Birincil nöronal hücre kültürü, in vitro kültürde ayrıştırılmış nöronları incelemek için ideal bir model sistemdir. Bu yöntemi kullanmanın avantajı, devre dışı kalan hücrelerin mekanizmalar, fonksiyonlar ve morfoloji in vitro koşullarda hücresel özelliklerini in vivo duruma mümkün olduğunca yakın birkaç hafta süreyle koruyabilmektir. Yuvarlak kapak fişlerini biyogüvenlik dolabının altına 24 kuyuluk bir plakaya koyun.
Her kapak fişinin üzerine 90 mikrolitre poli-L-ornit ekleyin. Kapağı kapatın ve plakayı yavaşça 37 derecelik kuvöze iki gün yerleştirin. Kültür orta ve tohumlama orta hazırlayın ve dört santigrat derece onları tutmak.
Çalışma trippsin çözeltisini DMEM/F12'de hazırlayın ve dört derecede tutun. 37 derece kuvözde kültür orta ve tohumlama ortamı yerleştirin. 24 kuyulu tabağı kuvözden çıkar.
Kapak fişlerini üç kez çift distile su ile yıkayın. Tamamen kuruması için kapak fişleri en az iki saat bekletin. Soğuk PBS ile dolu üç Petri yemeği, soğuk HBSS ile dolu üç Petri yemeği ve buz üzerinde soğuk diseksiyon ortamıyla dolu beş Petri yemeği hazırlayın.
Rahim boynuzları excise ve soğuk PBS üç kez buz üzerinde yıkayın. Buradan doku hasarını en aza indirmek için buz üzerinde tüm adımlar yapılmalıdır. Son yıkama adımından sonra, yavruları HBSS'de rahimden ayırın ve soğuk diseksiyon ortamına aktarın.
Diseksiyon ortamda, makas ile yavru lar decapitate. Foramen magnumdan orbital boşluğun alt sınırına kadar kalvarium açın. İnce bir çift forceps kullanarak, kafatası tabanını çıkarın ve beyinden kafatası soyma.
Dikkatle orta serebellar peduncle ve pons lateral yüzeyinden başlayarak beyincik menenjleri çıkarın. Hem serebellar peduncles kes ve beynin geri kalanından beyincik ayırın. Toplanan seremoniyi hemen dMEM/F12 ile dolu steril 15 mL konik bir tüpe buz üzerine yerleştirin.
Tüpü DMEM/F12'de bir dakika boyunca dört derecede 1,000 g'da santrifüj edin. Bunu üç kez tekrarlayın, her seferinde bir pipetle süpernatantı hafifçe çıkararak ve taze DMEM/F12 peletini yeniden askıya alarak. Önceden ısıtılmış tripsin iki mililitre ekleyin ve yavaşça onları karıştırmak için pipet.
12 dakika boyunca 37 derece su banyosu tüp yerleştirin. Kuluçkadan sonra tüpü emniyet kabine getirin ve trypsin inaktive edilmesi için 10 mL DMEM/F12 ekleyin. Karışımı 1, 200 gr'da beş dakika santrifüj edin.
Supernatant atın ve taze ortamda resuspend üç kez santrifüj ardından. DMEM/F2'li steril plastik pipet önceden ıslandı. Aynı tüpe 3,5 mililitre NAAse çalışma çözeltisi ekleyin.
Sıvı homojen sütlü bir renge erişene kadar dokuyu bir pipetle birkaç kez triturate. Karışıma 10 mL soğuk DMEM/F12 ekleyin ve santrifüje doğru ilerleyin. Numuneyi 1, 200 g'da dört derecede beş dakika santrifüj edin.
Peleti bozmadan supernatant'ı dikkatlice çıkarın. Tohumlama ortamını kuluçka makinesinden çıkarın. Önceden ısıtılmış tohumlama ortamı nın 500 mikrolitresini ekleyin ve pipetkullanarak iyice karıştırın.
Hemositometre kullanarak hücreleri say. Mililitre başına 500, 000 hücre yoğunluğuna tohumlama orta ile hücre süspansiyon seyreltin. Coverslip merkezinde her kuyuya karışımın 90 mikrolitre ekleyin.
Tabağı 37 derecede 3-4 saat kuvöze yerleştirin. Kuluçkadan sonra, her kuyuya 500 mikrolitre önceden ısınmış kültür ortamı ekleyin. Plakayı 37 derecede kuvöze yerleştirin.
Yedi gün sonra, taze kültür orta II.Prepare ilgili sayısal organizasyon ile ayrı bir 24-well plaka ile eski orta değiştirin ve PFA% 4 her kuyuya 100 mikrolitre ekleyin. Kültürde istenilen günlerden sonra, kapak fişlerini orijinal kültür plakasının kuyularından hafifçe çıkarın ve bir önceki adımda açıklanan PfA plakasının ilgili kuyularına yerleştirin. Kapak fişlerini tamamen batırmak için kuyulara PFA ekleyin.
PfA plakasını 30 ila 120 dakika boyunca dört derecede tutun. Kuluçkadan sonra, oda sıcaklığına plaka geri. Kapağı pbs ile hafifçe beş dakika üç kez yıkayın.
Metindeki ikinci şekil E18'den başlayan serebellar hücre kültürünü göstermektedir. Calbindin için immünofloresans üç gün in vitro aksonal uzantıları ile Purkinje nöronlar gösterir. Yedi ila 10 gün in vitro olarak, dendritik süreçler belirgindir.
21 günde kompleks dendritik dallar mevcuttur. Metindeki şekil 3 çeşitli embriyonik günlerde başlayan serebellar hücre kültürlerini göstermektedir. calbindin immünofloresan saptama sadece 18 gün in vitro sonra erken aksonları ile Purkinje nöronlar gösterir.
Purkinje nöron kültürleri E14 başladı ve E15 dendritler gelişecektir, ama E18 başlangıç noktası olduğunda geliştirmek gibi karmaşık asla. Metindeki şekil 4, 21 gün in vitro sonra E18 kültürlerden farklı hücre tiplerinin geliştiğini göstermektedir. Calbindin yeşil immünofluorescence Purkinje nöronlar gösterir.
B ve C parvalbumin için kırmızı immünofloresans inhibitör internöronlar göstermektedir. E ve F'de sodyum voltaj lı kanal için kırmızı immünoresans granül nöronları gösterir. Mevcut protokol uygun maliyetli dir ve yürütülmesi kolaydır.
Bu videonun sonunda, serebellar nöronlar toplamak ve kültür ve istenilen DIVs onları düzeltmek mümkün olacak.
