Bu eser Alman-İsrail İşbirliği Projesi (DIP) çerçevesinde Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) tarafından İsrail Bilim Vakfı (Hibe 399/11), tarafından ve Araştırma Rappaport Aile Enstitüsü tarafından (kısmen) desteklenmiştir Tıp Bilimleri.

1. Indüklenebilir Hücre Hatları Üretimi <ol><li> İstenen bir hücre hatlarının hazırlanması için kullanılan tüm hücreleri öldüren ilaç G418 asgari konsantrasyonu bulmak için gereken deney öncesinde. Bu amaç için, deney sırasında kullanılan ve G418 artan konsantrasyonlarda (her bir ml için 0-1.000 mg) eklemek olacaktır ortam içinde konfluense% 70 az birkaç çift plaka plaka içinde tercih edilen hücreler. Etkin bir şekilde hücrelerini öldürür en az G418 konsantrasyonunu belirlemek için günlük hücreleri izler. Hücre ölümüne, 3-7 gün içinde görülmüştür. </li><li> Bu shRNA ifade plazmidi üzerinde çalışılan genin ekspresyonu için bir ölçüde azaltabilir geçici transfeksiyon deneylerinde tarafından doğrulanması için tavsiye edilir hücre çizgileri üretimi işleminden önce. Bu, etkin bir şekilde transfekte edilebilir herhangi bir hücre hattı içinde yapılabilir. </li><li> DMEM ortamı (% 10 Tet sy içeren 8 ml, 10 cm tabak başına 6 5x10 etrafında bir hücre yoğunluğunda plaka T-REx-293 hücrelerikök onaylı FBS, 2mM L-glutamin, ml penisilin başına 100 birim ve ml streptomisin başına 0.1 mg, ml blasticidin başına 5 mg). 37 gece boyunca inkübe plakaları ° C,% 5 CO2. </li><li> Ertesi gün, transfeksiyondan önce 8 ml taze ortam ile orta değişir. </li><li> Bir tetrasiklin H1-indüklenebilir promotör, hem de GFP birleşmesini ve bir kurucu PGK promotör tarafından yönlendirilen neomisin-direnç geni tarafından tahrik pSuperior.neo + GFP plasmidi (Şekil 1) kodlama ACF1 veya SNF2h shRNA 10 ug kullanılarak hücrelere transfekte. NaCl 150 mM ile 500 ul DNA ekleyin. Ug DNA başına 2 ul 150 mM NaCI ve 500 ul bir başka alikotu ile jetPIE reaktif ekleyin. DNA jetPIE çözüm ekleyin ve vorteks iyice karıştırın. Oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Yavaşça 70-80% konfluent hücreleri içeren 10 cm plakalar üzerine DNA kompleksleri Pipeti. Inkübatör plakaları dönün. </li><li> Ertesi gün olarak (bir seçici ortam ile DMEM ortamı orta değiştirmek) ml G418 başına ek 500 mikrogram içeren yukarıda tarif. </li><li> Önümüzdeki iki hafta hücreleri izlemek ve koloniler görünür ve bir mikroskop olmadan görsellenebilir kadar her 3-4 günde bir benzer taze ortam ile seçici besiyeri değiştirin için. </li><li> Kolonilerin izolasyonu önce, seçici besiyeri ile 24 kuyucuğu hazırlamak. </li><li> Gözle koloniler tanımlamak ve bir renkli bir işaretleyici kullanılarak plaka alt kısmında da yer işaretleyin. Koloniler de ayrıldığı mikroskop altında doğrulayın. </li><li> Steril kaput ise, hafifçe ılık PBS ile yıkayın ve de tüm kalan sıvı aspire, plaka orta aspire. Tripsin / EDTA plaka üzerinde tek bir koloni 0.25% 3 ul ekleyin. Hücreleri ayırmak ve 24-kuyu plaka kuyu birine eklemeniz kadar art arda tripsin pipet. Plaka üzerinde birçok koloniler için bu işlemi tekrarlayın. </li><li> 37 hücreleri büyümek ° C,% 5 CO 2 kuyunun doldurana kadar. Daha sonra elde edilen hücreleri bölmeüç kuyu, ayrı bir 12-plaka her ve gece inkübe içine orijinal kolonilerin her. </li><li> Ertesi gün, çift damıtılmış su (her bir ml için 1-5 mg) &#39;de hazırlanan bir stok çözeltiden doksisiklin ml başına 1 ug ihtiva eden orta ile bir levha halinde orta değiştirin. Doksisiklin olmadan orta bir kontrol plaka orta değiştirin. 37 de 72 saat boyunca hücreler inkübe ° C,% 5 CO2. </li><li> Protein ekstreleri ve ACF1 veya SNF2h devirme verimi belirlemek için Western blot analizi hazırlanması için her bir hücre klonu da tedavi uygulanan bir ikinci ve bir hücre hasat. Bir yükleme kontrol olarak hizmet veren, aynı zamanda alfa-tübülin antikorlarının olarak ACF1 veya SNF2h antikorlar kullanın. Iyi üçüncü hücreler kullanarak, doksisiklin çalışmalar devam protein düzeyinde en az% 50 azalma sağlamıştır bulunan seçilmiş hücre klonlarının genişleme için, tedavi edilmediği. Daha sonra kullanmak için% 90 FBS,% 10 DMSO içinde, bu hücrelerin alikotları dondurun. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. Nakavt ve Transfeksiyon İndüksiyon <ol><li> 10 cm tabaklar içinde seçici ortam içinde Levha hücreler. Yarım tabak ml başına 1 mikrogram de doksisiklin ekleyin ve 37 inkübe ° C, 48-72 saat (bkz. Şekil 4) için% 5 CO 2. </li><li> 48-72 saat sonra, hücreler her bir grup hücre Trypsinize saymak üzere ve aynı ortam içinde 6 cm tabak başına plaka 1.5x10 6 hücreleri, birlikte ya da doksisiklin olmadan. 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 gece boyunca hücreler inkübe edin. Plan çok bölüm 2.1 &#39;dan plakaların her grup her bir nokta için DAPI tahlil için iki çiftleri yanı sıra her bir numune Western blot analizi için bir plaka (bkz. Şekil 4) içeren 6 cm oniki levhaları için hücreler sağlayacaktır. </li><li> Bir vektör 4 ug ile birlikte, bir 1 ug boş plazmid veya plazmid kodlama E4orf4 özdeş bir miktarı: Ertesi gün plazmid aşağıdaki kombinasyonları ile 6 cm tabaklar içinde hücreleri transfekteACF1-GFP ya da GFP-ifade eden SNF2h sessiz mutasyonlar, veya karşılık gelen boş vektör ve 1 ug plasmid GFP ifade eden (Şekil 4) 3 ug sokulması ile hücre klonları içinde shRNA karşı dirençli hale. Transfeksiyon karışımı hazırlamak için yukarıda tarif edildiği gibi reaktif jetPIE (5 ug DNA başına 10 ul) kullanın. Her örnek için, üç tabak için bir transfeksiyon karışımı hazırlayın. </li><li> Oda sıcaklığında jetPIE reaktif ile bir DNA 15 dakika inkübasyondan sonra, yavaşça üç 6 cm tabak üzerine her bir transfeksiyon karışımı DNA kompleksleri eşit miktarlarda, pipet ve 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 gece boyunca inkübe edilir. </li></ol> 3. Transfekte Hücreler DAPI Assay <ol><li> Ertesi gün, ACF1 veya SNF2h verimli nakavt edildiğini ve E4orf4 farklı örneklerdeki eşit ifade olduğunu belirlemek için Western blot analizi için numune başına bir plaka proteinler ayıklayın. </li><li> DAPI yönelik plakalar orta aspiretahlil, PBS ile yavaşça plakaları yıkama ve hücreler kapak PBS içinde hazırlanmış% 4 paraformaldehid 1 ml ekleyin. Bu kimya ile hücrelerin çözelti paraformaldehit ve tedavi hazırlanması kimyasal bir başlık içinde yapılmalıdır. Sallayarak olmadan oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. </li><li> Paraformaldehit ile 5 dakika aspire her zaman için oda sıcaklığında sallanan, üç kere PBS ile yıkayın. En az 1 saat boyunca -20 ° C, -20 ° C ile inkübe tutulur% 80 etanol ekleyin. Plakalar, bunlar etanol buharlaştırma ve kurutma önlemek için iyi bir sızdırmaz sürece birkaç gün boyunca -20 ° C&#39;de etanol altında tutulabilir. </li><li> Etanol aspire ve PBS ile iki kere yıkayın hücrelerini ve bir kez PBS-BT (PBS,% 0.5 BSA ve% 0.05 Tween-20 içeren) ile, her biri 5 dakika süre için oda sıcaklığında sallanan. </li><li> Oda sıcaklığında sallanan ise non-spesifik antikor bağlayıcı önlemek için, 20 dakika boyunca% 10 keçi serumu ihtiva eden 1 ml PBS-tampon BT hücrelerin bloke eder. Sonra t yıkayınPBS içinde iki kere BT-o hücreleri, her biri 5 dakika yıkama. </li><li> Oda sıcaklığında sallanan ise 1 saat boyunca 1 ml PBS-BT birincil antikor ile hücreler (bu durumda bir E4orf4-spesifik antikor) inkübe edin. Sonra, PBS-BT içinde iki kere yıkayın ve bir defa PBS içinde% 0.1 BSA, 5 dak, her yıkama içeren. </li><li> Karanlıkta oda sıcaklığında, 40 dakika sallama süre için uygun ikincil floresan-etiketli antikor ve DAPI ml nihai konsantrasyon başına 0.5 ug içeren PBS-% 0.1 BSA, 1 ml hücre inkübe edin. Ardından 5 dakika süreyle PBS ile yıkayın aspirasyonu ile iyice kurumasını ve tam kurumanın elde etmek gecede ek bir saat baş aşağı plakaları tutmak. Daha sonra Fluoromount-G çözeltisi kullanarak, hücreler üzerine kapak slaytlar monte edilebilir. 4 at tabak tutun ° C karanlıkta apoptotik çekirdekler saymak için hazır olana kadar. </li><li> Tarafsız bir şekilde yapılabilir böylece çeşitli örneklerde apoptotik nükleus sayma, yeni numaralar tarafından çeşitli levhalar tanımlamak için bir meslektaşım değildir. </li><li> Bir u altında hücreler görselleştirmek400X (hava) veya 630X (immersiyon yağı olarak) bir büyütme pright floresan mikroskop. Her örnek ifade çeşitli proteinler için lekeli ve transfekte hücre popülasyonu içindeki DAPI boyanarak gözlemlenmiştir özet ya da parçalanmış çekirdeklerin sayısını edilir transfekte hücreler tanımlayın. Birkaç alanları izlemek ve en az 200 transfekte hücreler toplam saymak. </li><li> Transfekte hücre popülasyonu içindeki apoptotik morfolojiye sahip çekirdeklerin yüzdesini hesaplayın. Çiftleri ile, deney tekrarlayın 2-3 kez, çeşitli örnekler arasındaki değişikliklerin istatistiksel anlamlılık hesaplamak için. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Gen ekspresyonunun şartlı devirme başarılı olmuştur ki içinde elde kolonilerin verim ilgili gen bağlı olarak değişir. Bizim eller, biz SNF2h için ACF1 ve 18 takım arasından 6 için test 12 üzerinden 7 başarılı koloniler elde edilmiştir. Şekil 2 shSeçilen hücre klonu (Şekil 2A) ve aynı zamanda, tek bir koloni (Şekil 2B) temsili bir plaka ows. Şekil 3, 72 saat için doksisiklin varlığı ya da yokluğu içinde yetiştirilen hücreler çeşitli klonlar elde edilen proteinler ile hazırlanmış bir temsilci blot göstermektedir. Blot bir yükleme kontrol olarak görev SNF2h ve alfa-tubulin antikorları ile boyandı. İki klon (sayısı 4 ve 5) doksisiklin indüksiyon üzerine SNF2h seviyelerinde güçlü bir azalma gösterdi. Şunu belirtmek gerekir ki, her ne kadar pSuperior.neo hücre hatları, neo-GFP füzyon proteinini kodlayan üretimi için kullanılan plazmid + GFP (Şekil 1), stabil hücre hatları da yeşil floresan çok düşük olduğu ve diğer GFP füzyon proteinlerinin ekspresyonu bu hücrelerin içine geçici olarak tanıttı kolayca arkaplanı yeşil floresans yukarıda tespit edilebilmiştir. Deneylerin şematik mea için hücre klonları içinde yürütülenemin ACF1 veya E4orf4 ile indüklenen hücre ölümü üzerindeki SNF2h devirme etkisi Şek. 4. Doksisiklin muamele ile gen ekspresyonu demonte için gereken zaman düzeyleri azaltılması gerekir proteinin stabilitesi bağlı olarak değişebilir. ACF1 ve SNF2h için, 72 saat tedavi protein düzeyinde etkin demonte için gerekli oldu. Şekil 5, E4orf4 ve GFP ifade eden ve bir sıkıştırılmış ya da morfolojisi ile parçalanmış DAPI-lekeli çekirdekleri ortaya çıkması ile kendini gösteren hücre ölümü geçiren hücrelerin bir örneği gösterilmiştir. Şekil 6, doksisiklin ile endüklenen ACF1 portatif bir yol olduğunu gösteren bir temsili deneyin sonuçlarını gösterir E4orf4 ile uyarılan hücre ölümü (Şekil 6A) bir artış görülmektedir. Bu artış E4orf4 düzeyleri (Şekil 6B) bir artış sonucu vermedi. Ayrıca, doksisiklin ile endüklenen hücrelerin ACF1 restorasyon seviyeleri E4orf4 toksisitesinde artışa azaldığı<html> uninduced hücreleri (Şekil 6) gözlendi. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4442/4442fig1.jpg" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4442/4442fig1highres.jpg"/> Şekil 1. Plazmid pSuperior.neo + GFP haritası. Haritası shRNA ifade ve neo-GFP füzyon proteini PGK organizatörü sürüş ifade sürüş tetrasiklin indüklenebilir H1 organizatörü gösterir. Haritayı OligoEngine pSuperior manuel uyarlanmıştır. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/4442/4442fig2.jpg" /> Şekil 2. Bir plaka neomisin dirençli kolonilerin tanımlanması. Görüntü koloniler (A) ihtiva eden ve bir tek koloni (B) gösterilmektedir. Koloniler neomisin içeren bir seçici ortam içinde kültürlenmesi ile 14 gün için hücreler elde edildi. ys &quot;&gt; <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4442/4442fig3.jpg" /> Şekil 3,. Neomisin varlığında seçilmiş çeşitli koloniler seçilmiş koloniler halinde devirme verim incelenmesi. Hücreler çift kuyu içinde ekildi. Her bir numunenin iyi bir doksisiklin (+) ile indüklendi ve bir de edilmiş ve trete edilmemiştir (-). Proteinler, 72 saat sonrası indüksiyon ekstre edilmiş ve SDS-PAGE üzerinde kromatograflanmıştır. Western Blot SNF2h ve alfa-tubulin (bir yükleme kontrol olarak görev) karşı antikorlar ile ardarda lekeli ve isteyerek ve kontrol hücrelerinde SNF2h seviyelerini gösterir oldu. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/4442/4442fig4.jpg" /> Şekil 4. Tipik knockdown-DAPI tahlil denemenizi planlama. Deney Ardışık adımları ACF1 veya SNF2h demonte, ACF1 veya SNF2h ifadeyi geri veya bir emp tanıtmak için bir transfeksiyon ulaşmak için doksisiklin tedavisi de dahil olmak üzere, gösterilirty vektör ve hücre içine E4orf4 ya karşılık gelen boş bir vektör tanıtmak ve sonuçların analizi. Doksisiklin ile tedavi edilen plakalar kırmızı renkle gösterilmiştir (Dox) ve kontrol plakaları mavi renkle işaretlenmiştir. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4442/4442fig4large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/4442/4442fig5.jpg" /> Şekil 5,. Şekil 4&#39;te gösterildiği üzere çeşitli tedavi uygulandı DAPI tahlil ile E4orf4 ile uyarılan hücre ölümü saptanması. Hücreler sabit ve Transfekte edilmiş hücrelerin çekirdeklerinin görselleştirmek için E4orf4-spesifik antikorlar ve DAPI ile boyandı. Bu, belirli bir resim, bir örnek içeren E4orf4 ve kontrol GFP protein alınmıştır. (A) GFP. (B) E4orf4. (C) DAPI. (D) Birleştirilmiş görüntü. Beyaz oklar işareti GFP ve apoptotik morfolojileri ile çekirdekler içeren E4orf4 transfekte hücreler. Kırmızı oklarapoptotik çekirdekler olarak sayılmaz düzensiz şekillere sahip çekirdekler işaretleyebilirsiniz. Sadece bölünmüş Asteriskler işareti mitotik çekirdekleri veya çekirdekler. <img alt="Şekil 6" src="/files/ftp_upload/4442/4442fig6.jpg" /> Şekil 6. ACF1 devirme E4orf4 ile uyarılan hücre ölümünü artırır. (A), bir tetrasiklin indüklenebilir promotör dan ACF1-shRNA eksprese eden T-Rex-293-türevi hücre hattı hücreleri doksisiklin (+ Dox) ya da sol tedavi edilmemiş (-Dox) ile oluşturuldu. Üç gün sonra, hücreler plazmid sessiz girişiyle shRNA dayanıklı hale getirildi boş bir vektör veya GFP etiketli ifade plazmid ACF1, birlikte E4orf4 (+ E4orf4) veya boş bir vektör (-E4orf4) ifade ile transfekte edildi mutasyonlar. Hücreleri yirmi dört saat E4orf4 antikorları ile transfeksiyon ve lekeli sonra ve DAPI ile tespit edildi. Hücre ölümü Asenkron yukarıda tarif edilen yöntemi ve DAPI yüzdesi o ile ölçüldüözet ya da parçalanmış nükleuslu f transfekte hücreler tespit edildi. Üç temsilcisi deney gösterilir çoğaltır ve hata çubukları standart sapma temsil eder. (B) paralel plaka hücreleri Western blot analizi için hasat edildi. Leke E4orf4, GFP ve ACF1 antikorları ile boyandı. Endojen ACF1 ve ACF1-GFP iki ayrı panel gösterilmiştir.

<ol>
	<li>Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+for+stable+expression+of+short+interfering+RNAs+in+mammalian+cells.">A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells.</a> Science (New York, N.Y). 296, 550-553 (2002).</li><li>Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+suppression+of+tumorigenicity+by+virus-mediated+RNA+interference.">Stable suppression of tumorigenicity by virus-mediated RNA interference.</a> Cancer. 2, 243-247 (2002).</li><li>Czauderna, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+shRNA+expression+for+application+in+a+prostate+cancer+mouse+model.">Inducible shRNA expression for application in a prostate cancer mouse model.</a> Nucleic acids research. 31, e127 (2003).</li><li>Matsukura, S., Jones, P. A., Takai, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+conditional+vectors+for+hairpin+siRNA+knockdowns.">Establishment of conditional vectors for hairpin siRNA knockdowns.</a> Nucleic acids research. 31, e77 (2003).</li><li>Wiznerowicz, M., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+suppression+of+cellular+genes:+lentivirus+vector-mediated+drug-inducible+RNA+interference.">Conditional suppression of cellular genes: lentivirus vector-mediated drug-inducible RNA interference.</a> Journal of. 77, 8957-8961 (2003).</li><li>Brestovitsky, A., Sharf, R., Mittelman, K., Kleinberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adenovirus+E4orf4+protein+targets+PP2A+to+the+ACF+chromatin-remodeling+factor+and+induces+cell+death+through+regulation+of+SNF2h-containing+complexes.">The adenovirus E4orf4 protein targets PP2A to the ACF chromatin-remodeling factor and induces cell death through regulation of SNF2h-containing complexes.</a> Nucleic acids research. 39, 6414-6427 (2011).</li><li>Livne, A., Shtrichman, R., Kleinberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+activation+by+adenovirus+E4orf4+protein+is+cell+line-specific+and+is+mediated+by+the+death+receptor+pathway.">Caspase activation by adenovirus E4orf4 protein is cell line-specific and is mediated by the death receptor pathway.</a> J. Virol. 75, 789-798 (2001).</li><li>Shtrichman, R., Kleinberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+type+5+E4+open+reading+frame+4+protein+induces+apoptosis+in+transformed+cells.">Adenovirus type 5 E4 open reading frame 4 protein induces apoptosis in transformed cells.</a> J. Virol. 72, 2975-2982 (1998).</li><li>Shtrichman, R., Sharf, R., Kleinberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+E4orf4+protein+interacts+with+both+Ba+and+B'+subunits+of+protein+phosphatase+2A,+but+E4orf4-induced+apoptosis+is+mediated+only+by+the+interaction+with+Ba.">Adenovirus E4orf4 protein interacts with both Ba and B' subunits of protein phosphatase 2A, but E4orf4-induced apoptosis is mediated only by the interaction with Ba.</a> Oncogene. 19, 3757-3765 (2000).</li><li>Galluzzi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+cell+death+in+higher+eukaryotes.">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes.</a> Cell death and differentiation. 16, 1093-1107 (2009).</li><li>Lavoie, J. N., Nguyen, M., Marcellus, R. C., Branton, P. E., Shore, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E4orf4,+a+novel+adenovirus+death+factor+that+induces+p53-independent+apoptosis+by+a+pathway+that+is+not+inhibited+by+zVAD-fmk.">E4orf4, a novel adenovirus death factor that induces p53-independent apoptosis by a pathway that is not inhibited by zVAD-fmk.</a> J. Cell Biol. 140, 637-645 (1998).</li><li>Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adenovirus+E4orf4+protein+induces+growth+arrest+and+mitotic+catastrophe+in+H1299+human+lung+carcinoma+cells.">The adenovirus E4orf4 protein induces growth arrest and mitotic catastrophe in H1299 human lung carcinoma cells.</a> Oncogene. 28, 390-400 (2009).</li><li>Lavoie, J. N., Champagne, C., Gingras, M. -. C., Robert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+E4+open+reading+frame+4-induced+apoptosis+involves+dysregulation+of+Src+family+kinases.">Adenovirus E4 open reading frame 4-induced apoptosis involves dysregulation of Src family kinases.</a> J. Cell Biol. 150, 1037-1055 (2000).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Belirli gen ekspresyon Nakavt düzenleyici yolaklar bir protein katkısı soruşturma için önemli bir yaklaşımdır. Elzem genlerin ifade bünye knockdown olumsuz hücre çoğalmasını etkiler bu yana, yaptıkları çalışmada geçici siRNA&#39;lar giriş veya sabit koşullu devirme sistemleri uygulama ya gerektirebilir. Burada tarif shRNAs bir ilaca bağlı ifade etme yeteneğine sahip kararlı hücre çizgileri üretimi, bir çok hücre hatları etkili olmayabilir geçici Transfeksiyonlar üzerinde bir avantaj sa...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> Yüksek glukoz DMEM </td><td> Gibco </td><td> 41965 </td><td></td></tr><tr><td> Tet sistemi onaylı FBS </td><td> Clontech </td><td> 631106 </td><td></td></tr><tr><td> L-glutamin </td><td> Gibco </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> Kalem Strep </td><td> Gibco </td><td> 15140 </td><td></td></tr><tr><td> % 0.25 tripsin-EDTA </td><td> Gibco </td><td> 25200 </td><td></td></tr><tr><td> T-Rex-293 hücreleri </td><td> Invitrogen </td><td> R710-07 </td><td></td></tr><tr><td> G418 </td><td> Sigma </td><td> A1720 </td><td></td></tr><tr><td> blasticidin </td><td> InvitRogen&#39;a </td><td> R210-01 </td><td></td></tr><tr><td> plazmid pSuperior.neo + GFP </td><td> OligoEngine </td><td> VEC-PBS-0007/0008 </td><td></td></tr><tr><td> jetPIE </td><td> Polyplus transfeksiyon </td><td> 101-40 </td><td></td></tr><tr><td> doksisiklin </td><td> Sigma </td><td> D9891 </td><td></td></tr><tr><td> paraformaldehid </td><td> Elektron Mikroskopi Bilimleri </td><td> 15710 </td><td></td></tr><tr><td> 4 &#39;,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) </td><td> Sigma </td><td> D9542 </td><td></td></tr><tr><td> Fluoromount-G </td><td> SouthernBiotech </td><td> 0100-01 </td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of cell-lines for conditional knockdown of gene expression and measurement of the knockdown effects on e4orf4-induced cell death

Memeli hücrelerinde gen ekspresyonu Fonksiyonel inaktivasyonu çeşitli yollar 1,2 ilgilendiren bir protein katkı çalışma için çok önemlidir. Kurucu zaman devirme 3-5 uzun bir süre için hücreler tarafından iyi tolere edilmez Bununla birlikte, gen ekspresyonunun şartlı devirme durumlarda gerekir. Burada ACF kromatin remodeling faktör altbirimden koşullu knockdown izin hücre hatlarının hazırlanması için bir protokol açıklar. Bu hücre hatları adenovirüs E4orf4 proteini tarafından 6 hücre ölümü indüksiyonu için ACF katkısının belirlenmesi kolaylaştırmak. ACF kromatin yeniden faktörü ACF1 ve SNF2h alt birimleri için kısa firkete RNA kodlayan diziler aynı zamanda neomisin direnç geni için bir geni içeren bir plazmid içinde bir doksisiklin-indüklenebilir promotör yanında klonlandı. Neomisin dirençli hücre klonları izole edilmiş ve G418 varlığında seçilmiştir. Sonuçta elde edilen hücre hatları ile uyarıldığındadoksisiklin tedavi, ve bir kez ACF1 SNF2h ya da ekspresyon düzeyleri azalmıştır, hücre bir plazmid kodlama E4orf4 veya boş vektör ile transfekte edildi. ShRNA yapıların belirli etkisini teyit etmek için, ACF1 veya SNF2h protein seviyeleri sessiz mutasyon dahil edilmesi ile shRNA karşı dirençli hale getirildi ifade eden bir plasmidin ACF1 veya SNF2h ile kotransfeksiyonu ile WT düzeylerine geri alındı. Çeşitli örneklerde hücre ölümünü teşvik etmek için E4orf4 yeteneği transfekte edilmiş bir hücre popülasyonunda apoptoz morfolojiye sahip çekirdeklerin görünüm frekans 7-9 ölçüldüğü bir DAPI tahlil ile belirlenmiştir. Yapıcı devirme hücre öldürücü olabilir burada açıklanan protokol durumlarda bunların protein partnerleri tarafından hücre ölümü indüksiyonu için çeşitli proteinlerin işlevsel katkı belirlenmesi için kullanılabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Cell-lines for Conditional Knockdown of Gene Expression and Measurement of the Knockdown Effects on E4orf4-Induced Cell Death at JoVE.com

Preparation of Cell-lines for Conditional Knockdown of Gene Expression and Measurement of the Knockdown Effects on E4orf4-Induced Cell Death

E4orf4 ile uyarılan hücre ölümüne ACF kromatin yeniden faktör katkı ölçüldü. Protokol doksisiklin tedavi ACF alt birimleri ACF1 ve SNF2h koşullu devirme neden olduğu hücre klonlarının seçimi içermektedir, ve indüklenebilir hücre hatlarında E4orf4 ile uyarılan hücre ölümü ölçmek için DAPI tahlil kullanımı.

E4orf4 Bağlı Hücre Ölümü üzerine Nakavt Etkilerinin Gen Ekspresyonu ve Ölçüm Şartlı Nakavt için Hücre hatları hazırlanması

Functional inactivation of gene expression in mammalian cells is crucial for the study of the contribution of a protein of interest to various ...

preparation-cell-lines-for-conditional-knockdown-gene-expression

Research

JoVE Journal

Biology

10.9K Görüntüleme.  Technion - Israel Institute of Technology. E4orf4 ile uyarılan hücre ölümüne ACF kromatin yeniden faktör katkı ölçüldü. Protokol doksisiklin tedavi ACF alt birimleri ACF1 ve SNF2h koşullu devirme neden olduğu hücre klonlarının seçimi içermektedir, ve indüklenebilir hücre hatlarında E4orf4 ile uyarılan hücre ölümü ölçmek için DAPI tahlil kullanımı.

Video: Preparation of Cell-lines for Conditional Knockdown of Gene Expression and Measurement of the Knockdown Effects on E4orf4-Induced Cell Death

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Hazırlık Elektroporasyon murin Kemik İliği itibaren İlköğretim Hematopoetik Hücre Kültürleri

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Biyoloji

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Yüksek Verimli Primer Hücre Transfect Gen Verici MXcell Elektroporasyon Sistemi

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Gen İfadesi Çalışmaları basitleştirin Otomatik Hücre Sayıcı kullanma: Namalwa Hücreler IL-4 Bağımlı Gen İfadesi siRNA demonte

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Parafin ve Dondurulmuş Bölüm Drosophila Yetişkin Kaslar

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Active T. in vitro Sulandırma castaneum Telomeraz

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells (HSCs) differentiate into oligopotent progenitors, committed precursors and mature red blood cells 1. This process is regulated for a large part at the level of gene expression, whereby specific transcription factors activate lineage-specific genes while concomitantly repressing genes that are specific to other cell types 2. Studies on transcription factors regulating erythropoiesis are often performed using human and murine cell lines that represent, to some extent, erythroid cells at given stages of differentiation 3-5. However transformed cell lines can only partially mimic erythroid cells and most importantly they do not allow one to comprehensibly study the dynamic changes that occur as cells progress through many stages towards their final erythroid fate. Therefore, a current challenge remains the development of a protocol to obtain relatively homogenous populations of primary HSCs and erythroid cells at various stages of differentiation in quantities that are sufficient to perform genomics and proteomics experiments.
Here we describe an ex vivo cell culture protocol to induce erythroid differentiation from human hematopoietic stem/progenitor cells that have been isolated from either cord blood, bone marrow, or adult peripheral blood mobilized with G-CSF (leukapheresis). This culture system, initially developed by the Douay laboratory 6, uses cytokines and co-culture on mesenchymal cells to mimic the bone marrow microenvironment. Using this ex vivo differentiation protocol, we observe a strong amplification of erythroid progenitors, an induction of differentiation exclusively towards the erythroid lineage and a complete maturation to the stage of enucleated red blood cells. Thus, this system provides an opportunity to study the molecular mechanism of transcriptional regulation as hematopoietic stem cells progress along the erythroid lineage. 
Studying erythropoiesis at the transcriptional level also requires the ability to over-express or knockdown specific factors in primary erythroid cells. For this purpose, we use a lentivirus-mediated gene delivery system that allows for the efficient infection of both dividing and non-dividing cells 7. Here we show that we are able to efficiently knockdown the transcription factor TAL1 in primary human erythroid cells. In addition, GFP expression demonstrates an efficiency of lentiviral infection close to 90%. Thus, our protocol provides a highly useful system for characterization of the regulatory network of transcription factors that control erythropoiesis.

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

An ex vivo protocol to generate mature human red blood cells from hematopoietic stem/progenitors is described. Additionally we describe an efficient lentiviral-delivery method to knockdown the transcription factor TAL1 in primary erythroid cells. The efficiency of lentivirus mediated gene delivery is demonstrated using GFP expressing viruses.

Lentiviral aracılı demonte sırasında Ex vivo İnsan Hematopoetik Kök Hücre Eritropoiesis

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression analyses by RNA interference and stable transgenesis remain limited in many species due to the particular anatomy and molecular cellular biology of the organism. For example, outside of the crown group Caenorhabditis that includes Caenorhabditis elegans3, stably transmitted transgenic lines in non-Caenorhabditis species have not been reported in this specious phylum (Nematoda), with the exception of Strongyloides stercoralis4 and Pristionchus pacificus5. To facilitate the expanding role of P. pacificus in the study of development, evolution, and behavior6-7, we describe here the current methods to use microinjection for making transgenic animals and gene knock down by RNAi. Like the gonads of C. elegans and most other nematodes, the gonads of P. pacificus is syncitial and capable of incorporating DNA and RNA into the oocytes when delivered by direct microinjection. Unlike C. elegans however, stable transgene inheritance and somatic expression in P. pacificus requires the addition of self genomic DNA digested with endonucleases complementary to the ends of target transgenes and coinjection markers5. The addition of carrier genomic DNA is similar to the requirement for transgene expression in Strongyloides stercoralis4 and in the germ cells of C. elegans. However, it is not clear if the specific requirement for the animals' own genomic DNA is because P. pacificus soma is very efficient at silencing non-complex multi-copy genes or that extrachromosomal arrays in P. pacificus require genomic sequences for proper kinetochore assembly during mitosis. The ventral migration of the two-armed (didelphic) gonads in hermaphrodites further complicates the ability to inject both gonads in individual worms8. We also demonstrate the use of microinjection to knockdown a dominant mutant (roller,tu92) by injecting double-stranded RNA (dsRNA) into the gonads to obtain non-rolling F1 progeny. Unlike C. elegans, but like most other nematodes, P. pacificus PS312 is not receptive to systemic RNAi via feeding and soaking and therefore dsRNA must be administered by microinjection into the syncitial gonads. In this current study, we hope to describe the microinjection process needed to transform a Ppa-egl-4 promoter::GFP fusion reporter and knockdown a dominant roller prl-1 (tu92) mutant in a visually informative protocol.

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

In model organisms, transgenesis can manipulate gene functions while RNAi can knockdown specific mRNA transcripts 1-2. This protocol aims to illustrate the techniques needed to introduce stably transmitted DNA and transient double stranded RNA into the necromenic nematode Pristionchus pacificus for studies in evolutionary, developmental, and behavioral biology.

RNAi Necromenic nematodu Mikroenjeksiyon Gen demonte ve Transgenesis aracılığı ile Pristionchus pacificus</em

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression ...

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion rate. This method can be used to obtain a better understanding of the process of diuresis in insects and is especially useful in the study of diuresis in blood-feeding arthropods that are able to take up huge amounts of liquid in a single blood meal. 
This RNAi-mediated gene knockdown combined with an in vivo diuresis assay was developed by the Hansen lab to study the effects of RNAi-mediated knockdown of aquaporin genes on Aedes aegypti mosquito diuresis1. 
The protocol is setup in two parts: the first demonstration illustrates how to construct a simple mosquito injection device and how to prepare and inject dsRNA into the thorax of mosquitoes for RNAi-mediated gene knockdown. The second demonstration illustrates how to determine excretion rates in mosquitoes using an in vivo bioassay.

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

In this protocol we combine RNAi-mediated gene silencing with an in vivo diuresis assay to study the effects knockdown of genes of interest has on mosquito fluid excretion.

RNAi-aracılı Gene Nakavt ve<em&gt; In Vivo</emYetişkin Kadınlar&gt; diürez Testi<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; Sivrisinekler

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion ...

Generation of Stable Human Cell Lines with Tetracycline-inducible (Tet-on) shRNA or cDNA Expression

A major approach in the field of mammalian cell biology is the manipulation of the expression of genes of interest in selected cell lines, with the aim to reveal one or several of the gene's function(s) using transient/stable overexpression or knockdown of the gene of interest. Unfortunately, for various cell biological investigations this approach is unsuitable when manipulations of gene expression result in cell growth/proliferation defects or unwanted cell differentiation. Therefore, researchers have adapted the Tetracycline repressor protein (TetR), taken from the E. coli tetracycline resistance operon1, to generate very efficient and tight regulatory systems to express cDNAs in mammalian cells2,3. In short, TetR has been modified to either (1) block initiation of transcription by binding to the Tet-operator (TO) in the promoter region upon addition of tetracycline (termed Tet-off system) or (2) bind to the TO in the absence of tetracycline (termed Tet-on system) (Figure 1). Given the inconvenience that the Tet-off system requires the continuous presence of tetracycline (which has a half-life of about 24 hr in tissue cell culture medium) the Tet-on system has been more extensively optimized, resulting in the development of very tight and efficient vector systems for cDNA expression as used here.
Shortly after establishment of RNA interference (RNAi) for gene knockdown in mammalian cells4, vectors expressing short-hairpin RNAs (shRNAs) were described that function very similar to siRNAs5-11. However, these shRNA-mediated knockdown approaches have the same limitation as conventional knockout strategies, since stable depletion is not feasible when gene targets are essential for cellular survival. To overcome this limitation, van de Wetering et al.12 modified the shRNA expression vector pSUPER5 by inserting a TO in the promoter region, which enabled them to generate stable cell lines with tetracycline-inducible depletion of their target genes of interest.
Here, we describe a method to efficiently generate stable human Tet-on cell lines that reliably drive either inducible overexpression or depletion of the gene of interest. Using this method, we have successfully generated Tet-on cell lines which significantly facilitated the analysis of the MST/hMOB/NDR cascade in centrosome13,14 and apoptosis signaling15,16. In this report, we describe our vectors of choice, in addition to describing the two consecutive manipulation steps that are necessary to efficiently generate human Tet-on cell lines (Figure 2). Moreover, besides outlining a protocol for the generation of human Tet-on cell lines, we will discuss critical aspects regarding the technical procedures and the characterization of Tet-on cells.

Generation of Stable Human Cell Lines with Tetracycline-inducible Tet-on shRNA or cDNA Expression

A rapid and simple way to generate human cell lines with inducible and reversible cDNA overexpression or shRNA-mediated knock-down of the gene of interest. This method enables researchers to reliably and highly reproducibly manipulate cell lines that are difficult to alter by transient transfection methods or conventional knockdown/knockout strategies.

Tetrasiklin-indüklenebilir (Tet-on) shRNA veya cDNA Expression Durağan İnsan Hücre Üretimi

A major approach in  the field of mammalian cell biology is the manipulation of the expression of  genes of interest in selected cell lines, with the aim ...

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well when a small number of genes are targeted for knockdown, large scale feeding screens show variable knockdown efficiencies, which limits their utility. We have deconstructed previously published RNAi knockdown protocols and found that the primary source of the reduced knockdown can be attributed to the loss of dsRNA-encoding plasmids from the bacteria fed to the animals. Based on these observations, we have developed a dsRNA feeding protocol that greatly reduces or eliminates plasmid loss to achieve efficient, high throughput knockdown. We demonstrate that this protocol will produce robust, reproducible knock down of C. elegans genes in multiple tissue types, including neurons, and will permit efficient knockdown in large scale screens. This protocol uses a commercially available dsRNA feeding library and describes all steps needed to duplicate the library and perform dsRNA screens. The protocol does not require the use of any sophisticated equipment, and can therefore be performed by any C. elegans lab.

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

While dsRNA feeding in C. elegans is a powerful tool to assess gene function, current protocols for large scale feeding screens result in variable knockdown efficiencies. We describe an improved protocol for performing large scale RNAi feeding screens that results in highly efficacious and reproducible knockdown of gene expression.

Büyük ölçekli Gen demonte olarak<em&gt; C. elegans</em&gt; Sağlam Kayıp fonksiyon-fenotipleri oluşturmak için DsRNA Besleme Kitaplıklar kullanma

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well ...