Biz tartışma için Buchholz laboratuar ve Sigma-Aldrich RNAi ekibi üyeleri kabul etmek istiyorum. Max-Planck-Society ve Bundesministerium für Bildung und Forschung grands destek için [0315105]-Bio teşekkür etmek istiyorum. MİSYON ® Sigma-Aldrich Biyoteknoloji LP tescilli markasıdır.

1. Yüksek kaliteli MİSYON esiRNA kütüphaneler <ol><li> Ilgi her gen için DEQOR algoritma (http://cluster-1.mpi-cbg.de/Deqor/deqor.html) kullanan RNAi için en duyarlı ve spesifik bir hedef bölge seçilen 4 DEQOR puanları tüm susturma potansiyeli state-of-sanat tasarım kısıtlamaları 4 dayalı bir hedef-mRNA mümkün 21 nükleotidler uzun siRNA&#39;lar. Buna ek olarak, her bir potansiyel siRNA okudu organizmanın transcriptome karşı BLAST arama yaparak diğer genlerin olası çapraz reaktivite açısından analiz edilir. Bu program, böylece genel kalitesi ve potansiyel esiRNA (300-600 bp uzunluğunda) çapraz susturulması kapasiteleri bir analiz sağlar. </li><li> CDNA hedef genin seçtiğiniz bölge bakteriyofaj RNA polimeraz-organizatörü dizileri ile çevrili gen-spesifik primerler kullanılarak PCR ile yükseltilir. </li><li> MİSYON esiRNA üretimi için kullanılan her bir PCR ürünü kaliper Labchip analiz, sıralama tarafından kimlik ve saflık doğrulandı. </li><li> Uzun çift iplikli RNA, RNA polimeraz tarafından transkripsiyonu ipliklerini tavlama takip PCR ürün transkripsiyonu. </li><li> esiRNAs Q-sepharose dönüş sütunlarını kullanarak anyon değişim kromatografisi ile saflaştırılması tarafından takip RNaseIII kullanarak uzun çift iplikli RNA sınırlı enzimatik sindirimi tarafından hazırlanmıştır. </li><li> esiRNAs çöktürülmüş ve TE tamponunda yeniden süspanse. Verimi UV-emme ölçümleri ile ölçülür ve konsantrasyonu TE tamponu uygun bir hacim içinde eriterek ayarlanır. Nihai ürünün genel kalitesini kaliper Labchip analizi ile kontrol edilir. </li></ol> 2. Bir hücre hattı seçimi ve tarama için optimize transfeksiyon <ol><li> Titre esiRNA (pozitif ve negatif kontrol olarak renilla lusiferaz olarak kullanılması Eg5) ve 384 plaka transfeksiyon reaktif miktarları artan miktarda, hücre ve 48 saat süreyle inkübe ekleyin. Eg5 bipolar mili montaj ve tükenme için gerekli bir kinesin motor proteindir mitotik tutuklanmasına yol açar. Farklı transfeksiyon ayıraçları ve hücre hatları için bu yordamı tekrarlayın. Burada, transfeksiyon reaktif gibi standart prosedürler ve oligofectamine (Invitrogen) kültürlü HeLa hücreleri kullanır. </li><li> Optimal transfeksiyon koşulları seçimi için bir mitotik arrest (yuvarlak) ve renilla lusiferaz (RLUC) esiRNA ışık mikroskobu ile transfekte hücrelerin toplam sayısı gösteriyor Eg5 esiRNAs transfekte hücreler sayılır. RLUC için en az toksisite ve Eg5 için en belirgin fenotip durumu seçin. Transfeksiyon koşulları optimize etmek için alternatif bir yöntem EGFP (veya uygun başka bir muhabir geni) kurucu aktif organizatörü kontrol altında ifade istikrarlı bir hücre hattı içerir. EGFP (veya başka bir muhabir geni) ve RLUC (veya başka bir uygun negatif kontrol esiRNA) örneğin floresan destekli cep sıralama (FACS) ile ölçü knock-down etkinlik ve toksisite karşı esiRNA transfeksiyon sonra. EGFP için kullanılan esiRNA hedef mRNA tamamen tamamlayıcı olduğundan emin olun. </li></ol> 3. İlköğretim ekran 5,6 Kurma <ol><li> Pipetleme doğruluğu otomatik pipetleme istasyonu (örneğin, Kova, Tecan ve WellMate, Matrix) tüm bileşenleri için optimize edin. Pipetleme parametreleri çözüm, hacim ve plaka tipi türüne bağlı olarak değişir Bu nedenle optimizasyon her adımı için ayrı ayrı tekrarlanmalıdır. Mümkünse, pipetleme istasyonu Bulaşmayı önlemek için laminer akış kaputun altında yer olmalıdır. Tüm kullanılan bileşenler varsa otoklavlanarak veya% 75 etanol ile püskürterek birini kullanmadan önce sterilize edilmelidir. Kuyudan çapraz kontaminasyon hariç böylece yıkama protokolleri optimize edin. Optimizasyonu için otomatik pipetleme Ayrıntılar alan kısıtlamaları vermek ve büyük ölçüde kullanılan pipetleme istasyonu bağlı olamaz. Daha fazla bilgi için protokol üretmektedir bakın. </li><li> Eg5 ve RLUC esiRNAs yukarıda optimize koşulları kullanarak 384-well formatında Transfect hücreleri. Eg5 ve RLUC esiRNA için bütün plaka kapsayan bir alternatif desen kullanın. </li><li> 48 saat inkübasyon soğuk% 100 etanol ile hücreleri düzelttikten sonra, 1 mcg / ml DAPI ve 100 mg / ml RNaz A (Qiagen) içeren PBS ile 25 dakika leke, 15 dakika süreyle PBS içinde rehidrate. Son olarak 4 PBS ve mağaza ile yıkayın ° C </li><li> DAPI-floresan mikroskopi örneğin Olympus ScanR sistemi Tedbir yoğunluğu. Hücre sayısı karşı DAPI yoğunluğu planladığı bir histogram oluşturun ve G1-faz için DNA içeriği 2N hücrelerin yüzdesi hesaplanarak hücre döngüsü dağıtım değerlendirmek; &lt;2N&gt; S-faz için 4N; G2/M-phase için 4N &gt; anöploidi / poliploidi 4N. </li><li> Homojenliği plaka üzerinde sonuçları değerlendirin. Konum effe dışlamak için önemli bir farklılık daha fazla optimizasyon gereklicts. Çok iyi plakaları kullanarak yaygın bir sorun, inkübasyon süresi sırasında kenar kuyularında gelişmiş buharlaşma. Bu genellikle plaka pozisyonu belirli etkileri çevirir farklı kuyular, farklı deneysel koşullar yol açar. Bu nedenle, boş bir ekran için tüm kenar kuyular terk tavsiye ederiz. Daha sonra buharlaşma inkübatörler yüksek nem muhafaza emin olun en aza indirmek için. Ayrıca rutin buharlaşma blok Corning Nefes Sızdırmazlık Tape gibi buharlaşma engelleri istihdam. Ayrıca diğer kaynaklar konumunu etkiler, göz okuma sistemi örneğin teknik varyasyonu (mikroskop, plaka okuyucu, vb.) Ya da sıvı taşıma varyasyonlar (degradeler, homojen çözüm, vb) içine alınmalıdır. </li><li> Pozitif ve negatif kontroller arasında istatistiksel farklılık istihdam edilen testin önemi bir ölçü sağlar. Negatif kontrol (veya arka plan gürültüsü, mock-kontrol) arasında büyük bir fark ve örnek gerçek tarama başlatmadan önce kurulmuş olması gerekir. Istatistiksel anlamlılık için iyi bir önlem Z-faktördür. Z-faktör denklemi aşağıdaki şekilde hesaplanır: Z = 1 - (3 SD [örnek] + 3 SD [alay]) * (| Av [örnek] - Av [alay] |) -1 SD: standart sapma, ortalamanın Av. A dan Z ye 1-faktör&gt; Z&gt; 0.5, negatif kontrol, pozitif kontroller 7 istatistiksel olarak anlamlı bir ayırma (gürültü) gösterir . </li></ol> 4. Birincil ekran <ol><li> Yukarıdan optimize koşullar kullanan esiRNAs transfeksiyon 384-iyi doku kültürü tabak hazırlayın. Burada, her iyi 5μl TE tampon içinde çözünmüş 15ng esiRNA kullanın. Plaka başına en az sekiz kontrol pozisyonları incelenen biyolojik bir süreç için uygun pozitif ve negatif kontroller (Eg5 ve RLUC) yüklü olmalıdır. Kenarına kuyu önlemek konumunu etkiler sadece 5μl TE tamponu ile yüklenir. </li><li> 5μl OptiMEM (Invitrogen) yanı başına 0.2μl Oligofectamine içeren ekleyin, karıştırın ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. </li><li> 72 saat hücre süspansiyonu ve inkübe;: (1000 hücre başına eşdeğer bir HeLa hücre süspansiyonu 25 hücre / ml konsantrasyonu 40μl) transfeksiyon karışımı üzerine ekleyin. </li><li> Otomatik bir mikroskop (Olympus ScanR, yukarıya bakınız) DNA içeriği ölçün. Z-skoru, referans olarak negatif kontrol için sinyal kullanarak tüm numune esiRNAs hesaplanır: isabet seçim Z-skoru istatistikleri kullanarak değerlendirin. Not, Z-skoru Z-faktör olarak aynı değildir. Z-skoru (sahte) kontrol ile karşılaştırıldığında istatistiksel bir ölçüsüdür örnek değerler önemi sağlar. Bu denklemi şu şekilde hesaplanır: Z = (değer [Örnek] - ortalama [alay]) * standart sapma [alay] -1. Hit seçimi için bir eşik uygulanmak zorundadır. Tipik olarak, bir önemi kriterler: 2 &lt;Z &lt;-2, ancak veri kalitesine bağlı olarak, biyolojik bir süreç ya da sadece ekran kapsamında incelenir, farklı eşikleri geçerli olabilir. Oldukça kolay Z-skoru istatistikleri yanı sıra aynı zamanda daha ayrıntılı matematiksel değerlendirme yöntemleri kullanılabilir (tarama verilerinin istatistiksel değerlendirme geniş bir alana ilk iç Malo et al bulunabilir 8 ). </li></ol> 5. İkincil ekran ve hit doğrulama <ol><li> İkincil ekran nedeniyle yanlış pozitif deneysel hatalar ya da off-hedef etkilerini ortadan kaldırmak için birincil ekran izler. Seçilen hit için birincil ekran olarak kullanılan aynı prosedürü daha iyi bir istatistik değerlendirme izin çoğaltır, daha büyük bir sayı (3-5) tekrar edilmelidir. </li><li> Doğrulanmış hit için ilk ekranlarında belirlenen hedeflere karşı ikincil bir örtüşmeyen esiRNA (veya başka bir örtüşmeyen susturulması tetik) kullanılmalıdır. Aynı tahlil ve okuma-out birincil ekran olarak uygulanmalıdır. </li><li> Sonuçta seçilen genler, türler arası RNAi kurtarma 9 doğrulanabilir . Böylece örneğin bir bakteri geni fare orthologunu yapay kromozomu (BAC) kodlama stably hücrelerine transfekte. BAC-genomik bağlamda bir gen yapıları korumak ve neredeyse fizyolojik bir ifade için izin. Endojen insan gen karşı RNAi RNAi-fenotip kurtarır fare transgen ifadesi değişmeden bırakacaktır. RNAi-kurtarma, bugüne kadar RNAi fenotipleri doğrulanması için altın standart sağlar. </li><li> Son olarak, doğrulanmış adaylar sonunda mekanistik anlayış elde etmek için daha ayrıntılı olarak incelenmiştir. Birçok durumda RNAi ikincil, daha ayrıntılı testlerin, örneğin, bu deneylerde kullanılan olabilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Ghildiyal, M., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+silencing+RNAs:+an+expanding+universe.">Small silencing RNAs: an expanding universe.</a> Nat Rev Genet. 10, 94-108 (2009).</li><li>Jackson, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profiling+reveals+off-target+gene+regulation+by+RNAi.">Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi.</a> Nat Biotechnol. 21, 635-637 (2003).</li><li>Echeverri, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimizing+the+risk+of+reporting+false+positives+in+large-scale+RNAi+screens.">Minimizing the risk of reporting false positives in large-scale RNAi screens.</a> Nat Methods. 3, 777-779 (2006).</li><li>Henschel, A., Buchholz, F., Habermann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DEQOR:+a+web-based+tool+for+the+design+and+quality+control+of+siRNAs.">DEQOR: a web-based tool for the design and quality control of siRNAs.</a> Nucleic Acids Res. 32, W113-W120 (2004).</li><li>Kittler, R., Pelletier, L., Buchholz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+biology+of+mammalian+cell+division.">Systems biology of mammalian cell division.</a> Cell Cycle. 7, 2123-2128 (2008).</li><li>Kittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+RNAi+profiling+of+cell+division+in+human+tissue+culture+cells.">Genome-scale RNAi profiling of cell division in human tissue culture cells.</a> Nat Cell Biol. 9, 1401-1412 (2007).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).</li><li>Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+practice+in+high-throughput+screening+data+analysis.">Statistical practice in high-throughput screening data analysis.</a> Nat Biotechnol. 24, 167-175 (2006).</li><li>Kittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+rescue+by+bacterial+artificial+chromosome+transgenesis+in+mammalian+tissue+culture+cells.">RNA interference rescue by bacterial artificial chromosome transgenesis in mammalian tissue culture cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 2396-2401 (2005).</li><li>Kittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+resources+for+endoribonuclease-prepared+short+interfering+RNAs+for+specific+loss-of-function+studies.">Genome-wide resources for endoribonuclease-prepared short interfering RNAs for specific loss-of-function studies.</a> Nat Methods. 4, 337-344 (2007).</li></ol>

Yazarlar sunulan iş bir ilgi olabilir ticari kuruluşlar ile mali ilişkileri beyan ederim.

RNA girişim-fonksiyon kaybı fenotipleri incelemek için standart bir teknik haline gelmiştir. RNAi mediatörlerin Büyük ölçekli koleksiyonları farklı tedarikçilerden mevcuttur ve gen susturulması için kolay, maliyet-etkin ve hızlı bir yöntem sağlamak. Bu farklı türler ve hücre türleri geniş bir yelpazede bir genom ölçekli bir bakış açısı sağlayan birçok biyolojik süreçlerde anahtar oyuncular için sistematik tarama için kapı açtı. Yüksek yanlış pozitif ve yanlış negatif oranları RNAi ekranlarında ortak bir meydan okuma. Bu sorunu çözmek için, etkinliğini artırmak için önemli çabalar yatırım ve özellikle de sessizliğini özgüllüğü tetikler edilmiştir. Önemli bir keşif aynı transkript hedefleyen farklı siRNA&#39;lar bir havuz hedef özgüllüğü büyük ölçüde artırdığını oldu. Çok karmaşık, farklı siRNA&#39;lar bir havuz endoribonuclease tarafından üretilen olduğundan, esiRNAs RNAi ekranlarında yalancı pozitiflik oranı azaltmak, yüksek hedef özgüllüğü tetikler. esiRNAs aynı zamanda da yanlış negatif oranının azaltılması, etkili knockdowns ulaşmak için göstermiştir. RNAi ekranları teknik olarak zor olduğundan, muhtemelen bir süre için bir rutin olarak gerçekleştirmek zor kalacaktır. Ancak, reaktifler ve araçlar daha iyi ve daha laboratuvarlar kendi uzmanlık pay almak, modern biyolojinin RNAi ekranların kullanımı gelecekte artırmak için kabul edilir.

<table border="1">
<tr>
<td>Material Name</td>
<td>Type</td>
<td>Company</td>
<td>Catalogue Number</td>
<td>Comments</td>
</tr>	
<tr>
<td>MISSION esiRNA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>For additional information contact: rnai@sial.com</td>
</tr>
<tr>
<td>Wellmate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ThermoScientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Breathable sealing tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>Breathable Sealing Tape, Sterile (Product #3345)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>OptiMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=E7023|SIAL&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&F=SPEC&cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12346">Ethanol</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>E7023</td>
<td>200 proof (absolute), for molecular biology</td>
</tr>
<tr>
<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=P5493|SIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&F=SPEC&cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12347">Phosphate buffered saline</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P5493</td>
<td>BioReagent, 10x concentrate, suitable for cell culture, for molecular biology</td>
</tr>
<tr>
<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=D8417|SIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&F=SPEC&cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12348">4&#x2032;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>D8417</td>
<td>Poweder, BioReagent, suitable for cell culture, >98% (HPLC and TLC)</td>
</tr>
<tr>
<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=R6513|SIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&F=SPEC&cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12349">Ribonuclease A from bovine pancreas</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>R6513</td>
<td>For molecular biology, &ge;70 Kunitz units/mg protein, lyophilized powder</td>
</tr>
<tr>
<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=T9285|SIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&F=SPEC&cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12350">Tris-EDTA buffer solution</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T9285
</td>
<td>100 x, for molecular biology</td>
</tr>
</table>

mission esirna for rnai screening in mammalian cells

RNA enterferans (RNAi) gen ekspresyonunun kontrolü için temel bir hücresel mekanizmadır. RNAi küçük müdahale RNA&#39;lar (siRNA) olarak da bilinen kısa çift iplikçikli RNA&#39;lar tarafından indüklenir. Kısa çift iplikçikli RNA&#39;lar Dicer, endonükleazları RNaz III ailesinin bir protein aktivitesini daha uzun çift zincirli öncüleri kaynaklanır. Çıkan parçaları cognate hedef mRNA yönetmenlik, RNA-indüklenmiş susturulması kompleksi (RISC) bileşenleridir. RISC böylece kodlanmış protein 1,2,3 ifade azaltılması hedef mRNA parçalayarak. RNAi küçük müdahale RNA&#39;lar kullanan memeli hücrelerinde gen fonksiyon testleri kaybı için güçlü ve yaygın olarak kullanılan deneysel bir yöntem haline gelmiştir. Şu anda küçük müdahale RNA&#39;lar üretimi için iki ana yöntem mevcuttur. Bir yöntem, alternatif bir yöntem in vitro RNaz III hedef özgü uzun çift iplikçikli RNA&#39;lar endonucleolytic bölünme istihdam ise kimyasal sentez içerir. Böylece, siRNA-benzeri çeşitli bir havuz oligonükleotidler endoribonuclease hazırlanmış siRNA veya esiRNA olarak da bilinir üretilir. Kimyasal olarak elde edilen siRNA&#39;lar ve esiRNAs etkinliğinin karşılaştırılması, her iki tetikler hedef gen susturulması güçlü olduğunu gösterir. Özgüllüğü karşılaştırarak zaman Farklılıklar, ancak tanık olabilir. Birçok tek kimyasal olarak sentezlenmiş siRNA&#39;lar esiRNAs doğasında karışım daha spesifik bir demonte 10 yol açar ise, önde gelen off-hedef efektler üretir. Bu çalışmada, genom-ölçekli MİSYON esiRNA kütüphaneleri ve hücre döngüsünün ilerlemesi alan genlerin belirlenmesi için DNA içeriği ekran örneklediği RNAi tarama için kullanımı tasarım mevcut. Biz transfeksiyon protokolü ve yüksek verimlilik tarama testinin nasıl optimize göstermektedir. Biz de istatistiksel olarak değerlendirildi, ne kadar büyük olabilir veri setlerini göstermek ve birincil hit doğrulamak için yöntemler mevcut. Son olarak, valide vurur daha fazla fonksiyonel nitelendirmeler için potansiyel başlangıç ​​noktalarını verir.

Watch this Scientific Journal Video about MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells at JoVE.com

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

Burada bir insan esiRNA kütüphane ilgili genler hücre bölünmesi için yüksek verimli bir ekran kullanın. Biz nasıl bir esiRNA ekranlarının yanı sıra, sonuçları nasıl analiz etmek ve doğrulamak için kurmak ve yürütmek göstermektedir.

Memeli Hücreleri RNAi Tarama MİSYON esiRNA

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

mission-esirna-for-rnai-screening-in-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biology

16.2K Görüntüleme.  Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics. Burada bir insan esiRNA kütüphane ilgili genler hücre bölünmesi için yüksek verimli bir ekran kullanın. Biz nasıl bir esiRNA ekranlarının yanı sıra, sonuçları nasıl analiz etmek ve doğrulamak için kurmak ve yürütmek göstermektedir.

Video: MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite.  The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes A. gambiae

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes. This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite. The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Yetişkin Sivrisinekler (A. gambiae) RNAi Tahliller için protokol

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

Biyoloji

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in cell death. The first step in subculturing is to detach cells from the surface of the primary culture vessel by trypsinization or mechanical means. The resultant cell suspension is then subdivided, or reseeded, into fresh cultures. Secondary cultures are checked for growth and fed periodically, and may be subsequently subcultured to produce tertiary cultures. The time between passaging of cells varies with the cell line and depends on the growth rate.

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. This video will demonstrate a procedure for subculturing both adherent and suspension cells.

Memeli Hücreleri Trypsinizing ve alt kültüre

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

Bacterial Delivery of RNAi Effectors: Transkingdom RNAi

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory tool, the RNAi pathway appears to be promising for therapeutic utilization. For development of RNA interference (RNAi)-based therapies, delivery of RNAi-mediating agents to target cells is one of the major obstacles. A novel strategy to overcome this hurdle is transkingdom RNAi (tkRNAi). This technology uses non-pathogenic bacteria, e.g. Escherichia coli, to produce and deliver therapeutic short hairpin RNA (shRNA) into target cells to induce RNAi. A first-generation tkRNAi-mediating vector, TRIP, contains the bacteriophage T7 promoter for expression regulation of a therapeutic shRNA of interest. Furthermore, TRIP has the Inv locus from Yersinia pseudotuberculosis that encodes invasin, which permits natural noninvasive bacteria to enter &beta;1-integrin-positive mammalian cells and the HlyA gene from Listeria monocytogenes, which produces listeriolysin O. This enzyme allows the therapeutic shRNA to escape from entry vesicles within the cytoplasm of the target cell. TRIP constructs are introduced into a competent non-pathogenic Escherichia coli strain, which encodes T7 RNA polymerase necessary for the T7 promoter-driven synthesis of shRNAs. A well-characterized cancer-associated target molecule for different RNAi strategies is ABCB1 (MDR1/P-glycoprotein, MDR1/P-gp). This ABC-transporter acts as a drug extrusion pump and mediates the "classical" ABCB1-mediated multidrug resistance (MDR) phenotype of human cancer cells which is characterized by a specific cross resistance pattern. Different ABCB1-expressing MDR cancer cells were treated with anti-ABCB1 shRNA expression vector bearing E. coli. This procedure resulted in activation of the RNAi pathways within the cancer cells and a considerable down regulation of the ABCB1 encoding mRNA as well as the corresponding drug extrusion pump. Accordingly, drug accumulation was enhanced in the pristine drug-resistant cancer cells and the MDR phenotype was reversed. By means of this model the data provide the proof-of-concept that tkRNAi is suitable for modulation of cancer-associated factors, e.g. ABCB1, in human cancer cells.

For development of RNA interference (RNAi)-based therapies, a novel strategy was developed, transkingdom RNAi (tkRNAi). This technology uses non-pathogenic bacteria to produce and deliver therapeutic short hairpin RNA (shRNA) into target cells. Here, tkRNAi was successfully applied for reversal of classical ABCB1-mediated multidrug resistance (MDR) of cancer cells.

RNAi Efektör Bakteriyel Teslim Tarihi: Transkingdom RNAi

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

İyon Kanalları ve Fonksiyonel Analiz Mutagenez Heterologously Memeli Hücreleri cinsinden ifade edilir

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to knockdown gene expression levels in loss of gene function studies.
There are two main methods for performing RNAi. The first is the use of small interfering RNAs (siRNAs) that are chemically synthesized, and the second utilizes short-hairpin RNAs (shRNAs) encoded within plasmids 1. The latter can be transfected into cells directly or packaged into replication incompetent lentiviral particles. The main advantages of using lentiviral shRNAs is the ease of introduction into a wide variety of cell types, their ability to stably integrate into the genome for long term gene knockdown and selection, and their efficacy in conducting high-throughput loss of function screens. To facilitate this we have created the LentiPlex pooled shRNA library.
The MISSION LentiPlex Human shRNA Pooled Library is a genome-wide lentiviral pool produced using a proprietary process. The library consists of over 75,000 shRNA constructs from the TRC collection targeting 15,000+ human genes 2. Each library is tested for shRNA representation before product release to ensure robust library coverage. The library is provided in a ready-to-use lentiviral format at titers of at least 5 x 108 TU/ml via p24 assay and is pre-divided into ten subpools of approximately 8,000 shRNA constructs each. Amplification and sequencing primers are also provided for downstream target identification.
Previous studies established a synergistic antitumor activity of TRAIL when combined with Paclitaxel in A549 cells, a human lung carcinoma cell line 3, 4. In this study we demonstrate the application of a pooled LentiPlex shRNA library to rapidly conduct a positive selection screen for genes involved in the cytotoxicity of A549 cells when exposed to TRAIL and Paclitaxel. One barrier often encountered with high-throughput screens is the cost and difficulty in deconvolution; we also detail a cost-effective polyclonal approach utilizing traditional sequencing.

Here we use a human LentiPlex pooled library and traditional sequencing methods to identify gene targets promoting cell survival. We demonstrate how to set up and deconvolute a LentiPlex screen and validate the results.

MİSYON LentiPlex Memeli Hücreleri shRNA Kütüphane Tarama Pooled

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

Içinde Postembryonic Fenotiplerin Belirleme RNAi Tarama C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Memeli Hücreler, Hücre Döngüsü Pozisyon Analizi

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

Kültür Memeli Hücrelerde Biyolojik tanımında ubikitin ve Ubiquitin benzeri Sistemi Regülatörleri tanımak siRNA Eleme

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

Memeli Hücrelerde Heme Sentezi Düzeylerinin Ölçümü

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.