Yazarlar bu proje için temel ve teknik destek sağlamak için veteriner tıp VA-MD Regional College teşekkür ederim. Bu çalışma NIH Kariyer Geliştirme Ödülü (K01DK092355) tarafından desteklenmektedir.

Tüm çalışmalar Virginia Tech için Kurumsal Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) onayı altında ve Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Sağlık Rehberi, National Institutes göre yapılmıştır. 1.. Orofarengeal Yönetimi&#39;ni kullanarak LPS intratrakeal (it) Aşılama <ol><li> Her hayvan benzersiz bir kulak yumruk, kulak etiketi veya diğer kurumsal olarak onaylanmış bir yöntem kullanılarak tespit emin olun. </li><li> Bazal vücut ağırlığı ve her bir hayvan için vücut ısısını kaydedin. </li><li> LPS çalışma stok hazırlamak. Her fare, 1X fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 1 mg / kg LPS, 50 ul bir doz alacaktır. Mock 1 x PBS ile tedavi edilmiş hayvanlar için 50 ul bir doz alacaktır. </li><li> Aşağıdaki damla yöntemiyle izofluran uygulama için uygun bir bölmeyi hazırlayın. Kurumsal kurallar initiat için izofluran ve diğer anestezik ajanların ve önceki kullanımına ilişkin değişiklikherhangi bir çalışma ing, kişilerin tüm esasların karşılandığı sigorta Hayvan Bakım / Refah onların kurumun Bölümü başvurmalısınız. Bırak yöntemi izofluran bir seçenek değilse, diğer anestezik ajanların kabul alternatiflerdir. <ol><li> Uygun bir güvenlik kabini içinde, 500 ml&#39;lik bir cam kaba altındaki bir katlanmış emici kağıt havlu ve yere izofluran, yaklaşık 3 ml uygulanır. </li><li> Kağıt havlu üzerine alüminyum folyo küçük bir parça koyun ve şeffaf bir kapak ile kabı kapsamaktadır. </li></ol></li><li> Bu aşılama sırasında yararlanılacak araçları ve reaktifler hazırlayın. Hayvanlar entübasyon standında baş güvenli olacak lastik bant yerleştirin. Bu işlem düz forseps bir çift, açılı veya kavisli bir forseps bir çift, ve ipuçları ile bir P200 pipet gerektirir. </li><li> Entübasyon standın yanında kolayca erişilebilir bir yerde pipet ve yerine yük LPS 50 ul. </li><li> Fare anestezisiizofluran odasına hayvan yerleştirilmesi ve şeffaf bir kapak ile odasını kaplayarak. Birinci odacık içinde yerleştirildiğinde, hızlı ve sığ olacak, hayvanın solunum şekilleri dikkate alınmalıdır. Nefes oranları genellikle odasında yerleştirerek 30 saniye içinde ulaşılır 1 nefes / 2 sn, yaklaştığınızda hayvan yeterince anestezi olacak. Drop yöntem izofluran ile onaylanan hayvan protokolü belirtildiği gibi fare anestezi olmalıdır. </li><li> Odasından anestezi fareyi çıkarın ve ön kesici dişler tarafından ayakta entübasyon üzerinde hayvan askıya. Hayvan güvenli ölçülü ve ağız ve dil erişilebilir olduğunu sigortalayın. </li><li> Yavaşça düz forseps ile dil sabitleyin. Açılı forseps ile dilini kavramak ve hafif bir direnç hissedene kadar yavaşça ağzından çekin. Bu eylem, epiglottis blok ve trakea erişmek için yeterlidir. </li><li> De dilini tutmayı sürdürürkenuzatılmış pozisyon, boğazın arkasına LPS&#39;nin 50 ul dozunu ve hemen bir eldivenli parmak ile hayvanın burun delikleri kapsamaktadır. Fare nefes kadar LPS boğazın arka görünür olacaktır. </li><li> Burun delikleri kapak ve 5-10 ek nefesler için genişletilmiş dilini tutmaya devam edin. </li><li> Entübasyon standından fareyi çıkarın ve anestezi kurtarır kadar geri yeni bir kafese hayvan. </li><li> Hastalığın ilerlemesi ile ilişkili vekil belirteçler izleyin. Vücut ağırlığı ve vücut ısısı çalışma süresince her 4-8 saatte izlenmelidir. Aynı şekilde, davranışsal özellikleri ve artmış morbidite ile ilişkili klinik belirtileri değerlendirmek. </li><li> LPS maruz kaldıktan sonra belirli bir zaman-noktalarında hastalığın ilerlemesi, hasat fareler değerlendirmek. LPS maruz kalma sonraki hasat için tipik zaman noktaları 0, 6, 12, 18, 24, ve 48 saat arasındadır. Kurtarma ve hayatta kalma değerlendirmek, 7 dekar için fareler değerlendirmekYS sonrası aşılama. </li></ol> 2. Serum ve Bronkoalveoler Lavaj Sıvısı (BAL) Koleksiyon <ol><li> Kurumsal olarak onaylanmış bir yöntem kullanarak fare Kurban. </li><li> Sırtında hayvan koyun ve yüksekliği (1.27 cm), ideal 0.5, otopsi kuruluna sabitleyin. </li><li> % 70 etanol ile tüm fare ıslatın. </li><li> Bir 27 G iğne ile bir 1 ml şırınga kullanarak, önceden herhangi bir kesik yapmak için bir kardiyak ponksiyon yaparlar. Bu, tek bir fare, bütün haldeki kan 500-800 ul çekmek mümkün olmalıdır. </li><li> Şırıngadan iğne çıkarın ve prelabeled 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne bütün kan aktarın. Serum toplanması için, bütün kan, oda sıcaklığında en az 30 dakika süreyle pıhtılaşmaya izin verir. Serum koleksiyonuna ek olarak, bu prosedür, aynı zamanda önce bağışıklık hücrelerini dolaşımdaki çalışma, tam kan toplama tüpü ve enjektör, bir anti-pıhtılaştırıcı madde dahil edilerek modifiye edilebilir. </li><li> Yatay bir kesi a olunfare alt çenesine periton boşluğu uzunluğu ve periton boşluğundan dikey çapraz kesi. </li><li> Forseps kullanarak, kesi her iki tarafını kavrayın ve yavaşça yatan periton ve göğüs boşluklarında gelen cilt çekin. </li><li> Diyaframı kesim önlemek için dikkat çekici, genital sternum periton boşluğu uzunluğu boyunca büyük bir kesi yapmak. Yavaşça böbrekler birine erişim sağlamak için periton boşluğuna bağırsak geçiş. </li><li> Perfüzyon için bir drenaj noktası olarak hizmet etmek böbrek giden renal ven kesti. </li><li> Nick diyafram, makas kullanarak kalbin sol tarafını ortaya çıkarmak için, akciğerler ve kalbi önlemek için dikkat çekici. </li><li> El ile bir 27 G iğne ve 1 x PBS çözeltisi ile bir 10 ml şırınga kullanarak kalp serpmek. Tuzlu akciğerlere zorunlu olmadığından emin olmak için perfüzyon sırasında aşırı kuvvet uygulayarak kaçının. Kalan kan portal ven kesi drenaj gerekir.</li><li> Dikkatle kalp ve akciğerleri kesme önlemek için dikkat çekici, künt / künt makas kullanılarak sternum boyunca göğüs kafesi kesilmiş. Yanlışlıkla bu işlem sırasında akciğerleri kesme anlamlı toplanan BAL&#39;da miktarını azaltacak ve düzgün sabitleyici ile akciğerlerini şişirmek için bir yetersizlik neden olur. </li><li> Yavaşça kalp ve uzak forseps kullanarak göğüs kafesi akciğerleri izole. Dikkatle mümkün olduğunca omurga kadar yakın künt / künt makas kullanarak göğüs kafesi her bölümü kesilmiş ve tam iki bölümü çıkarın. </li><li> Forseps kullanarak tükürük bezleri ayırmak veya makas kullanarak bunları kaldırmak, trakea ortaya çıkarmak için. </li><li> Dikkatle makas kullanarak trakea kaplamak kasları kesti. Bu, soluk borusu, bu işlem sırasında kesilmeyebilir esastır. </li><li> Makas kullanarak, trakea örten köprücük ayırmak. </li><li> Yavaşça forseps kullanarak timus kavramak ve kalp uzak doku kaldırın. Dikkat çekerken, makas kullanarak timus çıkarınkalp ya da akciğerleri kesilmesini önlemek. </li><li> 1-2 halkaları açılı makas (45-90 º açı, keskin / keskin) kullanarak gırtlak altında trakea küçük bir yatay kesi olun. Kesi sıkıca kanül güvenli yeterince büyük olmalıdır. </li><li> Konik uç kesi altında 2-3 trakea halkaları uzanır, böylece kanül yerleştirin ve bir ipek dikiş kullanarak yerine kanül sağlamak. Sütür trakea ve özofagus arasında geçer ve kanül üzerinde sıkı çekti emin olun. </li><li> Hanks tamponlu tuz çözeltisi (HBSS) içinde 1 ml bir 1 ml şırınga doldurun ve yavaşça kanül içine dişin yerleştirin. </li><li> Yavaş, ama sürekli hareket kullanarak, akciğerler şişirme, trakea içine ~ 900 ul enjekte ve hemen HBSS çekilme. Bir 15 ml konik bir tüp içinde geri kazanılan BAL yerleştirin. </li><li> Gelecek analizi için BAL&#39;da yaklaşık 3 ml toplamak için bu lavaj 2 kez daha tekrarlayın. Kullanıma hazır olana kadar buz üzerinde ya da 4 ° C &#39;de BAL saklayın. </li></ol><ol><li> Akciğer enflasyon stand içine 10 ml şırınga takın. Ucu, vana için dişe ve şırıngaya vana için boru birleştirin. Musluk kapalı konumda olduğundan emin olun. 10 ml&#39;lik bir enjektör yerçekimi akış rezervuar olarak görev yapacak. Rezervuar hayvan yukarıda 4,75 durmak ve rezervuarın üst hayvan yukarıda 10,5 uzatmak gerekir enflasyona bağlı olmalıdır. </li><li> Nötr tamponlu formalin çözeltisi şırınga ile doldurun. Şırınga tamamen sabitleyici ile dolu olduğundan emin olun. </li><li> Hortumun açık ucu altında bir emici havlu yerleştirin ve sabitleyici boru doldurmak için izin vermek için musluğunu açın. Sabitleştirici borudan akan başladığında, hemen musluğunu kapatın ve sabitleyici ile üst şırınga doldurun. Bu enjektör tamamen akciğer enflasyonu için basınç temin etmek üzere uygun miktarda doldurulması önemlidir. </li><li&gt; Yavaşça yaklaşık 1-2 trakea halkaları kanül ucunun altında, trakea altında dikiş ipliğinin ikinci bir parça geçmek. </li><li> Sütür tek gevşek bir düğüm; Ancak, düğüm sıkı çekmeyin. </li><li> Kanül içine standı fare enflasyondan tüp yerleştirin. </li><li> Musluğunu açın ve akciğerler yerçekimi enflasyon doldurmak için izin. </li><li> Akciğerler maksimum enflasyon seviyesine ulaştıklarında, dikiş sıkı çekin ve ikinci bir düğüm. </li><li> Su musluğunu kapatın ve kanül tüp çıkarın. </li><li> Yavaşça, forseps bir çift dikiş tutup parmakları ile kanül tutarak trakea kanül çıkarın. Sıkıca göğüs boşluğuna ve geri fare burun doğru kanül aşağı doğru dikiş çekin. </li><li> Forseps ile yavaşça trakea veya sütür kavramak ve uzak boyun boşluğundan trakea kaldırın. </li><li> Künt makas kullanılarak bağlı sütür trakea caudal Sever. </li><li> Bir kez trakeostomiBir alttaki dokulara arınmış, uzak fare trakea çekmeye başlar. Yavaşça göğüs boşluğundan dışarı akciğerler kaldırın. </li><li> Dikkatle göğüs boşluğunda akciğerleri tutan bağ dokusu kesti. Uzakta fare vücuttan trakea çekerek devam edin ve altta yatan bağlantılarını keserken sürekli yukarı doğru kuvvet uygulanır. Akciğerleri kesim önlemek için özen gösterin. Kalp sol bu yöntem kullanılarak akciğerlere bağlı gerektiğini not edin. </li><li> Akciğerler çıkarıldıktan sonra, tamponlu formalin 10 ml yerleştirin. </li><li> Genotiplendirebilmek fare kuyruğu bir bölümü çıkarın. </li><li> Uygun kurumsal yönergeleri izleyerek fare karkas imha edin. </li></ol> 4. Sitokin Değerlendirme <ol><li> Serum izole edilmesi için 5 dakika için 12,000 xg&#39;de aşama 2.5 altında toplanan tam kan, santrifüj. -80 ° C&#39;de, bir 1.5 ml mikrosantrifüj prelabeled tüp ve saklamak için serum transferi </li><li> Seru değerlendirinELISA ya da başka bir benzer deney ile m sitokin seviyeleri. Serum 1:5 seyreltin - ardından, denemeye bağlı olarak, uygun bir seyreltme tamponu içinde 1:20 talimatları üretmektedir. Bu seyreltmeler önce deneysel örneklerin toplu çalışan belirlenmelidir. </li><li> Dolayı toplanan serum içinde düşük bir hacme kadar, yarı yarıya ELISA plaka üzerine yüklenen numune hacmi azaltır. Örneğin, bir çok ticari ELISA standart ve 100 ul numune hacimleri kullanmaktadır. Örnekleri, standartların yük 50 ul ve seyreltilmiş serum korumak başına iyi belirleyin. </li><li> Santrifüj 5 dakika boyunca 200 x g &#39;de bir buzdolabında masa üstü santrifüjde BALF. Ikiye hücresiz süpernatant aktarın -80 ° C&#39;de 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri ve mağaza prelabeled </li><li> Inceltmeden ELISA veya benzer başka bir deney ile BALS sitokinler değerlendirin. </li><li> -80 ° C&#39;de saklayın kullanılmayan serum ve BAL </li></ol> 5. Diferansiyel Boyama ve BAL Hücresellik Değerlendirme <ol><li> BALF santrifüj ve tam HBSS çıkarıldıktan sonra, hipotonik tuzlu su ile tane haline kırmızı kan hücrelerinin lize edildi. Damıtılmış su içinde 900 ul içinde tekrar süspansiyon hücreleri. Hemen 10x PBS 100 ul ekleyin. </li><li> Tek tek her örnek lyse. Örnekleri, kırmızı kan hücrelerinin aşırı miktarda ise, hücreler 5 dakika ve kırmızı kan hücresi parçalama kuralı tekrarlanabilir boyunca 400 xg&#39;de masa üstü bir santrifüj içerisinde topak haline edilebilir. </li><li> Trypan Blue lekelemesi ile 10X ya da 20 X büyütme altında bir hemasitometre kullanılarak 1 ml süspansiyon içinde toplam BALF selülarite belirler. Değerlendirmek ve hücre / ml olarak bu verileri sunmak. </li><li> Sitospin ve diferansiyel boyama malzemeleri hazırlayın. Bir kalem veya solvent dirençli kalem kullanarak standart bir mikroskop slaytlar etiketleyin. Bir sitospin dirsek ve huni içine slaytlar sabitleyin. Sitospin rotor slayt düzeneğini sabitleyen. </li><li> 5 dakika boyunca 100 xg&#39;de Sıvıda Cytospin 150 ul. Hücre yoğunluğu etkin bir şekilde çok büyük olursa, hücre morfolojisini değerlendirmek slaytlar üzerine aşağı bükülmüş hacmini azaltmak. Slaytlar kuru gecede havalandırmak için izin verin. </li><li> Diferansiyel üretmektedir protokoller aşağıdaki slaytlar leke. Slaytlar kuru gecede havalandırmak için izin verin. Permount ile slaytlar lamel ve 20X ve 40X objektif ile donatılmış bir mikroskop kullanılarak slaytlar değerlendirir. </li><li> Örneğin FACS, elektron mikroskobu, konfokal mikroskopi, gen ekspresyonu değerlendirmek için RNA ekstre etme, ve / veya western blot için protein ekstre etme gibi bir sonraki analiz için geri kalan hücreler, hasat. </li></ol> 6. Histopatoloji Değerlendirme <ol><li> Histopatolojik değerlendirilmesi için akciğer hazırlayın. Formalin tespit 24-48 saat sonra, ventral bütün şişirilmiş akciğer yönlendirmek ve parafin içine gömülmüştür. Ana iletken hava yolunu ortaya çıkarmak için elde edilen blok kesin. </li><li> Skor doğruluğunu artırmak için, aynı konumda akciğerlere pozisyon ve t en fazla uzunlamasına görselleştirme elde etmek için, her blok Döşemeo ana eksen havayolunu İntrapulmoner. Bu noktadan itibaren, 5 mikrondan seri bölümleri ve hematoksilen ve eozin (H &amp; E) ile leke kesti. Ek kesitler kesildi ve standart protokoller kullanılarak in situ melezleme için hazırlanabilir. </li><li> 0 (yok) ve 3 (şiddetli) arasında puanlanır aşağıdaki inflamatuar parametrelere dayalı yarı-kantitatif skorlama sistemi kullanılarak histopatolojisini değerlendirin: mononükleer ve polimorfonükleer hücre infiltrasyonu; epitel hücre hiperplazisi ve yaralanma havayolu; salgısı; perivasküler ve peribroncheolar Kesilen; ve enflamasyon ile ilgili akciğer oranında. Akciğer histopatolojik deneyimli bir patolog tarafından değerlendirilmesi gerekir. </li><li> Toplam puan histopatoloji oluşturmak ya da hastalığın ilerlemesinin belirli yönlerini ölçmek için tek tek puanları kullanılacak parametre puan her ortalama. Genotip ve tedavi hem kör yorumcular, bir çift kör tüm puanlama Davranış. Bu puanlama sistemi previousl olmuştury 6,7,10 tarif. </li></ol>

<ol>
	<li>Matute-Bello, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+official+American+Thoracic+Society+workshop+report:+features+and+measurements+of+experimental+acute+lung+injury+in+animals.">An official American Thoracic Society workshop report: features and measurements of experimental acute lung injury in animals.</a> Am. J. respir. Cell Mol. Biol. 44, 725-738 (2011).</li><li>Egger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Administration+of+bleomycin+via+the+oropharyngeal+aspiration+route+leads+to+sustained+lung+fibrosis+in+mice+and+rats+as+quantified+by+UTE-MRI+and+histology.">Administration of bleomycin via the oropharyngeal aspiration route leads to sustained lung fibrosis in mice and rats as quantified by UTE-MRI and histology.</a> PloS one. 8, (2013).</li><li>Rayamajhi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonsurgical+intratracheal+instillation+of+mice+with+analysis+of+lungs+and+lung+draining+lymph+nodes+by+flow+cytometry.">Nonsurgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Revelli, D. A., Boylan, J. A., Gherardini, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-invasive+intratracheal+inoculation+method+for+the+study+of+pulmonary+melioidosis.">A non-invasive intratracheal inoculation method for the study of pulmonary melioidosis.</a> Front. Cell. Infect. Microbiol. 2, 164 (2012).</li><li>Allen, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+NLRP3+in+the+development+of+allergic+airway+disease+in+mice.">Analysis of NLRP3 in the development of allergic airway disease in mice.</a> J. Immunol. 188, 2884-2893 (2012).</li><li>Allen, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+NLRP12+during+the+in+vivo+host+immune+response+to+Klebsiella+pneumoniae+and+Mycobacterium+tuberculosis.">Characterization of NLRP12 during the in vivo host immune response to Klebsiella pneumoniae and Mycobacterium tuberculosis.</a> PloS one. , (2013).</li><li>Allen, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+function+of+NPSR1/GPRA+in+the+lung+before+and+after+induction+of+asthma-like+disease.">Expression and function of NPSR1/GPRA in the lung before and after induction of asthma-like disease.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 291, 1005-1017 (2006).</li><li>Kebaier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+alpha-hemolysin+mediates+virulence+in+a+murine+model+of+severe+pneumonia+through+activation+of+the+NLRP3+inflammasome.">Staphylococcus aureus alpha-hemolysin mediates virulence in a murine model of severe pneumonia through activation of the NLRP3 inflammasome.</a> J. Infect. Dis. 205, 807-817 (2012).</li><li>Roberts, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+murine+immune+response+to+pulmonary+delivery+of+precisely+fabricated+nano-+and+microscale+particles.">Analysis of the murine immune response to pulmonary delivery of precisely fabricated nano- and microscale particles.</a> PloS one. 8, (2013).</li><li>Willingham, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NLRP3+(NALP3,+Cryopyrin)+facilitates+in+vivo+caspase-1+activation,+necrosis,+and+HMGB1+release+via+inflammasome-dependent+and+-independent+pathways.">NLRP3 (NALP3, Cryopyrin) facilitates in vivo caspase-1 activation, necrosis, and HMGB1 release via inflammasome-dependent and -independent pathways.</a> J. Immunol. 183, 2008-2015 (2009).</li><li>Kline, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variable+airway+responsiveness+to+inhaled+lipopolysaccharide.">Variable airway responsiveness to inhaled lipopolysaccharide.</a> Am. J. Respir. Crit. Med. 160, 297-303 (1999).</li><li>Cressman, V. L., Hicks, E. M., Funkhouser, W. K., Backlund, D. C., Koller, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+of+chronic+mucin+secretion+to+airway+disease+in+normal+and+CFTR-deficient+mice.">The relationship of chronic mucin secretion to airway disease in normal and CFTR-deficient mice.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 19, 853-866 (1998).</li></ol>

Yazarlar herhangi bir mali çıkarlarını beyan.

Aşağıdaki gibi başarılı bir şekilde, farenin akciğerlerinde bulunan konakçı bağışıklık tepkisini değerlendirmek için en kritik adım: 1) değerlendirilen modeli için uygun fare suşu ve cinsiyet seçin; 2) akciğerlere PAMP teslim optimize edilmesi; 3) doğru toplamak ve Balf işlemek; ve 4) düzgün düzeltmek ve histopatolojik değerlendirmeler için akciğerlerin hazırlamak. Fare soyunun seçimi konakçı bağışıklık tepkisini değerlendirmek için önemli bir fakt?...

Patojenik bakteri türleri ile ilişkili pulmoner enfeksiyonlar küresel morbidite ve mortalite ortak bir nedenidir. Bu patojenlere karşı bağışıklık tepkisini tahrik mekanizmaları belirlenmesi bu enfeksiyonların etkisini hafifletecektir yeni önleme stratejilerinin ve terapötik ajanların geliştirilmesini teşvik edecektir. Burada açıklanan protokol genel amacı, canlı bakteriler için bir vekil olarak bir patojen ilişkili moleküler deseni (PAMP) kullanarak patojen enfeksiyona konak doğuştan gelen bağışıklık yanıtı değerlendirmek için esnek bir yöntem ile kullanıcıya sunmaktır. Bakteri konakçı doğuştan gelen bağışıklık tepkisini değerlendirmek önceki çalışmaların büyük çoğunluğu nedeniyle yürütme göreli kolaylığı için peritoneal modeller üzerinde odaklanmıştır. Bu modeller son derece yararlıdır ve evsahibi-patojen etkileşimlerinin ve sistemik inflamasyon alanında önemli gelişmelere yol olsa da, bu modeller üretilen veriler her zaman çalışmaları için uygun değildir involvisolunum sistemi ng. Burada, akut akciğer iltihabı bir akciğer modeli klasik intraperitoneal (ip) enjeksiyonu model bir pratik ve klinik olarak anlamlı bir genişleme olarak önerilmiştir. Önerilen teknik, bir organ spesifik model sistemde doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin değerlendirilmesi için yerel sağlar. Burada açıklanan yöntemler kullanıcıların ortak PAMP olan LPS, konakçı bağışıklık tepkisini değerlendirmek için izin vermek için basit ve sağlam bir teknik sağlamak için tasarlanmıştır. Yöntem farelerde nefes borusu ve solunum yolu enfeksiyonları ve akut akciğer hasarı 1 geçiren insan hastalarda görülen patofizyolojik özellikleri birçok taklit akciğerlerinde sağlam bir doğuştan gelen bağışıklık tepkisi oluşturan LPS, (it) damlatma dayanmaktadır. Bu tekniğin bir avantajı, birinci kullanım in vivo çalışmalar yapılması ile ilişkili karıştırıcı faktörler ve güvenlik kaygıları olmayan bağışıklık tepkisini değerlendirmek için izin vermesidirCanlı bakteri kullanılmıştır. Aynı şekilde, bu protokolde tarif maruziyetin orofaringeal bu uygulama yolu, parenteral (in) burun ve cerrahi de dahil olmak üzere bu uygulama için diğer yaygın olarak kullanılan tekniklere göre önemli avantajları vardır. Örneğin, orofaringeal bu uygulama tipik olarak, burun boşluğunda ajanlar kaybına akciğer birikim artan değişiklere maruz kalır ve 2-4 sinüsler yönetim bölgesi ile karşılaştırıldığında nispeten doğru olan dozajlanmasını ve akciğer birikmesini sağlar. Bu uygulama yolu bu boşlukları circumvents ve trakea ve solunum doğrudan erişim sağlar. Aynı şekilde, cerrahi bu yaklaşımın bir ölçüde daha marazi uygulama yöntemidir ve master için kapsamlı bir eğitim gerektirir. Burada açıklanan protokolleri de ortak teknikleri ve inflamasyon ilerlemesini değerlendirmek ve lu hazırlanması için uygun teknikleri açıklayan bir protokol ile bitirmek için kullanılan vekil işaretçileri bir açıklama içerirhistopatolojik değerlendirmeler için NGS. Bu protokoller, her bir hayvandan elde edilen verileri maksimize her çalışma için gerekli olan farelerin sayısını en aza indirerek odaklandık. Anlatılan protokoller oldukça esnek ve hali hazırda, bir dizi çeşitli PAMPs hasar ve ilişkili moleküler modelleri (DAMPS) değerlendirmek için modifiye edilebilir. Bundan başka, bir kaç ilave değişiklik ile, bu protokol, aynı zamanda, alerjik nefes yolu, hastalığın ilerlemesini ya da canlı bakteri, virüs veya mantar 5-10 ile konukçu-patojen etkileşimlerine değerlendiren çalışmalar uygulanabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="596">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:269px;">C57Bl/6J</td>
			<td style="width:181px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:147px;">Stock 000664</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:269px;">Compact Scale</td>
			<td style="width:181px;">Ohaus Scale Corporation</td>
			<td style="width:147px;">71142845</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Small Animal Rectal Thermometer</td>
			<td style="width:181px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:147px;">TH 5</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Rectal Probe for Rodents</td>
			<td style="width:181px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:147px;">RET 3</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Ear Punch</td>
			<td style="width:181px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:147px;">EP-S 901</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Lipopolysaccharide from E. coli 0111:B4</td>
			<td style="width:181px;">InvivoGen</td>
			<td style="width:147px;">LPS-EB</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">1x Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:181px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">10010-023</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:181px;">Baxter</td>
			<td style="width:147px;">40032609</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Intratrachael Administration and Lung Inflation Stand</td>
			<td style="width:181px;">ICAP Manufacturing</td>
			<td style="width:147px;">n/a</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Rodent Intubation Stand</td>
			<td style="width:181px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:147px;">RIS 100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scissors (blunt/sharp)</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">13-806-2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">forceps (straight)</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td>22-327-379</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">forceps (45&#186;, curved)</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td>10-275</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scissors (blunt/blunt)</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td>08-940</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Pipette (200 &#181;l Capacity)</td>
			<td style="width:181px;">Gilson</td>
			<td style="width:147px;">F123601</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Ethanol</td>
			<td style="width:181px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">459844</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">&#160;1 ml Syringe</td>
			<td style="width:181px;">BD Medical</td>
			<td style="width:147px;">301025</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">10 ml Syringe</td>
			<td style="width:181px;">BD Medical</td>
			<td style="width:147px;">301604</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">27 G x 0.5 in. needle</td>
			<td style="width:181px;">BD Medical</td>
			<td style="width:147px;">305109</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Refrigerated Microcentrifuge</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">13-100-676</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">1.2 mm Tracheal Cannulae with Luer-adapter</td>
			<td style="width:181px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:147px;">732836</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td style="width:181px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">14025-076</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">4-0 Silk Braided Surgical Suture</td>
			<td style="width:181px;">Ethicon</td>
			<td style="width:147px;">A183</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Luer to Tube Connector Kits</td>
			<td style="width:181px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:147px;">721406</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Luer Stopcock Kit</td>
			<td style="width:181px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:147px;">721664</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Tygon formula E-3603 laboratory tubing</td>
			<td style="width:181px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">R-3603</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td style="width:181px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">HT501128-4L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Mouse IL-1&#946; OptEIA ELISA Kit</td>
			<td style="width:181px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:147px;">559603</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Mouse IL-6 OptEIA ELISA Kit</td>
			<td style="width:181px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:147px;">550950</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Mouse TNF-&#945; OptEIA ELISA Kit</td>
			<td style="width:181px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:147px;">560478</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Hemacytometer</td>
			<td style="width:181px;">Hausser Scientific</td>
			<td style="width:147px;">3520</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Hemacytometer Cover Glasses</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;">22-021-801&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;">SV3008401</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cytology Funel Clips</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td>10-357</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cytology Funels</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td>10-354</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Filter Cards</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td>22-030-410</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Microscope Slides</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">12-544-1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Cover Glasses</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">12-540A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Cytospin Cytocentrifuge</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;">A78300003&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Diff Quick Staining Kit</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">47733150</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Permount Mounting Medium</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">SP15-500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the utilization of oropharyngeal intratracheal pamp administration and bronchoalveolar lavage to evaluate the host immune response in mice

Patojenlere karşı konak bağışıklık tepkisi karmaşık biyolojik süreçtir. In vivo çalışmaların çoğunluğu klasik konak-patojen ilişkileri farelerde seçin bakteri veya patojen ilişkili moleküler desenleri (PAMPs) intraperitoneal yararlanmak karakterize edilmesi için kullanılır. Bu teknikler, bulaşıcı hastalık patobiyolojisi ilişkili verileri vermiştir büyük olsa da, periton içine enjeksiyon modelleri her zaman akciğerde konukçu-patojen etkileşim çalışmalar için uygun değildir. Farelerde akut akciğer enflamasyonu kullanarak, bu doğuştan gelen bağışıklık tepkisi lipopolisakkarid (LPS) kullanılarak ana bir yüksek çözünürlüklü analizi yapmak mümkündür. Burada, biz, cerrahi olmayan orofaringeal İntratrakeal yönetimini kullanarak LPS yönetmek hastalığı patogenezi ile ilişkili klinik parametrelerini izlemek ve konak immün yanıtı değerlendirmek için, BAL sıvısında kullanmak için yöntemler açıklanmaktadır. Açıklanan tekniklerPAMPs ve patojenlerin çok çeşitli konakçı doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin incelenmesi için yaygın olarak uygulanabilir. Aynı şekilde, minör modifikasyonlarla, bu teknikler, aynı zamanda, alerjik nefes yolu iltihap değerlendiren çalışmalar ve farmakolojik uygulamalarda uygulanabilir.

Gram-negatif bakterilerin hücre duvarları ortamında çok bol LPS, oluşmaktadır. Hassas insan popülasyonlarında LPS solunumu solunum yolu reaktivitesi arttırır ve güçlü bir bağışıklık response11 tetikleme yeteneğine sahiptir. LPS aynı zamanda sağlam bir doğuştan gelen bağışıklık tepkisi ortaya çıkarmak için, fare modellerinde kullanılan bir PAMP olduğunu. Burada açıklanan protokol olarak, fareler, E izole LPS&#39;nin bir o dozunu almıştır coli: orofarengeal bu yönet...

Watch this Scientific Journal Video about The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice at JoVE.com

The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice

Patojen enfeksiyonuna karşı konak bağışıklık tepkisi sıkı bir şekilde düzenlenmiş bir süreçtir. Farelerde bir lipopolisakarit akciğer maruz modeli kullanarak, bu hastalığın patojenezi ile ilgili kompleks mekanizmalar yüksek çözünürlüklü değerlendirme yapmak mümkündür.

Farelerde Host immün yanıtı değerlendirmek için Orofarengeal intratrakeal PAMP İdaresi ve Bronchoalveolar Lavage Kullanımı

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen ...

the-utilization-oropharyngeal-intratracheal-pamp-administration

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.5K Görüntüleme.  Virginia Polytechnic Institute and State University.  Patojen enfeksiyonuna karşı konak bağışıklık tepkisi sıkı bir şekilde düzenlenmiş bir süreçtir. Farelerde bir lipopolisakarit akciğer maruz modeli kullanarak, bu hastalığın patojenezi ile ilgili kompleks mekanizmalar yüksek çözünürlüklü değerlendirme yapmak mümkündür. 

Video: The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of Listeria, which results in systemic infection2. After injection, Listeria quickly disseminates to the spleen and liver due to uptake by CD8&alpha;+ dendritic cells and Kupffer cells3,4. Once phagocytosed, various bacterial proteins enable Listeria to escape the phagosome, survive within the cytosol, and infect neighboring cells5. During the first three days of infection, different innate immune cells (e.g. monocytes, neutrophils, NK cells, dendritic cells) mediate bactericidal mechanisms that minimize Listeria proliferation. CD8+ T cells are subsequently recruited and responsible for the eventual clearance of Listeria from the host, typically within 10 days of infection6.
Successful clearance of Listeria from infected mice depends on the appropriate onset of host immune responses6	. There is a broad range of sensitivities amongst inbred mouse strains7,8. Generally, mice with increased susceptibility to Listeria infection are less able to control bacterial proliferation, demonstrating increased bacterial load and/or delayed clearance compared to resistant mice. Genetic studies, including linkage analyses and knockout mouse strains, have identified various genes for which sequence variation affects host responses to Listeria infection6,8-14. Determination and comparison of infection kinetics between different mouse strains is therefore an important method for identifying host genetic factors that contribute to immune responses against Listeria. Comparison of host responses to different Listeria strains is also an effective way to identify bacterial virulence factors that may serve as potential targets for antibiotic therapy or vaccine design.
We describe here a straightforward method for measuring bacterial load (colony forming units [CFU] per tissue) and preparing single-cell suspensions of the liver and spleen for FACS analysis of immune responses in Listeria-infected mice. This method is particularly useful for initial characterization of Listeria infection in novel mouse strains, as well as comparison of immune responses between different mouse strains infected with Listeria. We use the Listeria monocytogenes EGD strain15 that, when cultured on blood agar, exhibits a characteristic halo zone around each colony due to &beta;-hemolysis1 (Figure 1). Bacterial load and immune responses can be determined at any time-point after infection by culturing tissue homogenate on blood agar plates and preparing tissue cell suspensions for FACS analysis using the protocols described below. We would note that individuals who are immunocompromised or pregnant should not handle Listeria, and the relevant institutional biosafety committee and animal facility management should be consulted before work commences.

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a model organism for studying immune responses and genetic susceptibility to intracellular bacteria in mice. This method enables one to measure bacterial load and generate single-cell suspensions of the liver and spleen from mice for FACS analysis to determine changes in immune cells due to Listeria infection.

Ile Enfekte Fare Bakteriyel Yük ve Bağışıklık Yanıtları Ölçüm Listeria monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. 1A-C), females of the genus Leptopilina (Fig. 1D, 1F, 1G) and Ganaspis (Fig. 1E) attack the larval stages. We use these parasites to study the molecular basis of a biological arms race. Parasitic wasps have tremendous value as biocontrol agents. Most of them carry virulence and other factors that modify host physiology and immunity. Analysis of Drosophila wasps is providing insights into how species-specific interactions shape the genetic structures of natural communities. These studies also serve as a model for understanding the hosts' immune physiology and how coordinated immune reactions are thwarted by this class of parasites.
The larval/pupal cuticle serves as the first line of defense. The wasp ovipositor is a sharp needle-like structure that efficiently delivers eggs into the host hemocoel. Oviposition is followed by a wound healing reaction at the cuticle (Fig. 1C, arrowheads). Some wasps can insert two or more eggs into the same host, although the development of only one egg succeeds. Supernumerary eggs or developing larvae are eliminated by a process that is not yet understood. These wasps are therefore referred to as solitary parasitoids.
Depending on the fly strain and the wasp species, the wasp egg has one of two fates. It is either encapsulated, so that its development is blocked (host emerges; Fig. 2 left); or the wasp egg hatches, develops, molts, and grows into an adult (wasp emerges; Fig. 2 right). L. heterotoma is one of the best-studied species of Drosophila parasitic wasps. It is a "generalist," which means that it can utilize most Drosophila species as hosts1. L. heterotoma and L. victoriae are sister species and they produce virus-like particles that actively interfere with the encapsulation response2. Unlike L. heterotoma, L. boulardi is a specialist parasite and the range of Drosophila species it utilizes is relatively limited1. Strains of L. boulardi also produce virus-like particles3 although they differ significantly in their ability to succeed on D. melanogaster1. Some of these L. boulardi strains are difficult to grow on D. melanogaster1 as the fly host frequently succeeds in encapsulating their eggs. Thus, it is important to have the knowledge of both partners in specific experimental protocols.
In addition to barrier tissues (cuticle, gut and trachea), Drosophila larvae have systemic cellular and humoral immune responses that arise from functions of blood cells and the fat body, respectively. Oviposition by L. boulardi activates both immune arms1,4. Blood cells are found in circulation, in sessile populations under the segmented cuticle, and in the lymph gland. The lymph gland is a small hematopoietic organ on the dorsal side of the larva. Clusters of hematopoietic cells, called lobes, are arranged segmentally in pairs along the dorsal vessel that runs along the anterior-posterior axis of the animal (Fig. 3A). The fat body is a large multifunctional organ (Fig. 3B). It secretes antimicrobial peptides in response to microbial and metazoan infections.
Wasp infection activates immune signaling (Fig. 4)4. At the cellular level, it triggers division and differentiation of blood cells. In self defense, aggregates and capsules develop in the hemocoel of infected animals (Fig. 5)5,6. Activated blood cells migrate toward the wasp egg (or wasp larva) and begin to form a capsule around it (Fig. 5A-F). Some blood cells aggregate to form nodules (Fig. 5G-H). Careful analysis reveals that wasp infection induces the anterior-most lymph gland lobes to disperse at their peripheries (Fig. 6C, D).
We present representative data with Toll signal transduction pathway components Dorsal and Sp&auml;tzle (Figs. 4,5,7), and its target Drosomycin (Fig. 6), to illustrate how specific changes in the lymph gland and hemocoel can be studied after wasp infection. The dissection protocols described here also yield the wasp eggs (or developing stages of wasps) from the host hemolymph (Fig. 8).

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Parasitoid (parasitic) wasps constitute a major class of natural enemies of many insects including Drosophila melanogaster. We will introduce the techniques to propagate these parasites in Drosophila spp. and demonstrate how to analyze their effects on immune tissues of Drosophila larvae.

Paraziter Eşek Arıları Bir Giriş<em&gt; Drosophila</em&gt; Ve antiparaziter İmmün Yanıt

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

A complex interaction between the immune response and host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in particular, is known to occur as a response to infection in mammals 1 and has also recently been described in Drosophila melanogaster2. It is generally accepted that sleep is beneficial to the host during an infection and that it is important for the maintenance of a robust immune system3,4. However, experimental evidence that supports this hypothesis is limited4, and the function of excess sleep during an immune response remains unclear. We have used a multidisciplinary approach to address this complex problem, and have conducted studies in the simple genetic model system, the fruitfly Drosophila melanogaster. We use a standard assay for measuring locomotor behavior and sleep in flies, and demonstrate how this assay is used to measure behavior in flies infected with a pathogenic strain of bacteria. This assay is also useful for monitoring the duration of survival in individual flies during an infection. Additional measures of immune function include the ability of flies to clear an infection and the activation of NF&kappa;B, a key transcription factor that is central to the innate immune response in Drosophila. Both survival outcome and bacterial clearance during infection together are indicators of resistance and tolerance to infection. Resistance refers to the ability of flies to clear an infection, while tolerance is defined as the ability of the host to limit damage from an infection and thereby survive despite high levels of pathogen within the system5. Real-time monitoring of NF&kappa;B activity during infection provides insight into a molecular mechanism of survival during infection. The use of Drosophila in these straightforward assays facilitates the genetic and molecular analyses of sleep and the immune response and how these two complex systems are reciprocally influenced.

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

To understand a link between the immune response and behavior, we describe a method to measure locomotor behavior in Drosophila during bacterial infection as well as the ability of flies to mount an immune response by monitoring survival, bacterial load, and real-time activity of a key regulator of innate immunity, NF&kappa;B.

İmmün Yanıt ve Uyku içinde kantitatif ölçümü<em&gt; Drosophila</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ROS are toxic and function to kill phagocytized microorganisms. In vivo quantification of phagocyte-derived ROS provides information regarding an organism's ability to mount a robust innate immune response. Here we describe a protocol to quantify and compare ROS in whole zebrafish embryos upon chemical induction of the phagocyte respiratory burst. This method makes use of a non-fluorescent compound that becomes fluorescent upon oxidation by ROS. Individual zebrafish embryos are pipetted into the wells of a microplate and incubated in this fluorogenic substrate with or without a chemical inducer of the respiratory burst. Fluorescence in each well is quantified at desired time points using a microplate reader. Fluorescence readings are adjusted to eliminate background fluorescence and then compared using an unpaired t-test. This method allows for comparison of the respiratory burst potential of zebrafish embryos at different developmental stages and in response to experimental manipulations such as protein knockdown, overexpression, or treatment with pharmacological agents. This method can also be used to monitor the respiratory burst response in whole dissected kidneys or cell preparations from kidneys of adult zebrafish and some other fish species. We believe that the relative simplicity and adaptability of this protocol will complement existing protocols and will be of interest to researchers who seek to better understand the innate immune response.

The innate immune response protects organisms against pathogen infection. A critical component of the innate immune response, the phagocyte respiratory burst, generates reactive oxygen species that kill invading microorganisms. We describe a respiratory burst assay that quantifies reactive oxygen species produced when the innate immune response is chemically induced.

Zebra balığı Doğuştan Bağışıklık Sağlık Bir Göstergesi Olarak Solunum Burst Tepki Kantitasyonu

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.

In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.

Fare Makrofagların yılında Doğuştan Bağışıklık Tepkisi Soruşturma RNA girişimi kullanma

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in mice. Recently, myeloid differentiation factor 88 (MyD88) signaling was shown to be important for initial T cell priming and memory T cell development during WNV NS4B-P38G mutant infection. In this study, two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and an intracellular cytokine staining (ICS) &#8211; were utilized to assess dendritic cells (DCs) and T cell functions. In the T cell priming assay, cell proliferation was analyzed by flow cytometry following co-culture of DCs from both groups of mice with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) - labeled CD4+ T cells of OTII transgenic mice. This approach provided an accurate determination of the percentage of proliferating CD4+ T cells with significantly improved overall sensitivity than the traditional assays with radioactive reagents. A microcentrifuge tube system was used in both cell culture and cytokine staining procedures of the ICS protocol. Compared to the traditional tissue culture plate-based system, this modified procedure was easier to perform at biosafety level (BL) 3 facilities. Moreover, WNV- infected cells were treated with paraformaldehyde in both assays, which enabled further analysis outside BL3 facilities. Overall, these in vitro immunological assays can be used to efficiently assess cell-mediated immune responses during WNV infection.

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

Batı Nil Virüsü Mutant Soy Enfeksiyon MyD88-aracılı Hücresel Bağışıklık Tepki Vitro Analizi

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Protective Efficacy and Pulmonary Immune Response Following Subcutaneous and Intranasal BCG Administration in Mice

Despite global coverage of intradermal BCG vaccination, tuberculosis remains one of the most prevalent infectious diseases in the world. Preclinical data have encouraged pulmonary tuberculosis vaccines as a promising strategy to prevent pulmonary disease, which is responsible for transmission. In this work, we describe the methodology used to demonstrate in the mouse model the benefits of intranasal BCG vaccination when compared to subcutaneous. Our data revealed greater protective efficacy following intranasal BCG administration. In addition, our results indicate that pulmonary vaccination triggers a higher immune response in lungs, including Th1 and Th17 responses, as well as an increase of immunoglobulin A (IgA) concentration in respiratory airways. Our data show correlation between protective efficacy and the presence of IL17-producing cells in lungs post-Mycobacterium tuberculosis challenge, suggesting a role for this cytokine in the protective response conferred by pulmonary vaccination. Finally, we detail the global workflow we have developed to study respiratory vaccination in the mouse model, which could be extrapolated to other tuberculosis vaccines, apart from BCG, targeting the mucosal response or other pulmonary routes of administration such as the intratracheal or aerosol.

We herein detail the methodology followed to compare protective efficacy and lung immune response induced by intranasal and subcutaneous immunization with BCG in mouse model. Our results show the benefits of pulmonary vaccination and suggest a role for IL17-mediated response in vaccine-induced protection.

Koruyucu etkinliği ve Pulmoner Bağışıklık Tepkisi Fare Subkutan ve Burun BCG İdaresi ardından

Despite global coverage of intradermal BCG vaccination, tuberculosis remains one of the most prevalent infectious diseases in the world. Preclinical data ...

Inoculating Anopheles gambiae Mosquitoes with Beads to Induce and Measure the Melanization Immune Response

The stimulation of immune responses is a common tool in invertebrate studies to examine the efficacy and the mechanisms of immunity. This stimulation is based on the injection of non-pathogenic particles into insects, as the particles will be detected by the immune system and will induce the production of immune effectors. We focus here on the stimulation of the melanization response in the mosquito Anopheles gambiae. The melanization response results in the encapsulation of foreign particles and parasites with a dark layer of melanin. To stimulate this response, mosquitoes are inoculated with beads in the thoracic cavity using microcapillary glass tubes. Then, after 24 hr, the mosquitoes are dissected to retrieve the beads. The degree of melanization of the bead is measured using image analysis software. Beads do not have the pathogenic effects of parasites, or their capacity to evade or suppress the immune response. These injections are a way to measure immune efficacy and the impact of immune stimulations on other life history traits, such as fecundity or longevity. It is not exactly the same as directly studying host-parasite interactions, but it is an interesting tool to study immunity and its evolutionary ecology.

Inoculating Anopheles gambiae Mosquitoes with Beads to Induce and Measure the Melanization Immune Response

Through inoculation with beads, the described technique enables the stimulation of the mosquito melanization response in the hemolymph circulating system. The amount of melanin covering the beads can be measured after dissection as a measure of the immune response.

aşılanması<em&gt; Anofel gambiae</emMelanization Bağışıklık Tepkisi tetikleyebilecek ve Tedbir Boncuk&gt; ile Sivrisinekler

The stimulation of immune responses is a common tool in invertebrate studies to examine the efficacy and the mechanisms of immunity. This stimulation is ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain insight into an ongoing disease state.
Here, a simple and efficient method is described to perform BAL on murine lungs without the need of special tools or equipment. BAL fluid is isolated by inserting a catheter in the trachea of terminally anesthetized mice, through which a saline solution is instilled into the bronchioles. The instilled fluid is gently retracted to maximize BAL fluid retrieval and to minimize shearing forces. This technique allows the viability, function, and structure of cells within the airways and BAL fluid to be preserved.
Numerous techniques may be applied to gain further understanding of the disease state of the lung. Here, a commonly used technique for the identification and enumeration of different types of immune cells is described, where&#160;flow cytometry is combined with a select panel of fluorescently labeled cell surface-specific markers. The BAL procedure presented here can also be used to analyze infectious agents, fluid constituents, or inhaled particles within murine lungs.

The health status of the lung is reflected by the type and number of immune cells that are present in the bronchioles of the lung. We describe a bronchoalveolar lavage technique that allows the isolation and study of nonadherent cells and soluble factors from the lower respiratory tract of mice.

İnflamatuvar Hücre İnfiltrasyonunu İncelemek İçin Murin Akciğerlerin Bronkoalveoler Lavajı

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique

Extracellular vesicles (EVs) are newly discovered subcellular components that play important roles in many biological signaling functions during physiological and pathological states. The isolation of EVs continues to be a major challenge in this field, due to limitations intrinsic to each technique. The differential ultracentrifugation with density gradient centrifugation method is a commonly used approach and is considered to be the gold standard procedure for EV isolation. However, this procedure is time-consuming, labor-intensive, and generally results in low scalability, which may not be suitable for small-volume samples such as bronchoalveolar lavage fluid. We demonstrate that an ultrafiltration centrifugation isolation method is simple and time- and labor-efficient yet provides a high recovery yield and purity. We propose that this isolation method could be an alternative approach that is suitable for EV isolation, particularly for small-volume biological specimens.

Here, we describe two extracellular vesicle isolation protocols, ultrafiltration centrifugation and ultracentrifugation with density gradient centrifugation, to isolate extracellular vesicles from murine bronchoalveolar lavage fluid samples. The extracellular vesicles derived from murine bronchoalveolar lavage fluid by both methods are quantified and characterized.