Name: methods to assess subcellular compartments of muscle in c. elegans
Uploaded: 2014-11-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans at JoVE.com

This work was supported by a grant from the US National Institutes of Health National Institute for Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (AR-054342) to NJS. CJG was funded by a Doctoral training studentship funded by the University of Nottingham. JJB was funded by an MRC Doctoral training award (J500495). The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.

1. suşlar, Kültür ve Mikroskopi <ol><li> C. elegans Kolu ve korumak suşları daha önce 19 nitelendirdi. Suşları Caenorhabditis Genetik Merkezi (CGC) edinilebilir. NOT: mitokondri ve çekirdekler lokalize GFP füzyon proteinleri ile bu deneylerde kullanılan suşlar CB5600 (o-8 (e1489) IV,; PMYO-3 :: Mtgfp) ı ccIs4251 (PMYO-3 :: Ngfp-lacZ) idi; Unc-; kontraktil aparat ve PD55 (ccIs55 (sup-7 (ST5) lokalize GFP füzyon proteinleri ile; PJ727 (unc-54 :: lacZ V jls01 (myo-3 :: GFP, rol-6 (su1006))) 54 :: lacZ sitoplazmada lokalize β-galaktosidaz füzyon proteinleri ile) v). </li><li> Daha önce diziden RNAi bakterileri kuşaklı RNAi deneyler 13 için tarif ve elde gibi komple RNAi&#39;nin deneyler Marc Vidal ve ark. 12 tarafından inşa ORF-RNAi kütüphane doğrulandı. </li><li> Ihtiva eden suşlar Konstrukt &lt;em&gt; ccis 4251, jls01 veya ccis 55 standart teknikler 20 kullanılarak. Sırasıyla, mitokondriyal ağ yapısı, miyozin örgüt veya proteostasis durumunu değerlendirmek için bir yük oluşturmak için bu transgenleri kullanın. Her hayvan isteniyorsa bu alt-hücre bölümlerinde birinde bakarak nerede bir mutant haline suşları çapraz. </li><li> PtdIns-3-kinaz inhibitörü kullanmak, LY-294002 (LY) olarak daha önce 21 nitelendirdi. Kısaca, kuru OP50-tohumlu NGM plakalar üzerine 160 uM&#39;lik bir nihai konsantrasyonda LY-294002 ekleyin. </li><li> Yaygın olarak, GFP-tabanlı deneyler için bir GFP filtresi ve Cl 2 N 2 O H 32 C 32 ile in vivo membran potansiyelinin değerlendirilmesi için aynı anda, kırmızı, yeşil ve mavi kanalların görüntüleme sağlayan bir üçlü-geçiş filtresi ile bir mikroskop kullanarak tüm görüntüleri yakalayın MitoTracker Kırmızı CMXRos olarak pazarlanan. Görüntü işleme yazılımı görüntü analizi ve şekil hazırlık yapınız. </li></ol><ol><li> Önce gerekli 1 gün, asgari bir M9 tampon yapmak - 22.04 mM KH 2 PO 4, 42,27 mM Na 2 HPO 4, 85,56 mMNaCl (nihai konsantrasyonlar), ve otoklav ile sterilize. Bir kez 45 ° C&#39;ye kadar soğutuldu, çökeltme 22 bilmek otoklav sonrası 1 mM&#39;ye MgSO 4 steril ekleyin. M9 50 ml tüpler içinde 4 ° C ve kana soğumaya bırakın. </li><li> Deney gününde, L1 larvalarının yüksek sayıda tek 9 cm&#39;lik plakasına 3 mi M9 tampon ekleyin. Bir açıyla plaka ile agar yüzeyine karşı M9 sıvı ve pipetleme aspire art arda plaka yıkanır. </li><li> Plakadan L1&#39;in yıkayın ve daha sonra bir pipet kullanarak 10 ml&#39;lik bir test tüpüne M9 aktarın. </li><li> Büyük yetişkin ve daha sonra larva hayvanlar test tüpünün dibine düşmesine izin 2.5 dakika bekletin ve daha küçük L1 hayvanlar t yakın kalırM9 tampon op. </li><li> Bir pipet kullanarak test tüpünde M9 ilk 500 ul çıkarın. Sonra diseksiyon kapsamında 500 ul OP50 numaralı seribaşı yeni NGM plaka M9 içeren L1 larvaları pipetle. </li><li> Tipik olarak, plaka başına ~ 200-300 L1 larva transfer hedefliyoruz. Gerekirse, OP50 besin kaynağı tüketilen önlemek için taze OP50 NGM plakalar üzerine hayvan almak, yetişkinlik günlük plakaları izlemek ve. Not: Bu, orijinal plaka üzerinde L1&#39;in sayısına bağlı olarak büyük ölçüde değişiklik gösterir, ancak bu genellikle P1000 pipet kullanarak M9 1-3 düşmesi. </li><li> Bireysel hayvanlarda prospektif çalışmalar istenirse hayvanlar yetişkinlik ulaştıktan sonra, seribaşı NGM plakaları ayrı ayrı hayvan almak. Transferi hayvanlar her 24-48 saatte larva hayvanlardan ayırmak için. </li></ol> 3. Hareket Tahliller 19 <ol><li> Deney başlamadan önce, 2 saat, asgari bir M9 bir 50 ml&#39;lik bir şişe çıkarın ve oda sıcaklığına dengelenmeye gelmeye bırakınerature. </li><li> Bir mikroskop lamı üzerine 50 ul M9 tampon içine tek bir yetişkin hayvan almak. </li><li> Bir sola ve bir sağa viraj, bir inme eşittir 10 sn, sol ve sağa vücut virajlı sayısını. </li><li> Bir ortalama alınır ulaşılabilen en az 5 ölçümleri elde edilen toplam vücut strok sayısı tekrarlayın. Dakika başına hareket hızını vermek için altı ile bu rakamları çarpın. </li><li> Bir pipet kullanarak, petri geri hayvan aktarın. Bu yöntem, C. elegan s tüm kullanım süreleri boyunca hareketin zamansal ölçüm sağlar. </li></ol><img alt="Şekil 1," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52043/52043fig1highres.jpg" width="600" /> Şekil 1: Hareket deneyleri. Solucanlar tamponu içine toplanmıştır sonra, bir sola doğru (A) ve bir doğru (B) eğilme tam bir hareketini elde etmek üzere birbirine eklenir(Inme). Mitokondriyal Ağları ve sarkomer 4. Görüntüleme Vücut Duvar Kasında <ol><li> Not: Aynı protokol, mitokondri ve sarkomer hem görüntüleme için de geçerlidir. </li><li> Onlar genç erişkinliğe ulaşması zaman önce (Bölüm 1) tanımlanmış ve 20 ° C&#39;de 48-60 saat süreyle büyüdükçe solucanlar eşitleyin. </li><li> Bir mikroskop lamı üzerinde 20 ul M9 tabaklardan alınarak 20 dişli (plaka temsilcisi) seçin. </li><li> Bir kapak kayma uygulayın ve 40X büyütmede bir GFP filtre (460-500 nm, mavi ışık uyarma) altında floresan mikroskop kullanılarak görüntüye geçin. </li></ol> 5. MitoTracker Kırmızı CMXRos ile İn Vivo Birikim Testi (C 32 H 32 Cl 2 N 2 O) kullanarak Potansiyel Membran değerlendirilmesi <ol><li> CB5600 (Bölüm 1), kasların mitokondri GFP ile etiketlenmiş tüm senkronize ve 20 ° C&#39;de 48-60 saat süreyle NGM içeren OP50 erken yetişkinliğe büyür. </li><li> 940,692 uM bir stok çözelti yapmak için Cı 32, H 32, Cl 2N 2 O 50 ug kana ul DMSO 100 ekleyin. </li><li> 940,692 mcM stok solüsyonu 1 ul alın ve 4.70 mcM (4,70346 mcM) çalışan bir çözüm oluşturmak için 199 ul M9 içine tekrar süspansiyon. C 32 H 32 Cl 2 N 2 O ışığa, çünkü kahverengi 1.5 ml tüpler bu hazırlayın. </li><li> Çözeltisi (20 ul bölüntüde başına 20 erişkin solucanlar) çalışan 4.70 mcM 20 ul alikotları hazırlayın. </li><li> Kahverengi 1.5 ml tüplere 4.70 mcM C 32 H 32 Cl 2 N 2 O 20 ul içine 20 yetişkin hayvan almak. 1 saat boyunca 20 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> 1 saat inkübasyonu takiben, 10 saniye boyunca 2000 xg&#39;de solucanlar, santrifüj içeren kahverengi 1.5 ml tüpler için 1 ml M9 ekleyin ve sonra süpernatant kaldırmak. Kalan 20 μ solucan pelet resuspending ve aktarmadan önce bu yıkama işlemi tekrarlayınl görüntüleme için bir slayta (solucanları içeren). </li><li> 40X büyütme aynı anda iki, kırmızı, mavi ve yeşil kanalları görselleştirme sağlayan bir üçlü geçiş filtresi kullanılarak mitokondri görüntüleri çekmek. Üçlü geçişli filtre kullanılarak görüntüleme turuncu gibi görünen mitokondri lokalize C 32 H 32 Cl 2 GFP ile N 2 O co-lokalizasyon gösterir. </li><li> Turuncu mitokondri bir görüntü alınmış olması, uzaklaştırılmalı filtreler maksimum ayarlarına ilişkin dalga boyu 540/25 nm ışık kullanılarak 10 sn için hayvan foto-ağartıcıdır. Bu mitokondri içindeki kırmızı çamaşır suyu ve kas mitokondrilerinde ko onaylamak için yalnız mitokondriyal GFP ortaya çıkaracaktır. </li></ol> C. elegans kas Protein Parçalanabilirliklerinin 6. Değerlendirilmesi <ol><li> NGM plakalar için senkronize PD55s (veya lacZ transgen ihtiva eden herhangi bir suş) OP50 (Kısım 1) ile tohumlandı. 2 de 48-60 saat boyunca genç yetişkinliğe kadar büyür0 ° C&#39;dir. </li><li> Bir mikroskop lamı üzerine 20 ul GKD 2 O içine 20 erişkin solucanlar almak. Denemek ve sadece solucan ve pick ile herhangi bir bakteri almak için dikkatli olun. Kalem mikroskop lamı etiketleyin. </li><li> 30 dakika kuru ve hayvanların kütikül çatlak için bir desikatöre yerleştirin. Mühür etrafında yağı ile desikatörde sıkı bir mühür sağlamak. </li><li> Kuruma kontrol diseksiyon kapsamı (Şekil 2) altında etkili olmuştur. </li><li> 3.5 dakika sonra slayt üzerinde aseton buharlaşmasına izin vermek için 15 dakika boyunca, oda sıcaklığında, bir kağıt havlu üzerine bir mikroskop lamı bırakmak için buz-soğuğu aseton içinde bir mikroskop lamı daldırın. Bu noktada da X-gal ve oksidasyon tampon çözülmesi ve oda sıcaklığına dengelenmesi sağlar. </li><li> Nazikçe homojen olmasını sağlamak için oksidasyon tamponu ve vorteks ul ile 100 ul 2 X-gal ekleyin. Bu X-gal / oksidasyon tampon usta karışımıdır. </li><li> O her X-gal / oksidasyon tampon ana karışımı 20 ul ekleyin20 solucan orijinaldeki alanı. Ana karışım tamamen tamamen bütün hayvanları kapsar sağlamak için bir diseksiyon kapsamında kontrol edin. Yavaşça hayvanlar kapsamında değildir nerede alanlar üzerinde ana karışımı taşımak için mikroskop lamı eğin. </li><li> 20 ° C de 1-2.5 saat süreyle bir nem odasında bir mikroskop lamı yerleştirin. Resim hayvanlar koyu mavi renk kontrol hayvanlarının vücut duvarı kasları içinde mevcuttur. Hayvanlar görüntülü olmalıdır belirlemek için bir diseksiyon kapsamında her 15 dakikada bir kontrol hayvanları değerlendirin. </li></ol><img alt="Şekil 2," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52043/52043fig2highres.jpg" width="600" /> Şekil 2: β-galaktosidaz tahlilleri kullanılarak kas protein yıkımı Değerlendirilmesi. AcZ transgen ihtiva eden (A) &#39;Hayvanlar, bir mikroskop slayt (B) 20 ul GKD 2 O Petri kaplarından toplanır. Hayvanlar kurutulmuş ve kırık olmak <strong&gt; (° C). Hayvanlar daha sonra aseton (D) &#39;de yıkanır. Aseton (E) X-gal / oksidasyon tamponu ana karışımı ilave edilir buharlaşır kez. Kontrol hayvanlarında, mavi renk gelişimi, bir koyu mavi renk hayvanlarda (L) uzunluğu boyunca elde edilene kadar zamanı t = 0 dakika boyunca (F) ile 15 dakikalık aralıklar (FL) değerlendirilir. Solucanlar Görüntüleri FL AE ve 8X de 2.5X büyütme alınır. C, D, F, G ve L yakınlaştırır orijinal büyütme 4X bulunmaktadır.

The authors have nothing to disclose.

Bu yöntemler, bir hareket bozukluğu neden olmak için yeterli olan alt-hücresel bozukluklarının belirlenmesi için hareket macrophysiology gelen kas keşfini sağlar. Kombine edildiğinde bu yöntemler kas ayrıntılı analizini sağlar. Kazanılan içgörü genel fizyoloji, patofizyoloji ve yaşlanma ilgilendirmeyen kas odaklı hipotezler ileri test sağlar. Hareket Tahliller Bir hareket kusur Normal konlar bir bozulma gösterir. Bu sinirlerin veya kas özgü olabilir veya çeşitli dokulardan arasında ortak olabilir. Tamamladıktan hareket testlerin en zor aşamaları nüfus ve / veya tedavinin temsilcisi olan solucanlar seçerek ve aynı zamanda deneyci M9 transfer üzerine hayvan zarar vermez garantiliyoruz. Bu hareketin bir temsilcisi ve doğru bir değerlendirme elde etmek için büyük bir örneklem büyüklüğü olması önemlidir. Yüksek kalem tahlil zamanÖrneğin etrant etkileri, sık sık mutantta görülmektedir, on hayvan bir örnek boyutu her hareket on kez değerlendirilen vahşi tip karşı istatistiksel olarak anlamlı fark için yeterlidir. Ancak, hareket deneyleri ve kültür C. elegans kolaylığı basitliği solucanlar yüzlerce hızlı kantitatif sonucu sağlamak amacıyla değerlendirilebilir anlamına gelir. Bir nüfusun yalnızca bir bölümünde mevcut görünür etkilerini tahlil zaman en çok etkilenen hayvanlarda defekt şiddeti yanı sıra etkilenmiş görünüyor nüfusun ne kadarının belirlemek önemlidir. Bu gibi durumlarda, hayvanların daha fazla sayıda etkilenen nüfus kısmı için çok az veri sağlamak üzere değerlendirilmelidir. Sıkça ilaç ve RNAi tedavileri hem nüfusun küçük bir bölümünde şiddetli hareketi kusurları üretecek. Bazı durumlarda Aff oranı artacak tedavisi ve ya da teslimat yöntemi dozunu arttırmakyansıtılmaktadır hayvan ve yürütülmesini doz tepki eğrileri, bir ilaç veya RNAi optimum yoğunluğunu belirlemek faydalı olabilir. Bu hareket, testin ikinci bir sınırlama solucan hareket değerlendirmek için manipüle olmasıdır. Bu nedenle, solucanlar hem uyarılmamış ve sıvı içinde aldı bir ozmotik basınç belli bir dereceye kadar tabi tutulmaktadır. Ozmotik basınç derecesi M9 veya Bu suya karşı tamponu 19 ile sınırlanabilir. Bu sınırlamalardan bazıları ImageJ 35 Piyasada mevcut izleme sistemleri 34 ya da ücretsiz eklentileri kullanarak plakalar üzerinde alışılmış hareketinin ölçülmesi ile hafifler. Bir hayvanın hareket hızını ölçme ömrü boyunca ölçülen ve bu yöntemin non-invaziv kas fonksiyonlarının prospektif ömür boyu çalışmalar için anahtar olabilir fonksiyonu değişiklikleri de dahil olmak üzere genel kas sağlığı ile ilgili önemli bilgiler sağlayabilir. Kontraktil Aparatı Görüntüleme &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; resim kasılma aparatı yapısı Burada kullanılan solucan suşu vücut duvarı kasları içinde sarkomer lokalize bir miyozin GFP füzyon proteinini ifade PJ727 36 oldu. Bu türün kullanımı, canlı hayvanlarda sarkomer yapısı görselleştirme sağlar. Yukarıda tarif edilen hareket tahliline benzer biçimde, sarkomer yapısını değerlendirmek GFP etiketli sarkomer kullanılmasının önemli bir avantajı, bu yöntem nispeten invazif olmayan ve bu nedenle ileriye ömrü boyunca, ayrı ayrı hayvanlar içinde sarkomer yapısını takip etmek için kullanılabilir olmasıdır. Bu yöntemle büyük zorluk görüntülü solucanlar zor iyi odaklanmış görüntüler elde etmek için yapar, yine hareketli nedenle hayatta ve olmasıdır. Çeşitli yöntemler hareketini azaltmak ve daha basit görüntüleme yapmak için kullanılabilir; Bu anestezi veya basınç, emme ya da yüksek viskoziteli bir çözeltinin kullanımı ile solucanlar ve immobilizasyon felç vardır. Hareketsizleştirme Bu yöntemlerin her biritirme kendisi kas fonksiyonunu değiştirir gibi bir sakıncası vardır. Bu nedenle, bu analiz uygun muamele edilmemiş kontroller dahil etmek çok önemlidir. Ayrıca, seçilen bir hareketsizleştirme yöntemi, üzerinde çalışılmakta olan bir soru için ne kadar yaygın olarak kullanılan bağlı olarak, bağlı hareketsizleştirme yöntemi ile ilgili sorunlara yol sonuçları değildir teyit etmek için hareketsizleştirme en az iki bağımsız yöntemler kullanılması mantıklı bir çözüm olabilir. Burada azaltılmış hareketini başlatmak için solucanın üzerine lamel basit bir baskı kullandık. Lamel yerleştirdikten sonra, lamel altında sıvı buharlaşır ve lamel sonuç genellikle bu kolay görüntüleme sağlayacak kadar az hareket üretmek için 2-5 dakika sürer, solucanlar üzerinde daha fazla baskı üretmeye başlayacak. Lamel sonunda, co sonra genellikle 10-15 dk aşırı basınca gelen patlamaya solucanlar neden yeterli artacak basıncı girmiştir yakından sonra solucanları izlemek için esastırverslip ek. Ek tampon solucanlar ezilme yaralanmaları önlemek için lamel kenarlarında bir pipet ucu yardımıyla eklenebilir. Eğer istenirse bu, kapak kayma altında hayvanların alınmasını engelleyen, ancak Tırnak cilası, kapak kayma kenarlarını kapatırlar ve buharlaşmasını önlemek için de kullanılabilir. Benzer bir şekilde, çözelti içindeki silikon boncuk kullanımı basınç miktarını solucanlar üzerinde lamel yerleri azaltmaya yardımcı olabilir. Sadece bir hareket kusuru için değerlendirilmesi gibi, bu etkinin penetransdır dikkate almak önemlidir. % 80-100 hayvanlar nüfus ekranın ≤20% bir etkiliyorsa 21-79% eksik ve düşük NGM plaka üzerinde bir fenotip göstermeyen eğer Penetransı yüksek kabul edilebilir. Çok penetrant etkiler için, daha küçük örneklem büyüklükleri sarkomer kusurları üzerinde önemli nicel veri üretmek için kullanılabilir. Etki ilaca yanıt olarak açık bir hareket bozukluğu ekran hayvan düşük penetrasyonun, seçim vardır durumlardaveya RNAi uygulama en çok etkilenen tedavi hayvanlarda sarkomer kusurları analiz edilmesinde yararlı olabilir. Ancak, hareket ve sub-hücresel yapısına tedavi etkisinin ölçüde aynı olduğunu zorunlu bir durum değildir. Bu nedenle, örneğin, 100 hayvanların geniş bir popülasyonda bu kusurların ölçüde incelemek için arzu edilebilir. Bu, popülasyonda kusur dağılımının anlaşılmasını sağlar. Ayrıca en ağır etkilenen hayvanlarda kusurun derecesini incelemek ve / veya sarkomer kusur ölçüde ve hareket kusuru derecesi arasındaki ilişkiyi incelemek için istenebilir. Potansiyel zorluklar bir yana, bu yöntem sarkomer yapısı değerlendirilirken, diğer yöntemlere göre daha hızlı ve kolaydır. Bu hız ve kolaylığı, ancak, önemli bir sınırlamaya tabi olduğu, GFP füzyon proteinleri içeren sarkomer bozulduğu sarkomer 37 ve bu nedenle değerlendirme ilave daha emek-yoğun yöntemler kullanılarak teyit edilmelidir tamamen normal değildir.Bu yöntemler, 39 lekeleme falloidin polarize ışığın 38 kullanımını, ve dolaylı immünoflüoresans 40 içerir. Bu yöntemler arasında, ancak polarize ışık nispeten invazif olmayan olduğu; Diğer yöntemler tespiti gerektiren ve bu nedenle, ayrı ayrı hayvanlar arasında ileriye dönük çalışmalarda kullanılamaz, bunun yerine, sadece, bu çalışmalardan elde edilen sonuçlar teyit kesit geçmek için kullanılabilir. Mitokondriyal Ağları Görüntüleme Mitokondriyal görüntüleme deneyleri için kullanılan solucan soyu, gövde duvarı kaslarda ve, mitokondri ve çekirdekler lokalize bir GFP β-galaktosidaz füzyon proteini lokalize bir GFP füzyon proteinini tanımlayan CB5600 7 idi. Görüntüleme sarkomer için PJ727 kullanımı ile olduğu gibi, bu soyun kullanımı canlı hayvanlarda mitokondriyal ağ yapısı görselleştirme sağlar. Bu nedenle, bu suş örneğin, indirgenmiş mitocho oluşabilir, dinamik değişiklikleri değerlendirmek için kullanılabilirndrial füzyon ve / veya artan mitokondriyal füzyon 41. Ayrıca görüntüleme sarkomer gibi, bu yöntemle büyük zorluk görüntülü solucanlar zor iyi odaklanmış görüntüler almak için yapma, hala canlı ve hareketli olmasıdır. Yukarıda daha detaylı olarak tartışıldığı gibi çeşitli yöntemler, hareketini azaltmak için kullanılabileceği halde, mitokondri indirgenmiş hareketinin endüklenmesi müdahaleler için özellikle hassas bir görünür. Örneğin, en yaygın mitokondriyal solunum zinciri anestezikler hedef bileşenleri kullanılır ve bu nedenle, normal mitokondriyal yapı ve fonksiyonu çalışmalarında dikkatle kullanılmalıdır edilir. En paralitik ajanlar daha az sinyal nöromüsküler kavşak ve kas fonksiyonel denervasyon geçmesine neden Benzer şekilde, çoğu paralitik ajanlar mitokondriyal parçalanma uyarmak için normal mitokondriyal yapısı ve fonksiyonu çalışmaları dikkatle yeterlidir kullanılmalıdır. Bu çalışmada deneyler hayvan hareketsiz kılınması için baskı istihdamhemen görüntü hayvanlara gerekli olsa ler ama diğerleri başarıyla levamizolün 42 kullandık. Son olarak, örneğin, B. subtilis için kültür çeşitli bakteryel kirletici maddeler arasında, mitokondriyal parçalanma uyarabilir; bu nedenle analizinde uygun muamele edilmemiş kontroller dahil etmek çok önemlidir. Çok penetrant etkiler için, daha küçük örneklem büyüklükleri mitokondriyal ağ kusurları üzerinde önemli nicel veri üretmek için kullanılabilir. Bununla birlikte, mitokondriyal ağ küçük kusurlar yaygınlığı nedeniyle, bu hayvan az sayıda sarkomer yapısının değerlendirmesi için gereken iki kat fazla olması muhtemeldir. Etkisi düşük bir penetrasyonun sahip olduğu durumlarda, açık bir şekilde ilaç veya RNAi tedaviye yanıt olarak bir hareket bozukluğu gösteren hayvanların seçimi çoğu tedavi etkilenen hayvanların mitokondriyal kusurları analiz edilmesinde yararlı olabilir. Ancak yukarıda belirtildiği gibi, bu durum zorunlu değildirhareket ve sub-hücresel yapısına tedavi etkisinin ölçüde aynıdır. Bu nedenle, örneğin, 150-200 hayvanları, hem de en ağır enfekte olmuş hayvanların, bozulma derecesi ve kapsamı ile birlikte bozulma ölçüde varlığını veya yokluğunu geniş bir popülasyonda bu kusurların ölçüde incelemek için istenebilecektir hareket kusuru. Floresan etiketli mitokondri başka suşlar da CB5600 elde edilen sonuçları teyid etmek için kullanılabilir, ancak, farklı floresan proteinlerin kullanımı mitokondri taban ağ etkileyebilir. Örneğin, mitokondri görselleştirmek için bir tomm-20 TTT füzyon proteinin kullanımı ile mitokondriyal lokalize GFP 17 kullanımına karşı taban mitokondriyal parçalanma artmasına neden görünmektedir. Bu tür bağışıklık ve elektron mikroskopi gibi diğer yöntemler mitokondriyal yapısını değerlendirmek için kullanılabilecek olmakla birlikte, bir katılaştırma basamağı gerektirir çünkü onlar mitokondriyal dinamikleri in vivo değerlendirme izin vermezd. Gibi mitokondriyal lokalize boyaların kullanılması gibi başka yöntemler tespit olmadan da kullanılabilir ve bu nedenle, aynı zamanda mitokondriyal lokalize GFP kullanım yerine kullanılabilir. Bir sonraki bölümde tartışıldığı gibi, bu tür boyaların kullanımı, aynı zamanda in vivo olarak mitokondriyal fonksiyonun ham değerlendirilmesine olanak sağlamaktadır. C. elegans In Vivo Mitokondriyal Membran Potansiyelini Değerlendirme Boyaların çeşitli etiketleme mitokondri 28 için kullanılabilir. Bu boyalar, canlı C. elegans içinde mitokondriyal ağ yapısı görselleştirmek için alternatif bir yöntem sağlar. Onlar mitokondriyal membran potansiyeli dayalı mitokondri içinde birikir, çünkü bu boyaların çoğu aynı zamanda in vivo mitokondriyal işlevsellik ham değerlendirmesini sağlar. Yoluyla yutulur Burada biz kullandık C 32 H 32 Cl 2 N 2 OBazı ek nedeniyle% 0.5 DMSO içinde çözülerek elde geçirgenliği üst deri yoluyla solucan girerek sindirim sistemi. Hücrenin C 32 H 32 Cl 2 N 2 O içine girmesinin ardından oksitlenmiş ve amino asitler (örn metiyonin ve sistein) sülfür içeren bağlar mitokondri tarafından tecrit edilir. Bu boya-peptid komplekslerinin oluşumu, H 32 CI2 N2 O kez 28 etiketli mitokondri kalır Cı 32 anlamına gelir. Mitokondriyal boya maddelerinin kullanılması ile önemli bir zorluk ve hayvanın tüm mitokondri etiket olmasıdır. Bu nedenle CB5600, kas mitokondriyal ağ yapısı değerlendirilmesi için, yukarıda tarif edilen aynı suşunda etiketleme gerçekleştirdik. Kırmızı mitokondriyal boya, kas mitokondrilerinde, GFP ifade solucanlar bir yük ve üç geçişli bir filtre kullanarak, görüntü olan mitokondri O bularak kas sadece mitokondri nispeten basittirkırmızı boya ve GFP etiketli mitokondri ko tarafından aralığı. Boya fotoğraf ağartılmış yüksek yoğunluklu floresan ışığı altında saniye içinde olduğundan bu ko yaklaşımı yapılmasında en zor adım görüntüleme olduğunu. Bu etki deneyi görüntü hazır oluncaya kadar düşük güç floresan tutulması ve daha sonra buna göre floresans yoğunluğu ayarlanarak sınırlanabilir. Bir boya maddelerinin kullanılması ile tecrübe sonra başka bir yaklaşımı, doğru doku görüntü yalnızca mitokondrilerde Z-bacalara konfokal mikroskopi kullanmaktır; kas mitokondriyal şebekeler diğer dokulara kıyasla oldukça farklıdır. Ne yazık ki, mitokondri 28 terk C 32 yetersizlik, H 32 CI2 N2 O sarkomer ve mitokondriyal görüntüleme teknikleri, yukarıda tartışılan farklı olarak, ileriye yönelik olarak, H, 32 derecede 32 sürece, zamanla mitokondriyal fonksiyonun kaybı takip kullanılamaz anlamına gelir CI2 N2 OHayvan popülasyonlarının ayrı ayrı zaman noktalarında ilave edilir. Bu sınırlama gibi 43 potansiyel membranın yıkılmasından sonra mitokondri terk ediyor JC-10 gibi boyalar kullanılarak aşılabilir. Mitokondri, aynı zamanda C ile izole edilebilir sonraki biyokimyasal analizler için elegans 30. Bu ekstre, akış sitometrisi kullanılarak lipofilik katiyonik boya alımı veya bir fluoresan plaka okuyucusu 44 oranını nicelleştirilmesiyle mitokondriyal membran potansiyelinin ölçümü sağlar. Bozulmuş mitokondriyal membran potansiyelinin kurulmuş olması, proton degrade kaybı hassas bioluminometric lusiferaz tabanlı bir metot kullanılarak 45 ATP üretimi kaybı anlamına olmadığını belirlemek de mümkündür. C. Protein Parçalanabilme değerlendirilmesi elegans Kas protein parçalanmasını değerlendirmek için burada kullanılan solucan türü, bir kas belirli bir β içeren PD55 olduyetişkinlik ulaştı ve sonraki 72-96 saat 19 sitosolde stabil kaldığı kadar galaktosidaz olduğunu sürekli gelişimi boyunca sentezlenir. Yetişkinlik döneminde β-galaktosidaz kaybı müdahale sitosolik protein degradasyonunu 19 artmıştır tetiklendi gösterir ise Bu durumda, gelişme sırasında β-galaktosidaz seviyeleri ölçümü ağırlıklı miyozin yükselticiden sentezi üzerindeki müdahalelerin etkisini gösterir. Β-galaktosidaz aktivitesini belirlemede önemli safhalı ve etkili bir kurumaya sağlamaktır. Etkin hayvanlar kurutulması için başarısızlık hayvanların vücut duvarı kasları X-gal alt-tabaka ve bu nedenle zayıf mavi rengin zayıf sağlanması ile sonuçlanır. Desikatörde üzerindeki mühür kontrol edilmeli ve örnek ilerlemeyi değerlendirmek üzere kuruma boyunca 5-10 dk aralıklarla kontrol edilmelidir iyi kuruma sağlamak için (yani, 20 ul numune 10 dakika ve kalan 20 dakika içinde kurutulmuş olmalıdır) kapsamlı kurumaya sağlamaktır. Β-galaktosidaz deneyi bir aktivite deneyi, bu nedenle, uygun bir kontrol kaçınılmazdır. Buna ek olarak, bu bozunma meydana ispat olmayan kontrol etmek için bir işlem koşulu, göreceli olarak yetişkin azaltılmış lekeleme sağlar; bunun yerine tedaviye tepki olarak enzimatik aktivitesi azalma gösterir. Bozulmayı teyit etmek için, daha fazla emek-yoğun Western Blot analizi β-galaktosıdaz 13 karşı tamamlandı ve bu sayılan solucanlar küçük popülasyonlarında miktar protein parçalanmasını sağlar edilmelidir. Western Blot bant yoğunlukları ImageJ 46 kullanılarak belirlenebilir. Bu yöntemin diğer bir sınırlama transjenik proteinlerin kullanımı bozulmasının fizyolojik hedefleri olarak ve proteomik ve / veya hedeflenen hipotez tahrik western blotları 13 kullanılması gerekmektedir Bu tür yanıtlar için bilgi olmamasıdır. Son olarak, bu çalışmalarda transgenik protein sentezi gibi erken yetişkinlik 19 kapanıyor </sup&gt; tam gelişmiş C kas protein sentezinde değişiklikler incelemek isteyen zaman, diğer yöntemler kullanılması gerektiği kas elegans; Örneğin, buradaki dengeli veya radyoaktif izotop yöntemleri.

Kas iyi hareket, duruş desteği ve metabolizmasındaki rolü için takdir çok fonksiyonlu bir doku vardır. Sağlıklı kas gelişimi ve bakımı çok sayıda hücresel süreçleri ve bileşenlerinin koordinasyonunu gerektirir. Ya hasar veya hastalık nedeniyle, yanlış düzenlemenin değiştirilmiş kas yapısı ve / veya işlevi ile sonuçlanır oluşabilir. 1,2 kütle ve özellikle kas gücü ve dayanıklılığı 3-5 kas negatif mortalite ile ilişkilidir beri kas fonksiyonunda yaşa bağlı düşüş, batı dünyasında sağlık bütçelerine önemli bir yük sunuyor. Böyle değiştirilmiş mitokondriyal fonksiyon veya sarkomer bozulması gibi bozulan kas fonksiyonu ile ilgili yönleri, ölçüm genel kas gelişimi ve sağlığı destekleyen mekanizmaların daha iyi anlaşılmasını sağlayabilir. Cı aenorhabditis elegans (C. elegans), mikroskopik bir nematodu bes olduğuonun tüm genom 6 dizilimi ilk çok hücreli organizma, RNAi 7 kullanılarak susturulmuştur genlere sahip ilk ve ilk olarak önerilmiştir, tüm hücre soyu 8 ve nöroanatomi 9 belirlenmiştir. C. elegans için tek metazoon çünkü t bilinir Sydney Brenner 10 tarafından 1974 yılında davranışın genetik kontrolü ve bunun önemi ve sonraki çalışma çalışma için model C. elegans araştırmacılara verilen üç Nobel Ödüllerinin ilk tanındı. C yaklaşık% 35 genler C. elegans kas gelişimi 11 genetik kontrolünü anlamak için kullanılan bir anahtar organizma olmak, insanlarda ortologlara belirledik elegans. Neredeyse C. elegans genom her gen RNAİ&#39;nin 7,12 aşağı çaldı olabilir. Böylece, tam gelişmiş kas genleri aşağı vurma, genetik bileşenleri yeniden katkıdakas sağlığı gulation göreli basitliği 13 ile araştırılabilir. RNAi, mutantlar ve kimyasal bileşiklerin kullanılması kombine yeteneği C. 16 yaş ve hastalık modellerinde 17 kas yapısı ve fonksiyonu genetik düzenlenmesini 7,14,15 keşfetmek için bir öncü sistem elegans yapar. Kas yapısı ve / veya işlevi üzerine kimyasal bileşiklere gen demonte, mutasyonu ve / veya maruz kalma etkisi çok yönlü olarak yoluyla ölçülebilir. Burada kısaca kas sağlık prospektif çalışmalarda kullanılabilecek çok olan C. elegans kas yapısını ve işlevini değerlendirmek için basit teknikleri anlatıyor. Yeşil floresan protein geliştirme (GFP) 18 spesifik proteinlerin mevkiinde C. elegans organellerin genel yapısı, her iki görselleştirilmesini mümkün kılmıştır. Burada GFP speci ifade açıklaryöne- lik, gövde duvarı, kas mitokondri içinde, çekirdekler ya da sarkomer bu alt-hücresel yapıların distrofi mevcut olup olmadığını belirlemek için kullanılabilir. Yapısı her zaman fonksiyonu için güvenilir bir vekil değil, biz de in vivo katyonik boyaların kullanımı kas içinde bozulmuş mitokondrial membran potansiyelinin değerlendirilmesini sağlar açıklar. Boyalar GFP ile kombinasyon halinde kullanıldığı zaman, bunlar ömrü boyunca geçici bir şekilde mimari ve fonksiyon çalışma izin verir. Son olarak, aynı zamanda bu önlemlerin tüm hareket deneylerin kullanımı ile, bütün hayvanlar kas sağlığında değişiklikler belirlemek için kullanılabilir nasıl kas içinde protein homeostasisi değerlendirilebilir ve açıklar. Gen demonte, mutasyonları ve / veya kimyasal bileşikler ile birlikte bu teknikler, belirli bir gen ya da bileşikler, in vivo koşullarında, kas sağlığı üzerinde olumsuz etkileri ne çalışmak için güçlü bir cephanelik sağlar. C. elegans arasında yapısı, metabolizma ve kas brüt fonksiyonu paralelliklermemeliler C. elegans insanlar dahil yüksek organizmalarda, içinde kas düzenleme anlamak için olağanüstü bir model organizmadır demek.

<table><tbody><tr><td>MitoTracker Red CMXRos (C&lt;sub&gt;32&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;32&lt;/sub&gt;Cl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Invitrogen</td><td>M-7512</td><td>Red mitochondrial dye which accumulates based on a negative membrane potential</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Thermo Scientific</td><td>67-63-5</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>BDH</td><td>301584L</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M-7506</td><td></td></tr><tr><td>Microscopy Slides</td><td>Starfrost</td><td>K220</td><td></td></tr><tr><td>Microscopy Cover Slips</td><td>VW2 International</td><td>631-0124</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Eppendorph Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB74031</td><td></td></tr><tr><td>Dessicator</td><td>Nalgene</td><td>D2672</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Microscope</td><td>Nikon</td><td>H600L</td><td>Nikon H600L microscope with proprietary software</td></tr><tr><td>Nikon Camera</td><td>Nikon</td><td>DS-Fi1</td><td>Nikon Digital Sight DS-Fi1 digital camera&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Zeiss Microscope</td><td>Zeiss</td><td>Ax10</td><td>Zeiss AX10 microscope with an Axiocam MRC digital camera and Axiovision LE software and a triple-pass filter</td></tr><tr><td>Plates 9 cm</td><td>Starstedt</td><td>82-1473</td><td></td></tr><tr><td>Plates 6 cm</td><td>Gosselin</td><td>BP53-01</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Ferrocyanide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14459-95-1&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7786-30-3</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7601-54-9</td><td></td></tr><tr><td>5-Bromo-4-chloro-3-indolyl &amp;beta;-D-galactopyranoside</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7240-90-6&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N&lt;/em&gt;-dimethylformamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>68-12-2&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

methods to assess subcellular compartments of muscle in c. elegans

Kas beslenme, egzersiz ve hastalık durumundaki değişikliklerle yanıt dinamik bir dokudur. Yaşı ve kas kitlesi ve işlevi kaybı, önemli bir halk sağlığı yükler bulunmaktadır. Şu anda hastalık ya da yaşla birlikte kas sağlık genetik düzenlenmesi hakkında biraz anlıyorum. Nematod C. elegans, ilgi duyulan biyolojik süreçlerin genomik düzenleme anlamak için belirlenmiş bir modeldir. Bu solucan vücut duvarı kasları yüksek metazoon türlerinin kasları ile homoloji geniş ölçüde görüntüler. C. elegans şeffaf bir organizma olduğu için, mitokondri ve sarkomer GFP yerelleştirme in vivo bu yapıların görülmesini sağlar. Benzer şekilde, hayvanların bir mitokondriyal membran potansiyeli varlığına dayalı birikir katyonik boyalar, beslenme, in vivo mitokondriyal fonksiyonun değerlendirilmesini sağlar. Kas protein homeosta Bu yöntemler, hem de değerlendirmesis, kas performansı fonksiyonel önlemlerle alt-hücresel kusurlar arasında anlamlı bir ilişki sağlamak için, hareket deneyler şeklinde, bütün hayvanlar kas fonksiyonunun değerlendirilmesi ile birleştirilir. Böylece, C. elegans kas yapısı ve fonksiyonu üzerine mutasyonlar, gen demonte ve / veya kimyasal bileşiklerin etkisini değerlendirmek için güçlü bir platform sağlar. Son olarak, GFP, katyonik boyalar ve hareket deneyleri gibi değerlendirilir, non-invaziv, kas yapısı ve fonksiyonu prospektif çalışmalar tüm yaşam seyri boyunca yapılabilir ve şu anda bu kolayca başka bir organizmada in vivo araştırılması edilemez.

Hareket Tahliller Hareket Kusurları belirlememize Hareket düşüş C. mortalite iyi bir belirleyicisidir elegans 16 ile kas sinir sistemi ile ilgili sorunları gösteren oranları azalmıştır. Hareket değişiklikler, hareket deneyleri ile değerlendirildiği gibi, 23, belirli bir gen ya da ilaç tedavisi (Şekiller 3-5) karşı ya da mutant hayvanlarda 13 RNAi neden olabilir. Hareketin bir düşüş kompleks I, III, IV ya da V 24 kodlayan elektron taşıma genlerin aşağı gelişimsel vuruş örneğin aşağıdaki değiştirilmiş gelişmenin sonucu olabilir. Ayrıca, belirli müdahaleler sonrası gelişimsel fizyolojisi üzerinde etkisini araştırmak amacıyla sadece yetişkin C. elegans üzerinde test edilebilir. Örneğin, hayvan kodlayan unc-112, karşı RNAi ile işlemden geçirildi C ihtiva eden integrin lokalize kindlin-1 orthologue eleganskas bağlanma kompleksleri (Şekiller 3 ve 4) ya da gaz-1, elektron taşıma zinciri (Şekil 4) kompleks I bir bileşenini şifrelerken, 48-72 saat sonra-erişkinliğe kadar kontrol karşı hareket ilerleyen bir azalma gösterir. Bu kas fizyolojisi ile ilgili sorunlar göstergesi olabilir. Benzer bir şekilde, 24 ile ilgili bir hareket kaybı - 72 saat PI3K inhibitörü LY-294002 (Şekil 5) ile muamele normal olarak geliştirilmiş, yetişkin tedaviye tepki olarak görülmektedir. İkinci bir RNAi tedavi, mutasyon ya da bir başlangıç ​​müdahaleye karşılık olarak az hareket gösteren hayvanlarda hareketi geri bir ilacın etkisini test etmek de mümkündür. Örneğin, unc- 112 mutantlan dim-1 ila 13 ikinci bir mutasyon mevcudiyetinde zayıflatılmaktadır yabani tip hayvanlara kıyasla hareketinde ölçülebilir bir azalma gösterir. Bu nedenle, hareket deneyleri neuromuscu değiştirmek hem müdahaleleri tespit edebilirsinizlar geliştirme ve / veya fonksiyon yanı sıra geliştirmek ve / veya nöromusküler fonksiyonu geri olanları. Sarkomer bozulması Değerlendirilmesi Bir hareket kusur tespit ettikten sonra, bu hareket kusurun nedeni sinir, kas, ya da her ikisi mesafede olan problemler izah edilebilir olup olmadığını belirlemek için genellikle arzu edilir. Sarkomer üretimi ve hareket kuvveti böylece büzülmesini sağlar, kas gibi çok proteinli komplekslerdir. Kontraktil aparat lokalize miyosin GFP füzyon proteinlerini eksprese kullanılarak hayvanlar tarafından, miyosin filamentler ve sarkomer kesintileri ölçüde geliştirilmesi ve / veya yetişkinlikte de, ayrı ayrı hayvanlar nispeten non-invazif ve ileriye doğru görülmektedir. Yabani tip hayvanlar, her vücut duvarı kas içinde çoklu yeşil paralel düz çizgiler (Şekil 3) görünmesini dizilmiş sarkomer gösterilecek. Bu normal dizilerde için bozulma ile nispeten küçük olabilirparalel kalan yerine birleştirmek için görünen dizilmiş sarkomer. T unc-112 RNAi görülebilir Bu fenotip, = 24 saat ya da 48 saat (Şekil 3), memeli kas aktin bağlanma sitelerinin Z-hattı akış karşılaştırılabilir. Benzer şekilde, dizilerin küçük porsiyonlarda çökebilir ya da 48 saat ya da t = 72 saat (Şekil 3) = t unc-112 RNAİ&#39;nin ile tedavi gibi tamamen gibi kaybolabilir. Bir hareket kusuru görüntülemek hayvanların kas içinde sarkomer kusurların varlığı (Şekil 3) hareketi kusur için hesap yeterlidir ancak mutlaka bir müdahaleye tepki olarak kas, sinir ve / veya diğer dokuları ile diğer sorunları ekarte etmez . Mitokondriyal Ağı Yapısının Değerlendirilmesi Bir hareket kusur bulunması durumunda sebep veya hareket DE katkıda bulunabilecek diğer kusurlar için kas incelemek bazen arzu edilirfect. Mitokondri hücre enerjisinin büyük bir kısmını sağlar ve kas gelişiminin sağlanması için mevcut enerjiyi azaltır, indirgenmiş ATP karşılığının sonucu olabilir hareketi azalır. Böylece mitokondri yapısı anormallikleri için de incelenebilir. O hızlı mitokondriyal parçalanma neden olur gibi sodyumazid hayvanları uyuşturan için önemli değildir; Bu deneylerde hayvanlar kapak kayma tarafından uygulanan basınç ile hareketsizleştirildi. Vahşi-tip C. elegans içinde vücut duvarı kas, mitokondri organize ağları içinde (Şekil 4) bulunan ve mitokondri bir retikulum 25 olarak var ve fonksiyonu. Mitokondri ağının bozulması ağ (gaz-1 RNAi, Şekil 4B) 26 parçalanması olarak görülmektedir. Parçalanma organize ağlara no görünüş unc-112 RNAİ&#39;nin (Şekil 4B ve C) 13 ile muamele gibi kalır kadar şiddetli hale gelebilir. Wi gibisarkomer yapısında inci aksamalar, bir hareket kusuru görüntülemek hayvanlarda kas mitokondriyal yapısındaki kusurları hareket kusuru açıklamak için yeterli olabilir ama bu mutlaka kas, sinir ve / veya diğer dokuları ile diğer sorunları ekarte etmez. Örneğin, unc-112 mutantlar 13 ve tedavisi unc-112 RNAi (Şekil 3 ve 4) ekranındaki hem bozulur sarkomer ve mitokondriyal yapı bozulur. In Vivo Mitokondriyal Fonksiyon Değerlendirilmesi Mitokondriyal membran potansiyeli dolayısıyla, in vivo mitokondriyal membran potansiyeli değerlendirmek amacıyla yeteneğini proton itici gücü oluşturmak ve ATP 27 üretmek için mitokondri kapasitesini belirleyen ATP üretmek için o hayvanın kapasitesini gösterir. Mitokondriyal yapısal bozukluğa veya mitokondriyal fonksiyonel kapasitesini değiştirebilir olmayabilir gibi, desi olabilirayrılamaz değiştirilmiş mitokondriyal yapısını sergilemeye hayvanlarda mitokondriyal fonksiyonunu değerlendirmek için. Cı 32, H 32 CI2 N2 Ç zar potansiyeli bulunur ve mitokondri 28 (Şekil 4C) leke tüm hücre tiplerinde, ve, mitokondri ve burada birikir. Özellikle kas mitokondriyal fonksiyonunu değerlendirmek için, bir özel kas mitokondri (Şekil 4C) üzerine bir müdahalenin etkilerini göstermek C 32 H 32 N 2 O Cl 2 ve GFP etiketli kas mitokondri kullanabilirsiniz. Örneğin, unc-112 RNAİ&#39;nin mitokondriyal membran potansiyeli şu tedavi kaybı matrisi girerek H 32 Cl 2 N 2 O C 32 önler. Mitokondri Bu nedenle, çok az gösterirse, mitokondri GFP etiketleme (Şekil 4C) ek olarak mitokondri herhangi bir kırmızı boyama. Foto-ağartıcı ayrıca gözlemlenen doğrulamak için kullanılabilirmitokondri, özellikle kas (Şekil 4C) olanlardır. Düşük bir kapasite belirlenmesi ATP gözlenen hareket kusur için hesap yeterlidir ancak kas, sinir içinde diğer sorunları ekarte etmez üretmek ve / veya diğer dokular için. Azalmış ATP üretim kapasitesi insanlarda 29 ve 30 yaşlanma hastalık durumları ile ilişkili olduğundan olursa olsun, bir müdahaleye tepki olarak böyle bir kusurun tespiti ATP üretim kapasitesini artırmak ve bunların daha sonra olabilir bileşiklerin ve / veya RNAi tedaviler için tarama için bir platform sağlar Daha fazla terapötik potansiyeli araştırılmalıdır. Protein Parçalanabilirliklerinin Değerlendirilmesi Bir hareket kusur ve normal sarkomer ve mitokondri varlığında da neden olabilir veya hareket kusur katkıda bulunabilecek diğer kusurlar için kas incelemek için zaman zaman tercih edilir. Protein homeostazı korumak için yeteneği bir imza ne deMal sağlığı, protein sentezi ve / veya protein degradasyonu bir artışa azalma ise 31 yaşlanma ve bir çok hastalıkta 32,33 bir sonucudur. Bu yüzden değiştirilmiş protein homeostaz için bir hareket bozukluğu olan hayvanların kasları incelemek için arzu edilebilir. Bu sitosolik kas protein seviyelerinin değerlendirilmesi yoluyla gerçekleştirilebilir. Transgenik kodlanan proteinlerin, kas özel proteostasis değerlendirilmesine olanak sağlamaktadır. Örneğin, miyozin bir N-terminali kısmına kaynaşık β-galaktosidaz, ihtiva eden hayvan kullanımı, bir miyozin promoterin kontrolü altında sentezlenmiştir ve güçlendirici sitosolik kas protein içeriğinin 19 değerlendirilmesine olanak tanır. Vahşi tip yetişkin mavi leke varlığı aktif bir β-galaktosidaz varlığını ve patolojik sitosolik protein yıkımı yokluğunu gösterir. Tedaviye tepki olarak boyanmasının kaybı patolojik protein yıkımı (Şekil 5 olduğunu ortaya koymaktadır </strong&gt;), Β-galaktosidaz 72 sabit olduğu gibi - vahşi tip yetişkin 13,14,19 96 saat sonra erişkin. LY-249002 ile tedavi edilen hayvanlar bir leke kıtlığı ise Örneğin, tedavi edilmemiş vahşi tür hayvanlar, erişkin sonra (Şekil 5), yoğun bir mavi renk 72 saat gösterir. Sarkomer yapı ve mitokondriyal fonksiyon hatası olduğu gibi, ve de patolojik kas protein yıkımı varlığı gözlemlenen hareket kusur hesaplamak için yeterli olan fakat zorunlu kas, sinir, ve / veya diğer dokuları ile diğer sorunları ortadan kaldırmaz. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52043/52043fig3highres.jpg" width="600" /> Şekil 3: (A). Unc-112 RNAi t = 72 saat de önemli bir hareket kusuru olur vücut duvarı kas içinde dizilmiş A-band yapısının (B) Değerlendirme. Ağırlık olarakt, kas A-bantlar (wt zoom bakınız) genç yetişkinlik (t = 0 saat) olarak düz çizgiler görünür ve yetişkinlik 72 saat kadar ötesinde büyük ölçüde homojen kalır. unc-112 RNAi küçük alanlarda mimari kaybetmek sarkomer neden olur kas (t = 24 saat), çöktü ve eksik sarkomer (t = 48 saat), kümeleme (t = 72 saat üst panel ve zoom) ve sarkomer doğrusallık (t = 72 saat alt panel ve zoom) kaybı. Ölçek çubukları 25 mcM temsil ve yakınlaştırmalar 2.5X vardır. <img alt="Şekil 4," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52043/52043fig4highres.jpg" width="600" /> Şekil 4:. (A) 112-unc veya gaz-1 RNAi bir hareket kusuru neden vücut duvarı kas içinde mitokondriyal yapı (B) Değerlendirme. Kas mitokondri genç yetişkinlik (ağırlık) itibariyle ağ düz çizgiler olarak görünür. Unc-112 RNAi olan hayvanların tedavisi mitochondr sonuçlanırDaha önce 24 saat ve yetişkinlik (yakınlaştırır ve ok) 13 72 saat arasında gözlemlenen ial parçalanma. Aynı şekilde, gibi mitokondriyal ağların parçalanma RNAi gazına karşı -1 sonuçlar daha önce 26 gözlenmiştir. Bunlar 72 saat (zoom ve oka bakınız). Vivo mitokondriyal membran potansiyeli (C) Değerlendirilmesi için yaygın örgütsüzlük t = 24 saat ve ilerleme de mitokondriyal ağında küçük boşluklar olarak mevcuttur. Ayrıca GFP mitokondri lokalize içeren hayvanlarda, N 2 O C 32 H 32 Cl 2 vücut duvarı kas mitokondri içinde birikir ve 72 saat sonrası yetişkinliğe kadar genç yetişkinlik (t = 0 sa) bir üçlü-pass filtre altında turuncu renkte görülür. Kalan mitokondri N 2 O vs ağırlık Cl 2 H 32 C 32 daha az birikimini gösteriyor nerede 72 saatte gösterildiği gibi unc-112 RNAİ&#39;nin tedavisi membran potansiyeli ilerici kaybına neden olur. 10 se için Photobleachingc 540/25 nm ışık beyazlatıcılar MitoTracker gelen kırmızı kullanarak ve kas mitokondri (+ Fotoğraf ağartıcı) lokalize GFP ortaya koymaktadır. Ölçek çubukları 25 um temsil ve 2.5X olan yakınlaştırır. <img alt="Şekil 5," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52043/52043fig5highres.jpg" width="600" /> Şekil 5 (A) Tedavi LY-294002 hayvanlarla bir hareket bozukluğu oluşturan bir β-galaktosidaz deneyi kullanılarak protein yıkımı (B) değerlendirmesi.. L1 larvaların ağırlık senkronize Yaş OP50 (ağırlıkça kontrol) veya NGM ile seribaşı NGM aktarmadan önce 20 ° C (t = 0 saat) genç erişkinlik büyüdü 20 ° C&#39;de 24 saat boyunca LY-294002 (PI3K inhibitörü tedavisi) numaralı seribaşı . A&#39;da, yaklaşık 20-30 hayvan t = 0 saatte β-galaktosidaz aktivitesi (mavi) ile, 24 saat, 48 saat ve 72 saat sonra boyanır.

Watch this Scientific Journal Video about Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans at JoVE.com

C. elegans'ta Kasın Hücre Altı Bölmelerini Değerlendirme Yöntemleri | Biyoloji | Video

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

İskelet kası hareket etmek için gerekli olan ve bedenimizin ana protein deposudur. C. elegans içinde kas sağlık ölçüleri tanımlanmıştır. Kas yapısı ve fonksiyonu için Aday değişiklikler lokalize GFP ve katyonik boyalar kullanılarak değerlendirilir.

Yöntemler içinde Muscle hücrealtı Kompartmanları DeğerlendirecekÜSKÜP<em&gt; ° C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

methods-to-assess-subcellular-compartments-of-muscle-in-c-elegans

Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Human Biology

Musculoskeletal System

SCIENTISTS IN ACTION

16.5K Görüntüleme.  University of Nottingham.  İskelet kası hareket etmek için gerekli olan ve bedenimizin ana protein deposudur. C. elegans içinde kas sağlık ölçüleri tanımlanmıştır. Kas yapısı ve fonksiyonu için Aday değişiklikler lokalize GFP ve katyonik boyalar kullanılarak değerlendirilir. 

Video: Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for the targeted expression of genetically encoded calcium sensors. This protocol outlines the use of these sensors for the in vivo imaging of calcium dynamics in targeted cells, specifically the body wall muscles of the worms. By utilizing the co-expression of presynaptic channelrhodopsin, stimulation of acetylcholine release from excitatory motor neurons can be induced using blue light pulses, resulting in muscle depolarization and reproducible changes in cytoplasmic calcium levels. Two worm immobilization techniques are discussed with varying levels of difficulty. Comparison of these techniques demonstrates that both approaches preserve the physiology of the neuromuscular junction and allow for the reproducible quantification of calcium transients. By pairing optogenetics and functional calcium imaging, changes in postsynaptic calcium handling and homeostasis can be evaluated in a variety of mutant backgrounds. Data presented validates both immobilization techniques and specifically examines the roles of the C. elegans sarco(endo)plasmic reticular calcium ATPase and the calcium-activated BK potassium channel in the body wall muscle calcium regulation.

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

This method provides a way to couple optogenetics and genetically encoded calcium sensors to image baseline cytosolic calcium levels and changes in evoked calcium transients in the body wall muscles of the model organism C. elegans.

In Vivo Kalsiyum Görüntüleme C. elegans Vücut Duvar Kasları

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Biyokimya

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging

Multicellular tubes, fundamental units of all internal organs, are composed of polarized epithelial or endothelial cells, with apical membranes lining the lumen and basolateral membranes contacting each other and/or the extracellular matrix. How this distinctive membrane asymmetry is established and maintained during organ morphogenesis is still an unresolved question of cell biology. This protocol describes the C. elegans intestine as a&#160;model for the analysis of polarized membrane biogenesis during tube morphogenesis, with emphasis on apical membrane and lumen biogenesis. The C. elegans twenty-cell single-layered intestinal epithelium is arranged into a simple bilaterally symmetrical tube, permitting analysis on a single-cell level. Membrane polarization occurs concomitantly with polarized cell division and migration during early embryogenesis, but de novo polarized membrane biogenesis continues throughout larval growth, when cells no longer proliferate and move. The latter setting allows one to separate subcellular changes that simultaneously mediate these different polarizing processes, difficult to distinguish in most polarity models. Apical-, basolateral membrane-, junctional-, cytoskeletal- and endomembrane components can be labeled and tracked throughout development by GFP fusion proteins, or assessed by in situ antibody staining. Together with the organism&#39;s genetic versatility, the C. elegans intestine thus provides a unique in vivo model for the visual, developmental, and molecular genetic analysis of polarized membrane and tube biogenesis. The specific methods (all standard) described here include how to: label intestinal subcellular components by antibody staining; analyze genes involved in polarized membrane biogenesis by loss-of-function studies adapted to the typically essential tubulogenesis genes; assess polarity defects during different developmental stages; interpret phenotypes by epifluorescence, differential interference contrast (DIC) and confocal microscopy; quantify visual defects. This protocol can be adapted to analyze any of the often highly conserved molecules involved in epithelial polarity, membrane biogenesis, tube and lumen morphogenesis.

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analy

The transparent C. elegans intestine can serve as an "in vivo tissue chamber" for studying apicobasal membrane and lumen biogenesis at the single-cell and subcellular level during multicellular tubulogenesis. This protocol describes how to combine standard labeling, loss-of-function genetic/RNAi and microscopic approaches to dissect these processes on a molecular level.

C. elegans bağırsak olarak bir Model hücreler arası Lumen morfogenez ve In Vivo polarize membran Biyogenez tek hücre düzeyinde için: etiketleme antikor boyama, işlev RNAi kaybı çözümleme ve görüntüleme

Multicellular tubes, fundamental units of all internal organs, are composed of polarized epithelial or endothelial cells, with apical membranes lining the ...

Gelişim Biyolojisi

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

Caenorhabditis elegans is widely recognized for its central utility as a translational animal model to efficiently interrogate mechanisms and therapies of diverse human diseases. Worms are particularly well-suited for high-throughput genetic and drug screens to gain deeper insight into therapeutic targets and therapies by exploiting their fast development cycle, large brood size, short lifespan, microscopic transparency, low maintenance costs, robust suite of genomic tools, mutant repositories, and experimental methodologies to interrogate both in vivo and ex vivo physiology. Worm locomotor activity represents a particularly relevant phenotype that is frequently impaired in mitochondrial disease, which is highly heterogeneous in causes and manifestations but collectively shares an impaired capacity to produce cellular energy. While a suite of different methodologies may be used to interrogate worm behavior, these vary greatly in experimental costs, complexity, and utility for genomic or drug high-throughput screens. Here, the relative throughput, advantages, and limitations of 16 different activity analysis methodologies were compared that quantify nematode locomotion, thrashing, pharyngeal pumping, and/or chemotaxis in single worms or worm populations of C. elegans at different stages, ages, and experimental durations. Detailed protocols were demonstrated for two semi-automated methods to quantify nematode locomotor activity that represent novel applications of available software tools, namely, ZebraLab (a medium-throughput approach) and WormScan (a high-throughput approach). Data from applying these methods demonstrated similar degrees of reduced animal activity occurred at the L4 larval stage, and progressed in day 1 adults, in mitochondrial complex I disease (gas-1(fc21)) mutant worms relative to wild-type (N2 Bristol) C. elegans. This data validates the utility for these novel applications of using the ZebraLab or WormScan software tools to quantify worm locomotor activity efficiently and objectively, with variable capacity to support high-throughput drug screening on worm behavior in preclinical animal models of mitochondrial disease.

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

This study presents protocols for two semi-automated locomotor activity analysis approaches in C. elegans complex I disease gas-1(fc21) worms, namely, ZebraLab (a medium-throughput assay) and WormScan (a high-throughput assay) and provide comparative analysis among a wide array of research methods to quantify nematode behavior and integrated neuromuscular function.

Caenorhabditis elegans Mitokondriyal Hastalık Modellerinde Hayvan Aktivitesini Ölçmek için Deneysel Yöntemlerin Karşılaştırmalı Analizi

Caenorhabditis elegans is widely recognized for its central utility as a translational animal model to efficiently interrogate mechanisms and therapies of ...

Davranış

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Biyoloji

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed orientation. Here we describe methods to label, image, and analyze the microtubule dynamics and growth during the development and regeneration of touch neurons in C. elegans. Using genetically encoded fluorescent reporters of microtubule tips, we imaged the axonal microtubules. The local changes in microtubule behavior that initiates axon regeneration following axotomy can be quantified using this protocol. This assay is adaptable to other neurons and genetic backgrounds to investigate the regulation of microtubule dynamics in various cellular processes.

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

A protocol for imaging the dynamic microtubules in vivo using fluorescently labeled End binding protein has been presented. We described the methods to label, image, and analyze the dynamic microtubules in the Posterior lateral microtubule (PLM) neuron of C. elegans.

In vivo Caenorhabditis elegans Nöronlarında Mikrotübül Dinamiklerinin ve Oryantasyonunun Değerlendirilmesi

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed ...

Nörobilim

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a crucial component of intracellular signaling. The visualization of subcellular Ca2+ dynamics in vivo,&#160;where neurons can be studied in their native, intact circuitry, has proven technically challenging in complex nervous systems. The transparency and relatively simple nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans enable the cell-specific expression and in vivo visualization of fluorescent tags and indicators. Among these are fluorescent indicators that have been modified for use in the cytoplasm as well as various subcellular compartments, such as the mitochondria. This protocol enables non-ratiometric Ca2+ imaging in vivo with a subcellular resolution that permits the analysis of Ca2+ dynamics down to the level of individual dendritic spines and mitochondria. Here, two available genetically encoded indicators with different Ca2+ affinities are used to demonstrate the use of this protocol for measuring relative Ca2+ levels within the cytoplasm or mitochondrial matrix in a single pair of excitatory interneurons (AVA). Together with the genetic manipulations and longitudinal observations possible in C. elegans, this imaging protocol may be useful for answering questions regarding how Ca2+ handling regulates neuronal function and plasticity.

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

The current methods describe a non-ratiometric approach for high-resolution, sub-compartmental calcium imaging in vivo in Caenorhabditis elegans using readily available genetically encoded calcium indicators.

Nöronal Kalsiyum Kullanımının In Vivo Subsellüler Görüntülemesi

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans

In this protocol, a green fluorescence protein (GFP) fusion protein and 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining are used to track protein subcellular localization changes; in particular, a nuclear translocation under a heat stress condition. Proteins react correspondingly to external and internal signals. A common mechanism is to change its subcellular localization. This article describes a protocol to track protein localization that does not require an antibody, radioactive labeling, or a confocal microscope. In this article, GFP is used to tag the target protein EXL-1 in C. elegans, a member of the chloride intracellular channel proteins (CLICs) family, including mammalian CLIC4. An integrated translational exl-1::gfp transgenic line (with a promoter and a full gene sequence) was created by transformation and &#947;-radiation, and stably expresses the gene and gfp. Recent research showed that upon heat stress, not oxidative stress, EXL-1::GFP accumulates in the nucleus. Overlapping the GFP signal with both the nuclei structure and the DAPI signals confirms the EXL-1 subcellular localization changes under stress. This protocol presents two different fixation methods for DAPI staining: ethanol fixation and acetone fixation. The DAPI staining protocol presented in this article is fast and efficient and preserves both the GFP signal and the protein subcellular localization changes. This method only requires a fluorescence microscope with Nomarski, a FITC filter, and a DAPI filter. It is suitable for a small laboratory setting, undergraduate student research, high school student research, and biotechnology classrooms.

Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans

This protocol demonstrates how to track a protein nuclear translocation under heat stress by using a green fluorescence protein (GFP) fusion protein as a marker and 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining. The DAPI staining protocol is fast and preserves the GFP and protein subcellular localization signals.

Protein hücre altı yerelleştirme yeşil floresans Protein etiketleme ve 4', 6-Diamidino-2-phenylindole Caenorhabditis elegans içinde boyama tarafından tespit

In this protocol, a green fluorescence protein (GFP) fusion protein and 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining are used to track protein ...

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these mechanisms is to introduce mutations in candidate genes and qualitatively describe changes in the morphology of tissues and cellular organelles. However, qualitative descriptions may not capture subtle phenotypic differences, might misrepresent phenotypic variations across individuals in a population, and are frequently assessed subjectively. Here, quantitative approaches are described to study the morphology of tissues and organelles in the nematode Caenorhabditis elegans using laser scanning confocal microscopy combined with commercially available bio-image processing software. A quantitative analysis of phenotypes affecting synapse integrity (size and integrated fluorescence levels), muscle development (muscle cell size and myosin filament length), and mitochondrial morphology (circularity and size) was performed to understand the effects of genetic mutations on these cellular structures. These quantitative approaches are not limited to the applications described here, as they could readily be used to quantitatively assess the morphology of other tissues and organelles in the nematode, as well as in other model organisms.

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

This study outlines quantitative measurements of synaptic size and localization, muscle morphology, and mitochondrial shape in C. elegans using freely available image processing tools. This approach allows future studies in&#160;C. elegans&#160;to quantitatively compare the extent of tissue and organelle structural changes as a result of genetic mutations.

Caenorhabditis elegans hücresel yapıları ve organelle morfoloji eğitim için nicel yaklaşımlar

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these ...

Hand Dissection of Caenorhabditis elegans Intestines

Comprised of only 20 cells, the Caenorhabditis elegans intestine&#160;is the nexus of many life-supporting functions, including digestion, metabolism, aging, immunity, and environmental response. Critical interactions between the C. elegans host and its environment converge within the intestine, where gut microbiota concentrate. Therefore, the ability to isolate intestine tissue away from the rest of the worm is necessary to assess intestine-specific processes. This protocol describes a method for hand dissecting adult C. elegans intestines. The procedure can be performed in fluorescently labeled strains for ease or training purposes. Once the technique is perfected, intestines can be collected from unlabeled worms of any genotype. This microdissection approach allows for the simultaneous capture of host intestinal tissue and gut microbiota, a benefit to many microbiome studies. As such, downstream applications for the intestinal preparations generated by this protocol can include but are not limited to RNA isolation from intestinal cells and DNA isolation from captured microbiota. Overall, hand dissection of C. elegans intestines affords a simple and robust method to investigate critical aspects of intestine biology.

Hand Dissection of Caenorhabditis elegans Intestines

The present protocol describes a procedure for isolating intestines from adult Caenorhabditis elegans nematode worms by hand for input in genomics, proteomics, microbiome, or other assays.

Caenorhabditis elegans Bağırsaklarının El Diseksiyonu

Comprised of only 20 cells, the Caenorhabditis elegans intestine&#160;is the nexus of many life-supporting functions, including digestion, metabolism, ...

<meta charset="utf8"></head><body>C. elegans'ta Mitokondriyal Morfolojinin Analizi

Imaging and Quantifying Mitochondrial Morphology in C. elegans During Aging

Mitochondria, important cellular organelles found in most eukaryotic cells, are major sites of energy production through aerobic respiration. Beyond this well-known role as the 'cellular powerhouse,' mitochondria are also involved in many other essential cellular processes, including the regulation of cellular metabolism, proliferation, immune signaling, and hormonal signaling. Deterioration in mitochondrial function during aging or under mitochondrial stress is often characterized by distinct changes in mitochondrial morphology and volume. The nematode C. elegans is an ideal model for studying these changes due to its transparent body and short lifespan, which facilitate live microscopy throughout its lifetime. However, even within the C. elegans field, numerous transgenic constructs and methods for mitochondrial imaging are available, each with its own limitations. Here, single-copy, matrix-localized GFP constructs are presented as a robust and reliable method for imaging mitochondrial morphology in C. elegans. This study specifically focuses on experimentally controllable factors to minimize errors and reduce variability between replicates and across studies when performing mitochondrial imaging during the aging process. Additionally, mitoMAPR is recommended as a robust method to quantify changes in mitochondrial morphology across tissue types during aging.

<meta charset="utf8"></head><body>Yaşlanma Sırasında C. elegans'ta Mitokondriyal Morfolojinin Görüntülenmesi ve Ölçülmesi

This protocol provides a standardized approach for imaging mitochondrial morphology in multiple tissues of C. elegans during aging.

Yaşlanma Sırasında C. elegans'ta Mitokondriyal Morfolojinin Görüntülenmesi ve Ölçülmesi

Mitochondria, important cellular organelles found in most eukaryotic cells, are major sites of energy production through aerobic respiration. Beyond this ...

Yöntemler içinde Muscle hücrealtı Kompartmanları DeğerlendirecekÜSKÜP

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

In Vivo Kalsiyum Görüntüleme C. elegans Vücut Duvar Kasları

C. elegans bağırsak olarak bir Model hücreler arası Lumen morfogenez ve In Vivo polarize membran Biyogenez tek hücre düzeyinde için: etiketleme antikor boyama, işlev RNAi kaybı çözümleme ve görüntüleme

Caenorhabditis elegans Mitokondriyal Hastalık Modellerinde Hayvan Aktivitesini Ölçmek için Deneysel Yöntemlerin Karşılaştırmalı Analizi

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

In vivo Caenorhabditis elegans Nöronlarında Mikrotübül Dinamiklerinin ve Oryantasyonunun Değerlendirilmesi

Nöronal Kalsiyum Kullanımının In Vivo Subsellüler Görüntülemesi

Protein hücre altı yerelleştirme yeşil floresans Protein etiketleme ve 4', 6-Diamidino-2-phenylindole Caenorhabditis elegans içinde boyama tarafından tespit

Caenorhabditis elegans hücresel yapıları ve organelle morfoloji eğitim için nicel yaklaşımlar

Caenorhabditis elegans Bağırsaklarının El Diseksiyonu

Yaşlanma Sırasında C. elegans'ta Mitokondriyal Morfolojinin Görüntülenmesi ve Ölçülmesi