Bu çalışma, Wellcome Trust (Ref: 084.277) bir hibe ile desteklenmiştir.

1. Serebellar Granül Nöron Hazırlık <ol><li> Otoklav yaklaşık 100 25 mm çapında lamelleri (Tablo 1). </li><li> Poli-D-lizin steril solüsyon (Tablo 2) içeren 50 ml steril tüp yerleştirin lamelleri. Kat lamelleri 2 saat için dönen bir platform üzerine yerleştirin. </li><li> Laminer akış kaputu steril kağıt mendil Kuru kaplı lamelleri (Tablo 1). </li><li> Kullanmadan önce, steril 6 kuyucuğu ve sıcak bir CO 2 inkübatör (Tablo 1). Lameller içine yerleştirin lamelleri 4 ° C&#39;de 1 ay boyunca saklanabilir . </li><li> Yerel etik komite kurallarına göre yavru 7 gün eski Sprague Dawley sıçan Euthanize. Biz servikal dislokasyon kullanarak yavrular ötenazi. </li><li> Beyincik inceleyin ve tuzları çözüm tamponlu (B çözeltisi, Tablo 3) bir fosfat içeren steril bir petri yerleştirin. </li><li> 4-6 sıçan yavrular için 1.5 ve 1.6 adımları tekrarlayın. </li><li> Cerebella sonra bir McIlwain Doku Cho steril sahne üzerine yerleştirilenpper (Tablo 1). Doku, 90 ° ile sahneye dönen ve aynı işlemi tekrarlayarak önce 375 mikron aralıklarla doğranmış. </li><li> 37 önceden ısınmış olan bir tripsin çözümü (çözüm T, Tablo 4) ° C doğranmış cerebella aktarılır </li><li> Inkübe cerebella az 37 ° C yavaşça sallanarak yaklaşık her 5 dk ile 20 dk. </li><li> Triptik sindirim sırasında alev cilası, üç steril cam pipetler (Tablo 1) Bunsen alevi kullanarak. Alev ilgili ağızlarını pipetler ince bir delik, orta delik ve geniş bir delik oluşturmak için kullanın. </li><li> Çözüm T 20 dakika inkübasyondan sonra, bir masa üstü santrifüj 1 dakika (Tablo 1) 1.000 g serebellar süspansiyon ve pelet hücreleri için 20 ml (çözüm B, Tablo 5), bir tripsin / DNaz inhibitörü çözüm ekleyin . </li><li> Süpernatantı Durusu ve geniş delik pipet kullanarak konsantre tripsin / DNaz inhibitörü (C çözeltisi, Tablo 6) 1,5 ml hücre pelletini tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li&gt; Ilk geniş delik pipet kullanarak hücrelerin Karışım, daha sonra orta çap ve nihayet hücre süspansiyonu kadar dar delik homojen Bu önemli bir adım, bu aşamada süspansiyon homojen olmalıdır. </li><li> 10 ml üst katman hücre süspansiyonu prewarmed (37 ° C) 15 ml steril bir tüp içinde sığır serum albümin takviye Earles Dengeli Tuzlar Çözüm (Tablo 7). </li><li> Az 5 dakika boyunca 1.500 g süspansiyon Santrifüj ve tekrar süspansiyon prewarmed 2 ml hücre pelletini (37 ° C) kültür vasatı (Tablo 8). </li><li> Tahmini bir haemocytometer kullanarak hücre sayısı (Tablo 1) ve son bir ml&#39;de 3.3 x 10 6 hücre yoğunluğu hücre süspansiyonu seyreltik. </li><li> Hücreler hücre süspansiyonu 75 ul poli-D-lizin kaplı lamelleri (son yoğunluğu 2.5 x 10 5) merkezi ekleyerek kaplanmıştır. </li><li> Lamelleri içeren kültür plakaları hücrelerin bir izin için 60 dakika CO 2 inkübatör yerleştirilirdhere. </li><li> Her kaplama hücreleri de rahatsız ve CO 2 inkübatör kültür plakaları dönmek için özen içine kültür ortamı 1.5ml ekleyin. </li><li> Ertesi gün mitoz inhibitörü sitozin arabinozid (Tablo 8) ile desteklenmiş taze kültür ortamı ile kültür ortamı değiştirin. Glial hücreler kültürde Bu tutuklamalar çoğalması. </li></ol> 2. Deneysel Kurulum <ol><li> Temel deney düzeneği (bkz. Tablo 1 ve kullanılan belirli donanım ve yazılım için 9) aşağıdaki gibidir: <ul><li> Tersyüz edilmiş epi-floresan mikroskop </li><li> Soğutmalı CCD kamera </li><li> Floresan ışık kaynağı (monokromatör veya filtre tekerleği) </li><li> Yerçekimi perfüzyon cihazları </li><li> Görüntüleme paralel platin elektrot haznesi </li><li> Elektrik stimülatörü </li><li> Bilgisayar </li><li> Resim toplama yazılımı </li></ul></li><li> Deneyler karanlık veya kırmızı ışık koşul altında yapılmalıdırörnek en az floresan aydınlatma ile itions beyazlatma FM boya önlemek için. </li><li> Deneyler oda sıcaklığında yapılmaktadır. Fizyolojik sıcaklık gerekiyorsa, ısı kontrollü perfüzyon sistemi kullanılıyor olabilir. </li></ol> 3. Numune Hazırlama <ol><li> Kültürler in vitro 8-12 gün sonra kullanılmalıdır. </li><li> Yeni orta ve istikrar sağlamak için oda sıcaklığında 10 dakika tuzlu su solüsyonu (Tablo 10) tek bir lamel aktarın. </li><li> Lamel çıkarın, alt ve küçük bir parça kağıt havlu veya emici kağıt ile ekli hücreleri çevreleyen bölgede kuru. </li><li> Yapıştırıcı, silikon gres (Tablo 2) görüntüleme odasının alt lamel kullanılması. Hücreler iki paralel teller arasında olmalıdır. Yeterli silikon gres banyo odasının merkezine giren herhangi bir yağ haznesi olmadan tamamen sızdırmazlık için kullanılan ancak olmalıdır. </li><li> ~ 260 ul sa ile banyo odasının yavaşça doldurunuzhat çözümü ve daha sonra aynı çözümü ile giriş tüp doldurun. </li><li> Tutkal odasının üst silikon yağ ile temiz bir lamel sızdırmazlık için. Giriş ve çıkış boru, haznesinde sıkışmış olan herhangi bir hava kabarcıkları kaldırmak için kullanılabilir. Elektrik devresi, hava kabarcıkları tarafından kesintiye uğramaz olduğunu önemlidir. </li><li> Paslanmaz çelik bir platformda görüntüleme odasının Immobilise ve yavaşça giriş tüp aracılığıyla serum fizyolojik solüsyonu perfüze sızıntı olup olmadığını kontrol edin. </li><li> Mount ters bir mikroskop sahnede bir araya odasına ve odanın bir ağırlık perfüzyon sistemine bağlanmak, ilk tuzlu su çözeltisi ile giriş astarlanmalıdır. </li><li> Odasının bağlantı kabloları, elektrik stimülatörü takın. </li><li> Bir petrol lens kullanıldığında ise objektif bir damla immersiyon yağı ekleyin. Odanın ortasında parlak bir alan aydınlatma kullanarak hücreleri üzerinde odaklanın. </li></ol> 4. S1 Faz <ol><li> 1.5 ml serpmek nöronlartuzlu çözelti içinde seyreltilmiş FM boya (Tablo 2). </li><li> Ekli stimülatörü kullanarak boya alımı uyandırmak için nöronları uyarır. </li><li> Stimülasyon sonra 2 dakika süreyle taze tuzlu su çözeltisi ile serpmek nöronların aşırı FM boya (debisi 7 ml / dak) yıkayın. CGN kültür sistemi Glial kontaminasyon% 5&#39;inden az 14, bu nedenle bu süre boya kaldırmak için yeterli olacaktır . </li><li> 8 dakika dinlenmek için nöronların bırakın. </li><li> Bu süre zarfında, bireysel FM boya yüklü sinir uçları görünür kullanarak floresein dalga boylarında (emisyon&gt; 550 nm eksitasyon ve 480 nm) aksonal ağları bulun. Hücre kümeleri alanlardan kaçının bu aşamada minimum aydınlatma tutun, yoğun uyarım boya fototoksisite neden olabilir. Bunun en belirgin belirtileri, akson ve boya boşaltma eksikliği (sabitleme boya nedeniyle) blebbing . </li><li> Ynt odak görüntü görüntü elde etme hemen önce hafif bir sürüklenme bu yana dinlenme döneminde meydana gelmiş olabilir. </li&gt; <li> Time-lapse oranı her 4 saniyede 1 kare görüntü elde etme başlayın </li><li> 5 edinme sonra 10 bazal görüntüleri, 2 s (60 aksiyon potansiyelleri) 8 30 Hz stimülasyon sunarak RRP ekzositoz uyandırmak kare yakalama hemen sonra el stimülasyon başlatın. </li><li> Bir 10 görüntü aldıktan sonra, her biri 30 ayrı 8, 10 s (400 aksiyon potansiyelleri) için 40 Hz üç uyarılara kullanarak RP SV ekzositoz çağrıştırıyor. </li><li> Bir 5 Edinme - 10 görüntüler ve daha sonra duraklama görüntü elde etme. </li></ol> 5. Kurtarma Faz (bkz. Şekil 2) <ol><li> Nöronların en az 20 dakika kurtarmak için izin verin. </li><li> İsteğe bağlı - endositoz bir ilacın etkisini test edilecek ise, bu dönemde (Şekil 2b) 3,8 sırasında ilaç solüsyonu ile serpmek nöronlar. </li></ol> 6. S2 Faz <ol><li> Aynı alanını kullanarak kontrol deney için S1 faz protokolü (Bölüm 4) tekrarlayın.S1. </li><li> İsteğe bağlı - endositoz bir ilacın etkisini test edilecek ise, FM boya (Şekil 2b) 3,8 ile takviye ilaç solüsyonu ile nöronların serpmek. </li><li> İsteğe bağlı - ekzositoz uyuşturucu etkileri ilgi Alternatif varsa, önce ve RRP ve RP boşaltma uyaranlara (Şekil 2c) 3 sırasında her iki ilaç çözüm serpmek nöronlar. </li></ol> 7. Veri Analizi <ol><li> ImageJ ve Microsoft Excel veya veri analizi için benzer bir yazılım kullanın. </li><li> Analizi için, yığın formatında bir görüntü dizisi gereklidir. Bazı görüntüleme yazılımı, tek bir görüntü olarak dizilerini ihraç edebilir. Bu durumda, bir yığın yığını bir ImageJ built-in fonksiyonu Görüntü&gt; Bacalar&gt; Görüntü kullanarak görüntüleri dönüştürmek. </li><li> Dinamik aralık yığının en üst düzeye çıkarmak için parlaklık ve kontrastı ayarlayın. Image&gt; Ayarla&gt; Parlaklık / Kontrast (Şekil 3a). </li><li> T sırasında meydana gelen önemli yatay sürüklenme varsao deney, çalıştırmak StackReg ( <a href="http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/">http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/</a> ) ve TurboReg ( <a href="http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/">http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/</a> ImageJ) eklentileri görüntü yığını (Şekil 3b) hizalamak için . </li><li> Zaman Serisi Analyzer eklentisi (Çalıştır <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/time-series.html">http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/time-series.html</a> ) (Şekil 3c). </li><li> Ilgi (ROI) bölgelerinde en az 90 sinir terminalleri üzerinden tanımlayın. Bu aynı olmalıdır (1.5 mikron çapında dairesel ROI&#39;ler) önce görüntüler arasında geçiş yapmak için yararlı olur ve boya aktif sinir terminalleri (alternatif bir ön-uyarı görüntü stimülasyon sonrası görüntü çıkarılır olabilir) ortaya çıkarmak için boşalttıktan sonra ideal ROI boyutu tipik bir sinir terminali (Şekil 3c) biraz daha büyüktür. </li><li> Tim üzerinde her ROI entegre / toplam floresan alınMicrosoft Excel (Şekil 3b ve 4a) e ve ihracat. </li><li> S1 ve S2 her iki fazda ilk boşaltma uyaran (Şekil 4b-c) için Y-ekseni düzleminde izlerini hizalayarak aynı keyfi değeri ROI izleri Normale Bu, arka planda floresan küçük varyasyonları kontrol etmektir. </li><li> S1 ve S2 (Şekil 4d) aşağıdaki gibi keyfi floresan birimleri her boşaltma uyaran tarafından uyarılmış floresans mutlak azalma ölçün: <ul><li> Floresan RRP = Değişim (mesafe kadar taşınmış) 30 Hz 2 s tarafından tetiklenen </li><li> RP = Sum mesafe kadar taşınmış, 3 x 40 Hz 10 s tarafından tetiklenir </li><li> Toplam geri dönüşüm havuz = RRP + RP </li></ul></li><li> 7.9 her bir ilgili parametre için, tek bir deneyde tüm sinir terminalleri üzerinden ortalama değerini hesaplamak. </li><li> İstatistiksel analiz için, birden fazla bağımsız deneylerde elde edilen değerlerin ortalaması olabilir anlamına gelir. Sayısından daha çok sinir terminalleri lamelleri STATISTICA olarak kullanılmalıdırl n. </li></ol> 8. Temsilcisi Sonuçlar: Şekil 5 CGNs iki tur aynı yükleme ve boşaltma adımları uygulanan bir kontrol deneyi temsil edilmektedir. Bir dizi deney başlamadan, böyle bir kontrol deneyi, S1 ve S2 S2 sırasında çeşitli deneysel koşullar önce karşılaştırılabilir olduğunu onaylamak için her gün yapılır esastır. Bu örnekte, CGNs 10 mcM FM1-43 ile 80 Hz 10 stimülasyonu (Şekil 5a) kullanılarak yüklenmiştir. Şekil 5b floresan puncta tarafından temsil FM1-43 yüklenmiş sinir terminalleri gösterir. Şekil 5c gösterildiği gibi ROI&#39;ler 90 sinir terminalleri üzerinden tanımlanmıştır. ROI&#39;ler aynı set, hem S1 ve S2 için kullanılmıştır. Hem de kaldırır sırasında, RRP ilk RP 3 sıralı 40Hz (10 sn) uyaranlara (Şekil 5a) ile boşaltma, 30 Hz (2 saniye) stimülasyon ile kaldırıldı. Her uyaran sırasında floresans düşüş açıkça izlenmiştir (Şekil 5d-e) ve sayısal olarak ifade edilebilir.<html> Bakıldığında, floresan RRP karşılık gelen damlalar, RP ve toplam geri dönüşüm havuzu, S1 ve S2 karşılaştırılabilir. Buna ek olarak% 80, S1 ve S2 hem de RP ikamet ederken,% 20 geri dönüştürülmüş SV RRP ikamet. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3143/3143fig1.jpg" /> Şekil 1 tipik bir FM deneme şematik. A) SV endositoz FM boya (yeşil temsil) varlığı tetiklenir. Boya invaginating membran (tek SV veya toplu endosomes) tarafından alınır. Plazma zarı B) Sigara içselleştirilmiş boya perfüzyon yıkanabilir. C) floresan kaybı ile sonuçlanan plazma zarı ile serbest sigorta için kullanılabilir hale gelmiştir SV etiketli bir boşaltma uyarıcı, başvuru üzerine. D) piyasaya etiketli SV miktarı ile doğru orantılıdır floresans (mesafe kadar taşınmış) değişiklik sonra belirlenebilir. _upload/3143/3143fig2.jpg &quot;/&gt; Olası deneysel protokollerin 2 şematik diyagramları Şekil. A) hücreleri, yükleme ve boşaltma (S1 ve S2) FM boya iki tur geçmesi bir kontrol deneyi Akış şeması. Hücreler bir dizi farklı uyaranlar kullanılarak yüklenebilir. Boşaltma adımları 3 kez 10 saniye süreyle 40 Hz kullanarak boşaltma RP takip RRP 2 s için 30 Hz ile boş olduğunu aynı 30 sn ile 40 sn, diğer tüm uyaranlara RRP ve rezerv havuzu boşaltma uyaranlara ayrıldı. Hücreler 20 dakika S1 ve S2 arasındaki kurtarmak için bırakılır. Yatak ya da bir maddenin etkisini test etmek için olası değişiklikler akış şemaları) endositoz veya C) ekzositoz de gösterilir. Ilgili test ilaç, belirtilen süreler içinde odasına perfüze olabilir. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3143/3143fig3.jpg" /> Görüntü J veri analizi Şekil 3 Ekran Ekran.Resim J. kullanarak) parlaklık ve kontrast ayarı, B) çerçeve hizalama, C) ROI seçimi, ve D) yoğunluk değerleri çıkarma <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3143/3143fig4.jpg" /> Şekil 4 Ekran, Microsoft Excel veri analizi . = Ekran A) Resim J (1. sütun ham veri almak için gösterilen kare sayısı, tek tek sinir terminallerinden kalan sütunları = veri) B) başında, keyfi bir değere (200) S1 başlangıç ​​değerlerine (çerçeve 10) ayarlanması S1 aynı protokolü kullanarak çerçeve 55 S2 temel değerleri ilk uyaran, C) ayarı, Microsoft Excel kullanarak floresan damla D) ölçümü. D gösterilen ortalama iz her damla önce ve sonra zaman noktaları tanımlamak için kullanılır unutmayın. Her ROI için floresan damla boyutu C&#39;de gösterildiği tablo üzerinde değerler tespit edilmelidir <img alt="Şekil 5" src = &quot;/ files/ftp_upload/3143/3143fig5.jpg&quot; /&gt; Şekil 5. Temsilcisi kontrol deneyi. A) CGNs 10μM FM1-43, 80 Hz (10 sn) stimülasyon kullanarak yüklü bir kontrol deneyi Akış şeması. S1 ve S2 aşamaları aynıdır. 30 sn ile 40 sn, diğer tüm uyaranlara RRP ve rezerv havuzu boşaltma uyaranlara ayrıldı. B) sinir terminallerine gösteren bir görüntü FM1-43 ile yüklendi. C) 90 sayılı ROI&#39;ler gösteren B gibi aynı görüntüyü analiz için seçildi. D) B kırmızı bir kutu seçilen zaman noktalarında tarafından tasvir bir alan görüntüler. Stimülasyon önce Bazal = 30 Hz = = 30 Hz 2 s uyarımı sonrası, 40 Hz 1,2,3 her 40 Hz 10 s stimülasyon sonra. Bu görüntüler değişiklikleri floresans (sağda görünen spektrum bar) göstermek için Pseudocolor sunulmaktadır. E) Ortalama ± SEM iz C. Bireysel uyaranlara gösterilen 90 sinir uçları elde edilen yatay çubuklar tarafından temsil edilmektedir. Ölçek bar = 10 mm.

<ol>
	<li>Rizzoli, S. O., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+vesicle+pools.">Synaptic vesicle pools.</a> Nat. Rev. Neurosci. 6, 57-69 (2005).</li><li>Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+synaptic+vesicle+cycle+revisited.">The synaptic vesicle cycle revisited.</a> Neuron. 28, 317-320 (2000).</li><li>Evans, G. J., Cousin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+control+of+slow+synaptic+vesicle+endocytosis+by+cyclin-dependent+kinase+5.">Activity-dependent control of slow synaptic vesicle endocytosis by cyclin-dependent kinase 5.</a> J. Neurosci. 27, 401-411 (2007).</li><li>Clayton, E. L., Cousin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+labelling+of+bulk+endocytosis+in+nerve+terminals+by+FM+dyes.">Differential labelling of bulk endocytosis in nerve terminals by FM dyes.</a> Neurochem. Int. 53, 51-55 (2008).</li><li>Clayton, E. L., Evans, G. J., Cousin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+synaptic+vesicle+endocytosis+is+rapidly+triggered+during+strong+stimulation.">Bulk synaptic vesicle endocytosis is rapidly triggered during strong stimulation.</a> J. Neurosci. 28, 6627-6632 (2008).</li><li>Cousin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+FM1-43+and+other+derivatives+to+investigate+neuronal+function.">Use of FM1-43 and other derivatives to investigate neuronal function.</a> Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 2, Unit 2-Unit 2 (2008).</li><li>Clayton, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phospho-dependent+dynamin-syndapin+interaction+triggers+activity-dependent+bulk+endocytosis+of+synaptic+vesicles.">The phospho-dependent dynamin-syndapin interaction triggers activity-dependent bulk endocytosis of synaptic vesicles.</a> J. Neurosci. 29, 7706-7717 (2009).</li><li>Cheung, G., Jupp, O. J., Cousin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+bulk+endocytosis+and+clathrin-dependent+endocytosis+replenish+specific+synaptic+vesicle+pools+in+central+nerve+terminals.">Activity-dependent bulk endocytosis and clathrin-dependent endocytosis replenish specific synaptic vesicle pools in central nerve terminals.</a> J. Neurosci. 30, 8151-8161 (2010).</li><li>Betz, W. J., Mao, F., Smith, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+exocytosis+and+endocytosis.">Imaging exocytosis and endocytosis.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 6, 365-371 (1996).</li><li>Ryan, T. A., Reuter, H., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+detection+of+a+quantal+presynaptic+membrane+turnover.">Optical detection of a quantal presynaptic membrane turnover.</a> Nature. 388, 478-482 (1997).</li><li>Murthy, V. N., Sejnowski, T. J., Stevens, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+release+properties+of+visualized+individual+hippocampal+synapses.">Heterogeneous release properties of visualized individual hippocampal synapses.</a> Neuron. 18, 599-612 (1997).</li><li>Tan, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdk5+is+essential+for+synaptic+vesicle+endocytosis.">Cdk5 is essential for synaptic vesicle endocytosis.</a> Nat. Cell. Biol. 5, 701-710 (2003).</li><li>Anggono, V., Cousin, M. A., Robinson, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Styryl+dye-based+synaptic+vesicle+recycling+assay+in+cultured+cerebellar+granule+neurons.">Styryl dye-based synaptic vesicle recycling assay in cultured cerebellar granule neurons.</a> Methods. Mol. Biol. 457, 333-345 (2008).</li><li>Gallo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+release+of+glutamate+from+cerebellar+granule+cells+differentiating+in+culture.">Selective release of glutamate from cerebellar granule cells differentiating in culture.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7919-7923 (1982).</li><li>Stevens, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotransmitter+release+at+central+synapses.">Neurotransmitter release at central synapses.</a> Neuron. 40, 381-388 (2003).</li><li>Mozhayeva, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+vesicle+pools+during+maturation+of+hippocampal+synapses.">Development of vesicle pools during maturation of hippocampal synapses.</a> J. Neurosci. 22, 654-665 (2002).</li><li>Cousin, M. A., Evans, G. J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+silent+and+weak+synapses+by+cAMP-dependent+protein+kinase+in+cultured+cerebellar+granule+neurons.">Activation of silent and weak synapses by cAMP-dependent protein kinase in cultured cerebellar granule neurons.</a> J. Physiol. 589, 1943-1955 (2011).</li><li>Kim, S. H., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+vesicle+recycling+at+CNS+synapses+without+AP-2.">Synaptic vesicle recycling at CNS synapses without AP-2.</a> J. Neurosci. 29, 3865-3874 (2009).</li><li>Kim, S. H., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdk5+serves+as+a+major+control+point+in+neurotransmitter+release.">Cdk5 serves as a major control point in neurotransmitter release.</a> Neuron. 67, 797-809 (2010).</li><li>Groemer, T. W., Klingauf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+vesicles+recycling+spontaneously+and+during+activity+belong+to+the+same+pool.">Synaptic vesicles recycling spontaneously and during activity belong to the same pool.</a> Nat. Neurosci. 10, 145-147 (2007).</li></ol>

Biz ifşa etmek başka bir şey var.

FM boyalar yoğun birçok nöronal hazırlıkları sinir terminali fonksiyon araştırmak için kullanılır. Onlar ya SV endositoz, SV ciro veya ekzositoz 6 kinetiği ölçüde izlemek başta olmak üzere istihdam edilmiştir. Açıklanan protokol belirli SV havuzlarının boşaltılması diferansiyel incelemek için bu çalışmalar uzanır. Bu SV havuzlarının yenileme ve aynı zamanda seferberlik ölçüde ilgili ek bilgi sağlar. FM boyalar aynı sinir terminalleri içinde SV geri dönüşüm birden fazla mermi etiket kullanılabilir. Biz her bir terminal SV ciro aynı sinir uçlarında iki kez takip edilebilir olan protokoller bu özelliği istismar ve tasarladık. Bu paralel sinir terminallerine 11 SV geri dönüşüm heterojen doğası nedeniyle gerekli, doğru bir iç kontrol sağlar. S1 faz bir iç kontrol sistemi olarak kullanımı, Via RRP, RP ve toplam dolumSV pool ilaçların varlığı güvenilir ve doğrudan mukayese edilebilir. RRP ve RP havuzları, geri dönüşüm mutlak büyüklüğü bilgi vermenin yanı sıra, farklı stimülasyon koşullar altında, bu protokol, ayrıca şunları da veri sağlayabilir - 1) geri dönüşüm havuz bir fonksiyonu olarak RRP ve RP arasında SV, bölümleme S1 ve S2, 2) toplam S1 geri dönüşüm havuz ve 3) S2 S1 aynı havuzun bir fonksiyonu olarak tanımlanmış herhangi bir SV havuzu göreli büyüklüğü bir fonksiyonu olarak S2 havuzları göreceli büyüklüğü (RRP ve RP). Bu özel protokol alma süresi (kinetik ölçümler için satın alma süreleri mümkün ve görüntü yakalamak için senkronize otomatik olarak boşaltma gibi hızlı olmalıdır) çok yavaş olduğundan, ancak boşaltma kinetiği hakkında bilgi vermek olmaz. 30 Hz 2 s uyaranlara hipertonik sakaroz 8 boşaltma RRP özdeş bir ölçüde çağrıştırıyor. RRP boyutu bu yanahipertonik sakaroz boşaltma 15 tarafından tanımlanan, hipokampal nöronların 16 çalışmaları ile anlaşma bu protokol tüm RRP SV kaldırır ifade edebiliriz. Rezerv havuzu, 400 uyaranlara Bu uyarının bu yana (40 Hz 10 sn)% 95, tüm boya etiketli SV tüketir bir paradigma (50 mM KCl ile 2 uyaranlara) benzer bir miktarda boya kaldırır üç trenler neredeyse tamamen tükenmiş 8,17. Doğru kantifikasyon RRP ve rezerv havuzu her iki boyutu da CCD kamera doğrusal dinamik aralık içinde bilgi edinme bağlıdır. Bu basit bir protokol daha da değiştirilebilir. Yükleme uyaranların gücü de nöronal aktivitenin nasıl ve farklı endositoz modları SV havuzu ikmal etkileyen belirlemek için çeşitli olabilir. Ayrıca, gerekirse iki kür daha fazla yükleme ve boşaltma yapılabilir. Bu protokol transfekte hücreler aşırı ekspresyonu ya da kullanılabilirshRNA vektörler. Birincil nöronal kültürlerin düşük transfeksiyon verimliliği nedeniyle, ifade proteinler floresan proteinleri ile etiketlenmiş olmalıdır. Bu fluoresan etiketleri (örneğin, camgöbeği veya kırmızı proteinler) FM boya sinyal ile müdahale etmediğini esastır. Bu durumda, aynı alanda görüş transfekte ve non-transfekte hücreler sinir uçları, aynı zamanda ek bir kontrol 8 olarak karşılaştırılabilir. Pertürbasyon yüklerin sırasında mevcut olduğundan, bu tür deneylerde, S1 ve S2 yükler arasında yükleme ölçüde bir karşılaştırma çok az değer taşır. SV havuzları arasında boya bölümleme hala ancak 8 görüntülendi olabilir. Genetik gazetecilere pHluorins primer nöronal kültür SV ekzositoz ve endositoz izlemek için istihdam edilebilir çağırdı. Bu probları VAMP, sinaptofizin ve VGLUT1 18 olarak etiketlenen SV proteinler luminal etki pH ortamı pH duyarlı yeşil flüoresan protein </sup&gt; Veziküler ATPaz inhibitörleri ile birlikte kullanıldığında, pHluorins SV havuzu seferberlik 19 kinetiği ve kapsamı hem de rapor edebilirsiniz . FM-boya dayalı bir yaklaşım, burada açıklanan pHluorin tekniği üzerinde bazı avantajları vardır, Öncelikle, FM boyalar SV endositoz modu RRP ve rezerv havuzları 8 takviye yapar hangi bilgileri sağlar . İkincisi özel SV havuzları, 20 farklı spektral özellikleri ve nihayet transfeksiyon için hiçbir gereklilik yoktur FM boyalarla etiketli olabilir . Görülebilmesi için endositoz sırasında boya ile yüklenmesi gerekir beri tanımı SV FM boyalar, dinlenme ve ancak SV havuzları geri dönüşüm (pHluorins 19 kontrast) arasında SV trafik hakkında bilgi sağlayamaz. Böylece FM boyalar ve pHluorins hem de güçlü ve zayıf yanları var ve aynı soruyu adresine bağımsız deneylerde kullanılan en güçlüsüdür. Yüksek kaliteli görüntüleri, geçerli analiz ve reproducib için gerekli olanle sonuçları. Yatay sürüklenme kolayca düzeltilebilir iken, Z ekseninde bir kayma var deneyler geri alınamaz. Bu nedenle, S1 ve S2 kaldırır başlamadan önce görüntü tekrar odaklanmak için önemlidir. Önemli bir floresan çürüme meydana geldi durumlarda, çürüme düzeltmeler (genellikle stimülasyon yokluğunda FM yüklü hücrelerin önceden kaydedilmiş bir iz çıkarılarak) uygulanabilir. Ancak, herhangi bir kantitatif analiz için kullanılacak grafik gösterimi ve çürüme düzeltme için gerçekleştirildiğini öne sürülmektedir.

<table border="1"><tbody><tr><th> Isim </th><th> Şirket </th><th> Hayır Kataloğu. </th></tr><tr><td> AxioCam MRM Rev 3 Dijital Kamera </td><td> Carl Zeiss </td><td> 4265099901000 </td></tr><tr><td> Axio Observer.A1 Mikroskop </td><td> Carl Zeiss </td><td> 4310040000000 </td></tr><tr><td> Hücre kültürü plakaları (6 kuyu) </td><td> Greiner biyo-bir </td><td> 657160 </td></tr><tr><td> Santrifüj (Evrensel 32R) </td><td> Hettich Zentrifugen </td><td> 1610 </td></tr><tr><td> CO 2 inkübatör </td><td> Heraeus Aletleri </td><td> 51014042 </td></tr><tr><td> Falcon tüpleri (15/50 ml) </td><td> Greiner biyo-bir </td><td> 188271/210261 </td></tr><tr><td> Fluar 20X / 0.75 ∞ / 0.17 hedefi </td><td> Carl Zeiss </td><td> 4401459901000 </td></tr><tr><td> Cam lamelleri (25mm) </td><td> VWR uluslararası </td><td> 631-1584 </td></tr><tr><td> Cam pasteur pipetler (230 nm) </td><td> Greiner biyo-bir </td><td> 612-1799 </td></tr><tr><td> Haemocytometer </td><td> VWR </td><td> 15170-170 </td></tr><tr><td> Görüntüleme kamara </td><td> Warner </td><td> RC-21 BRFS </td></tr><tr><td> Laminar akış kapağı </td><td> BIOHIT </td><td> VLF BHS 1200 </td></tr><tr><td> McIlwain Doku Chopper </td><td> Mickle Laboratuvar Engineering Co Ltd. </td><td> MTC / 2 </td></tr><tr><td> Cıva lambası </td><td> Carl Zeiss </td><td> HBO 103 </td></tr><tr><td> MultiStim Sistemi Elektrik Stimülatör (100mV, 1ms pluse genişlik) </td><td> Digitimer Ltd. </td><td> D330 </td></tr><tr><td> Perfüzyon pompası </td><td> Watson-Marlow </td><td> 313S </td></tr><tr><td> Serolojik Pipetler (5/10/25 ml) </td><td> Greiner biyo-bir </td><td> 606180/607180/760180 </td></tr><tr><td> Shutter denetleyicisi </td><td> Carl Zeiss </td><td> MAC5000 </td></tr><tr><td> Şırınga (20 ml) </td><td> BD Plastipak </td><td> ST01-B002 </td></tr><tr><td> Şırınga Filtreler (Minisart - 0.20 mikron) </td><td> Sartorius Stedim </td><td> 16532 </td></tr><tr><td> VC-6 Altı Kanal valf kontrolörü </td><td> Warner </td><td> 64-0135 </td></tr><tr><td> YFP filter seti (46 Set) </td><td> Carl Zeiss </td><td> 1196-681 </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Kullanılan özel ekipman ve cihazları <table border="1"><tbody><tr><th> Isim </th><th> Şirket </th><th> Hayır Kataloğu. </th><th> Konsantrasyon </th></tr><tr><td> FM1-43 </td><td> BioScience Cambridge </td><td> BT70021 </td><td> 10 mcM </td></tr><tr><td> FM2-10 </td><td> BioScience Cambridge </td><td> BT70044 </td><td> 100 mcM </td></tr><tr><td> Poly-D-lisin </td><td> Sigma </td><td> P7886 </td><td> 15 mg / ml </td></tr><tr><td> Silikon gres </td><td> Sigma </td><td> 85403 </td><td align="center"> - </td></tr></tbody></table> Tablo 2. Kullanılan Özel reaktifler <table border="1"><tbody><tr><th> Isim </th><th> Şirket </th><th> Hayır Kataloğu. </th><th> Konsantrasyon </th></tr><tr><td> Sığır Serum Albumin (BSA) </td><td> Sigma </td><td> A4503 </td><td> % 0.3 </td></tr><tr><td> D-glikoz </td><td> Sigma </td><td> G5767 </td><td> % 0.25 </td></tr><tr><td> Mg4 SO · 7H 2 O </td><td> Sigma </td><td> M2773 </td><td> 1.5 mM </td></tr><tr><td> D-PBS </td><td> Gibco </td><td> 21300 </td><td> 960 mg/100 ml </td></tr></tbody></table> Her hazırlanması için taze 100ml- Kullanmadan önce steril filtre Tablo 3. CGN hazırlık Çözüm B <table border="1"><tbody><tr><th> Isim </th><th> Şirket </th><th> Hayır Kataloğu. </th><th> Konsantrasyon </th></tr><tr><td> Çözüm B </td><td align="center"> - </td><td align="center"> - </td><td> 19 ml </td></tr><tr><td> Tripsin (5 mg / ml stok, -20 ° C) </td><td> Sigma </td><td> T9201 </td><td> 1 ml </td></tr></tbody></table> Tablo 4. Çözüm CGN hazırlanması için T <table border="1"><tbody><tr><th> Isim </th><th> Şirket </th><th> Hayır Kataloğu. </th><th> Konsantrasyon </th></tr><tr><td> Çözüm C </td><td align="center"> - </td><td align="center"> - </td><td> 3.2 ml </td></tr><tr><td> Çözüm B </td><td align= &quot;Center&quot;&gt; - </td><td align="center"> - </td><td> 16.8 ml </td></tr></tbody></table> Tablo 5. Çözüm W CGN hazırlık için <table border="1"><tbody><tr><th> Isim </th><th> Şirket </th><th> Hayır Kataloğu. </th><th> Konsantrasyon </th></tr><tr><td> Deoksiribonükleaz (DNaz, 0.5 ml hisse başına 500 U, -20 ° C) </td><td> Sigma </td><td> D5025 </td><td> 0.5 ml </td></tr><tr><td> MgSO 4 · 7H 2 O </td><td> Sigma </td><td> M2773 </td><td> 1.5 mM </td></tr><tr><td> Çözüm B </td><td align="center"> - </td><td align="center"> - </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> Soya tripsin inhibitörü (SBTI, 0.5 ml hisse başına 0.5 mg, -20 ° C) </td><td> Sigma </td><td> T9003 </td><td> 0.5 ml </td></tr></tbody></table> Tablo 6. Çözüm CGN hazırlanması için C <table border="1"><tbody><tr><th> Isim </th><th> Şirket </th><th> Hayır Kataloğu. </th><th> Konsantrasyon </th></tr><tr><td> Sığır Serum Albumin (BSA) </td><td> Sigma </td><td> A4503 </td><td> % 4 </td></tr><tr><td> Earle Dengeli Tuz Çözeltisi (EBSS) </td><td> Gibco </td><td> 24010 </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> MgSO 4 · 7H 2 O </td><td> Sigma </td><td> M2773 </td><td> 3 mM </td></tr></tbody></table> Tablo 7. CGN hazırlanması için EBSS Çözüm <table border="1"><tbody><tr><th> Isim </th><th> Şirket </th><th> Hayır Kataloğu. </th><th> Konsantrasyon </th></tr><tr><td> Sitozin β-D-arabinofuranoside (Ara-C) * </td><td> Sigma </td><td> C1768 </td><td> 10 mcM </td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum </td><td> Gibco </td><td> 10106 </td><td> % 10 </td></tr><tr><td> D-glikoz </td><td> Sigma </td><td> G5767 </td><td> 30 mm </td></tr><tr><td> L-Glutamine </td><td> Sigma </td><td> G3126 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma </td><td> P5405 </td><td> 25 mM </td></tr><tr><td> Minimal Essential Medium (MEM) </td><td> Gibco </td><td> 21090 </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> Penisilin (P) / Streptomisin (S) </td&gt; <td> Gibco </td><td> 15140 </td><td> 100 U / ml (P), 100 mg / ml (S) </td></tr></tbody></table> * Ara-C 1 DIV itibaren orta eklenmelidir Tablo 8. CGN hazırlanması için Kültür Medya <table border="1"><tbody><tr><th> Isim </th><th> Versiyon </th><th> Şirket </th></tr><tr><td> AxioVision Rel. </td><td> 4,8 </td><td> Carl Zeiss </td></tr><tr><td> ImageJ </td><td> 1.42q </td><td> Ulusal Sağlık Enstitüleri </td></tr><tr><td> Microsoft Excel </td><td> 2003 </td><td> Microsoft </td></tr></tbody></table> Tablo 9. Belirli bilgisayar yazılımı kullandı <table border="1"><tbody><tr><th> Isim </th><th> Şirket </th><th> Hayır Kataloğu. </th><th> Konsantrasyon </th></tr><tr><td> CaCl 2 · 2H 2 O </td><td> Sigma </td><td> C7902 </td><td> 1.3 mm </td></tr><tr><td> Glikoz </td><td> Sigma </td><td> G5767 </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma </td><td> P5405 </td><td> 3.5 mm </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Sigma </td><td> P9791 </td><td> 0.4 mm </td></tr><tr><td> MgCl 2 · 6H 2 O </td><td> Sigma </td><td> M0250 </td><td> 1.2 mm </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Fluka </td><td> 71378 </td><td> 170 mm </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Fluka </td><td> 71627 </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> Na 2 SO 4 </td><td> BDH Laboratuvar Malzemeleri </td><td> 10264 </td><td> 1.2 mm </td></tr><tr><td> TES </td><td> Sigma </td><td> T1375 </td><td> 20 mM </td></tr></tbody></table> Tablo 10. Tuzlu Çözüm (pH 7.4)

quantitative analysis of synaptic vesicle pool replenishment in cultured cerebellar granule neurons using fm dyes

Merkezi sinir uçlarında nörotransmitter yayımlanmasından sonra, SV hızla endositoz alınır. Sonra alındı. SV nörotransmitter ile doldurulabilir ve ekzositoz 1,2 SV olarak tanımlanan, geri dönüşüm havuzu, geri dönmek. Kolayca açıklanmaması havuzu (RRP) ve rezerv havuzu (RP) - geri dönüşüm havuz, genellikle iki ayrı havuza ayrılmıştır. Isimlerinin ima ettiğin gibi, RRP RP SV yoğun stimülasyonu 1,2 sırasında yayımlanan hemen füzyon için kullanılabilir olduğunu SV oluşur. 1) anlamak için bu SV havuzları diferansiyel ikmal raporlar güvenilir bir tahlil olması önemlidir. SV endositoz farklı modlar sonra trafik (clathrin bağımlı endositoz ve aktivite bağımlı toplu endositoz) ve 2) mekanizmalarının nasıl RRP ve RP hem de farklı uyaranlara tepki olarak seferber kontrol. FM boyalar rutin olarak kullanır.ed kantitatif merkezi sinir terminallerine 3-8 SV ciro rapor etmek. Membranlar boyunca çift katlı lipid geri dönüşümlü bölümleme sağlar hidrofobik hidrokarbon kuyruk ve hidrofilik bir başı grup engelleyen geçit var. Boyalar, biraz sulu çözeltisi floresan, ancak membran 9 bölümlenmiş kuantum verimi önemli ölçüde artırır . Böylece FM boyalar aktif SV geri dönüşüm izleme için ideal bir floresan probları. FM boya kullanımı için standart bir protokoldür. Önce nöronlar uygulanır (Şekil 1) endositoz sırasında alınır. Olmayan içselleştirilmiş boya geri dönüşüm havuz içinde plazma membranı, geri dönüşümlü SV yeniden dağıtma yıkanıp sonra. Bu SV sonra boşaltma uyaranlara (Şekil 1) kullanarak tükenmiş. SV FM boya etiketleme quantal 10 olduğundan, ortaya çıkan floresans damla piyasaya veziküller miktarı ile doğru orantılıdır. Böylece, SV, geri dönüşüm ve füzyon pr eldeendositoz evious yuvarlak güvenilir bir şekilde belirlenebilir. Burada, iki ek bilgi unsurları elde etmek için modifiye edilmiş bir protokol mevcut. Öncelikle, sıralı boşaltma uyaranlara farklı ölçümü belirli SV havuzları ikmal izin vermek için RRP ve RP boşaltmak için kullanılır. İkincisi, her sinir terminal protokolü iki defa uğrar. Böylece, bir iç kontrol sağlayan, aynı sinir terminal S1 yanıt S2 faz (Şekil 2) bir test maddenin varlığına karşı karşılaştırılabilir. SV geri dönüşüm farklı sinir uçları arasında 11 dereceye kadar oldukça değişken olduğundan bu önemlidir. Herhangi yapışık birincil nöronal kültürlerin bu protokol için kullanılan olabilir, ancak kaplama yoğunluğu, çözümleri ve stimülasyon şartları, serebellar granül nöronların (CGNs) 12,13 için optimize edilmiştir .

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes at JoVE.com

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

Merkezi sinir terminallerine ikmal ve belirli sinaptik vezikül (SV) havuzları seferberlik ölçmek için canlı bir floresan görüntüleme tekniği açıklanmıştır. SV geri dönüşüm iki tur bir iç kontrol sağlayan aynı sinir uçlarında izlenir.

FM Boyalar Kültür Serebellar Granül Nöronlar Synaptic veziküllü Havuzu Yenileme Kantitatif Analiz

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

quantitative-analysis-synaptic-vesicle-pool-replenishment-cultured

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.0K Görüntüleme.  University of Edinburgh. Merkezi sinir terminallerine ikmal ve belirli sinaptik vezikül (SV) havuzları seferberlik ölçmek için canlı bir floresan görüntüleme tekniği açıklanmıştır. SV geri dönüşüm iki tur bir iç kontrol sağlayan aynı sinir uçlarında izlenir.

Video: Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes

The fusion of synaptic vesicles with the plasma membrane (exocytosis) is a required step in neurotransmitter release and neuronal communication. The vesicles are then retrieved from the plasma membrane (endocytosis) and grouped together with the general pool of vesicles within the nerve terminal, until they undergo a new exo- and endocytosis cycle (vesicle recycling). These processes have been studied using a variety of techniques such as electron microscopy, electrophysiology recordings, amperometry and capacitance measurements. Importantly, during the last two decades a number of fluorescently labeled markers emerged, allowing optical techniques to track vesicles in their recycling dynamics. One of the most commonly used markers is the styryl or FM dye 1; structurally, all FM dyes contain a hydrophilic head and a lipophilic tail connected through an aromatic ring and one or more double bonds (Fig. 1B). A classical FM dye experiment to label a pool of vesicles consists in bathing the preparation (Fig. 1Ai) with the dye during the stimulation of the nerve (electrically or with high K+). This induces vesicle recycling and the subsequent loading of the dye into recently endocytosed vesicles (Fig. 1Ai-iii). After loading the vesicles with dye, a second round of stimulation in a dye-free bath would trigger the FM release through exocytosis (Fig. 1Aiv-v), process that can be followed by monitoring the fluorescence intensity decrease (destaining).

Although FM dyes have contributed greatly to the field of vesicle recycling, it is not possible to determine the exact localization or morphology of individual vesicles by using conventional fluorescence microscopy. For that reason, we explain here how FM dyes can also be used as endocytic markers using electron microscopy, through photoconversion. The photoconversion technique exploits the property of fluorescent dyes to generate reactive oxygen species under intense illumination. Fluorescently labeled preparations are submerged in a solution containing diaminobenzidine (DAB) and illuminated. Reactive species generated by the dye molecules oxidize the DAB, which forms a stable, insoluble precipitate that has a dark appearance and can be easily distinguished in electron microscopy 2,3. As DAB is only oxidized in the immediate vicinity of fluorescent molecules (as the reactive oxygen species are short-lived), the technique ensures that only fluorescently labeled structures are going to contain the electron-dense precipitate. The technique thus allows the study of the exact location and morphology of actively recycling organelles.

FM dyes have been of invaluable help in the understanding of synaptic dynamics. FMs are normally followed under the fluorescent microscope during different stimulation conditions. However, photoconversion of FM dyes combined with electron microscopy allows the visualization of distinct synaptic vesicle pools, among other ultrastructure components, in synaptic boutons.

Styryl Boyaların Fotoçevrim kullanarak Synaptic veziküllü Havuzları incelenmesi

The fusion of synaptic vesicles with the plasma membrane (exocytosis) is a required step in neurotransmitter release and neuronal communication. The ...

Nörobilim

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These structures are rich in actin and have been shown to be highly dynamic. In response to classical Hebbian plasticity 
as well as neuromodulatory signals, dendritic spines can change shape and number, which is thought to be critical for the refinement of neural 
circuits and the processing and storage of information within the brain. Within dendritic spines, a complex network of proteins link extracellular 
signals with the actin cyctoskeleton allowing for control of dendritic spine morphology and number. Neuropathological studies have demonstrated that 
a number of disease states, ranging from schizophrenia to autism spectrum disorders, display abnormal dendritic spine morphology or numbers. 
Moreover, recent genetic studies have identified mutations in numerous genes that encode synaptic proteins, leading to suggestions that these 
proteins may contribute to aberrant spine plasticity that, in part, underlie the pathophysiology of these disorders. In order to study the potential 
role of these proteins in controlling dendritic spine morphologies/number, the use of cultured cortical neurons offers several advantages. Firstly, 
this system allows for high-resolution imaging of dendritic spines in fixed cells as well as time-lapse imaging of live cells. Secondly, this in 
vitro system allows for easy manipulation of protein function by expression of mutant proteins, knockdown by shRNA constructs, or pharmacological 
treatments. These techniques allow researchers to begin to dissect the role of disease-associated proteins and to predict how mutations of these 
proteins may function in vivo.

Numerous recent studies have identified mutations in synaptic proteins associated with brain pathologies. Primary cultured cortical neurons offer great flexibility in examining the effects of these disease-associated proteins on dendritic spine morphology and motility.

Kültür MSS Nöronlar Dendritik Omurga Morfoloji Analizi

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This directed trafficking is of fundamental importance to deliver, maintain or remove synaptic proteins.
Super-ecliptic pHluorin (SEP) is a pH-sensitive derivative of eGFP that has been extensively used for live cell imaging of plasma membrane proteins1-2. At low pH, protonation of SEP decreases photon absorption and eliminates fluorescence emission. As most intracellular trafficking events occur in compartments with low pH, where SEP fluorescence is eclipsed, the fluorescence signal from SEP-tagged proteins is predominantly from the plasma membrane where the SEP is exposed to a neutral pH extracellular environment. When illuminated at high intensity SEP, like every fluorescent dye, is irreversibly photodamaged (photobleached)3-5. Importantly, because low pH quenches photon absorption, only surface expressed SEP can be photobleached whereas intracellular SEP is unaffected by the high intensity illumination6-10. 
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) of SEP-tagged proteins is a convenient and powerful technique for assessing protein dynamics at the plasma membrane. When fluorescently tagged proteins are photobleached in a region of interest (ROI) the recovery in fluorescence occurs due to the movement of unbleached SEP-tagged proteins into the bleached region. This can occur via lateral diffusion and/or from exocytosis of non-photobleached receptors supplied either by de novo synthesis or recycling (see Fig. 1). The fraction of immobile and mobile protein can be determined and the mobility and kinetics of the diffusible fraction can be interrogated under basal and stimulated conditions such as agonist application or neuronal activation stimuli such as NMDA or KCl application8,10. 
We describe photobleaching techniques designed to selectively visualize the recovery of fluorescence attributable to exocytosis. Briefly, an ROI is photobleached once as with standard FRAP protocols, followed, after a brief recovery, by repetitive bleaching of the flanking regions. This 'FRAP-FLIP' protocol, developed in our lab, has been used to characterize AMPA receptor trafficking at dendritic spines10, and is applicable to a wide range of trafficking studies to evaluate the intracellular trafficking and exocytosis.

This report describes the use of live cell imaging and photobleach techniques to determine the surface expression, transport pathways and trafficking kinetics of exogenously expressed, pH-sensitive GFP-tagged proteins at the plasma membrane of neurons.

Kültür Nöronlar Membran Proteinlerin Yanal Difüzyon ve ekzositoz Floresans Kurtarma ve Floresans kaybı Photobleaching kullanarak Değerlendirilen

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.
This extracellular technique has advantages. First, extracellular electrodes can stimulate and record neurons through the sheath5, so it does not need to be removed. Thus, neurons will be healthier in extracellular experiments than in intracellular ones. Second, if ganglia are rotated by appropriate pinning of the sheath, extracellular electrodes can access neurons on both sides of the ganglion, which makes it easier and more efficient to identify multiple neurons in the same preparation. Third, extracellular electrodes do not need to penetrate cells, and thus can be easily moved back and forth among neurons, causing less damage to them. This is especially useful when one tries to record multiple neurons during repeating motor patterns that may only persist for minutes. Fourth, extracellular electrodes are more flexible than intracellular ones during muscle movements. Intracellular electrodes may pull out and damage neurons during muscle contractions. In contrast, since extracellular electrodes are gently pressed onto the sheath above neurons, they usually stay above the same neuron during muscle contractions, and thus can be used in more intact preparations.
To uniquely identify motor neurons for a motor pool (in particular, the I1/I3 muscle in Aplysia) using extracellular electrodes, one can use features that do not require intracellular measurements as criteria: soma size and location, axonal projection, and muscle innervation4,6,7. For the particular motor pool used to illustrate the technique, we recorded from buccal nerves 2 and 3 to measure axonal projections, and measured the contraction forces of the I1/I3 muscle to determine the pattern of muscle innervation for the individual motor neurons.
We demonstrate the complete process of first identifying motor neurons using muscle innervation, then characterizing their timing during motor patterns, creating a simplified diagnostic method for rapid identification. The simplified and more rapid diagnostic method is superior for more intact preparations, e.g. in the suspended buccal mass preparation8 or in vivo9. This process can also be applied in other motor pools10,11,12 in Aplysia or in other animal systems2,3,13,14.

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.

Ekstraselüler bir kas Motor Pool için motor nöronlar belirlenmesi<em&gt; Aplysia&#39;nın californica</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using styryl FM dyes, which reveal membrane turnover. Conventional protocols for the use of FM dyes were designed for analyzing neurons following stimulated (evoked) synaptic activity. Recently, protocols have become available for analyzing the FM signals that accompany weaker synaptic activities, such as spontaneous or miniature synaptic events. Analysis of these small changes in FM signals requires that the imaging system is sufficiently sensitive to detect small changes in intensity, yet that artifactual changes of large amplitude are suppressed. Here we describe a protocol that can be applied to evoked, spontaneous, and miniature synaptic activities, and use cultured hippocampal neurons as an example. This protocol also incorporates a means of assessing the rate of photobleaching of FM dyes, as this is a significant source of artifacts when imaging small changes in intensity.

We describe the use of styryl FM dyes to image synaptic vesicle recycling in functional nerve terminals. This protocol can be applied not only to evoked, but also spontaneous and miniature synaptic activities. The protocol expands the variety of synaptic events that can be effectively evaluated.

Uyarılmış, Spontan ve Minyatür Synaptic Faaliyetleri Sırasında FM boyalar kullanarak sinaptik vezikül Geri Dönüşüm Sınavı

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Serebellar Granül Nöronlar Genetik Manipülasyon<em&gt; In Vitro</em&gt; Ve<em&gt; In Vivo</em&gt; Nöronal morfoloji ve Göç Eğitim için

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then radial migration in the molecular layer and the Purkinje cell layer to reach the internal granular layer of the cerebellar cortex. Default in migratory processes induces either cell death or misplacement of the neurons, leading to deficits in diverse cerebellar functions. Centripetal granule cell migration involves several mechanisms, such as chemotaxis and extracellular matrix degradation, to guide the cells towards their final position, but the factors that regulate cell migration in each cortical layer are only partially known. In our method, acute cerebellar slices are prepared from P10 rats, granule cells are labeled with a fluorescent cytoplasmic marker and tissues are cultured on membrane inserts from 4 to 10 hr before starting real-time monitoring of cell migration by confocal macroscopy at 37 &#176;C in the presence of CO2. During their migration in the different cortical layers of the cerebellum, granule cells can be exposed to neuropeptide agonists or antagonists, protease inhibitors, blockers of intracellular effectors or even toxic substances such as alcohol or methylmercury to investigate their possible role in the regulation of neuronal migration.

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal cerebellum development, immature granule cells originating from the germinal zone exhibit distinct modalities of migration to reach their final destination and to establish neuronal networks. This protocol describes the preparation of cerebellar slices and the confocal macroscopic approach used to investigate the factors that regulate neuronal migration.

Konfokal Makroskopi kullanarak Postnatal Serebellar Granül Hücre Göç Ex Vivo Görüntüleme

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating innate immunity. Primary rodent cell culture models have greatly advanced our understanding of neuronal-glial interactions, but only recently have methods to specifically eliminate microglia from mixed cultures been utilized. One such technique &#8211; described here &#8211; is the use of L-leucine methyl ester, a lysomotropic agent that is internalized by macrophages and microglia, wherein it causes lysosomal disruption and subsequent apoptosis13,14. Experiments using L-leucine methyl ester have the power to identify the contribution of microglia to the surrounding cellular environment under diverse culture conditions. Using a protocol optimized in our laboratory, we describe how to eliminate microglia from P5 rodent cerebellar granule cell culture. This approach allows one to assess the relative impact of microglia on experimental data, as well as determine whether microglia are playing a neuroprotective or neurotoxic role in culture models of neurological conditions, such as stroke, Alzheimer&#8217;s or Parkinson&#8217;s disease.

Microglia can influence neurons and other glia in culture by various non-cell autonomous mechanisms. Here, we present a protocol to selectively deplete microglia from primary neuronal cultures. This method has the potential to elucidate the role of microglial-neuronal interactions, with implications for neurodegenerative conditions where neuroinflammation is a hallmark feature.

Beyindeki granü hücre kültürlerinden mikroglia zayıflatılması, L-lösin metil ester

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA receptors (NMDARs) and AMPA receptors (AMPARs). Physiological data have indicated that glutamate receptors at RGCs are expressed not only in postsynaptic but also in perisynaptic or extrasynaptic membrane compartments. However, precise anatomical locations for glutamate receptors at RGC synapses have not been determined. Although a high-resolution quantitative analysis of glutamate receptors at central synapses is widely employed, this approach has had only limited success in the retina. We developed a postembedding immunogold method for analysis of membrane receptors, making it possible to estimate the number, density and variability of these receptors at retinal ribbon synapses. Here we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of retinal fixation, 2) freeze-substitution, 3) postembedding immunogold electron microscope (EM) immunocytochemistry and, 4) quantitative visualization of glutamate receptors at ribbon synapses.

The postembedding immunogold method is one of the most effective ways to provide high-resolution analyses of the subcellular localization of specific molecules. Here we describe a protocol to quantitatively analyze glutamate receptors at retinal ribbon synapses.

Retina Şerit Sinapslar at Membran Reseptör Yüksek Çözünürlüklü Sayısal immunogold Analizi

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Assessment of Neuronal Viability Using Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide Double Staining in Cerebellar Granule Neuron Culture

Primary cultured Cerebellar Granule Neurons (CGNs) have been widely used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research. However, the co-existence of glial cells and neurons in CGN culture might lead to biases in the accurate assessment of neuronal viability. Fluorescein diacetate (FDA) and Propidium Iodide (PI) double staining has been used to measure cell viability by simultaneously evaluating the viable and dead cells. We used FDA-PI double staining to improve the sensitivities of the colorimetric assays and to evaluate neuronal viability in CGNs. Furthermore, we added blue fluorescent DNA stains (e.g., Hoechst) to improve the accuracy. This protocol describes how to improve the accuracy of assessment of neuronal viability by using these methods in CGN culture. Using this protocol, the number of glial cells can be excluded by using fluorescence microscopy. A similar strategy can be applied to distinguish the unwanted glial cells from neurons in various mixed cell cultures, such as primary cortical culture and hippocampal culture.

This protocol describes how to accurately measure neuronal viability using Fluorescein diacetate (FDA) and Propidium Iodide (PI) double staining in cultured cerebellar granule neurons, a primary neuronal culture used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research.

Serebellar Granül Nöron Kültüründe Floresan Diasetat-Propidyum İyodür Çift Boyama Kullanarak Nöronal Canlılığın Değerlendirilmesi

Primary cultured Cerebellar Granule Neurons (CGNs) have been widely used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research. However, the ...