This work was supported by a grant from the US National Institutes of Health National Institute for Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (AR-054342) to NJS. CJG was funded by a Doctoral training studentship funded by the University of Nottingham. JJB was funded by an MRC Doctoral training award (J500495). The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.

1. suşlar, Kültür ve Mikroskopi <ol><li> C. elegans Kolu ve korumak suşları daha önce 19 nitelendirdi. Suşları Caenorhabditis Genetik Merkezi (CGC) edinilebilir. NOT: mitokondri ve çekirdekler lokalize GFP füzyon proteinleri ile bu deneylerde kullanılan suşlar CB5600 (o-8 (e1489) IV,; PMYO-3 :: Mtgfp) ı ccIs4251 (PMYO-3 :: Ngfp-lacZ) idi; Unc-; kontraktil aparat ve PD55 (ccIs55 (sup-7 (ST5) lokalize GFP füzyon proteinleri ile; PJ727 (unc-54 :: lacZ V jls01 (myo-3 :: GFP, rol-6 (su1006))) 54 :: lacZ sitoplazmada lokalize β-galaktosidaz füzyon proteinleri ile) v). </li><li> Daha önce diziden RNAi bakterileri kuşaklı RNAi deneyler 13 için tarif ve elde gibi komple RNAi&#39;nin deneyler Marc Vidal ve ark. 12 tarafından inşa ORF-RNAi kütüphane doğrulandı. </li><li> Ihtiva eden suşlar Konstrukt &lt;em&gt; ccis 4251, jls01 veya ccis 55 standart teknikler 20 kullanılarak. Sırasıyla, mitokondriyal ağ yapısı, miyozin örgüt veya proteostasis durumunu değerlendirmek için bir yük oluşturmak için bu transgenleri kullanın. Her hayvan isteniyorsa bu alt-hücre bölümlerinde birinde bakarak nerede bir mutant haline suşları çapraz. </li><li> PtdIns-3-kinaz inhibitörü kullanmak, LY-294002 (LY) olarak daha önce 21 nitelendirdi. Kısaca, kuru OP50-tohumlu NGM plakalar üzerine 160 uM&#39;lik bir nihai konsantrasyonda LY-294002 ekleyin. </li><li> Yaygın olarak, GFP-tabanlı deneyler için bir GFP filtresi ve Cl 2 N 2 O H 32 C 32 ile in vivo membran potansiyelinin değerlendirilmesi için aynı anda, kırmızı, yeşil ve mavi kanalların görüntüleme sağlayan bir üçlü-geçiş filtresi ile bir mikroskop kullanarak tüm görüntüleri yakalayın MitoTracker Kırmızı CMXRos olarak pazarlanan. Görüntü işleme yazılımı görüntü analizi ve şekil hazırlık yapınız. </li></ol><ol><li> Önce gerekli 1 gün, asgari bir M9 tampon yapmak - 22.04 mM KH 2 PO 4, 42,27 mM Na 2 HPO 4, 85,56 mMNaCl (nihai konsantrasyonlar), ve otoklav ile sterilize. Bir kez 45 ° C&#39;ye kadar soğutuldu, çökeltme 22 bilmek otoklav sonrası 1 mM&#39;ye MgSO 4 steril ekleyin. M9 50 ml tüpler içinde 4 ° C ve kana soğumaya bırakın. </li><li> Deney gününde, L1 larvalarının yüksek sayıda tek 9 cm&#39;lik plakasına 3 mi M9 tampon ekleyin. Bir açıyla plaka ile agar yüzeyine karşı M9 sıvı ve pipetleme aspire art arda plaka yıkanır. </li><li> Plakadan L1&#39;in yıkayın ve daha sonra bir pipet kullanarak 10 ml&#39;lik bir test tüpüne M9 aktarın. </li><li> Büyük yetişkin ve daha sonra larva hayvanlar test tüpünün dibine düşmesine izin 2.5 dakika bekletin ve daha küçük L1 hayvanlar t yakın kalırM9 tampon op. </li><li> Bir pipet kullanarak test tüpünde M9 ilk 500 ul çıkarın. Sonra diseksiyon kapsamında 500 ul OP50 numaralı seribaşı yeni NGM plaka M9 içeren L1 larvaları pipetle. </li><li> Tipik olarak, plaka başına ~ 200-300 L1 larva transfer hedefliyoruz. Gerekirse, OP50 besin kaynağı tüketilen önlemek için taze OP50 NGM plakalar üzerine hayvan almak, yetişkinlik günlük plakaları izlemek ve. Not: Bu, orijinal plaka üzerinde L1&#39;in sayısına bağlı olarak büyük ölçüde değişiklik gösterir, ancak bu genellikle P1000 pipet kullanarak M9 1-3 düşmesi. </li><li> Bireysel hayvanlarda prospektif çalışmalar istenirse hayvanlar yetişkinlik ulaştıktan sonra, seribaşı NGM plakaları ayrı ayrı hayvan almak. Transferi hayvanlar her 24-48 saatte larva hayvanlardan ayırmak için. </li></ol> 3. Hareket Tahliller 19 <ol><li> Deney başlamadan önce, 2 saat, asgari bir M9 bir 50 ml&#39;lik bir şişe çıkarın ve oda sıcaklığına dengelenmeye gelmeye bırakınerature. </li><li> Bir mikroskop lamı üzerine 50 ul M9 tampon içine tek bir yetişkin hayvan almak. </li><li> Bir sola ve bir sağa viraj, bir inme eşittir 10 sn, sol ve sağa vücut virajlı sayısını. </li><li> Bir ortalama alınır ulaşılabilen en az 5 ölçümleri elde edilen toplam vücut strok sayısı tekrarlayın. Dakika başına hareket hızını vermek için altı ile bu rakamları çarpın. </li><li> Bir pipet kullanarak, petri geri hayvan aktarın. Bu yöntem, C. elegan s tüm kullanım süreleri boyunca hareketin zamansal ölçüm sağlar. </li></ol><img alt="Şekil 1," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52043/52043fig1highres.jpg" width="600" /> Şekil 1: Hareket deneyleri. Solucanlar tamponu içine toplanmıştır sonra, bir sola doğru (A) ve bir doğru (B) eğilme tam bir hareketini elde etmek üzere birbirine eklenir(Inme). Mitokondriyal Ağları ve sarkomer 4. Görüntüleme Vücut Duvar Kasında <ol><li> Not: Aynı protokol, mitokondri ve sarkomer hem görüntüleme için de geçerlidir. </li><li> Onlar genç erişkinliğe ulaşması zaman önce (Bölüm 1) tanımlanmış ve 20 ° C&#39;de 48-60 saat süreyle büyüdükçe solucanlar eşitleyin. </li><li> Bir mikroskop lamı üzerinde 20 ul M9 tabaklardan alınarak 20 dişli (plaka temsilcisi) seçin. </li><li> Bir kapak kayma uygulayın ve 40X büyütmede bir GFP filtre (460-500 nm, mavi ışık uyarma) altında floresan mikroskop kullanılarak görüntüye geçin. </li></ol> 5. MitoTracker Kırmızı CMXRos ile İn Vivo Birikim Testi (C 32 H 32 Cl 2 N 2 O) kullanarak Potansiyel Membran değerlendirilmesi <ol><li> CB5600 (Bölüm 1), kasların mitokondri GFP ile etiketlenmiş tüm senkronize ve 20 ° C&#39;de 48-60 saat süreyle NGM içeren OP50 erken yetişkinliğe büyür. </li><li> 940,692 uM bir stok çözelti yapmak için Cı 32, H 32, Cl 2N 2 O 50 ug kana ul DMSO 100 ekleyin. </li><li> 940,692 mcM stok solüsyonu 1 ul alın ve 4.70 mcM (4,70346 mcM) çalışan bir çözüm oluşturmak için 199 ul M9 içine tekrar süspansiyon. C 32 H 32 Cl 2 N 2 O ışığa, çünkü kahverengi 1.5 ml tüpler bu hazırlayın. </li><li> Çözeltisi (20 ul bölüntüde başına 20 erişkin solucanlar) çalışan 4.70 mcM 20 ul alikotları hazırlayın. </li><li> Kahverengi 1.5 ml tüplere 4.70 mcM C 32 H 32 Cl 2 N 2 O 20 ul içine 20 yetişkin hayvan almak. 1 saat boyunca 20 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> 1 saat inkübasyonu takiben, 10 saniye boyunca 2000 xg&#39;de solucanlar, santrifüj içeren kahverengi 1.5 ml tüpler için 1 ml M9 ekleyin ve sonra süpernatant kaldırmak. Kalan 20 μ solucan pelet resuspending ve aktarmadan önce bu yıkama işlemi tekrarlayınl görüntüleme için bir slayta (solucanları içeren). </li><li> 40X büyütme aynı anda iki, kırmızı, mavi ve yeşil kanalları görselleştirme sağlayan bir üçlü geçiş filtresi kullanılarak mitokondri görüntüleri çekmek. Üçlü geçişli filtre kullanılarak görüntüleme turuncu gibi görünen mitokondri lokalize C 32 H 32 Cl 2 GFP ile N 2 O co-lokalizasyon gösterir. </li><li> Turuncu mitokondri bir görüntü alınmış olması, uzaklaştırılmalı filtreler maksimum ayarlarına ilişkin dalga boyu 540/25 nm ışık kullanılarak 10 sn için hayvan foto-ağartıcıdır. Bu mitokondri içindeki kırmızı çamaşır suyu ve kas mitokondrilerinde ko onaylamak için yalnız mitokondriyal GFP ortaya çıkaracaktır. </li></ol> C. elegans kas Protein Parçalanabilirliklerinin 6. Değerlendirilmesi <ol><li> NGM plakalar için senkronize PD55s (veya lacZ transgen ihtiva eden herhangi bir suş) OP50 (Kısım 1) ile tohumlandı. 2 de 48-60 saat boyunca genç yetişkinliğe kadar büyür0 ° C&#39;dir. </li><li> Bir mikroskop lamı üzerine 20 ul GKD 2 O içine 20 erişkin solucanlar almak. Denemek ve sadece solucan ve pick ile herhangi bir bakteri almak için dikkatli olun. Kalem mikroskop lamı etiketleyin. </li><li> 30 dakika kuru ve hayvanların kütikül çatlak için bir desikatöre yerleştirin. Mühür etrafında yağı ile desikatörde sıkı bir mühür sağlamak. </li><li> Kuruma kontrol diseksiyon kapsamı (Şekil 2) altında etkili olmuştur. </li><li> 3.5 dakika sonra slayt üzerinde aseton buharlaşmasına izin vermek için 15 dakika boyunca, oda sıcaklığında, bir kağıt havlu üzerine bir mikroskop lamı bırakmak için buz-soğuğu aseton içinde bir mikroskop lamı daldırın. Bu noktada da X-gal ve oksidasyon tampon çözülmesi ve oda sıcaklığına dengelenmesi sağlar. </li><li> Nazikçe homojen olmasını sağlamak için oksidasyon tamponu ve vorteks ul ile 100 ul 2 X-gal ekleyin. Bu X-gal / oksidasyon tampon usta karışımıdır. </li><li> O her X-gal / oksidasyon tampon ana karışımı 20 ul ekleyin20 solucan orijinaldeki alanı. Ana karışım tamamen tamamen bütün hayvanları kapsar sağlamak için bir diseksiyon kapsamında kontrol edin. Yavaşça hayvanlar kapsamında değildir nerede alanlar üzerinde ana karışımı taşımak için mikroskop lamı eğin. </li><li> 20 ° C de 1-2.5 saat süreyle bir nem odasında bir mikroskop lamı yerleştirin. Resim hayvanlar koyu mavi renk kontrol hayvanlarının vücut duvarı kasları içinde mevcuttur. Hayvanlar görüntülü olmalıdır belirlemek için bir diseksiyon kapsamında her 15 dakikada bir kontrol hayvanları değerlendirin. </li></ol><img alt="Şekil 2," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52043/52043fig2highres.jpg" width="600" /> Şekil 2: β-galaktosidaz tahlilleri kullanılarak kas protein yıkımı Değerlendirilmesi. AcZ transgen ihtiva eden (A) &#39;Hayvanlar, bir mikroskop slayt (B) 20 ul GKD 2 O Petri kaplarından toplanır. Hayvanlar kurutulmuş ve kırık olmak <strong&gt; (° C). Hayvanlar daha sonra aseton (D) &#39;de yıkanır. Aseton (E) X-gal / oksidasyon tamponu ana karışımı ilave edilir buharlaşır kez. Kontrol hayvanlarında, mavi renk gelişimi, bir koyu mavi renk hayvanlarda (L) uzunluğu boyunca elde edilene kadar zamanı t = 0 dakika boyunca (F) ile 15 dakikalık aralıklar (FL) değerlendirilir. Solucanlar Görüntüleri FL AE ve 8X de 2.5X büyütme alınır. C, D, F, G ve L yakınlaştırır orijinal büyütme 4X bulunmaktadır.

The authors have nothing to disclose.

Bu yöntemler, bir hareket bozukluğu neden olmak için yeterli olan alt-hücresel bozukluklarının belirlenmesi için hareket macrophysiology gelen kas keşfini sağlar. Kombine edildiğinde bu yöntemler kas ayrıntılı analizini sağlar. Kazanılan içgörü genel fizyoloji, patofizyoloji ve yaşlanma ilgilendirmeyen kas odaklı hipotezler ileri test sağlar. Hareket Tahliller Bir hareket kusur Normal konlar bir bozulma gösterir. Bu sinirlerin veya kas özgü olabilir veya çeşitli dokulardan arasında ortak olabilir. Tamamladıktan hareket testlerin en zor aşamaları nüfus ve / veya tedavinin temsilcisi olan solucanlar seçerek ve aynı zamanda deneyci M9 transfer üzerine hayvan zarar vermez garantiliyoruz. Bu hareketin bir temsilcisi ve doğru bir değerlendirme elde etmek için büyük bir örneklem büyüklüğü olması önemlidir. Yüksek kalem tahlil zamanÖrneğin etrant etkileri, sık sık mutantta görülmektedir, on hayvan bir örnek boyutu her hareket on kez değerlendirilen vahşi tip karşı istatistiksel olarak anlamlı fark için yeterlidir. Ancak, hareket deneyleri ve kültür C. elegans kolaylığı basitliği solucanlar yüzlerce hızlı kantitatif sonucu sağlamak amacıyla değerlendirilebilir anlamına gelir. Bir nüfusun yalnızca bir bölümünde mevcut görünür etkilerini tahlil zaman en çok etkilenen hayvanlarda defekt şiddeti yanı sıra etkilenmiş görünüyor nüfusun ne kadarının belirlemek önemlidir. Bu gibi durumlarda, hayvanların daha fazla sayıda etkilenen nüfus kısmı için çok az veri sağlamak üzere değerlendirilmelidir. Sıkça ilaç ve RNAi tedavileri hem nüfusun küçük bir bölümünde şiddetli hareketi kusurları üretecek. Bazı durumlarda Aff oranı artacak tedavisi ve ya da teslimat yöntemi dozunu arttırmakyansıtılmaktadır hayvan ve yürütülmesini doz tepki eğrileri, bir ilaç veya RNAi optimum yoğunluğunu belirlemek faydalı olabilir. Bu hareket, testin ikinci bir sınırlama solucan hareket değerlendirmek için manipüle olmasıdır. Bu nedenle, solucanlar hem uyarılmamış ve sıvı içinde aldı bir ozmotik basınç belli bir dereceye kadar tabi tutulmaktadır. Ozmotik basınç derecesi M9 veya Bu suya karşı tamponu 19 ile sınırlanabilir. Bu sınırlamalardan bazıları ImageJ 35 Piyasada mevcut izleme sistemleri 34 ya da ücretsiz eklentileri kullanarak plakalar üzerinde alışılmış hareketinin ölçülmesi ile hafifler. Bir hayvanın hareket hızını ölçme ömrü boyunca ölçülen ve bu yöntemin non-invaziv kas fonksiyonlarının prospektif ömür boyu çalışmalar için anahtar olabilir fonksiyonu değişiklikleri de dahil olmak üzere genel kas sağlığı ile ilgili önemli bilgiler sağlayabilir. Kontraktil Aparatı Görüntüleme &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; resim kasılma aparatı yapısı Burada kullanılan solucan suşu vücut duvarı kasları içinde sarkomer lokalize bir miyozin GFP füzyon proteinini ifade PJ727 36 oldu. Bu türün kullanımı, canlı hayvanlarda sarkomer yapısı görselleştirme sağlar. Yukarıda tarif edilen hareket tahliline benzer biçimde, sarkomer yapısını değerlendirmek GFP etiketli sarkomer kullanılmasının önemli bir avantajı, bu yöntem nispeten invazif olmayan ve bu nedenle ileriye ömrü boyunca, ayrı ayrı hayvanlar içinde sarkomer yapısını takip etmek için kullanılabilir olmasıdır. Bu yöntemle büyük zorluk görüntülü solucanlar zor iyi odaklanmış görüntüler elde etmek için yapar, yine hareketli nedenle hayatta ve olmasıdır. Çeşitli yöntemler hareketini azaltmak ve daha basit görüntüleme yapmak için kullanılabilir; Bu anestezi veya basınç, emme ya da yüksek viskoziteli bir çözeltinin kullanımı ile solucanlar ve immobilizasyon felç vardır. Hareketsizleştirme Bu yöntemlerin her biritirme kendisi kas fonksiyonunu değiştirir gibi bir sakıncası vardır. Bu nedenle, bu analiz uygun muamele edilmemiş kontroller dahil etmek çok önemlidir. Ayrıca, seçilen bir hareketsizleştirme yöntemi, üzerinde çalışılmakta olan bir soru için ne kadar yaygın olarak kullanılan bağlı olarak, bağlı hareketsizleştirme yöntemi ile ilgili sorunlara yol sonuçları değildir teyit etmek için hareketsizleştirme en az iki bağımsız yöntemler kullanılması mantıklı bir çözüm olabilir. Burada azaltılmış hareketini başlatmak için solucanın üzerine lamel basit bir baskı kullandık. Lamel yerleştirdikten sonra, lamel altında sıvı buharlaşır ve lamel sonuç genellikle bu kolay görüntüleme sağlayacak kadar az hareket üretmek için 2-5 dakika sürer, solucanlar üzerinde daha fazla baskı üretmeye başlayacak. Lamel sonunda, co sonra genellikle 10-15 dk aşırı basınca gelen patlamaya solucanlar neden yeterli artacak basıncı girmiştir yakından sonra solucanları izlemek için esastırverslip ek. Ek tampon solucanlar ezilme yaralanmaları önlemek için lamel kenarlarında bir pipet ucu yardımıyla eklenebilir. Eğer istenirse bu, kapak kayma altında hayvanların alınmasını engelleyen, ancak Tırnak cilası, kapak kayma kenarlarını kapatırlar ve buharlaşmasını önlemek için de kullanılabilir. Benzer bir şekilde, çözelti içindeki silikon boncuk kullanımı basınç miktarını solucanlar üzerinde lamel yerleri azaltmaya yardımcı olabilir. Sadece bir hareket kusuru için değerlendirilmesi gibi, bu etkinin penetransdır dikkate almak önemlidir. % 80-100 hayvanlar nüfus ekranın ≤20% bir etkiliyorsa 21-79% eksik ve düşük NGM plaka üzerinde bir fenotip göstermeyen eğer Penetransı yüksek kabul edilebilir. Çok penetrant etkiler için, daha küçük örneklem büyüklükleri sarkomer kusurları üzerinde önemli nicel veri üretmek için kullanılabilir. Etki ilaca yanıt olarak açık bir hareket bozukluğu ekran hayvan düşük penetrasyonun, seçim vardır durumlardaveya RNAi uygulama en çok etkilenen tedavi hayvanlarda sarkomer kusurları analiz edilmesinde yararlı olabilir. Ancak, hareket ve sub-hücresel yapısına tedavi etkisinin ölçüde aynı olduğunu zorunlu bir durum değildir. Bu nedenle, örneğin, 100 hayvanların geniş bir popülasyonda bu kusurların ölçüde incelemek için arzu edilebilir. Bu, popülasyonda kusur dağılımının anlaşılmasını sağlar. Ayrıca en ağır etkilenen hayvanlarda kusurun derecesini incelemek ve / veya sarkomer kusur ölçüde ve hareket kusuru derecesi arasındaki ilişkiyi incelemek için istenebilir. Potansiyel zorluklar bir yana, bu yöntem sarkomer yapısı değerlendirilirken, diğer yöntemlere göre daha hızlı ve kolaydır. Bu hız ve kolaylığı, ancak, önemli bir sınırlamaya tabi olduğu, GFP füzyon proteinleri içeren sarkomer bozulduğu sarkomer 37 ve bu nedenle değerlendirme ilave daha emek-yoğun yöntemler kullanılarak teyit edilmelidir tamamen normal değildir.Bu yöntemler, 39 lekeleme falloidin polarize ışığın 38 kullanımını, ve dolaylı immünoflüoresans 40 içerir. Bu yöntemler arasında, ancak polarize ışık nispeten invazif olmayan olduğu; Diğer yöntemler tespiti gerektiren ve bu nedenle, ayrı ayrı hayvanlar arasında ileriye dönük çalışmalarda kullanılamaz, bunun yerine, sadece, bu çalışmalardan elde edilen sonuçlar teyit kesit geçmek için kullanılabilir. Mitokondriyal Ağları Görüntüleme Mitokondriyal görüntüleme deneyleri için kullanılan solucan soyu, gövde duvarı kaslarda ve, mitokondri ve çekirdekler lokalize bir GFP β-galaktosidaz füzyon proteini lokalize bir GFP füzyon proteinini tanımlayan CB5600 7 idi. Görüntüleme sarkomer için PJ727 kullanımı ile olduğu gibi, bu soyun kullanımı canlı hayvanlarda mitokondriyal ağ yapısı görselleştirme sağlar. Bu nedenle, bu suş örneğin, indirgenmiş mitocho oluşabilir, dinamik değişiklikleri değerlendirmek için kullanılabilirndrial füzyon ve / veya artan mitokondriyal füzyon 41. Ayrıca görüntüleme sarkomer gibi, bu yöntemle büyük zorluk görüntülü solucanlar zor iyi odaklanmış görüntüler almak için yapma, hala canlı ve hareketli olmasıdır. Yukarıda daha detaylı olarak tartışıldığı gibi çeşitli yöntemler, hareketini azaltmak için kullanılabileceği halde, mitokondri indirgenmiş hareketinin endüklenmesi müdahaleler için özellikle hassas bir görünür. Örneğin, en yaygın mitokondriyal solunum zinciri anestezikler hedef bileşenleri kullanılır ve bu nedenle, normal mitokondriyal yapı ve fonksiyonu çalışmalarında dikkatle kullanılmalıdır edilir. En paralitik ajanlar daha az sinyal nöromüsküler kavşak ve kas fonksiyonel denervasyon geçmesine neden Benzer şekilde, çoğu paralitik ajanlar mitokondriyal parçalanma uyarmak için normal mitokondriyal yapısı ve fonksiyonu çalışmaları dikkatle yeterlidir kullanılmalıdır. Bu çalışmada deneyler hayvan hareketsiz kılınması için baskı istihdamhemen görüntü hayvanlara gerekli olsa ler ama diğerleri başarıyla levamizolün 42 kullandık. Son olarak, örneğin, B. subtilis için kültür çeşitli bakteryel kirletici maddeler arasında, mitokondriyal parçalanma uyarabilir; bu nedenle analizinde uygun muamele edilmemiş kontroller dahil etmek çok önemlidir. Çok penetrant etkiler için, daha küçük örneklem büyüklükleri mitokondriyal ağ kusurları üzerinde önemli nicel veri üretmek için kullanılabilir. Bununla birlikte, mitokondriyal ağ küçük kusurlar yaygınlığı nedeniyle, bu hayvan az sayıda sarkomer yapısının değerlendirmesi için gereken iki kat fazla olması muhtemeldir. Etkisi düşük bir penetrasyonun sahip olduğu durumlarda, açık bir şekilde ilaç veya RNAi tedaviye yanıt olarak bir hareket bozukluğu gösteren hayvanların seçimi çoğu tedavi etkilenen hayvanların mitokondriyal kusurları analiz edilmesinde yararlı olabilir. Ancak yukarıda belirtildiği gibi, bu durum zorunlu değildirhareket ve sub-hücresel yapısına tedavi etkisinin ölçüde aynıdır. Bu nedenle, örneğin, 150-200 hayvanları, hem de en ağır enfekte olmuş hayvanların, bozulma derecesi ve kapsamı ile birlikte bozulma ölçüde varlığını veya yokluğunu geniş bir popülasyonda bu kusurların ölçüde incelemek için istenebilecektir hareket kusuru. Floresan etiketli mitokondri başka suşlar da CB5600 elde edilen sonuçları teyid etmek için kullanılabilir, ancak, farklı floresan proteinlerin kullanımı mitokondri taban ağ etkileyebilir. Örneğin, mitokondri görselleştirmek için bir tomm-20 TTT füzyon proteinin kullanımı ile mitokondriyal lokalize GFP 17 kullanımına karşı taban mitokondriyal parçalanma artmasına neden görünmektedir. Bu tür bağışıklık ve elektron mikroskopi gibi diğer yöntemler mitokondriyal yapısını değerlendirmek için kullanılabilecek olmakla birlikte, bir katılaştırma basamağı gerektirir çünkü onlar mitokondriyal dinamikleri in vivo değerlendirme izin vermezd. Gibi mitokondriyal lokalize boyaların kullanılması gibi başka yöntemler tespit olmadan da kullanılabilir ve bu nedenle, aynı zamanda mitokondriyal lokalize GFP kullanım yerine kullanılabilir. Bir sonraki bölümde tartışıldığı gibi, bu tür boyaların kullanımı, aynı zamanda in vivo olarak mitokondriyal fonksiyonun ham değerlendirilmesine olanak sağlamaktadır. C. elegans In Vivo Mitokondriyal Membran Potansiyelini Değerlendirme Boyaların çeşitli etiketleme mitokondri 28 için kullanılabilir. Bu boyalar, canlı C. elegans içinde mitokondriyal ağ yapısı görselleştirmek için alternatif bir yöntem sağlar. Onlar mitokondriyal membran potansiyeli dayalı mitokondri içinde birikir, çünkü bu boyaların çoğu aynı zamanda in vivo mitokondriyal işlevsellik ham değerlendirmesini sağlar. Yoluyla yutulur Burada biz kullandık C 32 H 32 Cl 2 N 2 OBazı ek nedeniyle% 0.5 DMSO içinde çözülerek elde geçirgenliği üst deri yoluyla solucan girerek sindirim sistemi. Hücrenin C 32 H 32 Cl 2 N 2 O içine girmesinin ardından oksitlenmiş ve amino asitler (örn metiyonin ve sistein) sülfür içeren bağlar mitokondri tarafından tecrit edilir. Bu boya-peptid komplekslerinin oluşumu, H 32 CI2 N2 O kez 28 etiketli mitokondri kalır Cı 32 anlamına gelir. Mitokondriyal boya maddelerinin kullanılması ile önemli bir zorluk ve hayvanın tüm mitokondri etiket olmasıdır. Bu nedenle CB5600, kas mitokondriyal ağ yapısı değerlendirilmesi için, yukarıda tarif edilen aynı suşunda etiketleme gerçekleştirdik. Kırmızı mitokondriyal boya, kas mitokondrilerinde, GFP ifade solucanlar bir yük ve üç geçişli bir filtre kullanarak, görüntü olan mitokondri O bularak kas sadece mitokondri nispeten basittirkırmızı boya ve GFP etiketli mitokondri ko tarafından aralığı. Boya fotoğraf ağartılmış yüksek yoğunluklu floresan ışığı altında saniye içinde olduğundan bu ko yaklaşımı yapılmasında en zor adım görüntüleme olduğunu. Bu etki deneyi görüntü hazır oluncaya kadar düşük güç floresan tutulması ve daha sonra buna göre floresans yoğunluğu ayarlanarak sınırlanabilir. Bir boya maddelerinin kullanılması ile tecrübe sonra başka bir yaklaşımı, doğru doku görüntü yalnızca mitokondrilerde Z-bacalara konfokal mikroskopi kullanmaktır; kas mitokondriyal şebekeler diğer dokulara kıyasla oldukça farklıdır. Ne yazık ki, mitokondri 28 terk C 32 yetersizlik, H 32 CI2 N2 O sarkomer ve mitokondriyal görüntüleme teknikleri, yukarıda tartışılan farklı olarak, ileriye yönelik olarak, H, 32 derecede 32 sürece, zamanla mitokondriyal fonksiyonun kaybı takip kullanılamaz anlamına gelir CI2 N2 OHayvan popülasyonlarının ayrı ayrı zaman noktalarında ilave edilir. Bu sınırlama gibi 43 potansiyel membranın yıkılmasından sonra mitokondri terk ediyor JC-10 gibi boyalar kullanılarak aşılabilir. Mitokondri, aynı zamanda C ile izole edilebilir sonraki biyokimyasal analizler için elegans 30. Bu ekstre, akış sitometrisi kullanılarak lipofilik katiyonik boya alımı veya bir fluoresan plaka okuyucusu 44 oranını nicelleştirilmesiyle mitokondriyal membran potansiyelinin ölçümü sağlar. Bozulmuş mitokondriyal membran potansiyelinin kurulmuş olması, proton degrade kaybı hassas bioluminometric lusiferaz tabanlı bir metot kullanılarak 45 ATP üretimi kaybı anlamına olmadığını belirlemek de mümkündür. C. Protein Parçalanabilme değerlendirilmesi elegans Kas protein parçalanmasını değerlendirmek için burada kullanılan solucan türü, bir kas belirli bir β içeren PD55 olduyetişkinlik ulaştı ve sonraki 72-96 saat 19 sitosolde stabil kaldığı kadar galaktosidaz olduğunu sürekli gelişimi boyunca sentezlenir. Yetişkinlik döneminde β-galaktosidaz kaybı müdahale sitosolik protein degradasyonunu 19 artmıştır tetiklendi gösterir ise Bu durumda, gelişme sırasında β-galaktosidaz seviyeleri ölçümü ağırlıklı miyozin yükselticiden sentezi üzerindeki müdahalelerin etkisini gösterir. Β-galaktosidaz aktivitesini belirlemede önemli safhalı ve etkili bir kurumaya sağlamaktır. Etkin hayvanlar kurutulması için başarısızlık hayvanların vücut duvarı kasları X-gal alt-tabaka ve bu nedenle zayıf mavi rengin zayıf sağlanması ile sonuçlanır. Desikatörde üzerindeki mühür kontrol edilmeli ve örnek ilerlemeyi değerlendirmek üzere kuruma boyunca 5-10 dk aralıklarla kontrol edilmelidir iyi kuruma sağlamak için (yani, 20 ul numune 10 dakika ve kalan 20 dakika içinde kurutulmuş olmalıdır) kapsamlı kurumaya sağlamaktır. Β-galaktosidaz deneyi bir aktivite deneyi, bu nedenle, uygun bir kontrol kaçınılmazdır. Buna ek olarak, bu bozunma meydana ispat olmayan kontrol etmek için bir işlem koşulu, göreceli olarak yetişkin azaltılmış lekeleme sağlar; bunun yerine tedaviye tepki olarak enzimatik aktivitesi azalma gösterir. Bozulmayı teyit etmek için, daha fazla emek-yoğun Western Blot analizi β-galaktosıdaz 13 karşı tamamlandı ve bu sayılan solucanlar küçük popülasyonlarında miktar protein parçalanmasını sağlar edilmelidir. Western Blot bant yoğunlukları ImageJ 46 kullanılarak belirlenebilir. Bu yöntemin diğer bir sınırlama transjenik proteinlerin kullanımı bozulmasının fizyolojik hedefleri olarak ve proteomik ve / veya hedeflenen hipotez tahrik western blotları 13 kullanılması gerekmektedir Bu tür yanıtlar için bilgi olmamasıdır. Son olarak, bu çalışmalarda transgenik protein sentezi gibi erken yetişkinlik 19 kapanıyor </sup&gt; tam gelişmiş C kas protein sentezinde değişiklikler incelemek isteyen zaman, diğer yöntemler kullanılması gerektiği kas elegans; Örneğin, buradaki dengeli veya radyoaktif izotop yöntemleri.

Kas iyi hareket, duruş desteği ve metabolizmasındaki rolü için takdir çok fonksiyonlu bir doku vardır. Sağlıklı kas gelişimi ve bakımı çok sayıda hücresel süreçleri ve bileşenlerinin koordinasyonunu gerektirir. Ya hasar veya hastalık nedeniyle, yanlış düzenlemenin değiştirilmiş kas yapısı ve / veya işlevi ile sonuçlanır oluşabilir. 1,2 kütle ve özellikle kas gücü ve dayanıklılığı 3-5 kas negatif mortalite ile ilişkilidir beri kas fonksiyonunda yaşa bağlı düşüş, batı dünyasında sağlık bütçelerine önemli bir yük sunuyor. Böyle değiştirilmiş mitokondriyal fonksiyon veya sarkomer bozulması gibi bozulan kas fonksiyonu ile ilgili yönleri, ölçüm genel kas gelişimi ve sağlığı destekleyen mekanizmaların daha iyi anlaşılmasını sağlayabilir. Cı aenorhabditis elegans (C. elegans), mikroskopik bir nematodu bes olduğuonun tüm genom 6 dizilimi ilk çok hücreli organizma, RNAi 7 kullanılarak susturulmuştur genlere sahip ilk ve ilk olarak önerilmiştir, tüm hücre soyu 8 ve nöroanatomi 9 belirlenmiştir. C. elegans için tek metazoon çünkü t bilinir Sydney Brenner 10 tarafından 1974 yılında davranışın genetik kontrolü ve bunun önemi ve sonraki çalışma çalışma için model C. elegans araştırmacılara verilen üç Nobel Ödüllerinin ilk tanındı. C yaklaşık% 35 genler C. elegans kas gelişimi 11 genetik kontrolünü anlamak için kullanılan bir anahtar organizma olmak, insanlarda ortologlara belirledik elegans. Neredeyse C. elegans genom her gen RNAİ&#39;nin 7,12 aşağı çaldı olabilir. Böylece, tam gelişmiş kas genleri aşağı vurma, genetik bileşenleri yeniden katkıdakas sağlığı gulation göreli basitliği 13 ile araştırılabilir. RNAi, mutantlar ve kimyasal bileşiklerin kullanılması kombine yeteneği C. 16 yaş ve hastalık modellerinde 17 kas yapısı ve fonksiyonu genetik düzenlenmesini 7,14,15 keşfetmek için bir öncü sistem elegans yapar. Kas yapısı ve / veya işlevi üzerine kimyasal bileşiklere gen demonte, mutasyonu ve / veya maruz kalma etkisi çok yönlü olarak yoluyla ölçülebilir. Burada kısaca kas sağlık prospektif çalışmalarda kullanılabilecek çok olan C. elegans kas yapısını ve işlevini değerlendirmek için basit teknikleri anlatıyor. Yeşil floresan protein geliştirme (GFP) 18 spesifik proteinlerin mevkiinde C. elegans organellerin genel yapısı, her iki görselleştirilmesini mümkün kılmıştır. Burada GFP speci ifade açıklaryöne- lik, gövde duvarı, kas mitokondri içinde, çekirdekler ya da sarkomer bu alt-hücresel yapıların distrofi mevcut olup olmadığını belirlemek için kullanılabilir. Yapısı her zaman fonksiyonu için güvenilir bir vekil değil, biz de in vivo katyonik boyaların kullanımı kas içinde bozulmuş mitokondrial membran potansiyelinin değerlendirilmesini sağlar açıklar. Boyalar GFP ile kombinasyon halinde kullanıldığı zaman, bunlar ömrü boyunca geçici bir şekilde mimari ve fonksiyon çalışma izin verir. Son olarak, aynı zamanda bu önlemlerin tüm hareket deneylerin kullanımı ile, bütün hayvanlar kas sağlığında değişiklikler belirlemek için kullanılabilir nasıl kas içinde protein homeostasisi değerlendirilebilir ve açıklar. Gen demonte, mutasyonları ve / veya kimyasal bileşikler ile birlikte bu teknikler, belirli bir gen ya da bileşikler, in vivo koşullarında, kas sağlığı üzerinde olumsuz etkileri ne çalışmak için güçlü bir cephanelik sağlar. C. elegans arasında yapısı, metabolizma ve kas brüt fonksiyonu paralelliklermemeliler C. elegans insanlar dahil yüksek organizmalarda, içinde kas düzenleme anlamak için olağanüstü bir model organizmadır demek.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="603">
	<tbody>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:195px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:103px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:187px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:195px;">MitoTracker Red CMXRos (C32H32Cl2N2O)</td>
			<td style="width:103px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">M-7512</td>
			<td style="width:187px;">Red mitochondrial dye which accumulates based on a negative membrane potential</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:195px;">DMSO</td>
			<td style="width:103px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">67-63-5</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:195px;">KH2 PO4</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">7778-77-0</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:195px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:103px;">BDH</td>
			<td style="width:119px;">301584L</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">NaCl</td>
			<td style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">7647-14-5</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:195px;">MgSO4</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M-7506</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">Microscopy Slides</td>
			<td style="width:103px;">Starfrost</td>
			<td style="width:119px;">K220</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Microscopy Cover Slips</td>
			<td style="width:103px;">VW2 International</td>
			<td style="width:119px;">631-0124</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">1.5ml Eppendorph Tubes</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB74031</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Dessicator</td>
			<td style="width:103px;">Nalgene</td>
			<td style="width:119px;">D2672</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:195px;">Nikon Microscope</td>
			<td style="width:103px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">H600L</td>
			<td style="width:187px;">Nikon H600L microscope with proprietary software</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:195px;">Nikon Camera</td>
			<td style="width:103px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">DS-Fi1</td>
			<td style="width:187px;">Nikon Digital Sight DS-Fi1 digital camera&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:195px;">Zeiss Microscope</td>
			<td style="width:103px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">Ax10</td>
			<td style="width:187px;">Zeiss AX10 microscope with an Axiocam MRC digital camera and Axiovision LE software and a triple-pass filter</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Plates 9cm</td>
			<td style="width:103px;">Starstedt</td>
			<td style="width:119px;">82-1473</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="42" rowspan="2" style="height:42px;width:195px;">Plates 6cm</td>
			<td rowspan="2" style="width:103px;">Gosselin</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">BP53-01</td>
			<td rowspan="2" style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="84" rowspan="3" style="height:84px;width:195px;">Potassium Ferrocyanide</td>
			<td rowspan="3" style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="3" style="width:119px;">14459-95-1&#160;</td>
			<td rowspan="3" style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:195px;">MgCl2</td>
			<td style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">7786-30-3</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="61" rowspan="3" style="height:61px;width:195px;">Na3PO4</td>
			<td rowspan="3" style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="3" style="width:119px;">7601-54-9</td>
			<td rowspan="3" style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="147" rowspan="3" style="height:147px;width:195px;">5-Bromo-4-chloro-3-indolyl &#946;-D-galactopyranoside</td>
			<td rowspan="3" style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="3" style="width:119px;">7240-90-6&#160;</td>
			<td rowspan="3" style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="84" rowspan="3" style="height:84px;width:195px;">N,N8-dimethylformamide</td>
			<td rowspan="3" style="width:103px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td rowspan="3" style="width:119px;">68-12-2&#160;</td>
			<td rowspan="3" style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to assess subcellular compartments of muscle in c. elegans

Kas beslenme, egzersiz ve hastalık durumundaki değişikliklerle yanıt dinamik bir dokudur. Yaşı ve kas kitlesi ve işlevi kaybı, önemli bir halk sağlığı yükler bulunmaktadır. Şu anda hastalık ya da yaşla birlikte kas sağlık genetik düzenlenmesi hakkında biraz anlıyorum. Nematod C. elegans, ilgi duyulan biyolojik süreçlerin genomik düzenleme anlamak için belirlenmiş bir modeldir. Bu solucan vücut duvarı kasları yüksek metazoon türlerinin kasları ile homoloji geniş ölçüde görüntüler. C. elegans şeffaf bir organizma olduğu için, mitokondri ve sarkomer GFP yerelleştirme in vivo bu yapıların görülmesini sağlar. Benzer şekilde, hayvanların bir mitokondriyal membran potansiyeli varlığına dayalı birikir katyonik boyalar, beslenme, in vivo mitokondriyal fonksiyonun değerlendirilmesini sağlar. Kas protein homeosta Bu yöntemler, hem de değerlendirmesis, kas performansı fonksiyonel önlemlerle alt-hücresel kusurlar arasında anlamlı bir ilişki sağlamak için, hareket deneyler şeklinde, bütün hayvanlar kas fonksiyonunun değerlendirilmesi ile birleştirilir. Böylece, C. elegans kas yapısı ve fonksiyonu üzerine mutasyonlar, gen demonte ve / veya kimyasal bileşiklerin etkisini değerlendirmek için güçlü bir platform sağlar. Son olarak, GFP, katyonik boyalar ve hareket deneyleri gibi değerlendirilir, non-invaziv, kas yapısı ve fonksiyonu prospektif çalışmalar tüm yaşam seyri boyunca yapılabilir ve şu anda bu kolayca başka bir organizmada in vivo araştırılması edilemez.

Hareket Tahliller Hareket Kusurları belirlememize Hareket düşüş C. mortalite iyi bir belirleyicisidir elegans 16 ile kas sinir sistemi ile ilgili sorunları gösteren oranları azalmıştır. Hareket değişiklikler, hareket deneyleri ile değerlendirildiği gibi, 23, belirli bir gen ya da ilaç tedavisi (Şekiller 3-5) karşı ya da mutant hayvanlarda 13 RNAi neden olabilir. Hareketin bir düşüş kompleks I, III, IV ya da V 24 kodlayan elektron taşıma genlerin aşağı gelişimsel vuruş örneğin aşağıdaki değiştirilmiş gelişmenin sonucu olabilir. Ayrıca, belirli müdahaleler sonrası gelişimsel fizyolojisi üzerinde etkisini araştırmak amacıyla sadece yetişkin C. elegans üzerinde test edilebilir. Örneğin, hayvan kodlayan unc-112, karşı RNAi ile işlemden geçirildi C ihtiva eden integrin lokalize kindlin-1 orthologue eleganskas bağlanma kompleksleri (Şekiller 3 ve 4) ya da gaz-1, elektron taşıma zinciri (Şekil 4) kompleks I bir bileşenini şifrelerken, 48-72 saat sonra-erişkinliğe kadar kontrol karşı hareket ilerleyen bir azalma gösterir. Bu kas fizyolojisi ile ilgili sorunlar göstergesi olabilir. Benzer bir şekilde, 24 ile ilgili bir hareket kaybı - 72 saat PI3K inhibitörü LY-294002 (Şekil 5) ile muamele normal olarak geliştirilmiş, yetişkin tedaviye tepki olarak görülmektedir. İkinci bir RNAi tedavi, mutasyon ya da bir başlangıç ​​müdahaleye karşılık olarak az hareket gösteren hayvanlarda hareketi geri bir ilacın etkisini test etmek de mümkündür. Örneğin, unc- 112 mutantlan dim-1 ila 13 ikinci bir mutasyon mevcudiyetinde zayıflatılmaktadır yabani tip hayvanlara kıyasla hareketinde ölçülebilir bir azalma gösterir. Bu nedenle, hareket deneyleri neuromuscu değiştirmek hem müdahaleleri tespit edebilirsinizlar geliştirme ve / veya fonksiyon yanı sıra geliştirmek ve / veya nöromusküler fonksiyonu geri olanları. Sarkomer bozulması Değerlendirilmesi Bir hareket kusur tespit ettikten sonra, bu hareket kusurun nedeni sinir, kas, ya da her ikisi mesafede olan problemler izah edilebilir olup olmadığını belirlemek için genellikle arzu edilir. Sarkomer üretimi ve hareket kuvveti böylece büzülmesini sağlar, kas gibi çok proteinli komplekslerdir. Kontraktil aparat lokalize miyosin GFP füzyon proteinlerini eksprese kullanılarak hayvanlar tarafından, miyosin filamentler ve sarkomer kesintileri ölçüde geliştirilmesi ve / veya yetişkinlikte de, ayrı ayrı hayvanlar nispeten non-invazif ve ileriye doğru görülmektedir. Yabani tip hayvanlar, her vücut duvarı kas içinde çoklu yeşil paralel düz çizgiler (Şekil 3) görünmesini dizilmiş sarkomer gösterilecek. Bu normal dizilerde için bozulma ile nispeten küçük olabilirparalel kalan yerine birleştirmek için görünen dizilmiş sarkomer. T unc-112 RNAi görülebilir Bu fenotip, = 24 saat ya da 48 saat (Şekil 3), memeli kas aktin bağlanma sitelerinin Z-hattı akış karşılaştırılabilir. Benzer şekilde, dizilerin küçük porsiyonlarda çökebilir ya da 48 saat ya da t = 72 saat (Şekil 3) = t unc-112 RNAİ&#39;nin ile tedavi gibi tamamen gibi kaybolabilir. Bir hareket kusuru görüntülemek hayvanların kas içinde sarkomer kusurların varlığı (Şekil 3) hareketi kusur için hesap yeterlidir ancak mutlaka bir müdahaleye tepki olarak kas, sinir ve / veya diğer dokuları ile diğer sorunları ekarte etmez . Mitokondriyal Ağı Yapısının Değerlendirilmesi Bir hareket kusur bulunması durumunda sebep veya hareket DE katkıda bulunabilecek diğer kusurlar için kas incelemek bazen arzu edilirfect. Mitokondri hücre enerjisinin büyük bir kısmını sağlar ve kas gelişiminin sağlanması için mevcut enerjiyi azaltır, indirgenmiş ATP karşılığının sonucu olabilir hareketi azalır. Böylece mitokondri yapısı anormallikleri için de incelenebilir. O hızlı mitokondriyal parçalanma neden olur gibi sodyumazid hayvanları uyuşturan için önemli değildir; Bu deneylerde hayvanlar kapak kayma tarafından uygulanan basınç ile hareketsizleştirildi. Vahşi-tip C. elegans içinde vücut duvarı kas, mitokondri organize ağları içinde (Şekil 4) bulunan ve mitokondri bir retikulum 25 olarak var ve fonksiyonu. Mitokondri ağının bozulması ağ (gaz-1 RNAi, Şekil 4B) 26 parçalanması olarak görülmektedir. Parçalanma organize ağlara no görünüş unc-112 RNAİ&#39;nin (Şekil 4B ve C) 13 ile muamele gibi kalır kadar şiddetli hale gelebilir. Wi gibisarkomer yapısında inci aksamalar, bir hareket kusuru görüntülemek hayvanlarda kas mitokondriyal yapısındaki kusurları hareket kusuru açıklamak için yeterli olabilir ama bu mutlaka kas, sinir ve / veya diğer dokuları ile diğer sorunları ekarte etmez. Örneğin, unc-112 mutantlar 13 ve tedavisi unc-112 RNAi (Şekil 3 ve 4) ekranındaki hem bozulur sarkomer ve mitokondriyal yapı bozulur. In Vivo Mitokondriyal Fonksiyon Değerlendirilmesi Mitokondriyal membran potansiyeli dolayısıyla, in vivo mitokondriyal membran potansiyeli değerlendirmek amacıyla yeteneğini proton itici gücü oluşturmak ve ATP 27 üretmek için mitokondri kapasitesini belirleyen ATP üretmek için o hayvanın kapasitesini gösterir. Mitokondriyal yapısal bozukluğa veya mitokondriyal fonksiyonel kapasitesini değiştirebilir olmayabilir gibi, desi olabilirayrılamaz değiştirilmiş mitokondriyal yapısını sergilemeye hayvanlarda mitokondriyal fonksiyonunu değerlendirmek için. Cı 32, H 32 CI2 N2 Ç zar potansiyeli bulunur ve mitokondri 28 (Şekil 4C) leke tüm hücre tiplerinde, ve, mitokondri ve burada birikir. Özellikle kas mitokondriyal fonksiyonunu değerlendirmek için, bir özel kas mitokondri (Şekil 4C) üzerine bir müdahalenin etkilerini göstermek C 32 H 32 N 2 O Cl 2 ve GFP etiketli kas mitokondri kullanabilirsiniz. Örneğin, unc-112 RNAİ&#39;nin mitokondriyal membran potansiyeli şu tedavi kaybı matrisi girerek H 32 Cl 2 N 2 O C 32 önler. Mitokondri Bu nedenle, çok az gösterirse, mitokondri GFP etiketleme (Şekil 4C) ek olarak mitokondri herhangi bir kırmızı boyama. Foto-ağartıcı ayrıca gözlemlenen doğrulamak için kullanılabilirmitokondri, özellikle kas (Şekil 4C) olanlardır. Düşük bir kapasite belirlenmesi ATP gözlenen hareket kusur için hesap yeterlidir ancak kas, sinir içinde diğer sorunları ekarte etmez üretmek ve / veya diğer dokular için. Azalmış ATP üretim kapasitesi insanlarda 29 ve 30 yaşlanma hastalık durumları ile ilişkili olduğundan olursa olsun, bir müdahaleye tepki olarak böyle bir kusurun tespiti ATP üretim kapasitesini artırmak ve bunların daha sonra olabilir bileşiklerin ve / veya RNAi tedaviler için tarama için bir platform sağlar Daha fazla terapötik potansiyeli araştırılmalıdır. Protein Parçalanabilirliklerinin Değerlendirilmesi Bir hareket kusur ve normal sarkomer ve mitokondri varlığında da neden olabilir veya hareket kusur katkıda bulunabilecek diğer kusurlar için kas incelemek için zaman zaman tercih edilir. Protein homeostazı korumak için yeteneği bir imza ne deMal sağlığı, protein sentezi ve / veya protein degradasyonu bir artışa azalma ise 31 yaşlanma ve bir çok hastalıkta 32,33 bir sonucudur. Bu yüzden değiştirilmiş protein homeostaz için bir hareket bozukluğu olan hayvanların kasları incelemek için arzu edilebilir. Bu sitosolik kas protein seviyelerinin değerlendirilmesi yoluyla gerçekleştirilebilir. Transgenik kodlanan proteinlerin, kas özel proteostasis değerlendirilmesine olanak sağlamaktadır. Örneğin, miyozin bir N-terminali kısmına kaynaşık β-galaktosidaz, ihtiva eden hayvan kullanımı, bir miyozin promoterin kontrolü altında sentezlenmiştir ve güçlendirici sitosolik kas protein içeriğinin 19 değerlendirilmesine olanak tanır. Vahşi tip yetişkin mavi leke varlığı aktif bir β-galaktosidaz varlığını ve patolojik sitosolik protein yıkımı yokluğunu gösterir. Tedaviye tepki olarak boyanmasının kaybı patolojik protein yıkımı (Şekil 5 olduğunu ortaya koymaktadır </strong&gt;), Β-galaktosidaz 72 sabit olduğu gibi - vahşi tip yetişkin 13,14,19 96 saat sonra erişkin. LY-249002 ile tedavi edilen hayvanlar bir leke kıtlığı ise Örneğin, tedavi edilmemiş vahşi tür hayvanlar, erişkin sonra (Şekil 5), yoğun bir mavi renk 72 saat gösterir. Sarkomer yapı ve mitokondriyal fonksiyon hatası olduğu gibi, ve de patolojik kas protein yıkımı varlığı gözlemlenen hareket kusur hesaplamak için yeterli olan fakat zorunlu kas, sinir, ve / veya diğer dokuları ile diğer sorunları ortadan kaldırmaz. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52043/52043fig3highres.jpg" width="600" /> Şekil 3: (A). Unc-112 RNAi t = 72 saat de önemli bir hareket kusuru olur vücut duvarı kas içinde dizilmiş A-band yapısının (B) Değerlendirme. Ağırlık olarakt, kas A-bantlar (wt zoom bakınız) genç yetişkinlik (t = 0 saat) olarak düz çizgiler görünür ve yetişkinlik 72 saat kadar ötesinde büyük ölçüde homojen kalır. unc-112 RNAi küçük alanlarda mimari kaybetmek sarkomer neden olur kas (t = 24 saat), çöktü ve eksik sarkomer (t = 48 saat), kümeleme (t = 72 saat üst panel ve zoom) ve sarkomer doğrusallık (t = 72 saat alt panel ve zoom) kaybı. Ölçek çubukları 25 mcM temsil ve yakınlaştırmalar 2.5X vardır. <img alt="Şekil 4," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52043/52043fig4highres.jpg" width="600" /> Şekil 4:. (A) 112-unc veya gaz-1 RNAi bir hareket kusuru neden vücut duvarı kas içinde mitokondriyal yapı (B) Değerlendirme. Kas mitokondri genç yetişkinlik (ağırlık) itibariyle ağ düz çizgiler olarak görünür. Unc-112 RNAi olan hayvanların tedavisi mitochondr sonuçlanırDaha önce 24 saat ve yetişkinlik (yakınlaştırır ve ok) 13 72 saat arasında gözlemlenen ial parçalanma. Aynı şekilde, gibi mitokondriyal ağların parçalanma RNAi gazına karşı -1 sonuçlar daha önce 26 gözlenmiştir. Bunlar 72 saat (zoom ve oka bakınız). Vivo mitokondriyal membran potansiyeli (C) Değerlendirilmesi için yaygın örgütsüzlük t = 24 saat ve ilerleme de mitokondriyal ağında küçük boşluklar olarak mevcuttur. Ayrıca GFP mitokondri lokalize içeren hayvanlarda, N 2 O C 32 H 32 Cl 2 vücut duvarı kas mitokondri içinde birikir ve 72 saat sonrası yetişkinliğe kadar genç yetişkinlik (t = 0 sa) bir üçlü-pass filtre altında turuncu renkte görülür. Kalan mitokondri N 2 O vs ağırlık Cl 2 H 32 C 32 daha az birikimini gösteriyor nerede 72 saatte gösterildiği gibi unc-112 RNAİ&#39;nin tedavisi membran potansiyeli ilerici kaybına neden olur. 10 se için Photobleachingc 540/25 nm ışık beyazlatıcılar MitoTracker gelen kırmızı kullanarak ve kas mitokondri (+ Fotoğraf ağartıcı) lokalize GFP ortaya koymaktadır. Ölçek çubukları 25 um temsil ve 2.5X olan yakınlaştırır. <img alt="Şekil 5," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52043/52043fig5highres.jpg" width="600" /> Şekil 5 (A) Tedavi LY-294002 hayvanlarla bir hareket bozukluğu oluşturan bir β-galaktosidaz deneyi kullanılarak protein yıkımı (B) değerlendirmesi.. L1 larvaların ağırlık senkronize Yaş OP50 (ağırlıkça kontrol) veya NGM ile seribaşı NGM aktarmadan önce 20 ° C (t = 0 saat) genç erişkinlik büyüdü 20 ° C&#39;de 24 saat boyunca LY-294002 (PI3K inhibitörü tedavisi) numaralı seribaşı . A&#39;da, yaklaşık 20-30 hayvan t = 0 saatte β-galaktosidaz aktivitesi (mavi) ile, 24 saat, 48 saat ve 72 saat sonra boyanır.

Watch this Scientific Journal Video about Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans at JoVE.com

C. elegans'ta Kasın Hücre Altı Bölmelerini Değerlendirme Yöntemleri | Biyoloji | Video

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

İskelet kası hareket etmek için gerekli olan ve bedenimizin ana protein deposudur. C. elegans içinde kas sağlık ölçüleri tanımlanmıştır. Kas yapısı ve fonksiyonu için Aday değişiklikler lokalize GFP ve katyonik boyalar kullanılarak değerlendirilir.

Yöntemler içinde Muscle hücrealtı Kompartmanları DeğerlendirecekÜSKÜP<em&gt; ° C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

methods-to-assess-subcellular-compartments-of-muscle-in-c-elegans

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Human Biology

Musculoskeletal System

SCIENTISTS IN ACTION

16.5K Görüntüleme.  University of Nottingham.  İskelet kası hareket etmek için gerekli olan ve bedenimizin ana protein deposudur. C. elegans içinde kas sağlık ölçüleri tanımlanmıştır. Kas yapısı ve fonksiyonu için Aday değişiklikler lokalize GFP ve katyonik boyalar kullanılarak değerlendirilir. 

Video: Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Mikroenjeksiyon Kararlı Transgenik C. elegans Üretimi

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Biyoloji

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

Transgenik, Üretimi C. elegans Biyolistik Dönüşüm

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

Içinde Postembryonic Fenotiplerin Belirleme RNAi Tarama C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Temel<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Yöntem: Senkronizasyon ve Gözlem

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, normal development or changes in environmental conditions2-5. Understanding the cellular signaling pathways that are involved in the response to hypoxia could provide new insight into treatment strategies for diverse human pathologies, from stroke to cancer. This goal has been impeded, at least in part, by technical difficulties associated with controlled hypoxic exposure in genetically amenable model organisms.
The nematode Caenorhabditis elegans is ideally suited as a model organism for the study of hypoxic response, as it is easy to culture and genetically manipulate. Moreover, it is possible to study cellular responses to specific hypoxic O2 concentrations without confounding effects since C. elegans obtain O2 (and other gasses) by diffusion, as opposed to a facilitated respiratory system6. Factors known to be involved in the response to hypoxia are conserved in C. elegans. The actual response to hypoxia depends on the specific concentration of O2 that is available. In C. elegans, exposure to moderate hypoxia elicits a transcriptional response mediated largely by hif-1, the highly-conserved hypoxia-inducible transcription factor6-9. C .elegans embryos require hif-1 to survive in 5,000-20,000 ppm O27,10. Hypoxia is a general term for "less than normal O2". Normoxia (normal O2) can also be difficult to define. We generally consider room air, which is 210,000 ppm O2 to be normoxia. However, it has been shown that C. elegans has a behavioral preference for O2 concentrations from 5-12% (50,000-120,000 ppm O2)11. In larvae and adults, hif-1 acts to prevent hypoxia-induced diapause in 5,000 ppm O212. However, hif-1 does not play a role in the response to lower concentrations of O2 (anoxia, operational definition &lt;10 ppm O2)13. In anoxia, C. elegans enters into a reversible state of suspended animation in which all microscopically observable activity ceases10. The fact that different physiological responses occur in different conditions highlights the importance of having experimental control over the hypoxic concentration of O2.
Here, we present a method for the construction and implementation of environmental chambers that produce reliable and reproducible hypoxic conditions with defined concentrations of O2. The continual flow method ensures rapid equilibration of the chamber and increases the stability of the system. Additionally, the transparency and accessibility of the chambers allow for direct visualization of animals being exposed to hypoxia. We further demonstrate an effective method of harvesting C. elegans samples rapidly after exposure to hypoxia, which is necessary to observe many of the rapidly-reversed changes that occur in hypoxia10,14. This method provides a basic foundation that can be easily modified for individual laboratory needs, including different model systems and a variety of gasses.

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

This paper details how to use continuous-flow hypoxia chambers to generate atmospheres with defined concentrations of O2 to understand biological responses to decreased O2. This system is easy to setup and maintain, and flexible enough to suit a wide range of O2 concentrations and model systems

Üzerine Hipoksi Etkileri Eğitim için tanımlı Gazlı ortamlar oluşturma<em&gt; C. elegans</em

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. elegans Kemotaksis Deneyi

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional measures of muscle health. In this video article, we demonstrate a method to measure force generation during contraction of zebrafish larval trunk muscle. Force measurements are accomplished by placing an anesthetized larva into a chamber filled with a salt solution. The anterior end of the larva is tied to a force transducer and the posterior end of the larva is tied to a length controller. An isometric twitch contraction is elicited by electric field stimulation and the force response is recorded for analysis. Force generation during contraction provides a measure of overall muscle health and specifically provides a measure of muscle function. Although we describe this technique for use with wild-type larvae, this method can be used with genetically modified larvae or with larvae treated with drugs or toxicants, to characterize muscle disease models and evaluate treatments, or to study muscle development, injury, or chemical toxicity.

Force measurements can be used to demonstrate changes in muscle function due to development, injury, disease, treatment or chemical toxicity. In this video, we demonstrate a method to measure force during a maximal contraction of zebrafish larval trunk muscle.

Zebra balığı Larva kas fonksiyonu değerlendirmek için daralma sırasında Kuvvet Ölçümü

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C. elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be bypassed by chemical or mechanical methods. "Freeze-cracking" is one method used to physically pull the cuticle from nematodes by compressing nematodes between two adherent slides, freezing them, and pulling the slides apart. Freeze-cracking provides a simple and rapid way to gain access to the tissues without chemical treatment and can be used with a variety of fixatives. However, it leads to the loss of many of the specimens and the required compression mechanically distorts the sample. Practice is required to maximize recovery of samples with good morphology. Freeze-cracking can be optimized for specific fixation conditions, recovery of samples, or low non-specific staining, but not for all parameters at once. For antibodies that require very hard fixation conditions and tolerate the chemical treatments needed to chemically permeabilize the cuticle, treatment of intact nematodes in solution may be preferred. If the antibody requires a lighter fix or if the optimum fixation conditions are unknown, freeze-cracking provides a very useful way to rapidly assay the antibody and can yield specific subcellular and cellular localization information for the antigen of interest.

Antibody Staining in C. Elegans Using "Freeze-Cracking"

"Freeze-cracking," a method for exposing the inner tissues of the nematode C. elegans to antibodies for protein localization, is demonstrated.

Antikor boyamasında<em&gt; C. Elegans</em&gt; &quot;Freeze-Cracking kullanma&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

Iskemi / reperfüzyon içinde bir anoksisi-açlık Modeli<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound responses and repair in this model have illuminated our understanding of the cytoskeletal and genomic responses to tissue damage. The two most commonly used methods to wound the C. elegans adult skin are pricks with microinjection needles, and local laser irradiation. Needle wounding locally disrupts the cuticle, epidermis, and associated extracellular matrix, and may also damage internal tissues. Laser irradiation results in more localized damage. Wounding triggers a succession of readily assayed responses including elevated epidermal Ca2+ (seconds-minutes), formation and closure of an actin-containing ring at the wound site (1-2 hr), elevated transcription of antimicrobial peptide genes (2-24 hr), and scar formation. Essentially all wild type adult animals survive wounding, whereas mutants defective in wound repair or other responses show decreased survival. Detailed protocols for needle and laser wounding, and assays for quantitation and visualization of wound responses and repair processes (Ca dynamics, actin dynamics, antimicrobial peptide induction, and survival) are presented.

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.

Içinde Yara Yanıtları Cilt yaralayarak Yöntemleri ve Testler<em&gt; ° C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...