Bu eser hibe # IOS-1025627 altında Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenen ve hibe kapsamında Ulusal Sağlık Enstitüleri # 1R21NS078582-01 tarafından ÇENE etmek edildi

Bu protokol, bir bakteriyel enfeksiyona maruz kalan sinek toplandı dört farklı okuma elde etmek için iki düzeneklerinin (Şekil 1) kullanır. 2) sağkalım sonuçları;; 3) sinek bakteri yükü ve 4) in vivo NFKB muhabiri aktivitesinin gerçek zamanlı ölçümü Bu çıkışlar) uyku / uyanıklık davranışları 1 içerir. Drosophila mevcuttur genetik araçları ile birlikte, bu ölçümler bağışıklık fonksiyonu ve davranışı arasındaki moleküler bağlantıyı içine mekanistik bakış açısı sağlar. 1. Sinekler Tedbir Lokomotor Aktivite ve Uyku <ol><li> Lokomotor aktivitesini ölçmek ve Drosophila etkinliği izleme sistemi (DAM2, Trikinetics), inkübatör, karanlık oda ve deney hayvanları ve aktivite tüplerin hazırlanması içeren, sinekler uyku için kullanılan kurulum, daha önce 6 tarif edilmiştir. Aynı yaklaşım, bazı küçük değişikliklerle, burada kullanılır. <ol class="lalpha"><li&gt; Kuluçka aydınlatma inkübatör kendisi tarafından kontrol edilir. Bu nedenle, bu bilgisayar ve kuluçka süresi ayarı arasında senkronize etmek için önemlidir. </li><li> Aktivite tüpler de-iyonize su bir sıcak plaka üzerinde kaynatarak yeniden kullanım için temizlenir. Deterjan küçük bir miktar ilk kaynama ilave edilir, tüp yanı sıra iki kere durulanmış ve daha kaynatılır. Iplik tüp takmak için kullanılması durumunda, ikinci faaliyet tüpler (gıda, balmumu, sinek ve iplik içeren) iplik çıkarma işleminden önce olmaksızın temizlenebilir. </li></ol></li><li> Önce bir deneme başlatmak için geç pupa içeren yer kültürleri deneysel aydınlatma ve diğer çevre koşullarına uyum sağlamak için üç dört gün için kuluçka sinekler düzenledi. Işık: koyu veya sabit koşullar sık ​​uykusu davranış ölçmek için kullanılmaktadır. Bu örnekte, sinekler immün yanıt ve davranış 2,7,8 ilgili sirkadiyen saat etkisini ortadan kaldırmak için sabit ışık acclimated edilmektedir. Şekil 1A açıklandığı gibi </strong&gt;, Trikinetics DAM2 faaliyet içine yük 1-4 gün eski sinek gibi enfeksiyon öncesi üç gün en az 6, ve kayıt açıklanan izler. </li></ol> 2. Bakteriler bir patojen ile Sinekler Infect <ol><li> Burada açıklanan protokol S. için spesifiktir büyümek ve bakımı kolay olan marcescens. Diğer bakteri türleri için uzun vadeli depolama ve kültür koşulları için Protokoller. S. değişir marcescens -80 ° C &#39;de% 15-50 gliserol depolanır 1,5 ml mikrosantrifüj tüpleri içinde otoklavlanmış% 50 gliserol 1 hacim - uzun vadeli depolama için hazırlamak için, bir gecede bakteri kültürü 2 cilt (1.0 OD 600 = 0.5) karıştırın. Bu,% 17 gliserol nihai konsantrasyon neden olur. -80 ° C&#39;de saklayın tüpleri Bakteri kaynağı kullanımı kısa vadeli hazırlamak için steril bir 200 ul pipet ucu ile dondurulmuş stok kazıyın ve LB agar plaka üzerinde üç yönlü bir çizgi gerçekleştirin. 37 &amp; d gecede plaka inkübeörneğin; C izole koloniler elde etmek. 4 ° C&#39;de depolayın plaka Planlanan enfeksiyondan önce bir gün, 5 ml LB ortamı içeren bir kültür tüpüne steril bir 200 ul pipet ve batığın ucuyla LB agar plaka tek bir koloni seçin. Bakteri gecede büyümek, ya kadar 37 küvöz çalkalayıcı içinde 16 saat ° C ve 250 rpm de üstel büyüme safhasına kadar. OD 600 bir spektrofotometre ile konsantrasyonunu ölçün. Bu aşamada yoğunluğu 0,5 ile 1 arasında değişir. Konsantrasyonu çok yüksek ise, alt kültür bakteri ve optimal bir konsantrasyon elde etmek için başka bir kaç saat için büyür. Bir alev kaynağının yakınında prosedürü uygulayın. Bazı bakteri suşları antibiyotik direnç için tasarlanmıştır ve büyümüş ve uygun bir antibiyotik için seçilen orta eklendi. S. marcescens (ATCC # 8100) antibiyotik dirençli değildir ve bu nedenle antibiyotik olmaksızın, steril ortamda yetiştirilen. Steril teknik doğrulamak için, bir aldatma cultu yapınkontrol olarak bakteri olmadan yeniden. Sinekler bulaştırmak için çözüm bakteriler (= 0,1 OD 600 seyreltilmiş) ve PBS içinde% 1 gıda boyası (Parlak Mavi FCF) içerir. PBS içinde enfeksiyon çözeltisi ve% 1 mavi renklendirici olarak kullanılan gıda LB ortamı eşdeğer miktarda eklenmesi ile enjeksiyon için bir kontrol çözeltisi hazırlayın. Buz üzerinde çözümler saklayın. </li><li> Sinekler enjekte için cam iğneler hazırlayın. Bir mikropipet çektirmesi (Narishige) kullanılarak ince bir ucu cam kapilerleri (od = 1 mm, id = 0.58 mm, TEFE) çekin. Diseksiyon mikroskobu altında açılış bir şırınga ile emme uygulanarak enjeksiyon sıvı ile doldurmak için yeterince büyük, ancak enjeksiyon işlemi sırasında sinek hasarı en aza indirmek için yeterli küçük olduğunu böylece iğne ucu kopmak ince forseps kullanın. Ucu kırdıktan sonra, ucu boyutu 40-50 mikron civarında olmalıdır. Iğne cam tüp bir uzunluğa sahip bir 3 cc plastik şırınga ile eklenmiştir. Enjeksiyon ortamının akış elle pozitif bir basınç uygulanması ya da s kontrol edilirşırınga ile uction. Şırınga cihaz ve enfeksiyon kontrol enjeksiyonlar için kullanılmış olduğu gibi, enjeksiyon sıvı ile kauçuk borudan yapılmış kirletici kaçının. </li><li> Bir CO 2 pad üzerinde koyarak sinekler uyuştur. CO 2 ped nemlendirmek için ve ped üzerinde uçan bir manipülasyon olarak gelişebilen statik elektrik, su azaltmak için bir kapalı kap içinden geçirilir. Dorsal toraks scutellum Yukarıdaki bölgeye cam iğne alay tarafından sinekler enjekte. Sinek içine enjeksiyon orta geçen gıda boyası ile de doğrulanmaktadır - sinekler sistemi yoluyla gıda boyası yayıldıkça maviye döner. Kısım 3 &#39;de tanımlanan sinekler almak bakteri doz altında, ölçülebilir. Bazı deneysel tasarımlar PBS ve gıda boyası ile ancak bakteri olmadan sinek enjekte edilerek aseptik yaralanma alan bir kontrol grubu yer almaktadır. </li></ol> 3. Bakteriyel Yük belirleyin Evaluatin için bir yaklaşımg bakteriyel enfeksiyona karşı bağışıklık yanıtı bakteri yük sonrası enfeksiyon belirlemektir. D. melanogaster bütün uçucu bir birey içinde toplam bakteri sayısını belirlemek için homojenize edilebilir, çünkü bu parametreleri belirlemek için bir çok iyi bir modeldir. Bu protokol arkasındaki mantık gibi Luria broth (LB) bir Petri kabı agar (LB plaka) olarak sağlam bir ortamda yetiştirilen zaman, tek bir bakterinin görünür ayırt koloni oluşturmasıdır. Bu nedenle, Homojenat seri dilüsyonları üreten ve LB plakaları üzerine seyreltilmiş homojenat yayma, LB sıvı ortam içinde enfekte sinekler homojenleştirici ile, bir uçucu enfekte bakteri hücrelerinin sayısını tespit edilebilir. PBS ve gıda boyası ile ancak bakteri olmadan enjekte sinekler bir kontrol grubu enfeksiyonu diğer bakteriyel türleri ile kontamine olmadığını doğrulamak için kullanılmalıdır. Bu durumda LB agar plakası üzerinde hiçbir koloni olmamalıdır. <ol><li> Bunun için kullanılacak olan malzemelerin otoklavGerçek homojenizasyon adımı gerçekleştirmeden önce prosedürü. Bu homojenizasyon için kullanılan makas, LB medya ve havan ile kesilmiş 200 ul pipet uçları içerir. Sinekler homojenleştirici önce en az 1 gün 10 cm steril Petri kutularına otoklavlanmış LB / agar besiyeri dökülerek tabak hazırlayın. </li><li> Anestezisi ve buz üzerinde 1,5 ml mikrosantrifüj tüpleri ve mağaza tüpler sinekler toplamak. </li><li> Kontaminasyonu önlemek için bir alev yakınında homojenizasyon gerçekleştirin. Böyle S. gibi bir bakterinin kullanırken özellikle enfeksiyon olmadan sinekleri içeren bir denetim homojenizasyon önerilir Antibiyotiğe dayanıklı değildir marcescens. 10 sinekler her başı deney koşulunda 2 grup en az homojenize. Homojenat başına kullanılan sineklerin sayısı deneyi ile belirlenir. Diğerleri Homojenat başına 3-10 sinekler kullanmış Bazı gruplar, bireysel sinekler 8 arasında bakteri yükü değişimi değerlendirmek için yararlı olduğu Homojenat başına bir sinek kullanmış9-12 genotip veya deneysel durum karşısında karşılaştırmaktır. <ol class="lalpha"><li> Sinekleri içeren her mikrosantrifüj tüp 400 ul LB ortamı ekleyin ve küçük bir motor ve havaneli (Kontes) kullanılarak homojenize. </li><li> Sterilize kesilmiş pipet uçları kullanarak, seri 180 ul LB ortamı içeren 1.5 ul mikrosantrifüj tüpe 20 ul homojenize LB / bakteriyel orta ekleyerek homojenat 01:10 sulandırmak. Pipet uçları Kesme anında enkaz tıkanmaları önler ve uygun bir ses aktarılıyor sağlar. </li><li> Seyreltme faktörü ampirik olarak belirlenir ve sinek genotip, kullanılan bakteri suşu ve deneysel koşula bağlıdır. Vahşi tip S. ile enfekte sinekler için marcescens, enfeksiyon sonrası hemen homojenize sinekler için 01:10 2 veya 1:10 3 dilüsyonları kullanmak ve sinekler için 01:10 4 veya 1:10 5 dilüsyonları 24 saat sonrası enfeksiyon homojenize. </li><li> Mikrofon 100 ul LB / bakteriyel orta Ekleve son seyreltme içeren rocentrifuge tüpleri eşit dağılımını sağlamak için cam bilyalar (VWR) kullanarak bir LB plaka üzerinde orta yayıldı. </li><li> % 100 EtOH solüsyonu içine cam topları atın. Bir gece boyunca 37 ° C inkübatör LB plakaları yerleştirin. </li><li> Isteğe bağlı bir adım olarak, LB plakaları (; Alpha Innotech FluorChem 8900) bir görüntü elde etmek için görsel ışık ile bir görüntüleme sistemi kullanın. Plaka kendisi ya da Photoshop yazılımı (Photoshop CS3) üzerinde sayım aracı kullanılarak levhanın görüntü ya da kolonilerini sayın. </li><li> Sayısı koloni oluşturan formül kullanılarak sinek başı üniteleri hesaplayın: [n / (N * D * v)] * V, n LB plaka üzerinde yetiştirilen koloni = sayı; N = sineklerin sayısı birinde toplanmış mikrosantrifüj tüp; D = seyreltme faktörü ve v Her plaka üzerine yayılmış çözüm = hacmi V Homojenat = başlangıç ​​hacmi. </li></ol></li></ol> 4. Enfeksiyon Sonrası Uyku ve Sağkalım Süresi Değerlendirin <ol><li> Içinbakteri yükü ölçmek için hasat değil sinekler, başka bir 7-10 gün davranışını izlemeye devam. Sağkalım süresi sinek, çevresel koşulların genotip etkilenmiştir ve bakteriyel türler enfeksiyon için kullanılır. </li><li> ~ 10 gün sonra, deney sona indirebilir ve daha önce 6 açıklandığı gibi davranışsal verileri işlemek. Matlab dayanır Insomniac2 özel yazılım, uyku parametrelerin analiz etmek için kullanılır. Bu davranış analizden ölü sinekler ortadan kaldırmak için önemlidir. Normal olarak, bu enfeksiyon ve uçucu genotip türüne bağlı olarak, enfeksiyondan sonra ilk gün içinde için analiz kısıtlar. Tahlil Ölüm tüm etkinlik sayıları sıfıra ulaşmış süresi belirtilir. Sağkalım analizi kolaylaştırmak için, Drosonex, Microsoft Visual yazılmış özel yazılım C + + 6.0, Trikinetics DAM sistemi ham veri dosyaları işlemek için kullanılır. Excel dosyaları, her bir sineğin sağkalım süresi (saat olarak), hem yazılım raporları aktivite dat derlertek bir elektronik tabloya tüm monitörleri bir ve yüzde uçar raporlar kullanıcı tarafından belirlenen zaman içinde hayatta. Excel dosyaları ayrıntılı analiz için diğer istatistik yazılım paketleri içine entegre etmek için tasarlanmıştır. </li></ol> 5. Bir Lusiferaz Reporter Assay kullanma Enfeksiyon sırasında NFKB Aktivite ölçün Transgenik KB&#39;yi-luc Bu tahlilde kullanılan önceden sinekleri gibi Kuo ve ark tarif elde edildi., 2010 2. Kısaca, kappa B-luc lusiferaz raportör bir açık okuma çerçevesinin üst akışında bir promotör içine yerleştirildi bir NFKB bağlayıcı sekans 8 tekrarlar içerir. <ol><li> Olarak bölüm 1.2 &#39;de açıklanan deney aydınlatma koşullarına sinekler ayarlayın. Bu örnekte, 1-4 günlük KB&#39;yi-luc kara sinekler,% 5 sukroz,% 2 agar gıda ve orta enfeksiyon sırasında diğer sinekler gibi aynı yaş ulaşmak için 2 gün boyunca sürekli ışık (LL) yerleştirilir ihtiva eden küçük şişeler içine yerleştirildi. </li><li> Sinekler için 96-çukurlu bir mikrolevhadaki hazırlayın. Her iyi gıda orta 2 kat (Şekil 2) içerir; üst tabaka luciferase, lusiferaz ve substrat içerir. % 5 sukroz, her oyuğa% 2 agar çözeltisi 300 ul ekle ve katılaşmasına izin verir. Daha sonra, her bir sıra içeren% 5 sukroz,% 1 agar, ve 2 mM lusiferin (Gold Biotechnology, Inc) ile bir 50 ul üst tabaka ekleyin. Drosophila ölçüm raportör etkinliği için kullanılan lusiferin konsantrasyonlarda literatürde değişiklik göstermektedir, ve 100 uM 13 gibi düşük olmuştur. Gerekli konsantrasyon ampirik olarak saptanabilir. Gıda katmanları dağıtım arasında, sterilite korurken kurutma kolaylaştırmak için ince örgü kumaş ile plaka kapağı. Plaka yoğunlaşma damlacıkları sıkışmış uçar önlemek için, bir saat kadar, iyice kurumasına izin verilmelidir. Luciferase ışığa duyarlı olduğundan, gereğinden fazla ışığa plakalar maruz bırakmayın. </li><li> Açık yapışkan film (En Uygula-Seal-A, Perkin Elmer) kuyu başına 2 adet delik bir miktarda ince bir iğne kullanılarak bir 96-gözlü mikro levha ve perfore. Bu delikler sadece her iyi hava değişimi izin vermez, aynı zamanda bireysel bazda sinekler uyutmak için bir yol sağlayacaktır. Keskin bir bıçak ve straight edge kullanarak, her sütun arasında bir kesim tanıtmak. Bu bir seferde yüklemek / 8 kişilik gruplar halinde sinekler boşaltmak için kolay bir yol sağlar. Mikro plaka içine sinekler yüklemek için, bir CO 2 pad üzerinde kuvöz ve uyutmak sinekler şişeleri çıkarın. Yük sütun-by-sütunu, her iyi bir-tek uçar. Genellikle müdahalesi olmadan kurtulmaları mümkün olduğu gibi bir yapıştırıcı mühür takılıp yanlışlıkla uçması gerektiğini, yalnız sinek bırakın. 8-24 saat yeni ortama alışması için ve luciferase substrat tüketmek için LL olarak inkübatör Mikro plaka dön. </li><li> Kültür bakteriler, S. marcescens, ve yukarıda tarif edildiği gibi enfeksiyon için bir solüsyon hazırlanır. </li><li> Anesteziyoloji to bir düşük basınçlı CO2 hattına bağlı bir mikropipet ucu kullanarak uçuyor. Doğrudan her kuyu için yapılan havalandırma delikleri yukarıda mikropipet ucu yerleştirin. CO 2 basınç sinek uyuşturan için yeterince yüksek, ama sinek yaralanmasını önlemek için yeterince düşük olduğundan emin olmak için dikkatli atın. Sekiz gruplar halinde, ayrı ayrı bir CO2 ped için her bir uçucu aktarmak ve yukarıda açıklandığı gibi enfekte. Enfeksiyon sonra, iyi orijinal her sinek dönmek ve mikroplak kapatın. </li><li> Tedbir lüminesans (TopCount-NXT Lüminesans ve Sintilasyon Sayıcı; Perkin-Elmer). TopCount lüminesans sayacı herhangi bir süre (genellikle en fazla beş gün) için istenilen aralıklarla sürekli olarak programlanmış ve otomatik okuma sağlayan plakalar için bir istifleme kaset içerir. Bu özellik, tüm enstrümanlar mevcut değildir, ve diğer enstrümanlar ile yapıldı deneyler için veri toplama dolayısıyla daha az sık olabilir. Işıldama sayacı bir ro housedkontrollü bir sıcaklık ve aydınlatma programı ile om. Istifleme kasete plakaları yüklerken, sinekler ışık almasını sağlamak için açık boş plakaları arasındaki sinekleri içeren plakalar yığını. Okumalar 24 saat en az saatte toplamak için üreticinin spesifikasyonlarına göre Programı luminometre. Bu örnekte, detektörler 10 saniye için her bir kuyu okumak için ve saniye başına sayımları (isteğe bağlı birimleri) sonuç olarak ifade etmek için programlanmıştır. Bu değer, kuyu başına 3 okumalar karşısında ortalaması alınır. Bir elektronik veri dosyalarını verme ve bir standart analiz, lüminesans sonuçlarının grafik. </li></ol>

<ol>
	<li>Majde, J. A., Krueger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Links+between+the+innate+immune+system+and+sleep.">Links between the innate immune system and sleep.</a> J. Allergy Clin. Immunol. 116, 1188-1198 (2005).</li><li>Kuo, T. H., Pike, D. H., Beizaeipour, Z., Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+triggered+by+an+immune+response+in+Drosophila+is+regulated+by+the+circadian+clock+and+requires+the+NFkappaB+Relish.">Sleep triggered by an immune response in Drosophila is regulated by the circadian clock and requires the NFkappaB Relish.</a> BMC Neurosci. 11, 1471-2202 (2010).</li><li>Preston, B. T., Capellini, I., McNamara, P., Barton, R. A., Nunn, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parasite+resistance+and+the+adaptive+significance+of+sleep.">Parasite resistance and the adaptive significance of sleep.</a> BMC Evol Biol. 9, 7 (2009).</li><li>Imeri, L., Opp, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+(and+why)+the+immune+system+makes+us+sleep.">How (and why) the immune system makes us sleep.</a> Nat. Rev. Neurosci. 10, 199-210 (2009).</li><li>Ayres, J. S., Schneider, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Signaling+Protease+Required+for+Melanization+in+Drosophila+Affects+Resistance+and+Tolerance+of+Infections.">A Signaling Protease Required for Melanization in Drosophila Affects Resistance and Tolerance of Infections.</a> PLoS Biol. 6, e305 (2008).</li><li>Chiu, J. C., Low, K. H., Pike, D. H., Yildirim, E., Edery, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+Locomotor+Activity+to+Study+Circadian+Rhythms+and+Sleep+Parameters+in+Drosophila.">Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila.</a> J. Vis. Exp. (43), e2157 (2010).</li><li>Lee, J. E., Edery, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+Regulation+in+the+Ability+of+Drosophila+to+Combat+Pathogenic+Infections.">Circadian Regulation in the Ability of Drosophila to Combat Pathogenic Infections.</a> Curr. Biol. 18, 195-199 (2008).</li><li>Stone, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+circadian+clock+protein+timeless+regulates+phagocytosis+of+bacteria+in+Drosophila.">The circadian clock protein timeless regulates phagocytosis of bacteria in Drosophila.</a> PLoS Pathog. 8, e1002445 (2012).</li><li>Hill-Burns, E. M., Clark, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-linked+variation+in+immune+response+in+Drosophila+melanogaster.">X-linked variation in immune response in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 183, 1477-1491 (2009).</li><li>Short, S. M., Lazzaro, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Female+and+male+genetic+contributions+to+post-mating+immune+defence+in+female+Drosophila+melanogaster.">Female and male genetic contributions to post-mating immune defence in female Drosophila melanogaster.</a> Proc. Biol. Sci. 277, 3649-3657 (2010).</li><li>Williams, J. A., Sathyanarayanan, S., Hendricks, J. C., Sehgal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+sleep+and+the+immune+response+in+Drosophila:+a+role+for+the+NFkappaB+relish.">Interaction between sleep and the immune response in Drosophila: a role for the NFkappaB relish.</a> Sleep. 30, 389-400 (2007).</li><li>Ramsden, S., Cheung, Y. Y., Seroude, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+the+Drosophila+immune+response+during+aging.">Functional analysis of the Drosophila immune response during aging.</a> Aging Cell. 7, 225-236 (2008).</li><li>Williams, J. A., Su, H. S., Bernards, A., Field, J., Sehgal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+circadian+output+in+Drosophila+mediated+by+neurofibromatosis-1+and+Ras/MAPK.">A circadian output in Drosophila mediated by neurofibromatosis-1 and Ras/MAPK.</a> Science. 293, 2251-2256 (2001).</li><li>Hedengren, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relish,+a+central+factor+in+the+control+of+humoral+but+not+cellular+immunity+in+Drosophila.">Relish, a central factor in the control of humoral but not cellular immunity in Drosophila.</a> Mol. Cell. 4, 827-837 (1999).</li><li>Leulier, F., Rodriguez, A., Khush, R. S., Abrams, J. M., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+caspase+Dredd+is+required+to+resist+gram-negative+bacterial+infection.">The Drosophila caspase Dredd is required to resist gram-negative bacterial infection.</a> EMBO Rep. 1, 353-358 (2000).</li><li>Wu, L. P., Choe, K. -. M., Lu, Y., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Immunity:+Genes+on+the+Third+Chromosome+Required+for+the+Response+to+Bacterial+Infection.">Drosophila Immunity: Genes on the Third Chromosome Required for the Response to Bacterial Infection.</a> Genetics. 159, 189-199 (2001).</li><li>Dionne, M. S., Ghori, N., Schneider, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster+is+a+genetically+tractable+model+host+for+Mycobacterium+marinum.">Drosophila melanogaster is a genetically tractable model host for Mycobacterium marinum.</a> Infect. Immun. 71, 3540-3550 (2003).</li><li>Romeo, Y., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+immunity:+methods+for+monitoring+the+activity+of+Toll+and+Imd+signaling+pathways.">Drosophila immunity: methods for monitoring the activity of Toll and Imd signaling pathways.</a> Methods Mol. Biol. 415, 379-394 (2008).</li><li>Lu, Y., Wu, L. P., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antibacterial+arm+of+the+Drosophila+innate+immune+response+requires+an+I{kappa}B+kinase.">The antibacterial arm of the Drosophila innate immune response requires an I{kappa}B kinase.</a> Genes Dev. 15, 104-110 (2001).</li><li>Koh, K., Evans, J. M., Hendricks, J. C., Sehgal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+model+for+age-associated+changes+in+sleep:wake+cycles.">A Drosophila model for age-associated changes in sleep:wake cycles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 13843-13847 (2006).</li><li>Bushey, D., Hughes, K. A., Tononi, G., Cirelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep,+aging,+and+lifespan+in+Drosophila.">Sleep, aging, and lifespan in Drosophila.</a> BMC Neurosci. 11, 1471-2202 (2010).</li><li>Allee, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The social life of animals. , (1938).</li><li>Stanewsky, R., Jamison, C. F., Plautz, J. D., Kay, S. A., Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+circadian-regulated+elements+contribute+to+cycling+period+gene+expression+in+Drosophila.">Multiple circadian-regulated elements contribute to cycling period gene expression in Drosophila.</a> Embo. J. 16, 5006-5018 (1997).</li><li>Levine, J. D., Funes, P., Dowse, H. B., Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+analysis+of+behavioral+and+molecular+cycles.">Signal analysis of behavioral and molecular cycles.</a> BMC Neurosci. 3, 1 (2002).</li><li>Ayres, J. S., Schneider, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+anorexia+in+resistance+and+tolerance+to+infections+in+Drosophila.">The role of anorexia in resistance and tolerance to infections in Drosophila.</a> PLoS Biol. 7, e1000150 (2009).</li><li>Plautz, J. D., Kaneko, M., Hall, J. C., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+photoreceptive+circadian+clocks+throughout+Drosophila.">Independent photoreceptive circadian clocks throughout Drosophila.</a> Science. 278, 1632-1635 (1997).</li><li>Huber, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+homeostasis+in+Drosophila+melanogaster.">Sleep homeostasis in Drosophila melanogaster.</a> Sleep. 27, 628-639 (2004).</li><li>Zimmerman, J. E., Raizen, D. M., Maycock, M. H., Maislin, G., Pack, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+video+method+to+study+Drosophila+sleep.">A video method to study Drosophila sleep.</a> Sleep. 31, 1587-1598 (2008).</li><li>Toth, L. A., Rehg, J. E., Webster, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain+differences+in+sleep+and+other+pathophysiological+sequelae+of+influenza+virus+infection+in+naive+and+immunized+mice.">Strain differences in sleep and other pathophysiological sequelae of influenza virus infection in naive and immunized mice.</a> J. Neuroimmunol. 58, 89-99 (1995).</li><li>Hendricks, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rest+in+Drosophila+is+a+sleep-like+state.">Rest in Drosophila is a sleep-like state.</a> Neuron. 25, 129-138 (2000).</li><li>Wu, M. N., Koh, K., Yue, Z., Joiner, W. J., Sehgal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+for+sleep+and+circadian+mutants+reveals+mechanisms+underlying+regulation+of+sleep+in+Drosophila.">A genetic screen for sleep and circadian mutants reveals mechanisms underlying regulation of sleep in Drosophila.</a> Sleep. 31, 465-472 (2008).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu protokol davranış, özellikle uyku, bağışıklık yanıtı parametreleri nasıl bağlantılı olduğuna araştırmak için bir yaklaşım belirlemektedir. Bu parametreler in vivo bir lusiferaz muhabir tarafından ölçülen bakteri yükü, sağkalım sonuçları ve NFKB aktivite içerir. Birlikte bu parametreler bir sinek bir enfeksiyonla mücadele ne kadar iyi hakkında bilgi sağlar. Bakteriyel yük ve sağkalım sonuçları Drosophila basit ölçümü dahil bağışıklık yanıtı parametrel...

<table border="1"><tbody><tr><td> Malzeme Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Ekipman </td></tr><tr><td> İnkübatörler </td><td> Percival Scientific, Inc </td><td> I30BLLC8 I36VLC8 </td><td> Programlanmış ışık / sıcaklık programları çalıştıran herhangi inkübatör yeteneğine uygundur. </td></tr><tr><td> Drosophila Aktivite Monitörler </td><td> Trikinetics Inc, Waltham, MA </td><td> DAM2 </td><td> Başka 6 açıklandığı gibi, bu sistem bir bilgisayar arayüzü, yazılım ve diğer aksesuarları gerektirir. </td></tr><tr><td> Pyrex Cam Tüpler </td><td> Trikinetics Inc, Waltham, MA </td><td> PGT-5x65 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroplaka sintilasyon ve ışıldama sayacı </td><td>Perkin Elmer </td><td> TopCount NXT 12 dedektör </td><td> Işıldama tespit etme yeteneğine sahip herhangi bir mikroplaka okuyucu haberci deneyi için bu tür de kullanılabilir. TopCount birden dedektörleri ve otomatik istifleyici içerir; birden plakaları sürekli okumak için programlanmış olma yeteneğine sahiptir. </td></tr><tr><td> FluorChem 8900 </td><td> Alpha Innotech </td><td></td><td> Bakteri kültürlerinin Görüntüleme isteğe bağlıdır; görsel ışık kapasitesi ile herhangi bir dijital görüntüleme sistemi yeterlidir. </td></tr><tr><td> Mikropipet Çektirme </td><td> TriTech Research, Inc </td><td> Narishige PC-10 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Malzemeleri </td></tr><tr><td> Borosilikat Cam Kapilerde </td><td> Dünya Precision Enstrüman A.Ş. </td><td> 1B100F-4 </td><td></td></tr><tr><td> 3 ml Şırınga </td><td> Fisher Scientific </td><td> BD 305482 </td><td></td></tr><tr><td> Şırınga İğneler </td><td> Fisher Scientific </td><td> BD 305196 </td><td> 18 G - tüp zarar görmesini önlemek için iğne ucu kesilir. </td></tr><tr><td> Silikon Hortum, id (0.030 &quot;) od (0.065&quot;) Duvar Kalınlığı (0.018 &quot;) </td><td> VWR </td><td> 60985-706 </td><td> Bir şırınga cam kılcal iğne takmak için kullanılır </td></tr><tr><td> 3 Yollu Musluk </td><td> Amerikan Pharmaseal Şirketi </td><td> K75 </td><td></td></tr><tr><td> Kontes Pelet Pestle Akülü Motor </td><td> Fisher Scientific </td><td> K749540-0000 </td><td></td></tr><tr><td> Kontes Pelet Pestle </td><td> Fisher Scientific </td><td> K749521-1590 </td><td></td></tr><tr><td> Cam bilyalar 3mm </td><td> VWR </td><td> 26396-630 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroplaka Microlite 1 + </td><td> Thermo Scientific </td><td> 7571 </td><td> Select ışıldama için uygun olan levha 96-kuyu - onlar opak olması gerekir. </td></tr><tr><td> Topseal&#39;ın-A :96-iyi mikropleytin </td><td> Perkin Elmer </td><td> 6005185 </td><td> Mikroplaka Basın-On Yapıştırıcı Sızdırmazlık Film </td></tr><tr><td> D-lusiferin, potasyum tuzu </td><td> Altın Biyoteknoloji, Inc </td><td> LUCNA </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Yazılım </td></tr><tr><td> Insomniac2 </td><td> Yazarlara istek üzerine mevcuttur </td><td> özel; Lesley Ashmore, Ph.D. tarafından yazılmış (Westminster College) </td><td> Uyku 2,6,11 analizi için rutin kullanılır olmuştur Matlab tabanlı yazılım </td></tr><tr><td> Drosonex </td><td> Yazarlara istek üzerine mevcuttur </td><td> özel; Thomas Coradetti (Kaldırım Yazılımı) tarafından yazılmış </td><td> Ham veri dosyaları hayatta kalma analizi için kullanılan bir bilgisayar programı MSVC6 ile toplanmışTrikinetics sistemi </td></tr><tr><td> Photoshop CS3 </td><td> Kerpiç </td><td></td><td> Dijital görüntüler (isteğe bağlı) kob / plaka numaralarını almak için Faydalı </td></tr></tbody></table>

quantitative measurement of the immune response and sleep in drosophila

Immün yanıtı ve konak davranış arasında karmaşık bir etkileşim tür geniş bir biçimde tarif edilmiştir. Aşırı uyku, özellikle, memelilerde 1 enfeksiyonuna yanıt olarak oluştuğu bilinmektedir ve ayrıca son zamanlarda Drosophila melanogaster 2&#39;de tarif edilmiştir. Bu, genel olarak uyku bir enfeksiyon sırasında ana için yararlı olan ve bir güçlü bağışıklık sistemi 3,4 korunması için önemli olduğu kabul edilir. Ancak, bu hipotezi destekleyen deneysel kanıtlar 4 sınırlıdır ve bir bağışıklık yanıtı sırasında aşırı uyku fonksiyonu belirsizdir. Biz bu karmaşık sorunu çözmek için multidisipliner bir yaklaşım kullanmış ve basit bir genetik model sistem, meyve sineği Drosophila melanogaster de çalışmalar yapmıştır. Biz, sinekler lokomotor davranışlar ve uyku ölçülmesi için bir standart tahlil kullanmak, ve bu tahlil sinekler infecte davranış ölçmek için nasıl kullanıldığını göstermekbir bakteri patojen d. Bu test aynı zamanda bir enfeksiyon sırasında bireysel sinekler sağkalım süresini izlemek için yararlıdır. Bağışıklık işlevi ek önlemler enfeksiyon ve NFKB, Drosophila doğal immün yanıtı için merkezi bir anahtar transkripsiyon faktörünün aktivasyonu temizlemek için sinekler yeteneğini içerir. Enfeksiyon sırasında sağkalım sonuçları ve bakteriyel klirense Hem birlikte direniş ve enfeksiyona hoşgörü göstergeleridir. Toleransı sistem 5 içinde patojen yüksek seviyelerde olmasına rağmen bir enfeksiyon hasarı sınırlamak ve böylece hayatta kalmak için ana yeteneği olarak tanımlanır iken Direniş, bir enfeksiyon temizlemek için sinekler yeteneğini ifade eder. Enfeksiyon sırasında NFKB faaliyet Gerçek zamanlı izleme enfeksiyon sırasında hayatta bir moleküler mekanizma fikir sağlar. Bu apaçık deneylerinde Drosophila kullanımı uyku genetik ve moleküler analizler kolaylaştırırve immün yanıt ve nasıl bu iki kompleks sistemlerin karşılıklı etkilenir.

<ol><li> Enfeksiyon uyku teşvik. Bu örnekte, Canton-S (CS), vahşi tip sinekler ve bir NFKB gen, Relish (İ E20) 14 eksik mutant sinekleri, iki DAM2 aktivite monitörleri dolduruldu (n = her bir genotip için 32) ve yukarıda açıklandığı gibi enfekte. Sinekler davranış ve enfeksiyon 2,7,8 üzerinde sirkadiyen saat etkisini ortadan kaldırmak için sürekli ışık altında tutuldu. Daha önce anlatıldığı gibi 11 İ E20 mutant CS isogenized edildi. Sinekler Hem s...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila at JoVE.com

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Immün yanıt ve davranış arasındaki bağlantıyı anlamak için, lokomotor davranışları ölçmek için bir yöntem tarif<em&gt; Drosophila</em&gt; Bakteriyel enfeksiyon yanı sıra izleme sağkalım, bakteri yükü, ve doğuştan gelen bağışıklık, NFKB önemli bir regülatör gerçek zamanlı aktivite ile bir bağışıklık yanıtı bağlamaya sinekler yeteneği sırasında.

İmmün Yanıt ve Uyku içinde kantitatif ölçümü<em&gt; Drosophila</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

quantitative-measurement-immune-response-sleep

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

15.3K Görüntüleme.  University of Pennsylvania Perelman School of Medicine. Immün yanıt ve davranış arasındaki bağlantıyı anlamak için, lokomotor davranışları ölçmek için bir yöntem tarif Drosophila Bakteriyel enfeksiyon yanı sıra izleme sağkalım, bakteri yükü, ve doğuştan gelen bağışıklık, NFKB önemli bir regülatör gerçek zamanlı aktivite ile bir bağışıklık yanıtı bağlamaya sinekler yeteneği sırasında.

Video: Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development of vaccines and therapeutics1,2,3. Here, we describe a method for the detailed phenotypic and functional analyses of cellular immune responses, specifically intracellular cytokine production by CD4+ and CD8+ T cells as well as the individual memory subsets. We obtained precise quantitative and qualitative measures for the production of interferon gamma (INF-) and interleukin (IL) -2 in both CD4+ and CD8+ T cells from the rhesus macaque PBMC stimulated with PMA plus ionomycin (PMA+I). The cytokine profiles were different in the different subsets of memory cells. Furthermore, this protocol provided us the sensitivity to demonstrate even minor fractions of antigen specific CD4+ and CD8+ T cell subsets within the PBMC samples from rhesus macaques immunized with an HIV envelope peptide cocktail vaccine developed in our laboratory. The multicolor flow cytometry technique is a powerful tool to precisely identify different populations of T cells 4,5 with cytokine-producing capability6 following non-specific or antigen-specific stimulation 5,7.

We demonstrate the utility of multicolor flow cytometry for detailed phenotypic and functional characterization of total as well as memory subsets of CD4+ and CD8+ T cells in rhesus macaques, the ideal model for HIV/AIDS vaccine studies.

Rhesus Makak maymunlarının Hücresel Bağışıklık Tepkisi Multicolor Sitometrisi Analizleri

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. 1A-C), females of the genus Leptopilina (Fig. 1D, 1F, 1G) and Ganaspis (Fig. 1E) attack the larval stages. We use these parasites to study the molecular basis of a biological arms race. Parasitic wasps have tremendous value as biocontrol agents. Most of them carry virulence and other factors that modify host physiology and immunity. Analysis of Drosophila wasps is providing insights into how species-specific interactions shape the genetic structures of natural communities. These studies also serve as a model for understanding the hosts' immune physiology and how coordinated immune reactions are thwarted by this class of parasites.
The larval/pupal cuticle serves as the first line of defense. The wasp ovipositor is a sharp needle-like structure that efficiently delivers eggs into the host hemocoel. Oviposition is followed by a wound healing reaction at the cuticle (Fig. 1C, arrowheads). Some wasps can insert two or more eggs into the same host, although the development of only one egg succeeds. Supernumerary eggs or developing larvae are eliminated by a process that is not yet understood. These wasps are therefore referred to as solitary parasitoids.
Depending on the fly strain and the wasp species, the wasp egg has one of two fates. It is either encapsulated, so that its development is blocked (host emerges; Fig. 2 left); or the wasp egg hatches, develops, molts, and grows into an adult (wasp emerges; Fig. 2 right). L. heterotoma is one of the best-studied species of Drosophila parasitic wasps. It is a "generalist," which means that it can utilize most Drosophila species as hosts1. L. heterotoma and L. victoriae are sister species and they produce virus-like particles that actively interfere with the encapsulation response2. Unlike L. heterotoma, L. boulardi is a specialist parasite and the range of Drosophila species it utilizes is relatively limited1. Strains of L. boulardi also produce virus-like particles3 although they differ significantly in their ability to succeed on D. melanogaster1. Some of these L. boulardi strains are difficult to grow on D. melanogaster1 as the fly host frequently succeeds in encapsulating their eggs. Thus, it is important to have the knowledge of both partners in specific experimental protocols.
In addition to barrier tissues (cuticle, gut and trachea), Drosophila larvae have systemic cellular and humoral immune responses that arise from functions of blood cells and the fat body, respectively. Oviposition by L. boulardi activates both immune arms1,4. Blood cells are found in circulation, in sessile populations under the segmented cuticle, and in the lymph gland. The lymph gland is a small hematopoietic organ on the dorsal side of the larva. Clusters of hematopoietic cells, called lobes, are arranged segmentally in pairs along the dorsal vessel that runs along the anterior-posterior axis of the animal (Fig. 3A). The fat body is a large multifunctional organ (Fig. 3B). It secretes antimicrobial peptides in response to microbial and metazoan infections.
Wasp infection activates immune signaling (Fig. 4)4. At the cellular level, it triggers division and differentiation of blood cells. In self defense, aggregates and capsules develop in the hemocoel of infected animals (Fig. 5)5,6. Activated blood cells migrate toward the wasp egg (or wasp larva) and begin to form a capsule around it (Fig. 5A-F). Some blood cells aggregate to form nodules (Fig. 5G-H). Careful analysis reveals that wasp infection induces the anterior-most lymph gland lobes to disperse at their peripheries (Fig. 6C, D).
We present representative data with Toll signal transduction pathway components Dorsal and Sp&auml;tzle (Figs. 4,5,7), and its target Drosomycin (Fig. 6), to illustrate how specific changes in the lymph gland and hemocoel can be studied after wasp infection. The dissection protocols described here also yield the wasp eggs (or developing stages of wasps) from the host hemolymph (Fig. 8).

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Parasitoid (parasitic) wasps constitute a major class of natural enemies of many insects including Drosophila melanogaster. We will introduce the techniques to propagate these parasites in Drosophila spp. and demonstrate how to analyze their effects on immune tissues of Drosophila larvae.

Paraziter Eşek Arıları Bir Giriş<em&gt; Drosophila</em&gt; Ve antiparaziter İmmün Yanıt

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ROS are toxic and function to kill phagocytized microorganisms. In vivo quantification of phagocyte-derived ROS provides information regarding an organism's ability to mount a robust innate immune response. Here we describe a protocol to quantify and compare ROS in whole zebrafish embryos upon chemical induction of the phagocyte respiratory burst. This method makes use of a non-fluorescent compound that becomes fluorescent upon oxidation by ROS. Individual zebrafish embryos are pipetted into the wells of a microplate and incubated in this fluorogenic substrate with or without a chemical inducer of the respiratory burst. Fluorescence in each well is quantified at desired time points using a microplate reader. Fluorescence readings are adjusted to eliminate background fluorescence and then compared using an unpaired t-test. This method allows for comparison of the respiratory burst potential of zebrafish embryos at different developmental stages and in response to experimental manipulations such as protein knockdown, overexpression, or treatment with pharmacological agents. This method can also be used to monitor the respiratory burst response in whole dissected kidneys or cell preparations from kidneys of adult zebrafish and some other fish species. We believe that the relative simplicity and adaptability of this protocol will complement existing protocols and will be of interest to researchers who seek to better understand the innate immune response.

The innate immune response protects organisms against pathogen infection. A critical component of the innate immune response, the phagocyte respiratory burst, generates reactive oxygen species that kill invading microorganisms. We describe a respiratory burst assay that quantifies reactive oxygen species produced when the innate immune response is chemically induced.

Zebra balığı Doğuştan Bağışıklık Sağlık Bir Göstergesi Olarak Solunum Burst Tepki Kantitasyonu

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Neuroinflammation is a complex innate immune response vital to the healthy function of the central nervous system (CNS). Under normal conditions, an intricate network of inducers, detectors, and activators rapidly responds to neuron damage, infection or other immune infractions. This inflammation of immune cells is intimately associated with the pathology of neurodegenerative disorders, such as Parkinson&#39;s disease (PD), Alzheimer&#39;s disease and ALS. Under compromised disease states, chronic inflammation, intended to minimize neuron damage, may lead to an over-excitation of the immune cells, ultimately resulting in the exacerbation of disease progression. For example, loss of dopaminergic neurons in the midbrain, a hallmark of PD, is accelerated by the excessive activation of the inflammatory response. Though the cause of PD is largely unknown, exposure to environmental toxins has been implicated in the onset of sporadic cases. The herbicide paraquat, for example, has been shown to induce Parkinsonian-like pathology in several animal models, including Drosophila melanogaster. Here, we have used the conserved innate immune response in Drosophila to develop an assay capable of detecting varying levels of nitric oxide, a cell-signaling molecule critical to the activation of the inflammatory response cascade and targeted neuron death. Using paraquat-induced neuronal damage, we assess the impact of these immune insults on neuroinflammatory stimulation through the use of a novel, quantitative assay. Whole brains are fully extracted from flies either exposed to neurotoxins or of genotypes that elevate susceptibility to neurodegeneration then incubated in cell-culture media. Then, using the principles of the Griess reagent reaction, we are able to detect minor changes in the secretion of nitric oxide into cell-culture media, essentially creating a primary live-tissue model in a simple procedure. The utility of this model is amplified by the robust genetic and molecular complexity of Drosophila melanogaster, and this assay can be modified to be applicable to other Drosophila tissues or even other small, whole-organism inflammation models.

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Levels of the inflammatory cell-signaling molecule nitric oxide (NO) are commonly assayed using Griess reagent. In this protocol, we have created a modified Griess assay utilizing live Drosophila brain tissue in order to detect the secretion of NO in a simple, quantifiable and highly repeatable method.

Neuroinflammation is a complex innate immune response vital to the healthy function of the central nervous system (CNS). Under normal conditions, an ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.

In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.

Fare Makrofagların yılında Doğuştan Bağışıklık Tepkisi Soruşturma RNA girişimi kullanma

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen interactions take advantage of intraperitoneal injections of select bacteria or pathogen associated molecular patterns (PAMPs) in mice. While these techniques have yielded tremendous data associated with infectious disease pathobiology, intraperitoneal injection models are not always appropriate for host-pathogen interaction studies in the lung. Utilizing an acute lung inflammation model in mice, it is possible to conduct a high resolution analysis of the host innate immune response utilizing lipopolysaccharide (LPS). Here, we describe the methods to administer LPS using nonsurgical oropharyngeal intratracheal administration, monitor clinical parameters associated with disease pathogenesis, and utilize bronchoalveolar lavage fluid to evaluate the host immune response. The techniques that are described are widely applicable for studying the host innate immune response to a diverse range of PAMPs and pathogens. Likewise, with minor modifications, these techniques can also be applied in studies evaluating allergic airway inflammation and in pharmacological applications.

The host immune response to pathogen infection is a tightly regulated process. Utilizing a lipopolysaccharide lung exposure model in mice, it is possible to conduct high resolution evaluations of the complex mechanisms associated with disease pathogenesis.

Farelerde Host immün yanıtı değerlendirmek için Orofarengeal intratrakeal PAMP İdaresi ve Bronchoalveolar Lavage Kullanımı

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in mice. Recently, myeloid differentiation factor 88 (MyD88) signaling was shown to be important for initial T cell priming and memory T cell development during WNV NS4B-P38G mutant infection. In this study, two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and an intracellular cytokine staining (ICS) &#8211; were utilized to assess dendritic cells (DCs) and T cell functions. In the T cell priming assay, cell proliferation was analyzed by flow cytometry following co-culture of DCs from both groups of mice with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) - labeled CD4+ T cells of OTII transgenic mice. This approach provided an accurate determination of the percentage of proliferating CD4+ T cells with significantly improved overall sensitivity than the traditional assays with radioactive reagents. A microcentrifuge tube system was used in both cell culture and cytokine staining procedures of the ICS protocol. Compared to the traditional tissue culture plate-based system, this modified procedure was easier to perform at biosafety level (BL) 3 facilities. Moreover, WNV- infected cells were treated with paraformaldehyde in both assays, which enabled further analysis outside BL3 facilities. Overall, these in vitro immunological assays can be used to efficiently assess cell-mediated immune responses during WNV infection.

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

Batı Nil Virüsü Mutant Soy Enfeksiyon MyD88-aracılı Hücresel Bağışıklık Tepki Vitro Analizi

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of causing systemic disease in both fish and humans. A better understanding of S. iniae disease pathogenesis requires an appropriate model system. The genetic tractability and the optical transparency of the early developmental stages of zebrafish allow for the generation and non-invasive imaging of transgenic lines with fluorescently tagged immune cells. The adaptive immune system is not fully functional until several weeks post fertilization, but zebrafish larvae have a conserved vertebrate innate immune system with both neutrophils and macrophages. Thus, the generation of a larval infection model allows the study of the specific contribution of innate immunity in controlling S. iniae infection.
The site of microinjection will determine whether an infection is systemic or initially localized. Here, we present our protocols for otic vesicle injection of zebrafish aged 2-3 days post fertilization as well as our techniques for fluorescent confocal imaging of infection. A localized infection site allows observation of initial microbe invasion, recruitment of host cells and dissemination of infection. Our findings using the zebrafish larval model of S. iniae infection indicate that zebrafish can be used to examine the differing contributions of host neutrophils and macrophages in localized bacterial infections. In addition, we describe how photolabeling of immune cells can be used to track individual host cell fate during the course of infection.

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

Bir Zebra balığı Larva Modeli Doğuştan Bağışıklık Tepki Non-invaziv Görüntüleme<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Enfeksiyon

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins towards the immune synapse to assure a stable binding and signal exchange. Classical confocal, TIRF, or super-resolution microscopy have been used to study the immune synapse. Since these methods require manual image acquisition and time-consuming quantification, the imaging of rare events is challenging. Here, we describe a workflow that enables the morphological analysis of tens of thousands of cells. Immune synapses are induced between primary human T cells in pan-leukocyte preparations and Staphylococcus aureus enterotoxin B (SEB)-loaded Raji cells as APCs. Image acquisition is performed with imaging flow cytometry, also called In-Flow microscopy, which combines features of a flow cytometer and a fluorescence microscope. A complete gating strategy for identifying T cell/APC couples and analyzing the immune synapses is provided. As this workflow allows the analysis of immune synapses in unpurified pan-leukocyte preparations and hence requires only a small volume of blood (i.e., 1 mL), it can be applied to samples from patients. Importantly, several samples can be prepared, measured, and analyzed in parallel.

Here, we describe a complete workflow for the qualitative and quantitative analysis of immune synapses between primary human T cells and antigen-presenting cells. The method is based on imaging flow cytometry, which allows the acquisition and evaluation of several thousand cell images within a relatively short period of time.

Akış Sitometresi Imaging kullanılarak insan sisteminde bağışıklık Synapse nitel ve nicel analiz

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are extremely high, no direct treatment or organ-related mechanism has been examined in detail in real time. The liver is the key organ that manages toxins and infections in the human body. Herein, we aimed to perform intravital imaging of mouse liver after induction of endotoxemia in order to track the motility of immune cells, such as neutrophils and liver capsular macrophages (LCMs). Accordingly, we designed a novel surgical method for exposure of the liver with minimally invasive surgery. Mice were intraperitoneally injected with lipopolysaccharide (LPS), a common endotoxin. Using our novel surgical approach for exposure and intravital imaging of the mouse liver, we found that neutrophil recruitment in LPS-treated LysM-green fluorescent protein (GFP) mouse liver was increased compared with that in phosphate-buffered saline-treated liver. After LPS treatment, the number of neutrophils increased significantly with time. Additionally, using CX3Cr1-GFP mice, we successfully visualized liver resident macrophages called LCMs. Therefore, to investigate the efficacy of new reagents to control immune mobility in vivo, determining the motility and morphology of neutrophils and LCMs in the liver may allow us to identify therapeutic effect in organ failure and tissue damage caused by leukocytes activation in sepsis.

We established a novel surgical protocol for two-photon imaging of live mice liver with minimal invasion. With this technique, we identified the detailed structure of the liver during lipopolysaccharide-induced endotoxemia. We anticipate that this method may be utilized to determine the effectiveness of various reagents treatment to hepatic leukocyte migration.

İki fotonlu Lipopolysaccharide tedavi fare karaciğer bağışıklık yanıtında sırasında lökositlerin Intravital görüntüleme

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are ...