi geleneksel ya da yüksek tutma laboratuvarlarında kullanılan operasyonel güvenlik gereklidir artar korur. Sıvı bindirmeleri de belirli ısıya dayanıksız virüsler için geleneksel bindirmeleri daha duyarlı ispat edebilir.

Doğru viral titreleri değerlendirmek için Plak analizi yeteneği, çok sayıda faktöre dayanır: uygun bir konakçı hücre seçimi, uygun bir ortam ve hücre ve virüs canlılığı, büyümesi koşulları, hareketsizleştirilmiş virüs yayılması ve virüs Kuluçka süresinin doğru belirlenmesi farklı için yeterli zaman sağlamak için ve sayılabilir plak oluşumu. Örnek türleri farklı karşısında kaplama, seçimin, kuluçka dönemleri ve plak morfolojisi: Bu çalışma için, üç temsilci ailelerin virüsler farklılıkları göstermek için seçildi. Venezüella at ensefalit (VEEV) at tür ve insanlarda ciddi hastalığa neden Togaviridae ailesindendir bir (+) ssRNA, viral modeli olarak seçildi. Influenza B Tayvan suşu, bir segmente (-) öncelikle insanlara bulaşmasını ssRNA virüs, Orthomyxoviridae ailesini temsil eder. Ateşli Rift Valley virüsü (RVFV), bir (-) öncelikle eklembacaklıları enfekte ssRNA, artropod doğan virüsü,geviş ve insanlar, Bunyaviridae ailesinin temsilcisi olarak seçildi. RVFV (Şekil 1) için, titreleri 72 saat sonra enfeksiyonu için yan-yana kuluçkalanmıştır CMC, agaroz ya da Avicel bindirmeleri kullanan bir 12 kuyucuklu bir plaka biçiminde RVFV bir rekombinant canlı zayıflatılmış MP12 soyunun bir stok çözeltiden belirlendi (HPI). 10 -4 10 -7 arasında değişen dilüsyonlarını gösteren bir temsili plaka CMC kullanarak Panel A. Plaketlerinin görülen ve agaroz bindirmeleri iyi tanımlanmış bir dairesel sınırında, küçük, açık ve belirgin plaklar gösterdi edilebilir. Bir sıvı kalıbı ile plaklar biraz daha bol ve CMC plaklar agarosa ve kıyasla daha büyük olduğunu, ve daha az belirgin bir sınır sağladı. Viral titreleri bindirmeleri tüm karşılaştırılabilir performans ile Panel B karşılaştırıldı. Yeniden Üretim belirlemek için daha büyük bir örnek büyüklüğü ile MP12 için bindirme arasında net bir görsel bir karşılaştırma elde etmek içinnün, bir 6 yuvalı plaka da aynı şekilde üçlü (Şekil 2) trialed edildi. 6 yuvalı plaka biçiminde, CMC bindirmenin birbirinin boyut olarak karşılaştırılabilir agaroz ya da sıvı, şablon, &#39;den daha küçük plaklar gösterdi. Viral titreleri her üç bindirmeleri (Panel D) arasında benzer iken, agaroz ve sıvı bindirmeleri oluşan plaklar nedeniyle artan boyutu saymak daha kolay olmuştur. Belirgin değişmiştir (Şekil 3A), farklı şablonlar arasında RVFV, VEEV titreleri ve Plak aksine. Plak boyutu ve hassasiyet (Panel B) pahasına, 12 de plaka biçimi kullanarak CMC bindirmeleri oluşan plaklar, açık ve net morfolojisi gösterdi. CMC aksine, agaroz ve sıvı şablonlar kullanımı VEEV çoğaltma daha düşük viral önleme ve artan duyarlılık gösteren, önemli ölçüde daha büyük bir plaklar elde edildi. Sadece ap CMC&#39;nin karşı agarozun karşılaştırırken Bu önceden doğrulandıaper Juarez ve ark. 4 tarafından yayınlandı. Agaroz ve sıvı bindirmeleri CMC daha büyük plaklar üretirken, plaklar kötü sınırları tanımlanmış ve büyük sınır yaygınlaşmasını sağlayan sıvı bindirmeleri ile, bir 12 iyi biçimde saymak zordu vardı. Plakalar 6 yuvalı plakalar (Şekil 4) &#39;de trialed edildiğinde, büyük 6 göz formatındaki açısından CMC bindirmelere üstün kanıtlayan agaroz ile, 12 gözlü bir formatta ayırt etmek zor açıkça birikimdir ve sıvı bindirmeleri konusunu etkisiz plak tanımı ve hassas (Şekil 4D). Karşılaştırma RVFV ya da harici bir proteaz gereği olarak, plaquing zaman VEEV, grip birkaç benzersiz zorluklarla sağlar. Agaroz markalar farklı olarak küçük değişiklikler olması varken önemli değişiklikler belirtildiği gibi farklı bindirme seçimleri için grip virüsünün duyarlılığı da iyi geçmişte belgelenmiştirtr 9 kullanılır. İlginç İnfluenza B Tayvan suşu için bir kaplama olarak CMC&#39;nin kullanımı saymak zor ve (Şekil 5A) güvenilir puanı zor kanıtladı belirgin küçük plaklar sonuçlandı. Bir agaroz kaplamanın kullanılması iyi plaklar (Panel C) sağlanır ve (artan tek tabakalı canlılığı olasılığı nedeniyle) daha koyu bir arka plan leke sonuçlandı ve sıvı bindirme kullanımı (Panel B doğrudan karşılaştırıldığında daha net ve keskin plaklar gösterdi ). Böyle agaroz ve CMC gibi katı ve yarı katı bindirmeleri üzerinde sıvı polimerler, bir avantajı, kaldırma ve uygulama kolaylığı yatıyor. Yarı Katı bindirmeleri ısıtma gerektiren, ve taşıma ve kaldırma sırasında katılaşma problemli olabilir. Bu avantajlardan yararlanmak ve RVFV için yüksek verimli bir şekilde Avicel kullanan pratiklik belirlemek için, 96 kuyucuklu plak format değişik katlamalı konsantrasyon derecesinden en trialed edildions (Şekil 6). RVFV MP-12 için, seyreltme Avicel hem de 0.6 ve% 1.2 son konsantrasyonlarda dört kat olarak gerçekleştirilmiştir. Bini ve kaldırma tekrarlanabilirlik yüksek derecede gösteren, kopya arasından veya belirtilen konsantrasyonları arasında belirgin farklar, basit olduğu kanıtlanmamıştır. Puanlama yaparken, plaklar RVFV için yüksek verimli bir şekilde sıvı bindirmeleri kullanan fizibilitesini gösteren, çıplak gözle belirgin ve sayılabilir idi. <img alt="Şekil 1," fo:content-width="6.5in" width="650" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig1highres.jpg" /> Şekil 1:. 12 gözenekli plakalar kullanılarak RVFV leke kalıbı karşılaştırmalar Veros 12 yuvalı plakalar içinde, 2.5 x 10 5 hücre plakalanmış ve MP12 aynı seri olarak seyreltilmiş başlangıç ​​numunesi kullanılarak 200 ul ile enfekte edilmiştir. Enfeksiyon% 0.3 agaroz 1.5 ml bindirmeleri,% 0.6 Avicel, ya da% 1 CMC (son c sonraPanel A. plaklardaki gösterdi sayıldı ve Panel B&#39;de titre gibi oncentrations) doğrudan bindirmeleri karşılaştırma amacıyla uygulandı. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52065/52065fig2highres.jpg" /> Şekil 2:. 6 kuyucuklu levhaların kullanılması RVFV leke kalıbı karşılaştırmalar Veros 6 yuvalı plakalar içinde 5 x 10 5 hücre olarak plakalanır ve MP12 aynı seri olarak seyreltilmiş başlangıç ​​numunesi kullanılarak 400 ul ile enfekte edilmiştir. Paneller AC için tarif edildiği gibi Panel A&#39;da gösterildiği gibi% 0.3 agaroz üç mi bindirmeleri,% 0.6 Avicel®, ya da% 1 CMC doğrudan bindirmeleri karşılaştırma amacıyla uygulandı, B ve C Ayrı deneyler ile aynı şekilde gerçekleştirilmiştir plakalar sayılmıştır ve Panel D&#39;ye (n = 3) olarak titre. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52065/52065fig3highres.jpg" /> Şekil 3: &lt;12 gözenekli plakalar kullanılarak strong&gt; VEEV plak katlamalı karşılaştırmaları. Veros 12 yuvalı plakalar içinde, 2.5 x 10 5 hücre plaka haline getirilmiş ve VEEV, TC-83 aşı soyunun aynı seri olarak seyreltilmiş başlangıç ​​numunesi kullanılarak 200 ul ile enfekte edilmiştir. Panel A. plaklardaki gösterildiği gibi virüsle enfekte edildikten sonra% 0.3 agaroz 1.5 mi, şablon,% 0.6 Avicel®, ya da% 1 CMC, Pand B&#39;de sayıldı ve titre edildi doğrudan bindirmeleri karşılaştırma amacıyla uygulandı <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52065/52065fig4highres.jpg" /> Şekil 4:. 6 kuyucuklu levhaların kullanılması V EEV leke kalıbı karşılaştırmalar Veros 6 yuvalı plakalar içinde 5 x 10 5 hücre olarak kaplandı ve 400 ul VEEV TC-83 ile aynı seri olarak seyreltilmiş başlangıç ​​numunesi kullanılarak ile enfekte edilmiştir. Gösterildiği gibi enfeksiyondan sonra,% 0.3 agaroz 3 mi bindirmeleri,% 0.6 Avicel®, ya da bir% 1 CMC doğrudan bindirmeleri karşılaştırma amacıyla uygulandıC sayılır ve Panel D titre plaklarla göre, (N = 3) - Panel A için tarif edildiği gibi paneller A, B ve C, ayrı deneyler aynı yapılmıştır. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/52065/52065fig5highres.jpg" /> Şekil 5: İnfluenza plak katlamalı karşılaştırmalar MDCK hücreleri, 6 oyuklu plakalar içerisinde 5 x 10 5 hücre plakalanmış ve Influenza Tayvan aynı seri olarak seyreltilmiş başlangıç ​​numunesi kullanılarak aşı 400 ul ile enfekte edilmiştir.. FBS, viral füzyon için gerekli olan belirli proteazlann inhibisyonu yoluyla grip yayılmasını inhibe gibi fetal sığır serumu (FBS), büyüme ortamı veya üst kullanılmıştır. TPCK-tripsin konakçı hücrelerde viral füzyonu ve girişi kolaylaştırmak için uygulamadan önce bindirmeleri tümüne eklenmiştir. Enfeksiyondan sonra,% 0.3 agaroz 3 ml bindirmeleri,% 0.6 Avicel, ya da% 1 CMC doğrudan karşılaştırmak amacıyla uygulananCı, Panel D sayıldı ve titre plaklarla (n = 3) - Panel A tarif edildiği gibi Panel A, B ve C ile ayrı deneylerde gösterildiği gibi kaplamalar aynı yapılmıştır. Ortalama bir CMC plaklar için alınan iken diffüz sınırları ve çok küçük plak boyutları gösterdiği gibi onlar güvenilir saymak zor oldu. <img alt="Şekil 6," fo:content-width="6.5in" width="650" src="/files/ftp_upload/52065/52065fig6highres.jpg" /> Şekil 6:. Yüksek üretim leke düzenleri Veros bir 96 yuvalı plaka dörtlü olarak, 1 saat boyunca RVFV MP12 aynı seri olarak seyreltilmiş başlangıç ​​numunesi kullanılarak aşı 50 ul ile enfekte edilmiştir, oyuk başına 3 x 10 4 hücre kaplama. Bindirmeleri için Avicel 0.6 ve% 1.2 son konsantrasyonlara eklenmiştir bir yüksek verimli bir şekilde, paneller A ve B sıvı bindirmeleri kullanılmasının fizibilitesi ve tekrarlanabilirliğini belirlemek amacıyla trialed edilmiştir. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> RVFV </td><td> VEEV </td><td> Influenza B </td></tr><tr><td> Hücre tipi </td><td> Vero </td><td> Vero </td><td> MDCK </td></tr><tr><td> Enfeksiyon dönemi </td><td> 1 saat </td><td> 1 saat </td><td> 45 dakika </td></tr><tr><td> İnkübasyon süresi </td><td> 3 gün </td><td> 2 gün </td><td> 3 gün </td></tr></tbody></table> Tablo 1: Plak Testi Aşılama Koşulları ve Hücre Tipleri <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> RVFV </td><td> VEEV </td><td> Influenza B </td></tr><tr><td> Hücre Tipi </td><td> Vero </td><td> Vero </td><td> MDCK </td></tr><tr><td> Büyüme Tipi</td><td> DMEM 1 </td><td> DMEM 1 </td><td> DMEM 2 </td></tr><tr><td> Plak Medya </td><td> 2xEMEM A </td><td> 2xEMEM A </td><td> 2xEMEM B </td></tr></tbody></table> 1. Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı,% 10 fetal bovin serumu,% 1 L-glutamin,% 1 Penicllin / streptomisin ile takviye edilmiştir. 2. Dulbecco Modifiye Eagle ortamı,% 1 L-glutamin,% 1 Penicllin / Streptomisin,% 0.2 öküz serum albumini,% 0.025 HEPES, DEAE-Dekstran 50 ug / ml ile takviye edilmiştir. % 5 FBS (25 mi),% 1 Minimum Esansiyel amino asitler (5 mi),% 1 sodyum piruvat (5 mi),% 1 L-glutamin (5 ml) ile takviye edilmiş A 2x Minimal Esansiyel Ortam (500 mi), % 2 / Strep (10 mi). % 0.2 öküz serum albumini,% 1 Minimum Esansiyel amino asitler (5 mi), 50 ug / ml,% 0.025 HEPES, DEAE-Dekstran, Tripsin-TPCK ile takviye edilmiş B 2x Minimal Esansiyel Ortam (500 mi) * * Hazırlık hemen önce, 25 başına 1 ul eklemekalikotuna 2 ug TPCK-tripsin / ml stok ml Eğer plaklar için agaroz ile karıştırmak için kullanıyor olacak. Tablo 2: Plak ve Viral / Hücresel Büyüme Medias <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> RVFV </td><td> VEEV </td><td> Influenza B </td></tr><tr><td> Hücre tipi </td><td> Vero </td><td> Vero </td><td> MDCK </td></tr><tr><td> Enfeksiyon dönemi </td><td> 1 saat </td><td> 1 saat </td><td> 45 dakika </td></tr><tr><td> İnkübasyon süresi </td><td> 3 gün </td><td> 2 gün </td><td> 3 gün </td></tr></tbody></table> Çok uzun kısırlık muhafaza olarak yapıldığı zaman Yerleşimi çözümler dolacak değil. Tablo 3: Kaplamalar Stok <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> 6 yuvalı </td><td> 12 gözlü </td><td> 96 gözlü </td></tr><tr><td> Hücreler içinde / oyuk </td><td> 5 x 10 5 </td><td> 2.5 x 10 5 </td><td> 3 x 10 4 </td></tr><tr><td> Inokulum hacmi (ul) </td><td> 400 </td><td> 200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> paylaşımının hacmi (ml) </td><td> 3 </td><td> 1.5 </td><td> 0.100 </td></tr></tbody></table> Tablo 4: Plaka Biçimleri

Watch this Scientific Journal Video about Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems at JoVE.com

Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

Kullanımı Geleneksel Hikaye ve Roman Yerleşimi Sistemleri: Plak Tahliller sayesinde viral Konsantrasyon Tayini

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

viral-concentration-determination-through-plaque-assays-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

110.2K Görüntüleme.  George Mason University. Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

Video: Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

Viral Patojenler Klinik Örnekler Ekranına bir Pan-Viral Mikroarray Testi (Virochip)

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle and the induction of protective immune responses1,2. As the main target for neutralizing antibodies, HA is currently used as the influenza vaccine potency marker and is measured by single radial immunodiffusion (SRID)3. However, the dependence of SRID on the availability of the corresponding subtype-specific antisera causes a minimum of 2-3 months delay for the release of every new vaccine. Moreover, despite evidence that NA also induces protective immunity4, the amount of NA in influenza vaccines is not yet standardized due to a lack of appropriate reagents or analytical method5. Thus, simple alternative methods capable of quantifying HA and NA antigens are desirable for rapid release and better quality control of influenza vaccines.
Universally conserved regions in all available influenza A HA and NA sequences were identified by bioinformatics analyses6-7. One sequence (designated as Uni-1) was identified in the only universally conserved epitope of HA, the fusion peptide6, while two conserved sequences were identified in neuraminidases, one close to the enzymatic active site (designated as HCA-2) and the other close to the N-terminus (designated as HCA-3)7. Peptides with these amino acid sequences were synthesized and used to immunize rabbits for the production of antibodies. The antibody against the Uni-1 epitope of HA was able to bind to 13 subtypes of influenza A HA (H1-H13) while the antibodies against the HCA-2 and HCA-3 regions of NA were capable of binding all 9 NA subtypes. All antibodies showed remarkable specificity against the viral sequences as evidenced by the observation that no cross-reactivity to allantoic proteins was detected. These universal antibodies were then used to develop slot blot assays to quantify HA and NA in influenza A vaccines without the need for specific antisera7,8. Vaccine samples were applied onto a PVDF membrane using a slot blot apparatus along with reference standards diluted to various concentrations. For the detection of HA, samples and standard were first diluted in Tris-buffered saline (TBS) containing 4M urea while for the measurement of NA they were diluted in TBS containing 0.01% Zwittergent as these conditions significantly improved the detection sensitivity. Following the detection of the HA and NA antigens by immunoblotting with their respective universal antibodies, signal intensities were quantified by densitometry. Amounts of HA and NA in the vaccines were then calculated using a standard curve established with the signal intensities of the various concentrations of the references used. 
Given that these antibodies bind to universal epitopes in HA or NA, interested investigators could use them as research tools in immunoassays other than the slot blot only.

A simple slot blot method was developed for the quantification of influenza viral hemagglutinin and neuraminidase using universal antibodies targeting their most conserved sequences identified through bioinformatics analyses. This innovative approach may provide a useful alternative to quantitative determination of all viral hemagglutinin and neuraminidase.

Tüm Influenza Kantitatif Analiz Basit Slot Blot Tahliller Evrensel Antikorlar kullanarak Viral Hemagglutinins ve nöraminidaz yazın

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Cost-effective Method for Microbial Source Tracking Using Specific Human and Animal Viruses

Microbial contamination of the environment represents a significant health risk. Classical bacterial fecal indicators have shown to have significant limitations, viruses are more resistant to many inactivation processes and standard fecal indicators do not inform on the source of contamination. The development of cost-effective methods for the concentration of viruses from water and molecular assays facilitates the applicability of viruses as indicators of fecal contamination and as microbial source tracking (MST) tools. Adenoviruses and polyomaviruses are DNA viruses infecting specific vertebrate species including humans and are persistently excreted in feces and/or urine in all geographical areas studied. In previous studies, we suggested the quantification of human adenoviruses (HAdV) and JC polyomaviruses (JCPyV) by quantitative PCR (qPCR) as an index of human fecal contamination. Recently, we have developed qPCR assays for the specific quantification of porcine adenoviruses (PAdV) and bovine polyomaviruses (BPyV) as animal fecal markers of contamination with sensitivities of 1-10 genome copies per test tube. In this study, we present the procedure to be followed to identify the source of contamination in water samples using these tools. As example of representative results, analysis of viruses in ground water presenting high levels of nitrates is shown.
Detection of viruses in low or moderately polluted waters requires the concentration of the viruses from at least several liters of water into a much smaller volume, a procedure that usually includes two concentration steps in series. This somewhat cumbersome procedure and the variability observed in viral recoveries significantly hamper the simultaneous processing of a large number of water samples.
In order to eliminate the bottleneck caused by the two-step procedures we have applied a one-step protocol developed in previous studies and applicable to a diversity of water matrices. The procedure includes: acidification of ten-liter water samples, flocculation by skimmed milk, gravity sedimentation of the flocculated materials, collection of the precipitate and centrifugation, resuspension of the precipitate in 10 ml phosphate buffer. The viral concentrate is used for the extraction of viral nucleic acids and the specific adenoviruses and polyomaviruses of interest are quantified by qPCR. High number of samples may be simultaneously analyzed using this low-cost concentration method.
The procedure has been applied to the analysis of bathing waters, seawater and river water and in this study, we present results analyzing groundwater samples. This high-throughput quantitative method is reliable, straightforward, and cost-effective.

The study describes a cost-effective method for the identification of the source of fecal/urine contamination or contamination by nitrates in water using qPCR for the specific quantification of human/porcine/bovine DNA viruses, adenoviruses and polyomaviruses, proposed as MST tools.

Özgül İnsan ve Hayvan Virüsler Mikrobiyal Kaynak Takip için maliyet-etkin Yöntemi

Microbial contamination of the environment represents a significant health risk. Classical bacterial fecal indicators have shown to have significant ...

Plaque Assay for Murine Norovirus

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are observed during MNV-1 infection of murine dendritic cells or macrophages 1. This property of MNV-1 can be used to quantify the number of infectious particles in a given sample by performing a plaque assay 1. The plaque assay relies on the ability of MNV-1 to lyse cells and to form holes in a confluent cell monolayer, which are called plaques 3.
Multiple techniques can be used to detect viral infections in tissue culture, harvested tissue, clinical, and environmental samples, but not all measure the number of infectious particles (e.g. qRT-PCR). One way to quantify infectious viral particles is to perform a plaque assay 3, which will be described in detail below. A variation on the MNV plaque assay is the fluorescent focus assay, where MNV antigen is immunostained in cell monolayers 4. This assay can be faster, since viral antigen expression precedes plaque formation. It is also useful for titrating viruses unable to form plaques. However, the fluorescent focus assay requires additional resources beyond those of the plaque assay, such as antibodies and a microscope to count focus-forming units. Infectious MNV can also be quantified by determining the 50% Tissue Culture Infective Dose (TCID50) 3. This assay measures the amount of virus required to produce CPE in 50% of inoculated tissue culture cells by endpoint titration 5. However, its limit of detection is higher compared to a plaque assay 4.
In this article, we describe a plaque assay protocol that can be used to effectively determine the number of infectious MNV particles present in biological or environmental samples 1, 4, 6. This method is based on the preparation of 10-fold serial dilutions of MNV-containing samples, which are used to inoculate a monolayer of permissive cells (RAW 264.7 murine macrophage cells). Virus is allowed to attach to the cell monolayer for a given period of time and then aspirated before covering cells with a mixture of agarose and cell culture media. The agar enables the spread of viral progeny to neighboring cells while limiting spread to distantly located cells. Consequently, infected cells are lysed and form holes in the monolayer known as plaques. Upon sufficient spread of virus, plaques become visible following staining of cells with dyes, like neutral red, methylene blue, or crystal violet. At low dilutions, each plaque originates from one infectious viral particle and its progeny, which spread to neighboring cells. Thus, counting the number of plaques allows one to calculate plaque-forming units (PFU) present in the undiluted sample 3.

Here we describe a method to quantify infectious particles of murine norovirus (MNV), which is the only norovirus that efficiently replicates in cell culture. The plaque assay takes advantage of MNV&#x2019;s tropism for murine macrophages and can be adapted for use with biological or environmental samples containing MNV.

Mürin Norovirüs için Plak Testi

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

To identify potential antivirals against BTV, we have developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based assay was the first assay developed to evaluate whether a compound showed any antiviral efficacy and have been used to screen large compound library. Meanwhile, cytotoxicity of antivirals could also be evaluated using the CPE-based assay. The dose-response assay was designed to determine the range of efficacy for the selected antiviral, i.e. 50% inhibitory concentration (IC50) or effective concentration (EC50), as well as its range of cytotoxicity (CC50). The ToA assay was employed for the initial MoA study to determine the underlying mechanism of the novel antivirals during BTV viral lifecycle or the possible effect on host cellular machinery. These assays are vital for the evaluation of antiviral efficacy in cell culture system, and have been used for our recent researches leading to the identification of a number of novel antivirals against BTV.

Three assays, including the cytopathic effect (CPE)-based assay, dose-response assay and Time-of-Addition (ToA) assay have been developed, optimized, validated and utilized to identify novel antivirals against Bluetongue virus (BTV), as well as to determine the possible Mechanism-of-Action (MoA) for newly identified antivirals.

Bluetongue Virüs karşı Roman Antiviraller belirlenmesi için Tahliller

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms. We have shown that bacterially produced antimicrobial peptides (bacteriocins) dictate the outcome of these competitive interactions. All fully-sequenced pneumococcal strains harbor a bacteriocin-like peptide (blp) locus. The blp locus encodes for a range of diverse bacteriocins and all of the highly conserved components needed for their regulation, processing, and secretion. The diversity of the bacteriocins found in the bacteriocin immunity region (BIR) of the locus is a major contributor of pneumococcal competition. Along with the bacteriocins, immunity genes are found in the BIR and are needed to protect the producer cell from the effects of its own bacteriocin. The overlay assay is a quick method for examining a large number of strains for competitive interactions mediated by bacteriocins. The overlay assay also allows for the characterization of bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides. The assay is performed by pre-inoculating an agar plate with a strain to be tested for bacteriocin production followed by application of a soft agar overlay containing a strain to be tested for bacteriocin sensitivity. A zone of clearance surrounding the stab indicates that the overlay strain is sensitive to the bacteriocins produced by the pre-inoculated strain. If no zone of clearance is observed, either the overlay strain is immune to the bacteriocins being produced or the pre-inoculated strain does not produce bacteriocins. To determine if the blp locus is functional in a given strain, the overlay assay can be adapted to evaluate for peptide pheromone secretion by the pre-inoculated strain. In this case, a series of four lacZ-reporter strains with different pheromone specificity are used in the overlay.

Competition in Streptococcus pneumoniae is mediated by bacteriocins, small antimicrobial peptides with inhibitory activity towards pneumococcus and other related species.&#160; Here we describe an optimized bacterial overlay assay that allows for the characterization of bacteriocin activity and inhibitory spectrum, bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides.

Kaplama Testi kullanarak niteliksel Pnömokok Bakteriyosinlerin Bakteriyel Üretim ve Hassasiyet Tedbir

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage sequences share no homology to current annotated proteins. As a result, a large proportion of phage genes are annotated as hypothetical. This reality heavily affects the annotation of both structural and auxiliary metabolic genes. Here we present phenomic methods designed to capture the physiological response(s) of a selected host during expression of one of these unknown phage genes. Multi-phenotype Assay Plates (MAPs) are used to monitor the diversity of host substrate utilization and subsequent biomass formation, while metabolomics provides bi-product analysis by monitoring metabolite abundance and diversity. Both tools are used simultaneously to provide a phenotypic profile associated with expression of a single putative phage open reading frame (ORF). Representative results for both methods are compared, highlighting the phenotypic profile differences of a host carrying either putative structural or metabolic phage genes. In addition, the visualization techniques and high throughput computational pipelines that facilitated experimental analysis are presented.

Here, we present phenomic approaches for the functional characterization of putative phage genes. Techniques include a developed assay capable of monitoring host anabolic metabolism, the Multi-phenotype Assay Plates (MAPs), in addition to the established method of metabolomics, capable of measuring effects to catabolic metabolism.

Faj Phenomics: Fizyolojik Yaklaşımlar Roman Viral Proteinler karakterize etmek

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic approach to identify and evaluate antiviral agents that target specific steps of the viral entry. In this report, the methods of examining viral inactivation, viral attachment, and viral entry/fusion as antiviral assays for such purposes are described, using hepatitis C virus as a model. These assays should be useful for discovering novel antagonists/inhibitors to early viral entry and help expand the scope of candidate antiviral agents for further drug development.

Here, we present a protocol that examines specific steps of the viral entry to identify and evaluate novel antiviral agents.

Erken Viral Giriş Tespiti için Tahliller ve Antiviral Bileşiklerin Değerlendirilmesi

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

Enzim-linked Lektin Testi tarafından Grip Nöraminidaz İnhibisyon antikor titreleri Ölçme

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell surface-expressed T-cell receptor (TCR) must functionally recognize human leukocyte antigen (HLA)-restricted tumor-derived peptides (pHLA). However, we and others have shown that most TCRs bind sub-optimally to tumor antigens. Uncovering the molecular mechanisms that define this poor recognition could aid in the development of new targeted therapies that circumnavigate these shortcomings. Indeed, present therapies that lack this molecular understanding have not been universally effective. Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between TCRs and pHLA governs T-cell functionality. These methods include the generation of soluble TCRs and pHLA and the use of these reagents for X-ray crystallography, biophysical analysis, and antigen-specific T-cell staining with pHLA multimers. Using these approaches and guided by structural analysis, it is possible to modify the interaction between TCRs and pHLA and to then test how these modifications impact T-cell antigen recognition. These findings have already helped to clarify the mechanism of T-cell recognition of a number of cancer antigens and could direct the development of altered peptides and modified TCRs for new cancer therapies.

Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between the T-cell receptor and tumor antigens, presented by human leukocyte antigens, governs T-cell functionality; these methods include protein production, X-ray crystallography, biophysics, and functional T-cell experiments.

X-ışını kristalografisi, biyofizik ve fonksiyonel tahliller kullanılarak mekanizmalar Yönetim T hücresi kanser antijenleri Reseptör tanıma belirlemek için