Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Diyabet Enstitüsü, Sindirim ve Böbrek Hastalıkları, 2R01DK59558 (GN) bir hibe ile desteklenmiştir. Araştırma Kaynakları hibe UL1 RR029884 Sağlık Ulusal Merkezi Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenen UAMS Dönüştürülebilir Araştırma Enstitüsü UAMS az Flow Sitometri Çekirdek kısmi finansmanını sağladı. Biz teşekkür Dr Peipei Ping (Los Angeles California Üniversitesi, Los Angeles, CA) cDNA PKC-ε ve Dr Allen Samarel (Loyola Üniversitesi Tıp Merkezi dominant negatif (inaktif) mutant kodlama taşıyan adenovirüs bir kısım sağlamak için; PKC-ε ve yapısal olarak aktif mutantı kodlayan adenoviral vektör bir alikotu sağlamak için Maywood, IL). Biz de Drs ederim. PKC-ε yapısal olarak aktif cDNA kodlama sağlamak için Peter Parker ve Peter Sugden (Imperial College London, Londra, İngiltere).

1. Birincil Kültür Böbrek proksimal tübüllerde İzolasyonu <ol><li> Tavşan, tüketim hem böbrekleri anestezisi ve bir laminer akış kaputu steril hazırlık tampon (DMEM/F12 orta) ile dolu bir Petri kabı koyun. </li><li> Steril 50 mL ve ardından prep tamponu ve 50 ml her bir böbrek serpmek salin, pH 7.4 (PBS) fosfat-tamponlu, ve PBS-demir oksit çözeltisi (45 ml + 5 ml) eklenmiştir. Böbrekler De-capsulate ve deferoksamin içeren hazırlık tampon aktarabilirsiniz. </li><li> Her böbrek korteksi Harvest. </li><li> 15 ml Dounce homojenizer kullanılarak doku homojenize edilir. 1 L&#39;lik steril kabı üzerine yerleştirilen 2 steril elekler (alt 85 mm ve üstünde 235 mikron) üzerinde homojenat dökün. Deferoksamin içeren tampon ile elekler durulayın. </li><li> Deferoksamin içeren tampon 35-40 ml dolu steril bir konik santrifüj tüpüne 85 mikron elek üzerinde kalan doku toplayın. Yavaşça hücre süspansiyonu karıştırın. </li><li> Güçlü bir m yerleştirinboru dış agnet glomerül dolu demir kaldırmak ve süspansiyon yerleşmek izin. Pasteur pipeti kullanarak mıknatısın demir aspire. Bu işlemi tekrarlayın. </li><li> Kollajenaz I ve deferoksamin içeren tampon içinde çözünmüş 0,6 mg soya fasulyesi tripsin inhibitörü 2,400-2,500 üniteleri içeren sindirim orta 1 ml hazırlayın. Sindirim orta filtre sterilize. </li><li> 40 ml hücre süspansiyonu ses seviyesini ayarlama ve sindirim orta 1 ml ekleyin. 17 dk hafifçe 4, 2 dakika için 50 ° C x g, santrifüj süspansiyon karıştırma, oda sıcaklığında inkübe edilir, orta aspire ve taze tampon deferoksamin ekleyin. </li><li> Tekrar demir kaldırma mıknatıs ile birkaç kez prosedür, tekrar aşağı süspansiyon dönmeye orta aspirat ve hiçbir glukoz içeren orta 46 ml ekleyin. </li><li> Yavaşça karıştırın ve iki önceden tartılmış Eppendorf tüpleri içine süspansiyon 500 ul dışarı ölçmek. 1 dakika boyunca 10.000 xg&#39;de hücreleri aşağı Spin, medya aspire ve pelet tartmak. Islak kütle ve protein toplam verim hesaplayın. </li><li> 1 mg protein / glukoz içermeyen DMEM/F12 ortamı kullanılarak çanak yoğunlukta, steril 35 mm kültür tabaklarında Levha hücreler. 37 ° C (% 95 hava /% 5 CO2) de kuluçka makinesi içinde bir orbital çalkalayıcı üzerinde daima 2 ml glikoz serbest DMEM/F12 ortamında kültive hücreler. 1,2 </li></ol> 2. Böbrek Proksimal tübül Hücre Kültürü <ol><li> Kültür ortamı 15 mM NaHCO3, 15 mM HEPES, 6 mM laktat (pH 7.4, 295 mOsmol / kgh ile takviye edilmiş DMEM ve Ham fenol kırmızı, pirüvat ve glikoz olmadan F-12 besleyici karışımı 50:50 karışımı, bir 2 O). Ortam L-askorbik asit 2-fosfat (50 uM), bovin insülini (10 nM), insan transferin (5 mg / ml), hidrokortizon (50 nM), ve selenyum (5 ng / ml) hemen önce ilave edilir günlük ortam değişikliği. </li><li> Bir steril tekniği kullanarak yemekler eski medya aspire. Bir steril tekniği kullanarak her yemeğin sıcak, taze medya 2 ml ekleyin. Renal proksimal tübüler hücreler (RPTC) kaplama sonra yaklaşık 5-6 gün içinde izdiham ulaşmak. 1,2 </li></ol> 3. RPTC ve adenoviral enfeksiyonu <ol><li> Adenoviral enfeksiyon günlük ortam değişikliği RPTC arasında birleşmiş, hareketsiz kültürleri yapılmaktadır. Baskın negatif PKC-ε mutant (dnPKC-ε) yerini tarafından inşa edildi: 1) ATP-bağlayıcı sitesi ve pseudosubstrate etki 2) pozisyonunda glutamat ile alanin 159 pozisyon 436 az arginin ile lisin. Bu mutasyonlar PKC-ε ve aktif konformasyonunu değiştirmeden yapı kinaz aktivitesini yok. 3 PKC-ε inhibe pseudosubstrate etki artıkları 154-163 silinmesini tarafından yapısal olarak aktif yapıldı. 4 </li><li> PKC-&amp; epsil önemli bir artışla sonuçlanan enfeksiyon istenen çokluğu (İB) elde etmek için her yemeğin için caPKC-ε cDNA ya dnPKC-ε cDNA taşıyan adenovirüs stok solüsyonu ekleyinüzerine; protein düzeyleri. 24 saat boyunca adenovirüs ile RPTC inkübe edin. Başka bir 24 saat boyunca medya ve kültür hücreleri değiştirin. Fosforlu ve fosforlanmamış toplam PKC-ε proteinlerinin önemli ölçüde daha yüksek düzeyde adenoviral vektör caPKC-ε kodlama bölgesinin 25-50 İB kullanılarak elde edilebilir. Aktif PKC-ε düzeylerinde daha büyük artışlar Büyükşehir İB sonuçlar, ancak hızlı hücre ölümü ve kaybı nedeniyle RPTC tavsiye edilmez. Inaktif PKC-ε proteinin önemli ölçüde daha yüksek düzeyde yan etkilerine neden olmaksızın RPTC içinde İB 50-100 kullanılarak elde edilebilir. 5 </li><li> Enfeksiyondan sonra 48 saatte, aspirat medya, PBS ile monolayers yıkayın ve PKC-ε protein düzeylerini belirlemek için immunoblotting analiz için hücreleri toplamak. 5 </li></ol> 4. RPTC Solunum Ölçümü <ol><li> 3 durum, solunum (120 mM KCI, 5 mM KH 2 PO 4, 10 mM HEPES, 1 mM MgSO4, ve 2 mM EG ölçmek için bir tahlil tampon hazırlanmasıTA, pH 7.4). Karmaşık bir çiftli durum 3 solunum ölçmek için, 5 mM glutamat, 5 mM malat ve 0.1 mg / ml digitonin ile tahlil tampon tamamlar. Kompleks II-eşli 3 durum, solunum için, 10 mM süksinat, 0.1 uM rotenon, ve 0.1 mg / ml digitonin ile tahlil tampon tamamlar. Kompleks IV-3 solunum çiftli durum için, 1 mM askorbat, 1 mM N, N, N &#39;, N&#39;-tetrametil-p-fenilendiamin (TMPD), ve 0.1 mg / ml digitonin ile tahlil tampon tamamlar. Bir 37 ° C su banyosu içinde çözüm yerleştirin. </li><li> RPTC monolayer içeren bir kültür çanak medya aspire, sıcak bir devletin 3 solunum tampon 2 ml ekleyin, hafifçe bir lastik polis kullanarak çanak hücreleri kazıyın ve Clark-tipi elektrot ile donatılmıştır oksijen tüketimi odasına süspansiyonu aktarın. </li><li> Ölçü durum 2 solunum (ADP yokluğunda). 0.4 mM nihai bir konsantrasyona ADP ilave edilerek 3 durum, solunum başlatın. Nihai concentr için oligomycin ekleyerek devletin 4 solunumu başlatın0.5 mg / ml &#39;lik tirme. Bağlanmamış solunum durum 3&#39;te soluyarak hücreleri için 0.5 uM FCCP eklenmesi ile ölçülür. 6,7 </li><li> , Odasından gelen hücre süspansiyonu toplayın perklorik asit kullanarak protein çökelti, ve çökelti, aşağıya doğru dönerler. Hücresel pelet protein konsantrasyonu tayin edilir. </li></ol> 5. Mitokondriyal Membran Potansiyeli Analizi (ΔΨm) <ol><li> Steril kültür ortamı içinde JC-1 çözeltisinin 0.5 mM hazırlayın. </li><li> 5 uM nihai konsantrasyon elde etmek için her bir tabak için JC-1 çözeltisinin yavaş yavaş 20 ul ekle. Swirl çanak iyice boya karıştırmak için. 30 dakika inkübatöre yemekleri dönün. </li><li> Buz, aspirat medya yemekleri koyun ve buz gibi soğuk PBS ile iki kez monolayers yıkayın. Aspirat PBS, taze PBS 1 ml ekleyin çanak hücreleri kazıyın ve bir Eppendorf tüp aktarabilirsiniz. Onları pipetleme ve aşağı tarafından tek hücre içine monolayers kadar Break. </li><li> 2 dk, asp için 1000 xg&#39;de süspansiyon aşağı Spinsüpernatant kızgın, pelet PBS 1 ml ekleyin ve tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için yeniden askıya. Gerekirse yeniden bu adımı yineleyin. </li><li> 2 dakika boyunca 1.000 xg&#39;de hücreleri aşağı Spin, süpernatant aspire PBS 0.5 ml ekleyin ve pelet yeniden askıya. Bir 488-nm argon-iyon lazer uyarma kullanılarak akış sitometri ile floresans analiz edin. İki ayrı kanal, 590 nm 525 nm FL1 ve FL2 yılında emisyon okuyun. Mitokondrial membran potansiyeli FL2/FL1 flüoresans oranı olarak ifade edilir. 6 </li></ol> 6. Mitokondri İzolasyonu <ol><li> Izolasyon tamponlar hazırlamak: Tampon A (10 mM HEPES, 225 mM mannitol, 75 mM sükroz, 0.1 mM EGTA, pH 7.4), Tampon B (tampon A ihtiva eden proteaz inhibitörleri, 1 mM Na 3 VO 4, 1 mM NaF) ve Tampon C (10 mM HEPES, 395 mM sükroz, 0.1 mM EGTA, pH 7.4). Buz üzerinde tüm adımları uygulayın. </li><li> Buz gibi soğuk PBS ile iki kere RPTC mono tabakalar yıkayın. Eppendorf tüpleri içine monolayers kazıyın ve onları sıkma5 dakika boyunca 500 x g. Tampon A 1 ml pelet yıkayın </li><li> Tampon B, 1 ml pelet yeniden askıya ve 2 ml Dounce homojenizatörü ile süspansiyon aktarın. </li><li> Bir mikroskop altında kontrol zaman Homojenat hücrelerin en bozulana kadar Dounce homojenizatörü içinde hücreler homojenize edilir. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 1000 x g&#39;de santrifüje homojenat 4&#39;te süpernatant toplayın ve 10 dakika boyunca 15.000 xg&#39;de aşağı spin ° C </li><li> Süpernatant atılır ve Tampon C, 1 ml 4, 10 dakika için 15,000 x g süpernatan aşağı spin topak ihtiva eden ham mitokondri yeniden askıya ° C. Pelet iki kez yıkama tekrarlayın. 5 </li><li> Solunum kompleksleri faaliyetleri ölçmek için, sıvı azot deney tamponu ve dondurma 50-100 ul mitokondriyal pelet yeniden askıya. Buz üzerinde yavaş örnekleri çözülme. </li></ol> 7. NADH-ubikinon oksidoredüktazlar Aktivitenin Ölçümü (Kompleks I) <ol><li> 10 mM KH 2 PO 4, 5 mM MgCl2, pH 7.2: tahlil tampon hazırlayın. Sırasıyla, son konsantrasyon% 0.25 &#39;lik ve 0.25 mM elde etmek için serbest yağ asidi-BSA ve NADH ekleyin. 2 ug / ml &#39;lik nihai bir konsantrasyona antimycin A çözeltisi (1 mg / ml), 2 ul ekle. </li><li> 48 sıra şeffaf plaka örnekleri çalıştırın. Tüm eklemeler ancak mitokondriye sahip boş bir örnek sayılabilir. Her bir kuyucuğa, ilaveler ve mitokondriya tahlil tampon 500 ul ekleyin ve 5 dakika için karıştırma ile 30 ° C&#39;de inkübe edilir plaka. </li><li> Her kuyucuğa 3.25 mM ubikinon 10 ul ekleyerek reaksiyonu başlatın. 20 sn aralıklarla 3 dk süreyle absorbans (340 nm) kaydedin. Her bir kuyucuğa rotenon çözelti 5 ul (1 mg / ml) eklenir ve ek bir 2 dakika daha absorbansı. Rotenon duyarlı NADH oksidasyonu gibi kompleks I aktivitesinin hesaplayın. 7 </li></ol> 8. Süksinat-ubikinon oksidoredüktazlar Aktivitenin Ölçümü (Kompleks II) <ol&gt; <li> % 0.25 serbest yağ asidi-BSA, 20 mM potasyum sukkinat, 2,6-dichloroindophenol 0.25 mM, 2 ug / ml antimycin A, ve 10 ug / ml rotenon ihtiva eden tahlil tampon hazırlayın. </li><li> Tüm eklemeler ancak mitokondriye sahip boş bir örneği de dahil olmak üzere 48 sıra şeffaf plaka tekrarlardaki örnekleri çalıştırın. Her bir kuyucuğa, ilaveler ve mitokondriya tahlil tampon 500 ul ekleyin ve 2 dakika için karıştırma ile 30 ° C&#39;de inkübe edilir plaka. </li><li> Her kuyucuğa 3.25 mM ubikinon 10 ul ekleyerek reaksiyonu başlatın. 20 sn aralıklarla 3 dk süreyle absorbans (595 nm) kaydedin. 2,6-dichloroindophenol azaltılması izleyerek Kompleks II aktivitesi hesaplayın. 7 </li></ol> 9. Ubiquinol-sitokrom c oksidoredüktazlar Aktivitenin Ölçümü (Kompleks III) <ol><li> Siyanür% 0.1 serbest yağ asidi-BSA, 80 mM potasyum sukkinat, 10 ug / ml rotenon, ve 0.24 mM potasyum ihtiva eden tahlil tampon hazırlayın. </li><li> Örnekler çalıştırmaTüm eklemeler ancak mitokondriye sahip boş bir örneği de dahil olmak üzere 48 sıra şeffaf plaka tekrarlardaki. Her bir kuyucuğa, ilaveler ve mitokondriya tahlil tampon 291 ul ekleyin ve 5 dakika için karıştırma ile 30 ° C&#39;de inkübe edilir plaka. </li><li> Her kuyucuğa sitokrom c okside 6 mM 3 ul ekleyerek reaksiyonu başlatın. 20 sn aralıklarla 3 dk süreyle absorbans (550 nm) kaydedin. Her bir kuyucuğa antimycin A çözeltisi (1 mg / ml), 5 ul ilave edin ve 2 dakika süre ile ilave absorbansı. Antimycin A duyarlı sitokrom c redüksiyonu. 7 gibi karmaşık III aktivitesi hesaplama </li></ol> 10. Sitokrom Oksidaz Faaliyet Ölçümü (Kompleks IV) <ol><li> Sitokrom c 9 mM&#39;lik bir çözeltisi, sodyum askorbat ekleme ve fosfat tampon oda sıcaklığında 1 litre ° C (10 mM KH 2 PO 4, pH 7.2) 5 mM MgCl2 içeren 4 gece boyunca diyaliz solüsyonu ile sitokrom c azaltılmış hazırlanması. Içeren deney tamponu hazırlayın% 0.1 serbest yağ asidi-BSA ve antimycin A (2 ug / ml). </li><li> Tüm eklemeler ancak mitokondriye sahip boş bir örneği de dahil olmak üzere 48 sıra şeffaf plaka örnekleri çalıştırın. Her bir kuyucuğa, ilaveler ve mitokondriya tahlil tamponu, 233 ul ekleyin ve 5 dakika için karıştırma ile 30 ° C&#39;de inkübe edilir plaka. </li><li> Indirgenmiş sitokrom c (90 uM son konsantrasyon) ilavesiyle tepkime başlatın. 20 sn aralıklarla 3 dk süreyle absorbans (550 nm) kaydedin. Her bir kuyucuğa KCN solüsyonu 2 ul (8 ug / ml) ekleyin ve 2 dakika için başka absorbansı. KCN duyarlı sitokrom c oksidasyon gibi kompleks IV aktivitesini hesaplayın. 7 </li></ol> 11. F 0 Aktivitenin Ölçümü F 1-ATPaz (ATP sentaz) <ol><li> F 0 hazırlayın F 1-ATPaz tahlil tamponu (10 mM Tris-HCl, 200 mM KCl, 2 mM MgCl2, pH 8.2). Deney tamponu mitokondriyal pelet yeniden askıya, Liqui mitokondriyal örnekleri dondurmad azot ve yavaş yavaş buz örnekleri eritin. </li><li> Bir 48-kuyu saydam plaka, kopyalardaki örneklerde çalıştırın. Her tedavi grubu için, 2 kuyu kuyu (275 ul oligomycin duyarsız ATPaz aktivitesini ölçmek için toplam ATPaz aktivitesi (tahlil tampon 275 ul, 5 ul mitokondriyal süspansiyon, ve% 95 etanol 5 ul) ve 1 ölçmek için çalıştırmak olacaktır tahlil tamponu, 5 ul mitokondriyal süspansiyon, ve 1 mg /% 95 etanol içinde çözelti oligomycin ml) 5 ul. </li><li> Sürekli sallama ile 10 dakika için 31 ° C &#39;de örnekleri inkübe edin. 100 mM ATP çözeltisi (pH 7.0) 16 ul ekle ve sürekli sallama ile 5 dakika süreyle 31 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 3 M TCA 50 ul ihtiva eden bir tüp için inkübasyon karışım 200 ul aktarın. 10 dakika süreyle buz üzerinde inkübe örnekleri, 4, 5 dakika boyunca 10,000 x g&#39;de aşağı dönüş ° C. Sırasıyla, fosfat ve protein içeriği belirlemek için süpernatan ve pelet kullanın. </li><li> Kullanarak Süpernatantları fosfat içeriği belirlemeinorganik fosfat tayini. SO 4 3.75 0.88 g FeSO 4 ila 10 ml MH 2 ekleyerek ve H 2 O ile 90 ml&#39;ye ayarlayarak Sumner Reaktif 100 ml hazırlayın H 2 de FeSO 4 solüsyonuna 4 SO amonyum molibdat çözeltisi (0.66 g/10 ml H2O) 10 ml ilave edilir. Işıktan koruyunuz. </li><li> Ve çiftleri her süpernatan 50 ul - Her fosfat standart 50 ul (1.000 uM KH 2 PO 4 0) ile Yük 96-plaka. Her bir kuyucuğa Sumner reaktifi 250 ul ekle ve sürekli sallama ile 15 dakika için 30 ° C sıcaklıkta inkübe edilir plaka. </li><li> Oda sıcaklığında, 595 nm &#39;de absorbans kaydedin. F 0 F 1-ATPaz aktivitesi, daha önce tarif edildiği gibi ATP P i oligomycin-duyarlı serbest bırakma ölçülmesi ile tespit edilir. 7,8 toplam hesaplama ve oligomycin-duyarsız F 0 F 1-ATPaz aktiviteleri. Oligomycin duyarlı ATPaz acti hesaplamak içinvite, toplam ATPaz aktivitesi gelen oligomycin-duyarsız aktivite çıkarın. 8,9 </li></ol> 12. Hücre içi ATP İçerik Ölçümü <ol><li> Sıra kültür buz üzerinde RPTC monolayers içeren yemekler, aspirat orta ve buz PBS tamponu ile iki kez monolayers yıkayın. Her monolayer 1 ml PBS ekleyin, PBS içine her monolayer kazımak ve bir Eppendorf tüp hücre süspansiyonu toplamak. 5 saniye mikrofuge&#39;de içinde Eppendorf tüpleri Spin. </li><li> ATP Biyoparlaklık Test Seti HS II (Roche) ve üreticinin protokolü kullanılarak lusiferaz yöntemiyle her RPTC örnek ATP içeriği belirleyin. Her örnek protein konsantrasyonu tayin ve mg protein başına ATP konsantrasyonu. 8 hesaplamak </li></ol> 13. Mitokondriyal Morfoloji Görselleştirme <ol><li> Kültür ortamı değiştirin. Her yemeğin (son kons. 100 nM) için MitoTracker Kırmızı 580 100 uM solüsyonu 2 ul ekleyin ve incubato için yemekler dönmek30 dakika için r. </li><li> Bir su immersiyon objektif kullanarak bir floresan mikroskop altında canlı monolayers inceleyin. 5 </li></ol> 14. Hücre canlılığı analizi <ol><li> Deneye başlamadan önce 24 saat de apoptozis için pozitif kontrol (Anneksin V-pozitif hücreler) olarak görev yapacak hücrelerin tedavisinde sisplatin 50 mM solüsyon hazırlanır. Ayrıca, oncosis için pozitif kontrol (propidium iyodür-pozitif hücreler) olarak görev yapacak hücreleri tedavi etmek için ters-butylhydroperoxide 500 mM solüsyon hazırlanır. </li><li> 50 mM sisplatin ve tert-butylhydroperoxide 500 mM 2 ul 2 yemekler 2 ul 2 yemekler tedavi edin. No-leke kontrolü için 1 tabak Adamak. </li><li> Sisplatin ile tedavi TBHP ve sonra 24 saat olarak, bağlayıcı tampon hazırlamak (10 mM Hepes, 140 mM NaCl, 5 mM KCI, 1 mM MgCl2, 1.8 mM CaCl2) ile propidyum iyodür (PI) çözeltisi (50 mg / ml) bağlayıcı tampon içinde. </li><li> Bağlama tutkunu ile bir kez monolayers yıkayıner. Buz gibi soğuk tampon 1 ml ve no-leke ve Anneksin V-pozitif hücreleri hariç her yemeğin PI çözümü 50 ul ekleyin. Yemekler Kapak ve nazik orbital sallama ile 15 dakika süreyle buz üzerinde inkübe edin. </li><li> Bağlayıcı tampon (10 dakika) ile mono tabakalar yıkayın ve bağlayıcı tampon, 1 ml ve hiç leke ve PI-pozitif hücreleri hariç her bir tabak için Annexin V-FITC solüsyonu 2 ul ekleyin. Yemekler Kapak ve nazik orbital sallama ile 10 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Tampon aspire ve yumuşak orbital sallama ile 10 dakika için buz üzerinde buz-soğuk bağlama tamponu ile 1 ml mono tabakalar yıkayın. Yıkama adımı yineleyin. </li><li> Bağlayıcı tampon aspire ve her bir tabak için bağlayıcı tampon 500 ul ilave edin. Yavaşça bir lastik polis kullanarak hücreleri kazıyın ve sitometrisi tüpleri akmasına hücreleri aktarmak. Örnekler yukarı ve aşağı pipetleme ile tek bir hücre süspansiyonu içine hücreleri dağıtılır. Herhangi bir hücre kümeleri kadar Break. </li><li> Flo tarafından hemen PI ve Anneksin V-FITC floresans sayısalw sitometri sırasıyla, PI ve FITC için 590 ve 530 nm 488 nm ve emisyon eksitasyon kullanarak. Her numune için 10.000 olayları sayın. </li><li> X ekseni ve flow sitometri nokta arsa rakamlar Y ekseni üzerindeki PI floresans üzerine FITC floresans koyun. PI Annexin V için pozitif ve negatif hücreler apoptotik kabul edilir. Annexin V PI için pozitif ve negatif Hücreler onkotik kabul edilir. 10,11 </li></ol>

<ol>
	<li>Nowak, G., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+culture+conditions+stimulate+gluconeogenesis+in+primary+cultures+of+renal+proximal+tubule+cells.">Improved culture conditions stimulate gluconeogenesis in primary cultures of renal proximal tubule cells.</a> Am. J. Physiol. 268, C1053-C1061 (1995).</li><li>Nowak, G., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-ascorbic+acid+regulates+growth+and+metabolism+of+renal+cells:+improvements+in+cell+culture.">L-ascorbic acid regulates growth and metabolism of renal cells: improvements in cell culture.</a> Am. J. Physiol. 271, 2072-2080 (1996).</li><li>Ping, P., Takano, H., Zhang, J., Tang, X. L., Qiu, Y., Li, R. C., Banerjee, S., Dawn, B., Balafonova, Z., Bolli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoform-selective+activation+of+protein+kinase+C+by+nitric+oxide+in+the+heart+of+conscious+rabbits:+a+signaling+mechanism+for+both+nitric+oxide-induced+and+ischemia-induced+preconditioning.">Isoform-selective activation of protein kinase C by nitric oxide in the heart of conscious rabbits: a signaling mechanism for both nitric oxide-induced and ischemia-induced preconditioning.</a> Circ. Res. 84, 587-604 (1999).</li><li>Wotton, D., Ways, D. K., Parker, P. J., Owen, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+both+Raf+and+Ras+is+necessary+for+activation+of+transcription+of+the+human+T+cell+receptor+beta+gene+by+protein+kinase+C,+Ras+plays+multiple+roles.">Activity of both Raf and Ras is necessary for activation of transcription of the human T cell receptor beta gene by protein kinase C, Ras plays multiple roles.</a> J. Biol. Chem. 268, 17975-17982 (1993).</li><li>Nowak, G., Bakajsova, D., Samarel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C-&#949;+activation+induces+mitochondrial+dysfunction+and+fragmentation+in+renal+proximal+tubules.">Protein kinase C-&#949; activation induces mitochondrial dysfunction and fragmentation in renal proximal tubules.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 301, F197-F208 (2011).</li><li>Nowak, G., Clifton, G. L., Godwin, M. L., Bakajsova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+ERK1/2+pathway+mediates+oxidant-induced+decreases+in+mitochondrial+function+in+renal+cells.">Activation of ERK1/2 pathway mediates oxidant-induced decreases in mitochondrial function in renal cells.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 291, 840-855 (2006).</li><li>Shaik, Z. P., Fifer, E. K., Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akt+activation+improves+oxidative+phosphorylation+in+renal+proximal+tubular+cells+following+nephrotoxicant+injury.">Akt activation improves oxidative phosphorylation in renal proximal tubular cells following nephrotoxicant injury.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 294, F423-F432 (2008).</li><li>Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C-&#945;+and+ERK1/2+mediate+mitochondrial+dysfunction,+decreases+in+active+Na++transport,+and+cisplatin-induced+apoptosis+in+renal+cells.">Protein kinase C-&#945; and ERK1/2 mediate mitochondrial dysfunction, decreases in active Na+ transport, and cisplatin-induced apoptosis in renal cells.</a> J. Biol. Chem. 277, 43377-43388 (2002).</li><li>Liu, X., Godwin, M. L., Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C-+a+inhibits+the+repair+of+oxidative+phosphorylation+after+S-(1,2-dichlorovinyl)-L-cysteine+injury+in+renal+cells.">Protein kinase C- a inhibits the repair of oxidative phosphorylation after S-(1,2-dichlorovinyl)-L-cysteine injury in renal cells.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 287, F64-F73 (2004).</li><li>Nowak, G., Price, P. M., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+a+functional+p21WAF1/CIP1+gene+accelerates+caspase-independent+apoptosis+induced+by+cisplatin+in+renal+cells.">Lack of a functional p21WAF1/CIP1 gene accelerates caspase-independent apoptosis induced by cisplatin in renal cells.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 285, F440-F450 (2003).</li><li>Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisplatin-induced+renal+cell+apoptosis:+caspase+3-dependent+and+-independent+pathways.">Cisplatin-induced renal cell apoptosis: caspase 3-dependent and -independent pathways.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 302, 8-17 (2002).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada sunulan yaklaşım renal proksimal tübül hücrelerinin birincil kültür içinde PKC izozimleri bireysel ekspresyonu için olanak sağlar. Bu yaklaşımın birçok güçlü yanları vardır: 1. Bu çeşitli hakaretler (iskemi, hipoksi, oksidatif stres), ilaçlar ve böbrek içinde nephrotoxicants için birincil hedef hücreler (renal proksimal tübüler hücreler) homojen bir nüfus düzenleyici mekanizmaları araştırmak için izin verir. 2. Iyileştirilmiş koşullarda primer kültür yetiştirilen RPTC in <...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Laminer akış kaputu </td><td> Thermo Electron Corporation </td><td> FORMA 1104 </td></tr><tr><td> 2 ml ve 15 ml Dounce doku öğütücü </td><td> WHEATON </td><td> 989-24607, 357.544 </td></tr><tr><td> 85 ve 235 mikron naylon mesh </td><td> Küçük Parçalar </td><td> CMN - 0085 - 10YD CMN - 0250 - 10YD </td></tr><tr><td> 50 ml steril santrifüj tüpüne </td><td> BIOLOGIX </td><td> BCT-P 50BS </td></tr><tr><td> 1.5 ml mikro tüp </td><td> Sarstedt </td><td> 72.690.001 </td></tr><tr><td> 35 x 10 mm steril kültür kaplarına </td><td> Corning </td><td> 430165 </td></tr><tr><td> Jouan Santrifüj </td><td> Jouan </td><td> Jouan CR3 11175704 Rotorları: Jouan T40 </td></tr><tr&gt; <td> Ayarlanabilir mikro-santrifüj </td><td> SIGMA </td><td> Model 1 - 15 </td></tr><tr><td> Biyolojik Oksijen Monitörü </td><td> YSI Incorporated </td><td> YSI Model 5300A </td></tr><tr><td> Tek Odası Mikro Oksijen Sistemi </td><td> YSI Incorporated </td><td> 5356S </td></tr><tr><td> Oksijen Sondası </td><td> YSI Incorporated </td><td> 5331A </td></tr><tr><td> Banyo Sirkülasyon </td><td> YSI Incorporated </td><td> 5310 </td></tr><tr><td> KCl ve Standart Membran Takımı </td><td> YSI Incorporated </td><td> 5775 </td></tr><tr><td> Manyetik Karıştırıcı </td><td> YSI Incorporated </td><td> 5222 </td></tr><tr><td> Masaüstü Kaydedici </td><td> Kipp &amp; Zonen </td><td> BD 11E </td></tr><tr><td> 48-iyi ve 96-de şeffaf plaka </td><td> Costar </td><td> 3548, 3679 </td></tr><tr><td> Thermomixer R </td><td> Eppendorf </td><td> 5355 21919 </td></tr><tr><td> Orbital çalkalayıcı maxq 2000 </td><td> Thermo Scientific </td><td> SHKA 2000 </td></tr><tr><td> Spectra FLUOR Plus (absorbans / floresan / ışıldama okuyucu) </td><td> Tecan </td><td> F129005 </td></tr><tr><td> Su Ceketli ABD Autoflow Otomatik CO 2 İnkübatör </td><td> NUAIRE </td><td> NU 4850 </td></tr><tr><td> Akım sitometri için 12x75 mm polistren kültürü test tüpleri </td><td> Fisher Marka </td><td> 14-961-20 </td></tr><tr><td> Axioskop Su immersiyon objektif 63x / 0,90 W </td><td> Carl Zeiss </td><td> 114846 ACHROPLAN 44 00 67 </td></tr><tr><td> DMEM / F12 </td><td> Cellgro </td><td> 99-830 - PB </td></tr><tr><td> DMEM / F12 Ham </td><td> Sigma </td><td> D 2906 - 1L </td></tr><tr><td> Deferoksamin mesilat </td><td> Hospitalra </td><td> D110 </td></tr><tr><td> Kollajenaz Tip I </td><td> Worthington </td><td> 4196 </td></tr><tr><td> Tripsin inhibitörü </td><td> Sigma </td><td> T 6522 - 500mg </td></tr><tr><td> 5,5 &#39;, 6,6&#39;-tetrakloro-1, 1 &#39;, 3,3&#39;-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iyodür (JC-1) </td><td> Invitrogen </td><td> T3168 </td></tr><tr><td> Mitotracker Kırmızı </td><td> Invitrogen </td><td> M22425 </td></tr><tr><td> ATP Biyoparlaklık Assay Kit HS II </td><td> Roche </td><td> 11 699 709 001 </td></tr><tr><td> Annexin - V FITC çözümü </td><td> BioVision </td><td> 1001 - 200 </td></tr><tr><td> Akış sitometresi </td><td> BD Biosciences </td><td> BD FACSCalibur </td></tr></tbody></table>

assessment of mitochondrial functions and cell viability in renal cells overexpressing protein kinase c isozymes

Izozimlerinin protein kinaz C (PKC) ailesi çeşitli fizyolojik ve patolojik süreçler içinde yer almaktadır. Bizim son veriler PKC mitokondriyal fonksiyon ve hücresel enerji durumunu düzenler göstermektedir. Sayısız raporlar PKC-a ve PKC-ε aktivasyonu iskemik kalp ve aracılık kardiyoproteksiyon mitokondriyal fonksiyonu iyileştirir olduğunu göstermiştir. Buna karşılık olarak, PKC-α ve PKC-ε böbrek hücrelerinde nephrotoxicant bağlı mitokondriyal işlev bozukluğu ve hücre ölümü ile ilgili olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, bu çalışmanın amacı, PKC izozimleri seçici aktive veya oksidatif fosforilasyon ve hücre canlılığı düzenleme rollerini belirlemek için inhibe edilebileceği aktif mitokondrial fonksiyonları koruyarak böbrek hücrelerinin in vitro modeli geliştirmektir. Renal proksimal tübüler hücreler (RPTC) primer kültürlerinde mito mitokondrial solunum ve faaliyet sonucu geliştirilmiş koşullarında kültüre edildiin vivo RPTC ile benzer chondrial enzimler. Geleneksel transfeksiyon teknikleri (lipofektamin, elektroporasyon) primer kültürlerinde verimsiz ve mitokondriyal fonksiyon üzerinde olumsuz etkilere sahip olduğundan, PKC-ε mutant cDNAlarının adenoviral vektörlerin aracılığıyla RPTC teslim edildi. % 90&#39;ın üzerinde kültür RPTC aktarılmasının Bu yaklaşım, sonuç. Burada, PKC-ε rolünü değerlendirmek için yöntemler mevcut: 1. mitokondriyal morfolojisi ve ATP sentezi, ve 2 ile ilişkili fonksiyonların düzenlenmesi. Primer kültür RPTC yaşama. PKC-ε eksprese yapısal olarak aktif PKC-ε mutant tarafından aktive edilir. PKC-ε eksprese tarafından PKC-ε ve inaktif mutant inhibe edilir. Mitokondrial fonksiyonu, solunum kompleksleri ve faaliyetleri solunum zincirinin bütünlüğünü solunum incelenerek değerlendirilir F 0 F 1-ATPaz, ATP üretim hızı ve ATP içeriği. Solunum birhal 3 (fazlalık substrat ve ADP varlığında maksimum solunum) ve bağlantısız olarak solunum digitonin-permeabilize RPTC içinde ssessed. Solunum zinciri bütünlüğü izole mitokondrilerde solunum zincirinin dört komplekslerin faaliyetleri ölçülerek değerlendirilir. Oksidatif fosforilasyon Kapasitesi F 0 F 1-ATPaz ATP üretim hızı ve etkinliği, mitokondrial membran potansiyeli ölçülerek değerlendirilir. RPTC Enerji durum hücre içi ATP içeriğinin belirlenerek değerlendirilir. Canlı hücrelerde mitokondri morfolojisindeki MitoTracker Kırmızı 580, özellikle mitokondri biriken floresan boya ve canlı monolayers bir floresan mikroskop altında incelenir kullanılarak canlandırılmaya çalışılır. RPTC canlılığı Anneksin V / apoptoz ve oncosis belirlemek için flow sitometri ile takip propidium iyodür boyama kullanılarak incelenmiştir. Bu yöntemler, bireysel PKC izozimleri seçici bir aktivasyon / inhibisyonu için izin vermekin vitro olarak çoğaltılabilir fizyolojik ve patolojik durumlarda çeşitli hücresel fonksiyonları rollerini değerlendirmek.

Şekil 1 gösteriyor ki adenoviral teslimat RPTC ve mitokondri PKC-ε önemli ölçüde artmış protein düzeyleri PKC-ε sonuçları yapısal olarak aktif (caPKC-ε) ve inaktif (dnPKC-ε) mutantlar kodların cDNA. Hücreleri inaktif oldu cDNA kodlama dnPKC-ε aşırı ekspresyona PKC-ε (fosforile değil) (Şekil 1) ile enfekte ise caPKC-ε vektörü taşıyan cDNA ile enfekte hücreler PKC-ε ve fosforile (aktif) şeklinde aşırı eksprese. Aktif varlığı, PKC-ε PKC-ε inaktif hi...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes at JoVE.com

Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes

Solunum ve oksidatif fosforilasyon ile ve hücre canlılığı üzerindeki ilişkili mitokondriyal fonksiyonları üzerinde, protein kinaz C (PKC), izozimlerinin aktivasyon etkisi tarif edilmektedir. Yaklaşım seçici olarak mitokondriyal işlev ve hücre enerji durumunu belirlemek için birincil hücre kültürü deneyleri ve çeşitli PKC izozimleri overexpress için adenoviral teknik uyum sağlar.

Böbrek Hücreleri aşırı eksprese eden protein kinaz C izozimlerinin Mitokondriyal Fonksiyonlar ve Hücre Canlılık Değerlendirilmesi

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC ...

assessment-mitochondrial-functions-cell-viability-renal-cells

Research

JoVE Journal

Biology

18.1K Görüntüleme.  University of Arkansas for Medical Sciences. Solunum ve oksidatif fosforilasyon ile ve hücre canlılığı üzerindeki ilişkili mitokondriyal fonksiyonları üzerinde, protein kinaz C (PKC), izozimlerinin aktivasyon etkisi tarif edilmektedir. Yaklaşım seçici olarak mitokondriyal işlev ve hücre enerji durumunu belirlemek için birincil hücre kültürü deneyleri ve çeşitli PKC izozimleri overexpress için adenoviral teknik uyum sağlar.

Video: Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A hemacytometer is a thick glass slide with a central area designed as a counting chamber. Cell suspension is applied to a defined area and counted so cell density can be calculated. 

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. In this video, we demonstrate how cells are counted using a hemacytometer.

Doku ve Hücre Sayım ve Canlılık Belirlenmesi

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A ...

Biyoloji

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

Sitokrom Sitoplazmik Mikroenjeksiyon Apoptoz aktivasyonu C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Assessment of GFP Expression and Viability Using the Tali Image-Based Cytometer

Single-cell and population information are commonly obtained either by flow cytometry or fluorescence microscopy. However, these two methods provide different information. Flow cytometry gives quantitative multi-parametric information about physical characteristics and staining or expression, but doesn't allow for visualization. Stand-alone fluorescence microscopy provides visual data, but doesn't allow for straightforward quantitative measurements1.
Image-based cytometry bridges the gap between these two methods, enabling the quick visualization and simultaneous quantitative analysis of thousands of cells in heterogeneous populations2. Here, we present a method for performing cell viability and green fluorescent protein (GFP) expression assays using the Tali Image-Based Cytometer3. The Tali instrument is a 3-channel (bright field, green fluorescence, red fluorescence) benchtop assay platform that offers several advantages over flow cytometry and fluorescence microscopy. The Tali cytometer is less expensive, takes up less bench space, requires less maintenance, and the work flow has been simplified so that the operation and analysis is much simpler and quicker. The Tali cytometer is capable of performing a range of suspension cell-based assays, including GFP and red fluorescent protein (RFP) expression, apoptosis4-6 and cell viability analysis with propidium iodide (PI)7-11.
Here, we demonstrate the use of the Tali instrument in performing a cell viability assay in cells expressing GFP. GFP-transduced cells are stained using the Tali Viability Kit - Dead Cell Red. The cells are then pipetted into a Tali Cellular Analysis Slide and loaded into the cytometer. Bright field, red fluorescence and green fluorescence images are captured and analyzed using assay specific algorithms. Histograms are then generated to display cell size, PI fluorescence intensity, and GFP fluorescence intensity. These parameters can then be thresholded to home in on a specific cell population.
A side-by side comparison of the Tali Image-Based Cytometer and traditional flow cytometry demonstrates that the two methods provide comparable data regarding cell viability and protein expression. However, the Tali instrument provides additional visual information about the cell population that cannot be obtained using a flow cytometer.

This protocol describes how to perform cell viability and fluorescence expression assays using the Tali Image-Based Cytometer.

Tali Görüntü Tabanlı Sitometre kullanarak GFP İfade ve Canlılık Değerlendirilmesi

Single-cell and population information are commonly obtained either by flow cytometry or fluorescence microscopy. However, these two methods provide ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

Canlı Hücrelerde Protein Aggregation 4D Görüntüleme

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Viability Assays for Cells in Culture

Manual cell counts on a microscope are a sensitive means of assessing cellular viability but are time-consuming and therefore expensive. Computerized viability assays are expensive in terms of equipment but can be faster and more objective than manual cell counts. The present report describes the use of three such viability assays. Two of these assays are infrared and one is luminescent. Both infrared assays rely on a 16&#160;bit Odyssey Imager. One infrared assay uses the DRAQ5 stain for nuclei combined with the Sapphire stain for cytosol and is visualized in the 700 nm channel. The other infrared assay, an In-Cell Western, uses antibodies against cytoskeletal proteins (&#945;-tubulin or microtubule associated protein 2) and labels them in the 800 nm channel. The third viability assay is a commonly used luminescent assay for ATP, but we use a quarter of the recommended volume to save on cost. These measurements are all linear and correlate with the number of cells plated, but vary in sensitivity. All three assays circumvent time-consuming microscopy and sample the entire well, thereby reducing sampling error. Finally, all of the assays can easily be completed within one day of the end of the experiment, allowing greater numbers of experiments to be performed within short timeframes. However, they all rely on the assumption that cell numbers remain in proportion to signal strength after treatments, an assumption that is sometimes not met, especially for cellular ATP. Furthermore, if cells increase or decrease in size after treatment, this might affect signal strength without affecting cell number. We conclude that all viability assays, including manual counts, suffer from a number of caveats, but that computerized viability assays are well worth the initial investment. Using all three assays together yields a comprehensive view of cellular structure and function.

Therapeutic compounds are often first examined in vitro with viability assays. Blind cell counts by a human observer can be highly sensitive to small changes in cell number but do not assess function. Computerized viability assays, as described here, can assess both structure and function in an objective manner.

Kültür hücreleri için Canlılık Tahliller

Manual cell counts on a microscope are a sensitive means of assessing cellular viability but are time-consuming and therefore expensive. Computerized ...

Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1

Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The nuclear-encoded proteins are transported into mitochondria guided by their mitochondria targeting sequences (MTS); however, a majority of mitochondrial localized proteins lack an identifiable MTS. Nevertheless, the fact that MTS can instruct proteins to go into the mitochondria provides a valuable tool for studying mitochondrial functions of normally nuclear and/or cytoplasmic proteins. We have recently identified the cell cycle kinase CyclinB1/Cdk1 complex in the mitochondria. To specifically study the mitochondrial functions of this complex, mitochondrial overexpression and knock-down of this complex without interfering with its nuclear or cytoplasmic functions were essential. By tagging CyclinB1/Cdk1 with MTS, we were able to achieve mitochondrial overexpression of this complex to study its mitochondrial targets as well as functions. Via tagging dominant-negative Cdk1 with MTS, inhibition of Cdk1 activity was accomplished particularly in the mitochondria. Potential mitochondrial targets of CyclinB1/Cdk1 complex were identified using a gel-based proteomics approach. Unlike traditional 2D gel analysis, we employed 2-dimensional difference gel electrophoresis (2D-DIGE) technology followed by phosphoprotein staining to fluorescently label differentially phosphorylated proteins in mitochondrial Cdk1 expressing cells. Identification of phosphoprotein spots that were altered in wild type versus dominant negative Cdk1 bearing mitochondria revealed the identity of mitochondrial targets of Cdk1. Finally, to determine the effect of CyclinB1/Cdk1 mitochondrial localization in cell cycle progression, a cell proliferation assay using a synthetic thymidine analogue EdU (5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine) was used to monitor the cells as they go through the cell cycle and replicate their DNA. Altogether, we demonstrated a variety of approaches available to study mitochondrial localization and activity of a cell cycle kinase. These are advanced, yet easy to follow methods that will be beneficial to many cell biology researchers.

Here, we outline how to study mitochondrial localization of a (cell cycle) kinase, and how to determine its sub-mitochondrial location as well as potential mitochondrial substrates/targets. Forced expression of proteins into the mitochondria provides a useful tool for studying the functional consequences of mitochondrial localization of a protein of interest.

Deneysel Yaklaşımlar Mitokondriyal Yerelleşme ve Nükleer Hücre Döngüsü Kinaz, Cdk1 Fonksiyonu Eğitim için

Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ concentration. To do this, mitochondria utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester Ca2+. The influx of Ca2+ into the mitochondria stimulates three rate-limiting dehydrogenases of the citric acid cycle, increasing electron transfer through the oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes. This stimulation maintains &#916;&#936;m, which is temporarily dissipated as the positive calcium ions cross the mitochondrial inner membrane into the mitochondrial matrix.
We describe here a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using confocal microscopy. By permeabilizing the cells, mitochondrial Ca2+ can be measured using the fluorescent Ca2+ indicator Fluo-4, AM, with measurement of &#916;&#936;m using the fluorescent dye tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM). The benefit of this system is that there is very little spectral overlap between the fluorescent dyes, allowing accurate measurement of mitochondrial Ca2+ and &#916;&#936;m simultaneously. Using the sequential addition of Ca2+ aliquots, mitochondrial Ca2+ uptake can be monitored, and the concentration at which Ca2+ induces mitochondrial membrane permeability transition and the loss of &#916;&#936;m determined.

Mitochondria can utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester calcium (Ca2+), allowing them to shape cytosolic Ca2+ signaling within the cell. We describe a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using fluorescent dyes and confocal microscopy.

Floresan Mikroskopi Canlı hücreler Potansiyel Mitokondriyal Kalsiyum ve Mitokondriyal Membran Eşzamanlı Ölçümü

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Dinamik Hücresel Protrüzyonlarda Protein Konsantrasyonunun Yazılım Destekli Takibi için Grafiksel Bir Kullanıcı Arayüzü

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Primary Culture of Rat Adrenocortical Cells and Assays of Steroidogenic Functions

The hormone which the adrenal cortex secretes is vital for animals against stress and diseases. The method described here is the procedure of primary cultured rat adrenal cells and related functional assays (immunofluorescence staining of lipid droplet surface protein, as well as corticosterone analysis). Unlike an in vivo model, the variation of interexperiments in adrenal monolayer cultures is less and the experimental condition is easy to control. Besides, the source of rats is also more stable than other animals, like bovine ones. There are also several human adrenal cell lines (NCI-H295, NCI-H295R, SW13, etc.) that can be used in adrenal studies. However, the steroid production of these lines will still be influenced by numerous factors, which include serum lot number, passage number, mutant/loss of distinct genes, etc. Except for lacking 17&#945;-hydroxylase, the primary culture of rat adrenocortical cells is a better and more convenient technique for studying adrenal physiology. In summary, primary rat adrenal cultures could be a good in vitro platform for researchers to investigate the mechanisms of the reagent of interest in the adrenal gland system.

The hormone secreted by the adrenal cortex is vital for animals against stress and diseases. Here, we present a protocol to culture the primary rat adrenal cells. It could be a good in vitro platform for investigating the mechanisms of the reagent of interest in adrenal steroidogenesis and lipid biosynthesis.

Sıçan Adrenokortikal hücreleri ve deneyleri Steroidogenic fonksiyonların birincil kültür

The hormone which the adrenal cortex secretes is vital for animals against stress and diseases. The method described here is the procedure of primary ...

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase (ERK) Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Direct control of cellular defined molecular events is important to life science. Recently, studies have demonstrated that femtosecond laser stimulation can simultaneously activate multiple cellular molecular signaling pathways. In this protocol, we show that through coupling femtosecond laser into a confocal microscope, cells can be stimulated precisely by the tightly-focused laser. Some molecular processes that can be simultaneously observed are subsequently activated. We present detailed protocols of the photostimulation to activate extracellular signal regulated kinase (ERK) signaling pathway in Hela cells. Mitochondrial flashes of reactive oxygen species (ROS) and other mitochondrial events can be also stimulated if focusing the femtosecond laser pulse on a certain mitochondrial tubular structure. This protocol includes pretreating cells before photostimulation, delivering the photostimulation by a femtosecond laser flash onto the target, and observing/identifying molecular changes afterwards. This protocol represents an all-optical tool for related biological researches.

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase ERK Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Tightly-focused femtosecond laser can deliver precise stimulation to cells by being coupled into a confocal microscopy enabling the real-time observation and photostimulation. The photostimulation can activate cell molecular events including ERK signaling pathway and mitochondrial flashes of reactive oxygen species.

Femtosecond lazer tarafından fotostimulasyon hedef hücrelerde Ekstrelüler-sinyal düzenlenmiş kinaz (ERK) sinyalizasyon veya mitokondriyal olayları etkinleştirir

Direct control of cellular defined molecular events is important to life science. Recently, studies have demonstrated that femtosecond laser stimulation ...